CN114958769A - 一种永生化羊前体脂肪细胞系、及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种永生化的羊前体脂肪细胞构建方法，分离培养羊前体脂肪细胞，使用表达人端粒酶的慢病毒感染获得永生化细胞，利用永生化细胞分化研究其对羊乳腺上皮细胞生长的调控作用。本发明提高了羊脂肪前体细胞传代次数，完善了羊脂肪细胞的分化体系，降低了羊前体脂肪细胞的培养成本，将加快脂肪细胞分化在肌肉和乳腺发育等研究的进展，在畜牧业的基础研究中具有重要应用前景。

Description

一种永生化羊前体脂肪细胞系、及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及永生化细胞构建领域，特别是涉及慢病毒表达端粒酶构建永生化羊前体脂肪细胞。

背景技术

目前大部分动物的脂肪细胞分化的研究目前仍然依赖于体外培养的原代前脂肪细胞。原代前脂肪细胞虽具有与体内的前脂肪细胞在形态结构和功能活动上很接近的优点，在一定程度上可以作为脂肪细胞分化的研究模型，但是，原代培养的细胞本身存在难以克服的缺点和不足，(1)原代细胞不能无限传代，研究者在研究过程中需要反复从组织中分离细胞建立培养体系，这一过程非常繁琐耗时，需要大量的组织，且成本很高；(2)原代细胞是异质的(heterogeneous)，将前脂肪细胞从各种成纤维细胞中分离出来非常困难；(3)原代细胞来源于不同的个体，不同批次细胞间的遗传背景存在差异，导致研究难以获得稳定可靠的结果。由于这些原代前脂肪细胞培养系统的缺点和不足，严重阻碍了人类对羊肌肉发育和肌间脂肪分化对肉品质研究的深入。

脂肪细胞分化的理想研究模型是永生化前脂肪细胞系。与体外培养的原代细胞相比，永生化前脂肪细胞系是既具有无限增殖能力，又具有正常前脂肪细胞的特征，它能提供大量稳定均一、性状一致的细胞来源，排除由于不同发育阶段、不同生理条件以及不同细胞群体间的影响，保证研究的重复性和可比性。永生化细胞还可长期保存并可实施有效的质量监控，既便于广泛使用和标准化，又可使细胞材料成本降低。此外，通过基因操作可以使靶基因在永生化细胞中稳定表达和条件性表达，也能很容易地开展基因敲除、基因干扰以及药物研发等方面的研究。人类最早建立的永生化前脂肪细胞系是鼠永生化前脂肪细胞3T3L1，它被广泛应用于脂肪细胞分化研究。目前人类有关脂肪细胞分化的有关知识大多来源于对鼠的永生化前脂肪细胞系的研究。截至目前人类已建立人白色脂肪和棕色脂肪的永生化前脂肪细胞(Darimont C等，2003.Zilberfarb V等， 1997.)、鼠永生化前脂肪细胞、牛永生化前脂肪细胞(Aso H，1997)、猪永生化前脂肪细胞(Sanosaka M，2008)。

我国是肉羊产量最多的国家，羊肉在国内消费市场一直受到热捧。研究羊肉发育和生长的规律对丰富我国羊肉产量和提高羊肉品质具有重要意义。脂肪细胞分化在羊肉肌肉发育和生长中发挥重要作用，但目前羊的脂肪细胞分化的研究目前仍然依赖于体外培养的原代前脂肪细胞。羊原代培养的前体脂肪细胞本身存在难以克服的缺点和不足，主要是不能无限传代(一般6代以内)，研究者在研究过程中需要反复从组织中分离细胞建立培养体系，这一过程非常繁琐耗时，需要大量的组织，且成本很高。永生化前脂肪细胞至今尚未建立，这严重制约了羊脂肪细胞分化和羊肉发育等基础研究的深入。另外一个重要的问题，即使在体外能够分离到羊原代脂肪细胞，相较于成熟的小鼠细胞系，其难于分化产生脂滴(约20％)，难于满足目前科研的需求。因此，建立一种高效分化的羊永生化前体脂肪细胞系将大大助推我国肉羊产业的壮大和发展。

发明内容

技术问题：为克服现有技术中的不足，本发明提供一种慢病毒表达端粒酶构建羊前体脂肪细胞系永生化细胞的方法，提高羊永生化脂肪前体细胞传代次数，降低培养成本。

为实现上述目的，本发明第一方面公开了制备永生化羊前体脂肪细胞的方法，具体包括如下步骤：

1、羊前体脂肪细胞分离培养；

2、构建表达端粒酶的慢病毒，感染羊前体脂肪细胞，筛选细胞株。

进一步的，步骤1所述的分离培养包括如下步骤：

(1)新出生山羊处死，依次采用新洁而灭和酒精消毒；

(2)无菌条件下取皮下脂肪组织，PBS清洗后剪碎；

(3)将剪碎的组织酶解消化；

(4)终止消化，过滤除去大块组织；

(5)过筛，离心收集细胞；

(6)加入红细胞裂解液，除去红细胞后离心弃上清；

(7)完全培养基重悬培养获得山羊原代前体脂肪细胞。

进一步的，酶解消化过程中，操作为：加入2倍体积的Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，置于37℃水浴锅中消化1.5h；

