DE69629436T2

DE69629436T2 - Wirkungen auf der endothelauskleidung und behandlung von vasospastischen erkrankungen

Info

Publication number: DE69629436T2
Application number: DE69629436T
Authority: DE
Inventors: Anthony Ernest Bolton; Ernest Davidson Cooke
Original assignee: Vasogen Ireland Ltd
Current assignee: Vasogen Ireland Ltd
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2016-05-04
Also published as: NZ306395A; ES2205026T3; JPH10506636A; EP0768886A1; CA2194485A1; CA2194485C; DE69629436D1; PT768886E; AU721530B2; AU5494496A; DK0768886T3; WO1996034613A1; ATE246929T1; EP0768886B1

Description

Diese Erfindung betrifft die Behandlung von Blutzellen und die Verwendung behandelter, modifizierter Blutzellen im Zusammenhang mit bestimmten abnormalen physikalischen Beschwerden und Krankheitszuständen von Säugetieren. Genauer gesagt, betrifft sie modifiziertes Säugetierblut und modifizierte Säugetierblutzellen, Verfahren zum Gewinnen des modifizierten Säugetierbluts und der Blutzellen sowie die Behandlung vaskulärer Störungen, die mit einer defizienten Endothelfunktion einhergehen, wie etwa vasospastischen Störungen, neben anderen Störungen in einem Säugetier-Patienten, indem dem Patienten derartiges, modifiziertes Blut und derartige, modifizierte Blutzellen verabreicht werden.
Hintergrund der Erfindung
Allgemein anerkannt ist, daß die Kontrolle und Regulation der Durchblutung durch das kardiovaskuläre System eines Säugetiers im Zusammenhang mit kardiovaskulären Störungen, wie etwa einer Arteriosklerose, einer peripheren vaskulären Erkrankung und vielen anderen Durchblutungsstörungen von Bedeutung ist. Es gibt Literatur in zunehmendem Umfang, die darauf hinweist, daß das Endothel eine Hauptrolle bei der Regulation der Durchblutung durch das kardiovaskuläre System spielt. Das Endothel ist eine zelluläre Struktur, welche die Blutgefäße ausgekleidet, wobei es mit der Schicht glatter Muskulatur der Blutgefäßwände kommuniziert. Eine Kontraktion dieser Muskelschicht veranlaßt die Blutgefäße, zu konstringieren (Vasokonstriktion), und eine Relaxation dieser Muskelschicht veranlaßt die Blutgefäße, zu expandieren (Vasodilatation). Ein normal funktionierendes Endothel kontrolliert wirksam die glatten Muskeln der Gefäßwand, indem es Vasodilatatoren und Vasokonstriktoren sezeniert, welche diffundieren oder durch die Muskelfasern transportiert werden, um die Muskelfasern zu veranlassen, entweder zu relaxieren oder zu kontrahieren. Ein derartiger Vasodilatator, der durch das Endothel sezerniert wird, wird allgemein als „endothelium derived relaxing factor" (EDRF) bezeichnet, kürzlich wurde jedoch nachgewiesen, daß es sich um Stickoxid, eine Form davon oder eine nahe verwandte Verbindung handelt. Es wurde festgestellt, daß Stickoxid zusätzlich zum Regulieren der Durchblutung viele weitere Wirkungen im Körper ausübt, einschließlich einer Neurotransmission, einer die glatte Muskulatur im Magen-Darm-Trakt kontrollierenden Funktion, einer sowohl natürlichen als auch Arzneistoff-induzierten Analgesie, einer Rolle bei Impotenz und bei der Tumortoxizität.
Es wird angenommen, daß ein fehlerhaftes Funktionieren des Endothels eines Patienten ein Faktor ist, der vielen kardiovaskulären Erkrankungen, die in Säugetier-Patienten beobachtet werden, zugrunde liegt. Beispielsweise weist ein Patient mit einer Arteriosklerose exzessive Mengen an Lipid, das dem Endothel aufliegt, auf, einschließlich oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte (oxidized low density lipoprotein), das Cholesterin enthält, wobei angenommen wird, daß das Lipoprotein mit dem ordnungsgemäßen Funktionieren der Endothelzellen interferiert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß man ein Aliquot Blut eines Säugetier-Patienten oder die separierten zellulären Fraktionen des Bluts oder Gemische der separierten Zellen, einschließlich der Plättchen, extrakorporal bestimmten Stressoren unterwerfen und in dem Aliquot modifizierte Leukozyten erzeugen kann. Nach der Rückführung des Aliquots in den Körper des Patienten über verschiedene Wege, einschließlich intramuskulärer Injektion, haben die modifizierten Leukozyten bestimmte vorteilhafte Wirkungen. Eine dieser Wirkungen ist die Stimulation der Aktivität eines funktionell defizienten Endothels.
Die modifizierten Leukozyten der vorliegenden Erfindung können gewonnen werden, indem das Aliquot des Patientenbluts oder die separierten Zellfraktionen des Blutes oder Gemische der separierten Zellen, einschließlich der Plättchen, Stressoren unterworfen werden, die ausgewählt sind aus Hitze, ultravioletter Strahlung und oxidativer Umgebung, wie etwa bei einer Behandlung mit Ozon/Sauerstoff-Gemischen, oder jeder Kombination derartiger Stressoren, gleichzeitig oder aufeinanderfolgend.
Gemäß der vorliegenden Erfindung fördert demnach eine ex vivo-Behandlung des Bluts oder der separierten Zellfraktionen des Bluts oder von Gemischen der separierten Zellen, einschließlich der Plättchen, die nachfolgende Entwicklung modifizierter Leukozyten, die sich von den unbehandelten Zellen, die im peripheren Blut normaler Individuen und Patienten vor Erhalt dieser Behandlung gefunden werden, darin unterscheiden, daß sie eine in vivo-Wirkung ausüben.
Die Wirkungen der modifizierten Leukozyten der vorliegenden Erfindung sind, wenn sie in den Körper des Säugetier-Patienten re-injiziert werden, zahlreich. Erstens gibt es eine Wir kung auf andere Leukozyten oder deren Vorläuferzellen, die nicht durch extern verabreichte Stressoren modifiziert worden sind, als ein Ergebnis der Zell-Zell-Kommunikation, ein allgemein anerkanntes Phänomen zwischen Zellen des Immunsystems. Das Ergebnis eines Injizierens des Bluts, das außerhalb des Körpers Stressoren unterworfen wurde, ist die Aufregulation spezifischer Zelloberflächenmarker, wie etwa HLA-DR und CD25, auf andere, nicht behandelte Leukozyten im peripheren Blut, das im Patienten zirkuliert. Dies läßt auf eine verstärkte Reaktion des Immunsystems schließen. Es scheint, daß die behandelten Leukozyten Cytokine (interzelluläre Signalpeptide und -proteine) freisetzen oder Leukozyten des Empfängers stimulieren, dies zu tun, wobei das Phänomen einer Kaskade ausgelöst wird, welche eine ganze Anzahl der ruhenden Leukozyten im peripheren Blut beeinflußt und sie veranlaßt, stimuliert zu werden. Dies führt offensichtlich zu einer verbesserten Durchblutung an Stellen im Körper, die weit entfernt von der Stelle der Injektion der behandelten Leukozyten liegen.
