JPWO2021226151A5

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Publication number: JPWO2021226151A5
Application number: JP2022567268A
Authority: JP
Publication date: 2024-05-16

Claims

多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞のゲノムを編集するインビトロまたはエクスビボ方法であって、前記細胞を、
（ｉ）前記細胞における必須遺伝子であって、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び
（ｉｉ）前記必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型
と接触させることを含み、前記ノックインカセットは、前記切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記細胞のゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集された細胞は、
（ａ）前記目的の遺伝子産物、及び
（ｂ）前記細胞の生存及び／又は増殖に必要である、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物又はその機能変異体
を発現する、方法。
前記ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記細胞のゲノムに正しい位置又は向きで組み込まれない場合、前記細胞は、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物又はその機能変異体をもはや発現しない、
請求項１に記載の方法。
前記切断は、二本鎖切断である；および／または、
前記切断は、前記必須遺伝子の前記内因性コード配列の最後の１０００、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する；および／または、
前記切断は、前記必須遺伝子の最後のエクソン内に位置する、
請求項１または２に記載の方法。
前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び前記方法は、前記細胞を前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子と接触させることを更に含む；または
前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー鋳型は、
（i）ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である；および、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、前記プラスミドは、線状化されていない；および／または、
（ii）前記ノックインカセットの両側に相同性アームを含む；および、任意選択で、前記相同性アームは、前記細胞のゲノムにおいて前記切断の両側に位置する配列に対応する；および／または、
（iii）レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
（i）前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする；および、任意選択で、
前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む；および、任意選択で、
前記２Ａエレメントは、Ｔ２Ａエレメント（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｐ２Ａエレメント（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａエレメント（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）又はＦ２Ａエレメント（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）である；および／または、
前記ノックインカセットは、前記２Ａエレメントの上流において、リンカーペプチドをコードする配列を更に含む；および、任意選択で、
前記リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧを含む；および／または、
（ii）前記ノックインカセットは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性部分コード配列は、前記必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする；および、任意選択で、
前記Ｃ末端断片は、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である；および／または、
前記Ｃ末端断片は、前記必須遺伝子の前記内因性コード配列のうち、前記切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である；および、任意選択で、
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と比べて、前記ヌクレアーゼが標的部位に更に結合することを防ぎ、前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後の組換えの可能性を低下させ、且つ／又は前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後に前記必須遺伝子の前記遺伝子産物及び／若しくは前記目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている、
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である；および／または、
前記細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子である；および、任意選択で、
前記ｉＰＳ由来細胞は、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳ由来Ｔ細胞である、
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン（例えば、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）又はその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）又はその変異体）、ヒト白血球抗原（例えば、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ））、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
目的の遺伝子産物のための外因性コード配列が必須遺伝子のコード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるゲノムを含む遺伝子修飾された多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞であって、前記必須遺伝子は、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする、遺伝子修飾された多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞。
ゲノム修飾を含む操作された多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞であって、前記ゲノム修飾は、前記細胞のゲノムにおける必須遺伝子の内因性コード配列内への外因性ノックインカセットの挿入を含み、前記必須遺伝子は、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードし、前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記遺伝子産物又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含み、前記細胞は、前記目的の遺伝子産物と、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要である、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物又はその機能変異体とを発現する、
操作された多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞。
前記目的の遺伝子産物及び前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物は、前記必須遺伝子の内因性プロモーターから発現される、
請求項１２に記載の操作された多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞。
前記細胞のゲノムは、
（i）前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする；および、任意選択で、
前記細胞のゲノムは、前記必須遺伝子の前記コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む；および／または、
(ii)前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する；および／または、
(iii)レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、
請求項１１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
前記必須遺伝子の前記コード配列は、前記必須遺伝子の内因性コード配列と１００％未満の同一性である、
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の細胞。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である；および／または、
前記細胞がｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子であり；
任意選択で、前記ｉＰＳ由来細胞は、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳ由来Ｔ細胞であってよい、
請求項１１～１５のいずれか一項に記載の細胞。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、
請求項１１～１６のいずれか一項に記載の細胞。
医薬としての使用のための、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の細胞。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって作製される細胞又はその子孫。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって作製される細胞集団又はその子孫。
多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞のゲノムを編集するためのシステムであって、前記細胞と、前記細胞の必須遺伝子であって、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼと、前記必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型とを含むシステム。
前記切断は、二本鎖切断である；および／または、
前記切断は、前記必須遺伝子の前記コード配列の最後の１０００、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する；および／または、
前記切断は、前記必須遺伝子の最後のエクソン内に位置する、
請求項２１に記載のシステム。
前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び前記システムは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子を更に含む；または、
前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである、
請求項２１または２２に記載のシステム。
前記ドナー鋳型は、
（i）ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖であり、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、前記プラスミドは、線状化されていない；および／または、
（ii）前記ノックインカセットの両側に相同性アームを含み、任意選択で、前記相同性アームは、前記細胞のゲノムにおいて前記切断の両側に位置する配列に対応する；および／または、
（iii）レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、
請求項２１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセットは、
（i）前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にし、任意選択で、前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む；および／または、
（ii）前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、
請求項２１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性部分コード配列は、前記必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする；および、任意選択で、
前記Ｃ末端断片は、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である；および／または、
前記Ｃ末端断片は、前記必須遺伝子の前記コード配列のうち、前記切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項２１～２５のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である；および、任意選択で、
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼが標的部位に更に結合することを防ぐか、前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後の組換えの可能性を低下させるか、又は前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後に前記必須遺伝子の前記遺伝子産物及び／若しくは前記目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている；および、任意選択で、
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記ヌクレアーゼの標的部位を含まない、
請求項２１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である；および／または、
前記細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子である；および、任意選択で、
前記ｉＰＳ由来細胞は、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳ由来Ｔ細胞である、
請求項２１～２７のいずれか一項に記載のシステム。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、
請求項２１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞のゲノムの編集における使用のためのドナー鋳型であって、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列が必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるノックインカセットを含み、前記必須遺伝子は、多能性幹細胞又はｉＰＳ細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする、ドナー鋳型。
前記ノックインカセットは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記細胞のゲノムに組み込まれる、請求項３０に記載のドナー鋳型。
（i）ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である、および、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、前記プラスミドは、線状化されていない；および／または、
（ii）前記ノックインカセットの両側に相同性アームを含む；および／または、
（iii）レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、
請求項３０または３１に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセットは、
（i）前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、および、任意選択で、前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む；および／または、
（ii）前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、
請求項３０～３２のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性部分コード配列は、前記必須遺伝子の内因性コード配列によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする；および、任意選択で、
前記Ｃ末端断片は、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である、
請求項３０～３３のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である；および、任意選択で、
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼが標的部位に更に結合することを防ぐか、前記ノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後の組換えの可能性を低下させるか、又は前記ノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後に前記必須遺伝子の前記遺伝子産物及び／若しくは前記目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている、および、任意選択で、
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、ヌクレアーゼの標的部位を含まない、
請求項３０～３４のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である；および／または、
前記細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子である、
請求項３０～３５のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、
請求項３０～３６のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の細胞の使用。