过筛操作过程中，分别过100μm筛网和45μm筛网(Corning Falcon)后， 1000g离心5min。

进一步的，步骤2中，具体操作为：

(1)将原代前体脂肪细胞铺板，细胞融合密度达80％左右，加入表达人端粒酶的慢病毒(慢病毒骨架质粒：pCDH-TER-neo，Addgene plasmid#51631； http://n2t.net/addgene:51631；RRID:Addgene_51631，辅助质粒pMDLg/pRRE和 pRSV-rev由本实验室保存)，编码人端粒酶基因为Gene ID:7015。

(2)病毒感染48h后，添加G418药筛，细胞脱落即停止药筛，后续则进行永生化细胞的扩大培养与冻存。

进一步的，所述方法还包括对构建获得的永生化羊前体脂肪细胞的细胞周期和染色体带型分析。

具体操作为：取传代后的永生化细胞培养计数，绘制细胞生长曲线。

用终浓度0.03μg/mL的秋水仙素处理对数生长期的永生化羊前体脂肪细胞细胞(F30)6h，消化后1000g离心5min收集细胞，KCl溶液(37℃,0.075mol/L) 低渗20min后加入等体积的固定液(甲醇V∶乙酸V＝3∶1)预固定15min，1000g 离心5min，弃上清，加入2ml固定液重复固定3次，每次20min，1000g离心 5min弃去上清，最后加入200μL新鲜固定液制成细胞悬液，滴2滴于预冷的干净载玻片上，50℃烤片2h，Giemsa染色后镜检。

经过上述操作，最终获得了能够传代50次以上且维持前体脂肪细胞特性的永生化细胞，并且，所述细胞系培养简单。

本发明第二方面公开了一种永生化羊前体脂肪细胞的分化方法，所述方法的具体步骤如下：

将永生化和未永生化的羊前体脂肪细胞铺板培养，融合密度达到100％时继续培养24h，分别添加诱导因子，进行细胞分化试验。观察永生化和非永生化羊前体脂肪细胞分化情况。

具体地，

根据不同的诱导因子设计对照组，添加不同的诱导因子组合，

试验共分为5个组别：对照组(不额外添加因子)、诱导因子处理组(Induce)、诱导因子和油酸组(Induce+olei)、诱导因子+油酸+罗格列酮组 (Induce+oleic+ROSI)、诱导因子+油酸+罗格列酮组+PPARG2病毒 (Induce+oleic+ROSI+PPARG2)。将生长状态良好的细胞铺板于6孔板，每2 天更换一次生长培养基，直至分化完全(大约为D15)。不同分化条件筛选组别需要添加不同的分化促进剂，添加时间点为诱导开始(包括D0)后的每次换液。Oleic：100μM；ROSI：10μM；PPARG2过表达病毒本实验室保存，每孔添加50μL。分化期间拍照记录，大约D9时出现脂质滴，D15分化基本完全。诱导因子包括： 1μM Dex，0.5mM IBMX，5μg/LInsulin。

进一步的，在诱导分化过程中，添加染色剂，染色剂种类为ORO。

根据要分化的方向，选择了不同诱导因子组合，成功分化为带有脂质滴的脂肪细胞，且用于分化的永生化细胞一直维持永生化特性而且分化程度高，脂肪分化效率60％以上。

本发明第三方面公开了一种利用永生化羊前体脂肪细胞研究脂肪分化通路的模型和方法。

在永生化前体脂肪细胞分化过程中使用小分子物质干扰分化进程，具体为：

将永生化前体脂肪细胞铺板培养，待生长只所需汇合度时，根据添加诱导分化组合，并且添加小分子化合物，用于抑制分化进程。

具体地，小分子化合物可以是SB203580、PD169316、MK2206以及其他可调整代谢途径的化合物。

本发明第四方面公开了一种利用永生化羊前体脂肪细胞调控乳腺上皮细胞细胞周期的方法。

收集诱导永生化羊前体脂肪细胞分化不同阶段的培养基，将所述培养基添加到山羊乳腺上皮细胞培养皿中，进行实验，观察羊前体脂肪细胞对羊乳腺上皮细胞生长的影响。

发明的效果

本发明公开了制备永生化羊前体脂肪细胞的方法，获得的细胞具备较高的分化能力，不仅降低了培养成本，而且有助于乳腺发育、以及细胞增殖和分化等研究。

附图说明

图1为构建获得的永生化前体脂肪细胞与细胞形态。

图2为永生化前体脂肪细胞生长曲线。

图3为永生化前体脂肪细胞染色体核型(1000×)。

图4为永生化前体细胞诱导分化流程，注：生长培养基：DMEM培养基 +10％FBS+1％双抗；3因子诱导培养基：生长培养基+1μM Dex+0.5mM IBMX+5μg/L Insulin；1因子诱导培养基：生长培养基+5μg/L Insulin。