Zweitens wirken die stimulierten Leukozyten, die im Blutkreislauf vorhanden sind, möglicherweise durch die Vermittlung derselben oder ähnlicher Cytokine und wahrscheinlich nach physikalischem Kontakt oder einer Bindung an das Endothel über Zelladhäsionsmoleküle entweder direkt oder indirekt auf das Endothel, die Vasodilatatorfunktion des Endothels zu steigern, wahrscheinlich durch Steigern der Produktion und/oder Wirkung von Vasodilatatoren, wie etwa Stickoxid, Prostacyclin, und/oder durch Hemmen der Produktion und/oder Wirkung von Vasokonstriktoren, damit der Blutfluß zunimmt. Dies kann sich entweder als eine Wiederherstellung der Funktion eines Teils des Endothels, das defekt geworden ist, manifestieren, wobei der Teil nahe bei oder entfernt von der Injektionsstelle ist. Eine derartige Wiederherstellung der Funktion kann durch Reparatur defizienter Zellen oder durch eine erhöhte Rate, mit der beschädigte Zellen ersetzt werden, erfolgen. Sie kann sich auch manifestieren als eine insgesamte Verbesserung der Endothelfunktion. Diese gesteigerte Durchblutung, die das Ergebnis einer verbesserten Endothelvasodilatatorfunktion ist, und der konsequente Anstieg einer Oxigenierung von Geweben indiziert eine Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Patienten mit einer vaskulären Erkrankung, einschließlich jenen mit fortgeschrittener peripherer vaskulärer Erkrankung, jenen mit chronischen varikösen Ulzera und jenen mit einem Risiko, eine Gangrän zu entwickeln, was häufig zur Amputation führt. Allgemein sind die Leukozyten gemäß der vorliegenden Erfindung indiziert zur Verwendung bei der Behandlung jedes Typs von vaskulärer Erkrankung, an der entweder ein partieller oder ein vollständiger Blutgefäßverschluß beteiligt ist, der zu einer behinderten Durchblutung oder einer Dysfunktion des Mechanismus führt, der erforderlich ist, eine adäquate Vasodilatation zu erlauben, damit Gewebe, einschließlich jener des zentralen Nervensystems, von Herz, Lunge, dem Magen-Darm-Trakt, von Leber, Nieren, Plazenta oder den Extremitäten, akut oder chronisch im Hinblick auf Struktur oder Funktion beeinflußt werden.
Kurze Bezugnahme auf die Zeichnungen
1 ist eine Veranschaulichung in Form eines Diagramms der angenommenen Wirkungsweise der injizierten Leukozyten gemäß der vorliegenden Erfindung im Gefäßsystem.
Die 2 und 3 sind graphische Darstellungen der Ergebnisse klinischer Tests bei Verwendung der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel 3 unten beschrieben.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungen
Unter Bezugnahme auf die 1 wird dort in Form eines Diagramms eine Arteriole 10 veranschaulicht. Eine Arteriole ist ein die Blutgefäße bildender Teil des Gefäßsystems im Säugetier, die kleiner ist als eine Arterie und die zirkulierendes Blut von einer Arterie, die vom Herzen gespeist wird, empfängt. Arteriolen nehmen in ihrer Größe in Richtung stromabwärts allmählich ab. Von einer Metarteriole 12, die ein kleinerer terminaler Ast der Arteriole 10 ist, wird gezeigt, daß sie von der Arteriole 10 abzweigt. Metarteriolen, wie etwa 12, führen zu Kapillaren, welche den Ort des Nährstoff- und Gasaustauschs zwischen dem Blut und den Geweben darstellen, wobei Sauerstoff vom Blut in die Gewebe diffundiert und Kohlendioxid aus den Geweben ins Blut diffundiert. Die Arteriole 10 ist mit einer Endothelzellschicht aus Endothel 14 ausgekleidet. Das Äußere des Arteriolen-Endothels 14 ist von einer Schicht glatter Muskulatur 18 umgeben, die sich kontrahieren oder expandieren kann, um Veränderungen in der Größe der Arteriole 10 hervorzurufen, wobei entweder eine Vasodilatation verursacht wird, um die Menge an Blut, die hindurchfließt, zu steigern, oder eine Vasokonstriktion, um die Menge an hindurchfließendem Blut zu reduzieren. Die Metateriole 12 ist auf ähnliche Weise mit Endothel 16 ausgekleidet und weist eine Einzelschicht glatter Muskulatur 19 auf, die ähnlich funktioniert.
Wie im Fall all der anderen Blutgefäße im Körper unterschiedlicher Größe sind Kapillaren mit Endothel ausgekleidet. Allerdings gibt es keine glatte Muskelschicht, die mit den Kapillaren in Verbindung steht.
Gemäß dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Aliquot Blut oder die separierten Zellfraktionen des Bluts oder Gemische der separierten Zellen, einschließlich der Plättchen, dem Patienten entnommen und mit bestimmten Stressoren, die unten genauer beschrieben werden, behandelt. Die Wirkung der Stressoren ist, die Leukozyten in dem Aliquot zu modifizieren. Diese modifizierten Leukozyten 20 werden gemeinsam mit dem Rest des Aliquots intramuskulär re-injiziert und nach einer Zeit von unsicherer und wahrscheinlich variabler Dauer im Muskel erhalten sie wahrscheinlich Eintritt in den allgemeinen Blutkreislauf, indem sie die Blutgefäßwand passieren, wo eine Vermischung mit dem Blut erfolgt. Stromabwärts von dem Eintrittspunkt 22 wird das Blut deshalb modifizierte Leukozyten 20 zusätzlich zu unmodifizierten Leukozyten 24, roten Blutkörperchen 26 und Plättchen 28 ebenso wie anderen Komponenten enthalten.
