DE19956156A1 - Verfahren zur Aufbereitung eines Präparates von Thrombozyten und Thrombozytenpräparat - Google Patents

Abstract

Bei einem Verfahren zur Aufbereitung eines Präparates von Thrombozyten werden die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten derart blockiert, daß nach Transfusion des Thrombozytenpräparates eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufberei­ tung eines Präparates von Thrombozyten und ein Thrombozytenprä­ parat.

Thrombozyten, die auch Blutplättchen genannt werden, sind die zellulären Bestandteile des Blutes, die für die Blutgerinnung verantwortlich sind. Ein Fehlen der Thrombozyten oder eine starke Verringerung der üblichen Thrombozytenzahl resultiert in einer erhöhten Blutungsneigung und kann lebensbedrohliche Blu­ tungen verursachen.

Wie die Erythrozyten und die Leukozyten sind auch die Thrombo­ zyten periphere Blutzellen und entwickeln sich über definierte Knochenmarksvorstufen aus den hämatopoetischen Stamm- und Vor­ läuferzellen des Knochenmarks. Die Vorläuferzellen der Thrombo­ zyten im Blut sind die Megakaryozyten im Knochenmark.

Das zentrale Regulationshormon der Megakaryopoese und Thrombo­ poese ist das Thrombopoetin (TPO). Ein verkürztes Protein, das nur die Rezeptorbindungsregion von TPO umfaßt, wird als MGDF (megacaryocyte growth and development factor) bezeichnet. Sind die Thrombozyten im Blut vermindert, läßt sich ein erhöhter TPO-Gehalt im Blut nachweisen. Diese Erhöhung des Hormons führt dann zu einer gesteigerten Produktion der Megakaryopoese mit dem Ziel, die Blutwerte für die Thrombozyten im Normbereich zu halten.

Im Jahre 1994 gelang es mehreren Arbeitsgruppen, Thrombopoetin zu isolieren und zu charakterisieren; siehe z. B. Bartley et al.: "Identification and cloning of a megacaryocyte growth and development factor that is a ligand for the cytokine receptor Mpl" in Cell, Band 77 (July 1994), Seiten 1117-1124. Mit Hilfe des daraufhin in ausreichenden Mengen verfügbaren rekombinanten Hormons konnte gezeigt werden, daß Thrombopoetin sowohl in vi­ tro als auch in vivo nicht nur die Produktion der reifen Throm­ bozyten stimuliert, sondern auch der entscheidende Wachstums- und Reifungsfaktor für megakaryozytäre Vorläuferzellen und Kno­ chenmarksmegakaryozyten ist; siehe Kaushansky: "The Mpl ligand. Molecular and cellular biology of the critical regulator of me­ gacaryocyte development" in Stem Cells, Band 12 (Supplement 1), 1994, Seiten 91-97.

Die Rolle des Thrombopoetins (TPO) als zentrales Regulations­ hormon der Megakaryozytopoese/Thrombopoese kann aufgrund der vorliegenden Daten als hinreichend belegt angesehen werden, die Mechanismen der Thrombopoetinregulation sind jedoch derzeit noch unklar. Verschiedene experimentelle Studien deuten darauf hin, daß die Höhe des Thrombopoetinspiegels durch die Masse der vorhandenen Thrombozyten bestimmt wird. So haben Mäuse, die ei­ ne Defizienz für den TPO-Rezeptor (auch c-mpl genannt) aufwei­ sen, erniedrigte Thrombozytenzahlen bei erhöhtem TPO-Spiegel; Siehe Gurney et al.: "Thrombocytopenia in c-mpl-deficient mice" in Science, Band 265 (1994), Seiten 1445-1447.

Filder et al.: "Regulation of thrombopoietin levels by c-mpl- mediated binding of platelets" in Blood, Band 87 (1996), Seiten 2154-2161, konnten zeigen, daß die Infusion von gewaschenen normalen, TPO-Rezeptor tragenden Thrombozyten zu einem Abfall des TPO-Spiegels führt. Kuter et al.: "The reciprocal relati­ onship of thrombopoietin (c-mpl ligand) to changes in the plateless mass during busulfan-induced thrombocytopenia in the rabbit" in Blood, Band 85 (1995), Seiten 2720-2730, konnten an­ hand eines Chemotherapie-Modells bei Kaninchen zeigen, daß der TPO-Plasmaspiegel proportional zum Busulfan-induzierten Abfall der Thrombozytenmasse ansteigt. Weiterhin führten Thrombozyten­ transfusionen bei thrombozytopenen Tieren zu einem Abfall des TPO-Spiegels.