Die Injektion modifizierter Leukozyten 20 scheint eine Reihe unerwarteter Wirkungen auf die Arteriole 10 und auf das Blut, das durch sie hindurchfließt, zu haben. Eine Wirkung ist die Stimulation ruhender Leukozyten 24, die den Stressoren außerhalb des Körpers nicht ausgesetzt waren, sich in stimulierte Leukozyten 30 zu verwandeln. Dieser Aktivierungsprozess kann an anderen Orten als den Blutgefäßen auftreten, beispielsweise in Organen des Immunsystems, wie etwa Lymphknoten, Milz oder Knochenmark, und kann Leukozyten-Vorläuferzellen zusätzlich zu oder alternativ zu reifen Leukozyten einschließen. Damit wird der Mechanismus einer Kaskade in Gang gesetzt. Angenommen wird, daß dies durch die Sekretion bestimmter Cytokine 32 bewirkt wird, deren genaue Natur unsicher ist, entweder aus den modifizierten Leukozyten 20 selbst oder durch die Stimulation endogener Leukozyten 30 durch direkte Zell-Zell-Interaktion. Diese Mechanismen dienen dazu, eine Stimulation von zuvor ruhenden Leukozyten oder Vorläuferzellen zu bewirken, um die stimulierten Leukozyten 30 zu erzeugen. Die stimulierten Leukozyten 30 adhärieren wahrscheinlich an die beschädigten Endothelzellen über Zelladhäsionsmoleküle, wie etwa ICAM-1, das auf den Endothelzellen exprimiert wird, die mit aktiviertem LFA-1 interagieren, das auf bestimmten aktivierte Leukozyten exprimiert wird. Andere Cytokine 34, die möglicherweise von diesen adhärenten Leukozyten stammen und die tatsächlich dieselben Cytokine 32 oder davon verschieden sein können, treten mit dem Endothel 14 in Kontakt und veranlassen es, Vasodila tatoren 36 zu sezernieren, welche die Wirkung haben, die glatte Muskulatur 18 zu relaxieren, um einen Grad an Vasodilatation zu verursachen. Andere Sekretionen 38, die von dem Endothel 14 durch die Cytokine 34 freigesetzt werden, welche dieselben Substanzen oder Mischungen von Substanzen wie die Vasodilatatoren 36 oder davon verschieden sein können, treten mit den Plättchen 28 in Kontakt und haben die Wirkung, deren Fähigkeit, zu aggregieren, zu hemmen. Während die beigefügte Figur in Form eines Diagramms Wirkungen des Endothels am Endothel einer Arteriole des Gefäßsystems veranschaulicht, scheint es, daß das Verfahren der Erfindung eine ähnliche Wirkung auf Endothelzellen auf allen Stufen des Gefäßbaums aufweist.
Es wird angenommen, daß eine der Komponenten der Vasodilatatoren 36 und eine der Komponenten der Sekretionen 38 EDRF (endothelium derived relaxing factor) ist, wahrscheinlich Stickoxid oder nah verwandte Substanzen, und daß eine zweite Komponente Prostacyclin ist. Alternative oder zusätzliche Quellen von Stickoxid und/oder anderen Vasodilatatoren, die aus einer Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung stammen, können stimulierte Leukozyten sein, die in der Zirkulation vorhanden sind, oder stimulierte Plättchen, die in der Zirkulation vorhanden sind.
Die Stressoren, welchen die Leukozyten gemäß der Erfindung ex vivo ausgesetzt werden, sind ausgewählt aus Temperatur-Streß (Bluttemperaturen ober- oder unterhalb der Körpertemperatur), einer oxidativen Umgebung und Ultraviolett-Strahlung, einzeln oder in jeder Kombination, gleichzeitig oder nacheinander. Die Leukozyten werden den Stressoren als ein Teil eines Aliquots von Säugetierblut oder der separierten Zellfraktionen des Bluts oder Gemischen der separierten Zellen, einschließlich der Plättchen, unterworfen, wobei das Aliquot dem Patienten entnommen wurde, dem es nach Behandlung mit den Stressoren zu injizieren ist. Geeigneterweise hat das Aliquot ein Volumen von ungefähr 0,1 bis 100 ml, vorzugsweise 5–15 ml, wobei ein am meisten bevorzugtes, typisches Aliquot ein Volumen von 10 ml aufweist.
Gemäß der Erfindung wird bevorzugt, das zu behandelnde Aliquot allen drei der zuvor genannten Stressoren gleichzeitig auszusetzen, um die entsprechende Modifikation einer ausreichenden Anzahl von Leukozyten sicherzustellen. Es muß dafür Sorge getragen werden, daß nicht ein exzessives Ausmaß der Stressoren angewendet wird, in dem Ausmaß, daß die Zellen oder irgendwelche ihrer Teile irreparabel geschädigt werden oder daß die Zellmembran veranlaßt wird, aufzureißen.
Der Temperatur-Stressor muß, wenn er angelegt wird, das Aliquot flüssig halten und sollte es nicht über 55°C erhitzen, aus Furcht vor einer Schädigung der Zellen. Vorzugsweise erwärmt der Temperatur-Stressor das zu behandelnde Aliquot auf eine Temperatur über der normalen Körpertemperatur, d. h. auf ungefähr 37–55°C, und am meisten bevorzugt auf ungefähr 40– 50°C.
Der Stressor einer oxidativen Umgebung kann die Verabreichung von flüssigen oder gasförmigen oxidierenden Agenzien an das Aliquot sein. Vorzugsweise schließt sie ein Exponieren des Aliquots gegenüber einer Mischung aus medizinisch reinem Sauerstoff und Ozongas ein, besonders bevorzugt durch Einleiten eines Stroms von medizinisch reinem Sauerstoffgas mit Ozon als einer minderen Komponente darin in dem zuvor erwähnten Temperaturbereich in das Aliquot. Geeigneterweise weist der Gasstrom einen Ozongehalt von ungefähr 1,0–100 μg/ml, vorzugsweise 3–70 μg/ml und am meisten bevorzugt ungefähr 5–50 μg/ml auf. Der Gasstrom wird dem Aliquot mit einer Rate von ungefähr 0,01–2,0 l/min, vorzugsweise von ungefähr 0,05–5,0 l/min und am meisten bevorzugt bei ungefähr 0,06 l/min (STP) verabreicht.
Der Stressor ultraviolette Strahlung wird geeigneterweise durch Bestrahlen des zu behandelnden Aliquots mit einer entsprechenden UV-Strahlungsquelle angelegt, während das Aliquot bei der zuvor genannten Temperatur gehalten wird und während das gasströmige Sauerstoff/Ozon-Gemisch in das Aliquot eingeleitet wird. Geeignete UV-Quellen sind UV-Lampen, die Wellenlängen im C-Band emittieren, d. h. bei Wellenlängen, die kürzer als ungefähr 280 nm sind. Ultraviolette Strahlung, die den Standard UV-A- und UV-B-Quellen entspricht, kann ebenfalls verwendet werden. Emissionen bei einer Wellenlänge von 253,7 nm sind besonders geeignet. Eine angemessene Dosis einer solchen UV-Strahlung, die gleichzeitig mit den zuvor genannten Stressoren Temperatur und oxidative Umgebung verabreicht wird, wird von Lampen mit einer Leistung von ungefähr 15 bis ungefähr 25 Watt bei der gewählten UV-Wellenlänge erhalten, die derart angeordnet sind, daß sie den Probenbehälter, der das Aliquot hält, umgeben, wobei jede Lampe eine Intensität bei einer Entfernung von 1 Meter von ungefähr 45–65 mW/cm² liefert. Bis zu acht solcher Lampen, welche die Probenflasche umgeben, mit einer kombinierten Leistung bei 253,7 nm von 15–25 Watt, betrieben bei einer Intensität, die eine UV-Licht-Gesamtenergie an der Oberfläche des Bluts von ungefähr 0,025–10, vorzugsweise ungefähr 0,1–0,5 Joules/cm² liefert, können vorteilhafterweise angewendet werden. Eine derartige Behandlung macht ein Aliquot zur sofortigen Re-Injektion in den Patienten verfügbar, das stimulierte Leukozyten gemäß der Erfindung in entsprechenden Mengen enthält, um die oben aufgeführten Wirkungen zu verursachen.
Die Zeit während der das Aliquot den Stressoren ausgesetzt ist, liegt normalerweise im Bereich von 0,5–60 Minuten. Dies hängt bis zu einem gewissen Ausmaß von der gewählten Intensität der UV-Strahlung, der Temperatur und der Konzentration des oxidierenden Agens und der Rate, mit der das oxidierende Agens dem Aliquot verabreicht wird, ab. Je härter die Stressoren, denen das Aliquot ausgesetzt wird, umso kürzer wird im allgemeinen die Zeit sein, die sie angelegt werden müssen. Auf Seiten des Experimentators kann etwas Experimentieren notwendig sein, um optimale Zeiten zu etablieren, nachdem die anderen Stressor-Ausmaße festgesetzt worden sind. Unter den meisten Stressor-Bedingungen werden die bevorzugten Zeiten in einem angemessenem Bereich von ungefähr 2–5 Minuten und normalerweise bei ungefähr 3 Minuten liegen. Die Ausgangstemperatur des Bluts und die Rate, mit der das Blut auf eine vorbestimmte Temperatur erwärmt oder abgekühlt werden kann, neigt dazu, von Patient zu Patient zu variieren.
In der Praxis des bevorzugten Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann das Aliquot Blut (oder die separierten Zellfraktionen des Bluts oder Gemische der separierten Zellen, einschließlich der Plättchen, wobei diese verschiedenen Leukozyten-enthaltenden Kombinationen neben Vollblut vorzugsweise durchgängig gemeinsam als das „Aliquot" bezeichnet werden) mit den Stressoren unter Verwendung einer Apparatur von dem Typ, wie im US-Patent 4,968,483 von Mueller beschrieben, behandelt werden. Das Aliquot wird in einen geeigneten sterilen, strahlendurchlässigen Behälter gestellt, der dann in die Maschine eingepaßt wird. Die Temperatur des Aliquots wird auf den vorbestimmten Wert, z. B. 42,5°C, eingestellt und die UV-Lampen werden für eine festgelegte Zeitdauer angestellt, um eine Stabilisierung der Leistung der UV-Lampen zu erlauben, bevor der Gasstrom, der den oxidativen Streß erzeugt, an das Aliquot angelegt wird. Dann wird das Sauerstoff/Ozon-Gasgemisch bekannter Zusammensetzung und kontrollierter Flußrate dem Aliquot für die vorbestimmte Zeitdauer von 0,5–60 Minuten, vorzugsweise 2–5 Minuten und am meisten bevorzugt ungefähr 3 Minuten, wie oben diskutiert, verabreicht, damit das Aliquot alle drei Stressoren gleichzeitig erfährt. Auf diese Weise werden entsprechend modifizierte Leukozyten gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Anzahl erzeugt, die ausreicht, um die gewünschten Effekte zu erzielen.
Ein weiteres Kennzeichen der modifizierten Leukozyten der vorliegenden Erfindung ist ihre Fähigkeit, nach Re-Injektion im Blutstrom des Patienten stimulierte Leukozyten zu erzeugen, die eine Zunahme an Aktivierungsmarkern, beispielsweise CD-25 (IL-2-Rezeptor), Ber-Mac 3 und HLA-DR (T-Zell- und Monozyten-Aktivierung) aufweisen. Diese Zelloberflächenmarker sind Oberflächenproteine, deren Mengen durch Injektion der modifizierten Leukozyten, die unter Verwendung der Stressoren des bevorzugten Verfahrens der vorliegenden Erfindung, d. h. Temperatur, eine oxidierende Umgebung und UV-Strahlung, hergestellt wurden, erhöht sind. Sie können durch Färbetechniken und die Verwendung konventioneller monoklonaler Antikörper-Techniken quantifiziert werden.
Die richtige Funktion des Endothels eines Patienten an einer bestimmten Stelle oder das Fehlen dieser Funktion kann unter Verwendung eines Verfahrens überprüft werden, welches die iontophoretische Einführung von Acetylcholin durch die Haut und die Messung von dessen Wirkung auf oberflächliches Blut an der ausgewählten Stelle einschließt.
Acetylcholin, das einem Blutgefäß zugesetzt wurde, das intaktes, richtig funktionierendes Endothel aufweist, stimuliert die Produktion und Sekretion von Stickoxid durch das Endothel. Das auf diese Weise produzierte Stickoxid wirkt als ein Vasodilatator und veranlaßt die glatten Muskelzellen, zu relaxieren. Die Wirkung einer solchen Vasodilatation kann durch Messung des Blutflußes im Gefäß, z. B. durch Laser-Durchflußmessung nach Doppler, quantifiziert werden. Wenn jedoch das Endothel des Patienten einen größeren funktionellen Defekt aufweist, kann das Acetylcholin direkt an den glatten Muskeln selbst wirken und sie veranlassen, sich zu kontrahieren, was zu einer Vasokonstriktion führt, der gegenteiligen Wirkung, die zu beobachten ist, wenn das Endothel des Patienten normal funktioniert.
Die endotheliale Funktion kann dementsprechend folgendermaßen klinisch untersucht werden. Acetylcholin wird auf die Haut des Patienten aufgetragen und ein schwacher elektrischer Strom wird durch die Haut zwischen zwei angrenzenden Elektroden, von denen eine positiv und eine negativ geladen ist, geleitet (Iontophorese). Acetylcholin, das ein geladenes Molekül ist, passiert mit dem Strom die Haut und gelangt zu den unmittelbar unter der Hautoberfläche liegenden oberflächlichen Blutgefäßen. An dieser Stelle wirkt das Acetylcholin auf die Endothelzellen der Blutgefäße, wodurch sie angeregt werden, EDRF (z. B. Stickoxid) zu produzieren, was zu einer Vasodilatation (Endothel-abhängige Vasodilatation) und zu einer Zu nahme der Durchblutung führt, die beispielsweise durch Laser-Durchflußmessung nach Doppler gemessen wird. Diese Technik ist allgemein bekannt, z. B. siehe Chowienczyk et al., „Impaired endothelium-dependent vasodilation of forearm resistance vessels in hypercholesterolaemia", The Lancet, Vol. 340, December 12, 1992, S. 1430.
Eine speziell bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung oder zumindest eine Linderung der Symptome der Erkrankungen vom vasospastischen Typ, wie durch das Raynaud-Phänomen und andere vasospastische Störungen, wie etwa Migräne, Cluster-Kopfschmerz und Syndrom X, veranschaulicht. Das Raynaud-Phänomen ist ein Zustand, in dem die Finger und/oder Zehen eine Reihe von Farbänderungen durchlaufen, nämlich weiß (Vasospasmus), dann blau (kapilläre Stagnation), dann rot (arterielle Dilatation), was verschieden lang andauert und unterschiedlich häufig und mit oder ohne Schmerzen auftritt. Raynaud-Krankheit oder primäres Raynaud-Syndrom ist die Bezeichnung für das Raynaud-Phänomen in Abwesenheit einer anderen nachweisbaren Erkrankung. Raynaud-Syndrom oder sekundäres Raynaud-Syndrom ist die Bezeichung für das Raynaud-Syndrom, das mit anderen Erkrankungen einhergeht.