Zu den wichtigsten Nebenwirkungen einer Strahlen- oder Chemo­ therapie gehört die Schädigung des blutbildenden Systems, die u. a. in einer Reduktion der weißen Blutzellen (Leukopenie) so­ wie der Thrombozyten (Thrombopenie) resultiert. Bei Patienten mit stark erniedrigten Blut-Thrombozytenwerten werden daher Spender-Thrombozytenpräparate transfundiert, wobei sich durch diese Thrombozytensubstitution ernsthafte Blutungen weitgehend vermeiden lassen. Sobald sich die Blutbildung des Patienten nach der Behandlung wieder erholt hat, kann auf die Verabrei­ chung weiterer Thrombozytenpräparate verzichtet werden. Je schneller diese Regeneration erfolgt, desto größer ist der Vor­ teil für die Patienten, der vor allem in verringerter Blutungs­ gefahr sowie einer schnelleren Entlassung aus der Krankenhaus­ behandlung zu sehen ist.

Shinjo et al.: "Serum thrombopoietin levels in patients corre­ late inversely with platelet counts during chemotherapy-induced thrombocytopenia" in Leukemia, Band 12 (1998), Seiten 295-300, berichten in diesem Zusammenhang, daß eine Transfusion von Thrombozyten bei chemotherapeutisch behandelten Patienten zu einem zeitweiligen Absacken des TPO-Spiegels bei gleichzeitigem Anstieg des Thrombozytenspiegels führte. Die Studie wurde an drei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie durchgeführt. Die Autoren schlußfolgern aus ihren Ergebnissen, daß die TPO- Rezeptoren mit endogenem TPO des Patienten abesättigt wurden, so daß die Thrombozytenmasse direkt den Serum-TPO-Spiegel durch Rezeptor-vermittelte Adsorption reguliert.

Kaushansky: "Thrombopoietin" in: The New England Journal of Me­ dicine, Band 339 (1998), Seiten 746-754 beschreibt, daß TPO in vitro und in vivo die Zahl von megakaryozytischen Vorläuferzel­ len in vitro und in vivo erhöht und berichtet über die Verwen­ dung von rekombinantem humanem TPO, um die Thrombozytenzahl bei Patienten zu erhöhen. Zu diesem Zweck wurde TPO unmittelbar verabreicht. Bei Patienten mit autologer Knochenmarks­ transplantation konnte die Transfusion von Thrombozyten­ präparaten reduziert werden, während diese Behandlung bei Pati­ enten mit autologer Stammzellertransplantation nicht erfolg­ reich war.

Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, für eine schnelle Regeneration der Blutbil­ dung von Patienten, vorzugsweise von strahlen- oder chemothera­ peutisch behandelten Patienten zu sorgen.

Bei dem eingangs erwähnten Verfahren zur Aufbereitung eines Präparates von Thrombozyten wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten derart blockiert werden, daß nach Transfusion des Thrombozyten­ präparates eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vor­ zugsweise nahezu verhindert wird.

Bei dem eingangs erwähnten Thrombozytenpräparat wird diese Auf­ gabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten blockiert sind.

Während die bisher in der Literatur beschriebenen Ansätze zur Unterstützung der Regeneration der Blutbildung unmittelbar z. B. durch subkutane oder intravenöse Infusion von TPO auf den Pati­ entenorganismus direkt einwirkten, haben die Erfinder der vor­ liegenden Anmeldung erkannt, daß im Gegenteil eine Vorbehand­ lung des Thrombozytenpräparates nebenwirkungsfrei zu dem ge­ wünschten Ergebnis führt. Die Erfinder gehen nicht etwa den auch denkbaren Weg, den Thrombopoetinspiegel in dem Patienten vor oder während der Transfusion zu erhöhen, sie verhindern vielmehr das Absacken des Thrombopoetinspiegels dadurch, daß auf den transfundierten Thrombozyten die TPO-Rezeptoren derart blockiert sind, daß körpereigenes TPO nicht mehr binden kann. Wie die Erfinder in ersten klinischen Untersuchungen zeigen konnten, kommt es bei einer Transfusion mit derart blockierten Thrombozyten zu keinerlei Absenkung des TPO-Spiegels, so daß der vorhandene TPO-Spiegel die Blutbildung begünstigen kann.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die TPO-Rezeptoren in vitro mit einer Substanz abgesättigt werden, die an die TPO-Rezeptoren bindet und diese blockiert.