Während ein Raynaud-Syndrom selbst nicht lebensbedrohend ist, kann es zum Beginn anderer pathologischer Beschwerden führen, und bis heute ist keine wirksame Heilung in allgemeine Praxis umgesetzt worden. Ein Patient, der an einem Raynaud-Syndrom leidet, muß einfach den damit verbundenen Schmerz und die Unannehmlichkeiten ertragen. Bei einem kleinen Teil der Fälle kann die Ischämie in den Fingern und Zehen, die das Ergebnis eines extremen Vasospasmus ist, zur Ulkusbildung der Haut und einer Gangrän führen, was zur Amputation führen kann. Das Raynaud-Phänomen kann Patienten praktisch jeden Alters treffen und betrifft ungefähr viermal so viele Frauen wie Männer.
Im Fall aller Patienten, an denen die Behandlung bisher angewendet wurde, ist im Anschluß an eine oder mehrere Behandlungen gemäß dem Verfahren der Erfindung, verteilt auf geeignete Intervalle, eine dramatische Linderung der Symptome des Raynaud-Phänomens festzustellen gewesen. Iontophoretische Messungen, die im Bezug auf die Durchblutung der Patienten vor und nachdem diese die Behandlung gemäß der Erfindung durchlaufen hatten, durchgeführt wurden, haben eine Steigerung der endothelialen Leistungsfähigkeit in den betroffenen Patienten und eine Linderung der Symptome des Raynaud-Phänomens gezeigt.
Von einem anderen Aspekt aus macht die vorliegende Erfindung folglich ein Aliquot autologes menschliches Blut zur Verabreichung an einen Patienten verfügbar, um das Raynaud-Phänomen des Patienten zu lindern, wobei das Aliquot autologes Blut in vitro mindestens einem Stressor, ausgewählt aus Hitze, UV-Strahlung und einem Ozon/Sauerstoff-Gemisch, ausgesetzt worden ist, um die darin enthaltenen Leukozyten in dem Ausmaß zu stimulieren, daß nach Re-Injektion in den Patienten eine signifikante Steigerung der endothelialen Funktion mit dem Ziel, eine Vasodilatation zu verursachen, festzustellen ist.
Die Erfindung wird weiter veranschaulicht und beschrieben unter Bezugnahme der folgenden speziellen Beispiele.
BEISPIEL 1
Ein Patient, der unter einer primären Raynaud-Krankheit litt, wurde unter sorgfältig kontrollierten klinischen Bedingungen einer Kur gemäß der vorliegenden Erfindung unterzogen. Jede Behandlung, die dem Patienten verabreicht wurde, umfaßte die Entnahme eines kleinen Aliquots Blut des Patienten, seine Exponierung gegenüber Stressoren ex vivo und Rückführung des behandelten Aliquots Blut an den Patienten, wie durch die Erfindung beschrieben. Die Kur, die dem Patienten verabreicht wurde, umfaßte zehn derartiger einzelner Behandlungen, wobei eine täglich über einen Zeitraum von ungefähr zwei Wochen verabreicht wurde. Die Raynaud-Krankheit ist eine Störung, die mit peripherem Vasospasmus und unzureichender Durchblutung der Extremitäten des Körpers des Patienten, wie etwa den Fingern, verbunden ist, anfänglich charakterisiert durch eine ausgeprägte Fahlheit der Finger bei Exposition gegenüber Kälte, häufig gefolgt von einer anschließenden Phase einer Zyanose (blau-rote Färbung), und eine Verlangsamung der Wiederherstellung der Durchblutung, nachdem die Kälteeinwirkung aufhört.
Die Versuchsperson dieses Experiments war eine weibliche Patientin im Alter von ungefähr 24 Jahren, die seit mindestens 10 Jahren an einer primären Raynaud-Krankheit litt, wobei die Finger beider Hände erheblich betroffen waren. Bevor die Kur gemäß der Erfindung begonnen wurde, wurde die Durchblutung in den oberflächlichen Blutgefäßen der Finger als Antwort auf die Einwirkung von leichtem Kälte- und Wärme-Streß auf die Hand durch Laser-Durchflußmessung nach Doppler und Photoplethysmographie gemessen. Die Temperatur der Hautoberfläche der Finger wurden ebenfalls durch ein thermographisches Verfahren als Ant wort auf Wärme- und Kälte-Streß der Hände gemessen. Die Durchblutung als Antwort auf eine iontophoretische Einführung von Acetylcholin wurde durch Laser-Durchflußmessung nach Doppler gemessen, bevor die Kur begonnen wurde.
10 ml Patientenblut wurden einer Armvene entnommen, antikoaguliert und in einer sterilen Probenflasche gesammelt. Diese Probe wurde Hitze-, UV-Strahlung- und oxidierenden (Sauerstoff/Ozongemisch) Stressoren gemäß dem Verfahren der Erfindung in einer Apparatur, wie allgemein in dem zuvor erwähnten US-Patent 4,968,483 von Mueller dargestellt, ausgesetzt. Die Blutprobe wurde auf 42,5°C erhitzt und es wurde ihr UV-Strahlung der Wellenlänge 253,7 verabreicht. Nachdem die erforderliche Temperatur (42,5°C) erreicht worden war, wurde ein Gasgemisch aus medizinisch reinem Sauerstoff mit einem Ozongehalt von 12,5 Mikrogramm pro ml mit einer Gasdurchflußrate von ungefähr 60 ml/min drei Minuten lang in die Probe eingeleitet.
Nachdem die ex vivo-Behandlung der Blutprobe gemäß dem vorliegenden Verfahren der Erfindung beendet worden war, wurde die Probe in den Gesäßmuskel der Patientin re-injiziert. Kurz nachdem die Kur von 10 Behandlungen über einen Zeitraum von zwei Wochen abgeschlossen war, berichtete die Patientin von einer Linderung ihrer Symptome der Raynaud-Krankheit. Der verbesserte Zustand hielt für mindestens zwei Monate nach Abschluß der Kur an.
Die Messungen der Hauttemperatur und der Durchblutung als Antwort auf Wärme- und Kälte-Streß und die Durchblutung nach iontophoretischer Einführung von Acetylcholin wurden nach der Kur gemäß der Erfindung wiederholt. Die Antworten auf Wärme- und Kälte-Streß spiegelten eine Antwort wider, die nach der Behandlung eher normal war als davor. Die Antwort der Durchblutung auf Acetylcholin war nach der Behandlung gesteigert, was einen Anstieg der Fähigkeit des Endothels, nach der Behandlung Vasodilatatoren zu produzieren, anzeigt. Alle diese Messungen zeigten Anzeichen eines Anstiegs der peripheren Durchblutung nach der Behandlung zusammen mit der Linderung der Symptome einer Raynaud-Krankheit.
Die Bildung von erhöhten Konzentrationen an Prostacyclin im Blut der behandelten Patienten ist ebenfalls eine Wirkung, die aus der Einwirkung von Streß ex vivo auf die Blutzellen auf die beschriebene Weise gemäß der vorliegenden Erfindung folgt. Eine Verbesserung der Wirkungen eines geschädigten Endothels mit deren konsequenter Linderung abnormaler Be schwerden, die damit verbunden sind, wie etwa vasospastische Störungen, wie sie bei der Raynaud-Krankheit zum Ausdruck kommen, ist nur eine von mehreren vorteilhaften Wirkungen, die sich wahrscheinlich von einer korrekten medizinischen Anwendung der Verfahren, Techniken und Aspekte einer Bildung modifizierter Leukozyten der vorliegenden Erfindung ableiten.
BEISPIEL 2
Vier Patientinnen einschließlich der Versuchsperson aus Beispiel 1, Frauen im Alter von 15 bis 84 Jahren, die alle an einem primären Raynaud-Phänomen litten, wurden einer Kur gemäß der vorliegenden Erfindung unterzogen. Die Behandlung wurde durch qualifiziertes Fachpersonal in einem medizinischen Krankenhaus ambulant vorgenommen.
Jede Behandlung, die einer Patientin verabreicht wurde, umfaßte die Entnahme eines Aliquots von 10 ml des Bluts der Patientin, Erhitzen der Probe auf 42,5°C und ihre Exposition gegenüber UV-Strahlung bei einer Wellenlänge von 253,7 nm in einer Apparatur, wie allgemein im zuvor erwähnten US-Patent 4,968,483 von Mueller beschrieben. Nachdem die erforderliche Temperatur (42,5°C) erreicht worden war, wurde ein Gasgemisch aus medizinisch reinem Sauerstoff mit einem Ozon-Gehalt von 12,5 Mikrogramm pro ml mit einer Gasdurchflußrate von ungefähr 60 ml/min drei Minuten lang in die Probe eingeleitet.
Nachdem die ex vivo-Behandlung der Blutprobe auf diese Weise abgeschlossen war, wurde die Probe der jeweiligen Patientin in den Gesäßmuskel re-injiziert. Jede Patientin durchlief eine Kur von zehn derartigen Behandlungen über einen Zeitraum von zwei bis vier Wochen, wobei die einzelnen Behandlungen im Abstand von ungefähr 1–3 Tagen erfolgten.
Subjektiv berichtete jede Patientin von einer sehr ausgeprägten Linderung ihrer Raynaud-Symptome nach Abschluß der Kur. Dieser Zustand einer Besserung hielt mindestens zwei Monate nach Abschluß der Kur an. Im Fall der 14 jährigen Patientin verhielt es sich so, daß sie anfänglich als Teil der Raynaud-Symptome kleine, langsam heilende Ulzerationen der Füße um die Zehen herum zeigte. Diese waren am Ende der Kur von 10 Behandlungen alle abgeheilt. Die 84 jährige Patientin wies anfänglich erkennbar ungeformte Fingernägel in den Nagelbetten auf, was die Folge einer verminderten Nährstoffversorgung und einer verminderten Versorgung mit Sauerstoff war, verursacht durch dortiges Fehlen einer Blutzirkulation.
Am Ende der Kur hatte ein erneutes Wachstum der Nägel aus dem Nagelbett eingesetzt und war eindeutig sichtbar.
BEISPIEL 3
Im Fall jeder Patientin wurden vor und nach der Kur objektive Messungen der Durchblutung mit Hilfe des iontophoretischen Verfahrens unter Verwendung von Acetylcholin, wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Die iontophoretischen Anwendungen und Messungen wurden an den Unterarmen der Patientinnen vorgenommen. Die ersten Messungen wurden an jeder Patientin unmittelbar vor der ersten Behandlung (d. h. während Konsultation 1) vorgenommen. Die anschließenden Messungen wurden alle einen Tag nach Abschluß der Kur von 10 Behandlungen (d. h. während Konsultation 11) und noch einmal auf der Grundlage einer Nachuntersuchung zwei oder drei Wochen später (d. h. während Konsultation 12) vorgenommen. Eine der vier Patientinnen erhielt eine zweite, anschließende Kur von fünf weiteren Behandlungen. Die Durchblutung wurde durch Laser-Durchflußmessung nach Doppler gemessen, um einen Hinweis auf eine Vasodilatation zu erhalten.
Bei jeder Messung wurde ein Reservoir, das Acetylcholin enthielt, am Arm der Patientin befestigt, wobei das Acetylcholin mit der Haut der Patientin in Kontakt war. In das Reservoir wurden Elektroden eingeführt, damit ein Strom von bekannter, aber variabler Größe an das Reservoir angelegt werden konnte, um eine iontophoretische Wirkung auszuüben. Die Dosis an Acetylcholin, die der Haut verabreicht wurde, stellte eine Funktion der Zeit des Acetylcholin-Haut-Kontakts und der Spannung, die zwischen den Elektroden angelegt wurde, dar, wodurch sich eine Dosis in willkürlichen Einheiten ergab.
2 der beigefügten Zeichnungen zeigt eine graphische Darstellung der beobachteten Durchblutung, gemessen mittels der Laser-Doppler-Technik, gegen die Dosierung in willkürlichen Einheiten, bestimmt wie oben beschrieben, für eine repräsentative Patientin. Die Dauer der Iontophorese wurde willkürlich in mehrere gleiche Zeitintervalle oder -epochen aufgeteilt. Der mittlere Durchfluß zu jeder Epoche ist gegen die Zeit aufgetragen, wobei der Mittelwert zu jedem mittleren Zeitpunkt jeder Epoche aufgetragen wurde. Die durch Kreise gekennzeichnete Kurve ist diejenige, die aus einer Untersuchung erhalten wurde, die vor der ersten Behandlung, d. h. bei der ersten Konsultation der Patientin, durchgeführt wurde. Wie gezeigt wird, steigt die Durchblutung auf eine allgemein sigmoidale Weise mit der Zunahme der Acetylcholin-Dosierung (Funktion der Kontaktzeit und der angelegten iontophoretischen Spannung) an. Die durch Dreiecke bezeichnete Kurve ist diejenige, die auf ähnliche Weise bei der 11. Konsultation der Patientin erhalten wurde, einen Tag nach der Beendigung der Kur von 10 Behandlungen. Die durch Quadrate bezeichnete Kurve ist diejenige, die bei der 12. Konsultation der Patientin erhalten wurde, 28 Tage nach der 11. Konsultation. Tatsächlich sind dieses Dosis-Antwort-Kurven. Ein signifikanter Anstieg der Durchblutung als Antwort auf Acetylcholin, der eine verbesserte Endothelfunktion nach der Kur anzeigt, ist diesen Kurven eindeutig zu entnehmen.
Der Verlauf der jeweiligen Kurven zeigt an, daß zunehmende Dosen von Acetylcholin zunehmende Durchblutungswerte verursachen, bis hin zum Ausmaß eines Plateaus in jedem Fall. Dies wird durch die Tatsache erklärt, daß das Acetylcholin die Produktion und Sekretion des Vasodilatators Stickoxid (EDRF) durch das Endothel stimuliert, und daß sich das Endothel normal verhält.