Obwohl grundsätzlich auch andere Verfahren zur Blockierung der TPO-Rezeptoren denkbar sind, stellt doch die Absättigung dieser Rezeptoren durch an sie bindende Substanzen ein denkbar einfa­ ches Verfahren dar, die z. B. von einer Blutbank zur Verfügung gestellten Thrombozytenpräparate müssen z. B. vor der Transfusi­ on lediglich mit der entsprechenden Substanz inkubiert werden, was im einfachsten Falle eine Zugabe der Substanz zu dem Throm­ bozytenpräparat sowie eine kurzzeitige Inkubation unter leich­ tem Schütteln bedeutet.

Dabei ist von besonderem Vorteil, daß die abgesättigten Throm­ bozyten bezüglich ihres Aggregationsverhaltens keine Unter­ schiede zu nicht abgesättigten Thrombozyten zeigten, so daß sie einerseits effizient Blutungen verhindern, andererseits aber für den Erhalt des TPO-Spiegels sorgen, so daß der Patient schneller wieder eigene Thrombozyten bildet.

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner ein Ver­ fahren zur Behandlung eines an Thrombopenie und/oder Mega­ karyopenie leidenden Patienten, bei dem zur Erhöhung des Throm­ bozyten-Spiegels ein Thrombozytenpräparat transfundiert wird, wobei vor der Transfusion die TPO-Rezeptoren des Thrombozyten­ präparates in vitro derart blockiert werden, daß nach Transfu­ sion eine Bindung von körpereigenem TPO vermieden, vorzugsweise nahezu verhindert wird.

Gleichfalls betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines einer Strahlen- und/oder Chemotherapie ausgesetzten Pati­ enten, dem ein Thrombozytenpräparat verabreicht wird, wobei vor der Verabreichung des Thrombozytenpräparates die TPO-Rezeptoren des Thrombozytenpräparates in vitro derart blockiert werden, daß eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.

Dabei ist es dann bevorzugt, wenn die Thrombozyten für eine be­ stimmte Zeit mit der Substanz inkubiert und die inkubierten Thrombozyten danach ggf. gewaschen werden, um nicht-gebundene Substanz aus dem Präparat zumindest überwiegend zu entfernen.

Bei dieser Maßnahme ist von Vorteil, daß in dem Thrombozyten­ präparat keine freie Substanz vorhanden ist, die z. B. als Anti­ gen wirken und die Bildung unerwünschter Antikörper auslösen könnte. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erkannt, daß dieser Waschschritt die Wirksamkeit der Blockierung der TPO-Rezeptoren in keiner Weise vermindert, nach Transfusion ei­ nes derart aufbereiteten Thrombozytenpräparates war kein Absin­ ken des TPO-Spiegels zu beobachten.

Ein Waschvorgang inn Anschluß an die Absättigung der TPO- Rezeptoren in vitro ist unbedingt dann erforderlich, wenn die Blockade der TPO-Rezeptoren durch Substanzen erfolgt, die keine TPO-Funktion haben. Denn in diesem Falle könnte die überschüs­ sige Substanz eine Blockierung von TPO-Rezeptoren in vivo ohne Signalvermittlung bewirken, wodurch ein negativer Einfluß auf die Regeneration der Megakaryo- und Thrombozytopoese zu erwar­ ten sein kann.

Für die klinische Anwendung ist ein Waschvorgang jedoch dann nicht erforderlich, wenn die Blockierung der TPO-Rezeptoren durch alleinige Zugabe von TPO oder MGDF oder einer anderen Substanz, die c-mpl blockiert und TPO-Funktionen hat. Dabei ist dann nämlich von Vorteil, daß der Verlust von Thrombozyten durch den Waschvorgang (Zentrifugation, Abnahme des Überstandes und Resuspendieren der Thrombozyten) vermieden wird. Bei den bereits durchgeführten klinischen Untersuchungen (siehe unten Beispiel 5) wurde der Waschschritt jedoch durchgeführt, um eine Maskierung des erwarteten Abfalls des endogenen TPO-Spiegels durch überschüssiges MGDF im Thrombozytenpräparat zu verhin­ dern.