Alle vier der behandelten Patientinnen zeigten im wesentlichen ähnliche Ergebnisse, wobei die in 2 gezeigten repräsentativ sind und von einer einzelnen Patientin stammen. 3 der beigefügten Zeichnungen zeigt ähnliche Kurven wie 2, leitet sich jedoch von den Mittelwerten der gemessenen Durchblutung von allen vier Patientinnen ab. Wie im Fall der Kurven einer Patientin in 2 sind die durch Kreise bezeichnete Kurven mittlere Durchblutungswerte der vier Patientinnen bei verschiedenen, zunehmenden Dosen von Acetylcholin vor der ersten Behandlung. Die durch Dreiecke bezeichneten Kurven sind mittlere Werte vom ersten Tag nach Abschluß der Kuren. Die durch Quadrate bezeichneten Kurven sind mittlere Werte vom 28. Tag nach dem Abschluß der Kuren. Der Trend der Dosis-Antwort ist aus den in 3 gezeigten Kurven klar offensichtlich.
BEISPIEL 4
Die Werte der Iontophorese, die für alle vier Patientinnen erhalten wurden, wie oben beschrieben, wurden einer statistischen Analyse unterzogen, wobei die Werte von jeder der vier Patientinnen, die vor irgendeiner Behandlung erhalten wurden, und die Werte, die für alle vier Patientinnen zwei bis drei bis vier Wochen nach Beendigung der Kur von zehn Behandlungen (Konsultation 12) erhalten wurden, verwendet wurden.
Wie oben erwähnt, wird zum Erhalten der in 2 gezeigten Kurven der mittlere Durchfluß in jeder Epoche gegen die Zeit aufgetragen, wobei der Mittelwert zu jedem mittleren Zeitpunkt jeder Epoche aufgetragen wird. Da die graphischen Darstellungen zeigen, daß der Durchfluß auf eine sigmoidale Weise ansteigt, wurde die Steigung des Anstiegs für jeden Fall berechnet, wobei die mittleren Durchflüsse der Epoche, in der eine Kurve anzusteigen beginnt, bis zu dem Punkt, wo die Kurve beginnt, asymptotisch zu werden, verwendet wurden. Die Regressionsanalysen, die verwendet wurden, um diese Steigungen zu berechnen, ergaben alle mehr als 85% Variation und wurden deshalb als sehr gut übereinstimmend beurteilt. Auch wurde die gesamte Fläche unterhalb der Kurve (area under the curve, AUC) von dem Punkt aus, wo die Kurve anzusteigen beginnt, bis zu Epoche 10 berechnet. Der aufgezeichnete maximale mittlere Durchfluß und die Fläche unter der Kurve während Epoche 11 wurden ebenfalls analysiert.
Tabelle 1 faßt diese Ergebnisse zusammen. Sie zeigt, daß der Anstieg des Durchflusses als Antwort auf Acetylcholin nach einer Behandlung größer war, da der maximale Durchfluß, die AUC während des Anstiegs und die AUC in Epoche 11 zu einem statistisch signifikanten Ausmaß nach einer Behandlung höher waren, sogar auf der Grundlage von vier Patientinnen (wobei der Wert p 0,012, 0,020 bzw. 0,040 beträgt). Die Kurvensteigung war ebenfalls größer, jedoch nicht derart signifikant.
BEISPIEL 5
Neunzehn normale, gesunde Freiwillige, 15 Männer und 4 Frauen im Alter zwischen 20 und 30 Jahren wurden in die Studie einbezogen. Sie wurden blind zwei Gruppen zugeordnet, wobei 14 (10 Männer, 4 Frauen) die Behandlung erhielten, während die verbleibenden 5 Männer die Kontrollgruppe bildeten. Die Freiwilligen mußten sich während der Studie des Rauchens enthalten und vermeiden, Arzneimittel einzunehmen, die wahrscheinlich die Plättchenfunktion beeinflussen, wie durch die Britische Gesellschaft für Hämatologie (1988) empfohlen. Den Versuchspersonen wurde durch Venenpunktion Blut abgenommen und 10 ml ihres eigenen Bluts bei fünf Gelegenheiten während eines Zeitraums von zwei Wochen re-injiziert. Folglich wurden die Injektionen in Intervallen von 2–3 Tagen gemäß dem folgenden Protokoll verabreicht:
Die Versuchspersonen in der Behandlungsgruppe erhielten fünf intramuskuläre (Gesäßmuskel) Injektionen von 10 ml autologem Blut, das wie in Beispiel 1 oben beschrieben behandelt worden war. Die Versuchspersonen, die der Kontrollgruppe zugeordnet waren, erhielten Re-Injektionen von 10 ml ihres eigenen unbehandelten Bluts und die Studie wurde blind durchgeführt, insofern, als weder den Versuchspersonen oder den leitenden Ärzten, noch dem Laborpersonal, das die Analysen durchführte, bekannt war, welcher Gruppe eine Person zugeteilt worden war.
Die Prostacyclin-Konzentrationen im peripheren Blut wurden anhand der Plasma-Konzentration seines stabilen Metaboliten 6-Keto-Prostaglandin F1α gemessen (Wu et al., „Journal of Clinical Investigation" 75: 168–174, 1985), wobei ein kommerziell erhältlicher Radioimmuntest von Amersham International, U.K., verwendet wurde. Die Leukozyten- Oberflächenmarker CD25 (die α-Untereinheit des IL-2-Rezeptors), das MHC-Klasse 2-Antigen HLA-DR und der Monozyten-spezifische Marker Ber-Mac 3 wurden bei mononukleären Zellen (Monozyten, T-Zellen und B-Zellen), die durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert worden waren, bestimmt, wobei eine immunzytochemische Färbung mit kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörpern verwendet wurde. Die Quantifizierung von CD25-, HLA-DR- und Ber-Mac 3-positiven Zellen wurde mikroskopisch unter manuellem Zählen durchgeführt, und die Zahlen wurden als Prozent der leukocyte common antigen-positiven (CD45⁺) Zellen ausgedrückt.
Statistische Analysen: Die Signifikanz wurde unter Verwendung des Student-T-Test für gepaarte Werte durchgeführt, um die Werte nach der Behandlung mit den Werten vor der Behandlung zu vergleichen. Die Ergebnisse der Kontrollgruppe und der Gruppe behandelter Versuchspersonen wurden ebenfalls verglichen.
Prostacyclin – gemessen als 6-Keto-Prostaglandin F1α
Die Ergebnisse der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe werden in den Tabellen 2 und 3 gezeigt. Die Tabelle 4 zeigt eine Zusammenfassung der statistischen Analyse dieser Werte. Eine der Versuchspersonen (Nr. 3) wurde an diesem Tag wegen Zigarettenrauchens ausgeschlossen.