Als Substanz kann dabei z. B. ein agonistisch wirkender, vor­ zugsweise monoklonaler Antikörper gegen den TPO-Rezeptor einge­ setzt werden, wie er von Deng et al.: "An agonist murine mo­ noclonal antibody to the human c-Mpl receptor stimulates mega­ caryocytopoiesis" in: Blood, Band 92 (1998), Seiten 1981-1988, beschrieben wurde.

Darüber hinaus können synthetische Agonisten verwendet werden, die an den TPO-Rezeptor binden, wie z. B. das Cytokin Promega­ poietin der Firma Searle R & D, Monsanto, oder der von Cwirla et al.: "Peptide agonist of the thrombopoietin receptor-as po­ tent as the natural cytokine" in: Science, Band 276 (1997), Seiten 1696-1699, beschriebene Agonist. Schließlich ist es auch möglich, natürliches oder synthetisches TPO bzw. MGDF einzuset­ zen, das aufgrund der bekannten Sequenz in unbegrenzter Menge verfügbar ist.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschrei­ bung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach­ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Anwendungs- und Aus­ führungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Bestimmung der Bindungskapazität für TPO in vitro

Thrombozyten aus Standard-Thrombozytenpräparaten der Blutbank der Anmelderin wurden bezüglich der Zellzahl eingestellt auf ca. 2 × 10⁸/ml (in PBS + 1% HSA).

Als Substanz zur Blockierung der TPO-Rezeptoren wurde TPO der Firma CellGenix bzw. MGDF der Firma Kirin verwendet. Das letz­ tere liegt als PEG-rhMGDF, also als Polyethylen-Glykol- konjugiertes rekombinantes humanes Protein vor, das gegenüber dem natürlich vorkommenden TPO im wesentlichen auf die Rezep­ torbindungsregion verkürzt ist.

Die Thrombozyten wurden nach Zugabe von 10 ng/ml TPO bzw. MGDF für eine Stunde bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Bewegen inkubiert.

Nach bestimmten Zeiten wurden Aliquots entnommen, die umgehend für zehn Minuten bei Raumtemperatur bei 1000 g zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde abgenommen und erneut für zehn Mi­ nuten bei 4°C bei 10 000 g zentrifugiert.

Der Überstand wurde abgenommen und bis zur Analyse bei -80°C eingefroren.

Die Versuche zeigten, daß nach einer Stunde Inkubationszeit zwischen 50 und 60% von 10 ng/ml TPO bzw. MGDF gebunden wurde, die TPO-Rezeptoren der Thrombozyten waren abgesättigt.

Zusätzliches TPO konnte in einer zweiten Inkubationsrunde nicht mehr gebunden werden, wobei ferner festgestellt wurde, daß ge­ bundenes TPO nicht wieder freigegeben wurde.

Beispiel 2 Bestimmung der TPO-Konzentration

Die TPO-Konzentration im Überstand aus Beispiel 1 bzw. im Plas­ ma von mit TPO-abgesättigtem Thrombozytenpräparat transfundier­ ten Patienten wurde mit den humanen TPO-Immunoassay Quantiki­ ne® der Firma R & D Systems, Minneapolis, USA, bestimmt. Die­ ser Test basiert auf der Sandwichtechnik, ein TPO-spezifischer monoklonaler Antikörper wird auf einer Testplatte immobili­ siert, woraufhin die Proben auf die Testplatte gegeben werden, so daß in der Probe vorhandenes TPO an die immobilisierten An­ tikörper bindet.

Nach dem Waschen wird ein enzymgekoppelter monoklonaler Anti­ körper aufgegeben, cler ebenfalls spezifisch für TPO ist. Nach einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung hinzugege­ ben, woraufhin sich eine Farbreaktion proportional zu der Menge an gebundenem TPO ergibt. Die Farbentwicklung wird abgestoppt und die Intensität der Farbe wird als Maß für die TPO- Konzentration bestimmt.

Beispiel 3 Aufbereitung von Thrombozytenpräparaten

Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden Standard-Thrombozyten­ präparate mit ausreichenden Mengen (30-40 ng/ml) von TPO bzw. MGDF für eine Stunde unter leichter Bewegung bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach der Inkubation wird das Thrombozytenpräparat gewaschen, um nicht-gebundenes TPO bzw. MGDF zu entfernen. Hierzu wird das Thrombozytenpräparat mit 1400 g bei Raumtemperatur für 15 Minu­ ten zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Thrombozyten werden dann in 5%igem HSA (Humanes Serum Albumin) resuspen­ diert.