In der behandelten Gruppe waren die 6-Keto-PGF1α-Konzentrationen nach der Behandlung zu zwei der fünf Messungen nach der Behandlung, Post-1 und Post-4, im Vergleich zu den Werten der Grundlinie vor der Behandlung signifikant (p < 0,05) höher . Derartige signifikante Unterschiede wurden in der Placebo-behandelten Kontrollgruppe nicht beobachtet.
TABELLE 2 Konzentrationen von 6-Keto-Prostaglandin F1α [pg/ml] im peripheren Blut behandelter Freiwilliger vor und nach der Behandlung (Post-1 bis Post-5).
TABELLE 3 Konzentration von 6-Keto-Prostaglandin F1α [pg/ml] im peripheren Blut von Placebo-behandelten Freiwilligen (Kontrolle) vor und nach einer Reihe von Injektionen von unbehandeltem Blut.
TABELLE 4 Statistische Analyse der Werte in den Tabellen 2 und 3
Expression von CD25 auf peripheren mononukleären Blutzellen
Der Anteil von CD25-exprimierenden Zellen, gemessen als Prozent aller CD45⁺ mononukleären Zellen, wird in den Tabellen 5 und 6 unten gezeigt. Tabelle 7 zeigt die statistische Analyse dieser Werte. Die Ergebnisse zeigen, daß zu jeder der fünf Gelegenheiten, zu denen während und nach einer Kur untersucht wurde, ein signifikant größerer Anteil von peripheren mononukleären Blutzellen im Vergleich zu den Werten vor einer Behandlung CD25 exprimierte. Einen derartigen Anstieg des Ausmaßes der Expression dieses Markers in der Placebo-behandelten Kontrollgruppe gab es nicht. Zusätzlich zeigte die behandelte Gruppe zu den Zeitpunkten 2 und 3 nach der Behandlung eine signifikant höhere Expression dieses Markers als die Kontrollgruppe.
TABELLE 5 Anteil der CD25-exprimierenden Zellen (als Prozent der CD45⁺-Zellen) im peripheren Blut behandelter Freiwilliger vor und nach einer Kur.
TABELLE 6 Anteil der CD25-exprimierenden Zellen (als Prozent der CD45⁺-Zellen) im peripheren Blut von Placebo-behandelten Freiwilligen (Kontrolle) vor und nach einer Reihe von Injektionen von unbehandeltem Blut.
TABELLE 7 Statistische Analyse der Werte in den Tabellen 5 und 6.
Expression von HLA-DR auf peripheren mononukleären Blutzellen
Der Anteil an Zellen, die HLA-DR exprimieren, gemessen als Prozent aller CD45⁺ mononukleären Zellen, wird in den Tabellen 8 und 9 gezeigt, und Tabelle 10 zeigt eine Zusammenfassung der statistischen Analyse dieser Werte. Wie bei CD25 beobachtet, war die Expression von HLA-DR zu jeder der fünf Gelegenheiten, zu denen untersucht wurde, während und nach einer VasoCare^TM-Kur signifikant erhöht. Innerhalb der behandelten Gruppe waren alle Werte nach einer Behandlung signifikant höher als die Grundlinie vor der Behandlung. Wie bei CD25 wurden in der Kontrollgruppe keine signifikanten Änderungen beobachtet. Ein Vergleich der behandelten mit der Placebo-Gruppe zeigte, daß zu den Zeitpunkten 2, 3, 4 und 5 nach der Behandlung die behandelte Gruppe eine signifikant höhere HLA-DR-Expression als die Kontrollgruppe zeigte.
TABELLE 8 Anteil der HLA-DR-exprimierenden Zellen (als Prozent der CD45⁺-Zellen) im peripheren Blut behandelter Freiwilliger vor und nach einer Kur.
TABELLE 9 Anteil der HLA-DR-exprimierenden Zellen (als Prozent der CD45⁺-Zellen) im peripheren Blut von Placebo-behandelten Freiwilligen (Kontrolle) vor und nach einer Reihe von Injektionen von unbehandeltem Blut.
TABELLE 10 Statistische Analyse der Werte in den Tabellen 8 und 9
Expression von Ber-Mac 3 aufperipheren mononukleären Blutzellen
Der Anteil von Zellen, die Ber-Mac 3, einem Monozyten-spezifischen Oberflächenmarker, exprimieren, gemessen als Prozent aller CD45+ mononukleären Zellen, wird in den Tabellen 13 und 14 gezeigt, und Tabelle 15 zeigt eine Zusammenfassung der statistischen Analyse dieser Werte. Wie bei den anderen Leukozyten-Oberflächenmarkern beobachtet, war die Expression von Ber-Mac 3 während des Verlaufs der Therapie signifikant erhöht. Innerhalb der behandelten Gruppe waren die Werte nach einer Therapie signifikant höher als die Grundlinie zu den Zeitpunkten 1 und 2 vor einer Behandlung. Wie im Fall der beiden anderen untersuchten Marker wurden in der Kontrollgruppe keine signifikanten Änderungen beobachtet. Vergleiche der behandelten mit der Placebo-Gruppe zeigten nur einen einzigen signifikanten Unterschied in der Ber-Mac 3-Expression zum Zeitpunkt 2.
TABELLE 11 Anteil der Ber-Mac 3-exprimierenden Zellen (als Prozent der CD45⁺-Zellen) im peripheren Blut behandelter Freiwilliger vor und nach einer Kur.
TABELLE 12 Anteil der Ber-Mac 3-exprimierenden Zellen (als Prozent der CD45⁺-Zellen) im peripheren Blut von Placebo-behandelten Freiwilligen (Kontrolle) vor und nach einer Reihe von Injektionen von unbehandeltem Blut.
TABELLE 13 Statistische Analyse der Werte in den Tabellen 11 und 12

Claims

Verwendung eines Aliquots Blut eines Patienten, welches extrakorporal gleichzeitig einer erhöhten Temperatur von 37°C bis 55°C, ultravioletter Strahlung und einer oxidierenden Umgebung ausgesetzt worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Bewirken einer Verbesserung der Endothelfunktion und Linderung der Symptome einer vasospastischen Funktionsstörung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die vasospastische Funktionsstörung die Raynaud-Krankheit, Migräne, Cluster-Kopfschmerzen oder Syndrom X ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Aliquot Blut dem Stressor einer oxidativen Umgebung ausgesetzt worden ist, umfassend die Verabreichung an das Aliquot eines gasförmigen, oxidierenden Agens, das ein Gemisch medizinisch-reinen Sauerstoffs und Ozon umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das gasförmige, oxidierende Gemisch, 1,0– 100 μg pro ml umfaßt, das dem Aliquot mit einer Geschwindigkeit von 0,01–2,0 Liter/Minute zugeführt wird.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aliquot Blut dem Stressor einer ultravioletten Strahlung, umfassend die Abgabe einer UV-Lampe, die Wellenlängen im C-Band emittiert, ausgesetzt worden ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Blut Menschenblut ist und ein Volumen von 0,1–100 ml hat.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Aliquot Blut der Temperatur, Strahlung und oxidierenden Umgebung für eine Zeitdauer von 0,5–60 Minuten ausgesetzt worden ist.