Eine Überprüfung der TPO-Konzentration im Überstand gemäß Bei­ spiel 2 zeigte, daß durch diesen Waschschritt kein TPO wieder entfernt wurde, die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten des Präparates sind abgesättigt und somit derart blockiert, daß körpereigenes TPO nicht mehr an diese TPO-Rezeptoren binden sollte.

Beispiel 4 Messung der Thrombozytenfunktion

Als Maß für die Thrombozytenfunktion wurde die Thrombozytenag­ gregation in einem handelsüblichen Aggregometer gemessen.

Beispiel 5 Klinische Untersuchungen

Die TPO-Konzentration wurde jeweils wie in Beispiel 2 beschrie­ ben gemessen, die Messung der Thrombozytenfunktion erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben.

Bezüglich der Thrombozytenaggregation zeigten unbehandelte so­ wie abgesättigte Thrombozyten keine Unterschiede.

Bei Patienten, denen unbehandelte Thrombozytenpräparate verab­ reicht wurden, nahm die Zahl der zirkulierenden Thrombozyten nach einer Stunde ca. um das 3-fache und nach drei Stunden ca. um das 2,5-fache zu, wobei die TPO-Plasmaspiegel signifikant auf ca. 70% (einer Stunde) bzw. ca. 85% (drei Stunden) der Vortransfusionswerte absank. Vergleichbare Ergebnisse zeigten sich, wenn den Patienten gewaschene (siehe Beispiel 3) aber nicht mit MGDF inkubierte Thrombozytenpräparate verabreicht wurden.

Sechs von diesen Patienten erhielten dann bei der nächsten er­ forderlichen Transfusion Thrombozytenpräparationen mit abgesät­ tigten TPO-Rezeptoren gemäß Beispiel 3. Die Zahl der zirkulie­ renden Thrombozyten nahm ebenfalls nach der Transfusion signi­ fikant zu (2-fach nach einer Stunde und 2,3-fach nach drei Stunden), während die entsprechenden TPO-Plasmaspiegel unverän­ dert blieben.

Aufgrund des intraindividuellen Vergleichs konnte gezeigt wer­ den, daß der Erhalt des TPO-Plasmaspiegels auf die Absättigung der TPO-Rezeptoren zurückzuführen ist.

Claims (11)

1. Verfahren zur Aufbreitung eines Präparates von Thrombo­ zyten, dadurch gekennzeichnet, daß die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten derart blockiert werden, daß nach Trans­ fusion des Thrombozytenpräparates eine Bindung von kör­ pereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die TPO-Rezeptoren in vitro mit einer Substanz abgesättigt werden, die an die TPO-Rezeptoren bindet und diese bloc­ kiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler An­ tikörper ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Agonist des TPO-Rezeptors ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz natürliches oder synthetisches Thrombopoetin oder MGDF ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Thrombozyten für eine bestimmte Zeit mit der Substanz inkubiert und die inkubierten Thrombo­ zyten dann ggf. gewaschen werden, um nicht-gebundene Sub­ stanz aus dem Präparat zumindest überwiegend zu entfernen.

7. Thrombozytenpräparat, bei dem die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten blockiert sind.

8. Thrombozytenpräparat, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 aufbereitet wurde.

9. Verfahren zur Behandlung eines an Thrombopenie und/oder Megakaryopenie leidenden Patienten, bei dem zur Erhöhung des Thrombozytenspiegels ein Thrombozytenpräparat trans­ fundiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Trans­ fusion die TPO-Rezeptoren des Thrombozytenpräparates in vitro derart blockiert werden, daß eine Bindung von kör­ pereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.

10. Verfahren zur Behandlung eines einer Strahlen- und/oder Chemotherapie ausgesetzten Patienten, bei dem dem Patien­ ten ein Thrombozytenpräparat verabreicht wird, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die TPO-Rezeptoren des Thrombozytenprä­ parates in vitro derart blockiert werden, daß eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu ver­ hindert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Thrombozytenpräparat das Thrombo­ zytenpräparat aus den Ansprüchen 7 oder 8 ist.