图5为永生化前体脂肪细胞分化条件筛选。

图6为永生化前体脂肪细胞分化图和ORO染色。

图7为PI3K-AKT通路和MAPK通路抑制剂对山羊前体脂肪细胞分化的影响。

图8为划痕试验和细胞周期检测试验流程。

图9前体脂肪细胞不同分化时期的培养基对GMEC增殖能力的影响。

图10永生化前体脂肪细胞的分化对GMEC细胞周期的影响。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。

实施例1、永生化羊前体脂肪细胞的制备

1、羊前体脂肪细胞分离培养

(1)试验出生2-3天的山羊带回实验室后，颈动脉放血，用新洁而灭清洗2～ 3次，再用75％酒精擦拭消毒。

(2)在无菌细胞培养间取其皮下脂肪组织，用3-5倍双抗的PBS清洗3次后在超净工作台对其进行分离修剪。

(3)将剪碎的组织分装到50mL离心管中，分别加入2倍体积的Ⅰ型胶原酶(CAS：9001-12-1)，置于37℃水浴锅中消化1.5h(每隔5min震荡1次)。

(4)加入等体积的完全培养液[DMEM(Gibco，12491015)+10％胎牛血清 (Gibco，10099141)]终止消化，用无菌纱布将消化后的组织过滤到烧杯中，以除去未消化完的较大的组织。

(5)然后再分别过100μm筛网和45μm筛网(Corning Falcon)筛网，将滤液分装到离心管中，2000g离心5min，弃上清。

(6)加入红细胞裂解液将沉淀吹散，静置5min，2000g离心5min，弃上清，用完全培养基重悬沉淀。

(7)取适量的细胞重悬液分装到25cm²培养瓶中，加入适量完全培养基混匀，放至细胞培养箱中培养。

(8)培养2h后，将细胞培养液移至新的培养瓶中，在原培养瓶中加入新的 5mL完全培养基继续培养，此时即获得山羊原代前体脂肪细胞。

2、慢病毒感染

慢病毒的包装，将pMDLg/pRRE(实验室保存),pRSV-rev(实验室保存) 和pCDH-TER-neo三质粒利用脂质体3000(L3000001，

3000 TransfectionReagent，Thermofisher)转入293T细胞中，36h后收集慢病毒，经离心纯化后，测定滴度，获得包含人端粒酶Gene ID:7015的慢病毒。

将生长状态良好的原代前体脂肪细胞铺于中皿，细胞融合密度达80％左右，培养基中加入包含有以上包装的人端粒酶慢病毒，试验共分为3组，分别为正常细胞添加G418(CAS：108321-42-2)、永生化细胞添加G418和正常传代的对照组。

病毒感染48h后，添加400μg/mL的G418溶液进行筛选。药筛期间每次换液均需添加400μg/mLG418溶液，正常传代组期间正常换液与传代。当正常传代组细胞添加G418后，细胞基本脱落即停止药筛，后续则进行永生化细胞的扩大培养与冻存。

3、细胞周期和染色体带型分析

取第30代永生化细胞以3.2×10⁴个细胞/mL的密度接种于24孔细胞培养板中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。每天同一时间对3孔细胞分别计数，求平均值，连续9d。以培养时间为横坐标，3孔细胞的平均数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

用终浓度0.03μg/mL的秋水仙素(CAS：64-86-8)处理对数生长期的永生化的前体脂肪细胞6h，消化后1000g离心5min收集细胞，KCl(CAS：65567-96-6) 溶液(37℃，0.075mol/L)低渗20min后加入等体积的甲醇(CAS：67-56-1)-乙酸 (CAS:64-17-5)固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)预固定15min，1000g离心5min，弃上清，加入2ml固定液重复固定3次，每次20min，1000g离心5min弃去上清，最后加入200μL新鲜固定液制成细胞悬液，滴2滴于预冷的干净载玻片上， 50℃烤片2h，Giemsa(CAS：51811-82-6)染色后镜检。

结果

未永生化的前体脂肪细胞在添加终浓度为400μg/mL的G418后，细胞几乎全部死亡，而永生化细胞添加G418后则可以正常生长，且其细胞形态与正常传代组并无差异。在本实验条件下，前体脂肪细胞永生化成功，结果如图1所示。获得的永生化细胞具有无限繁殖能力，目前实验室传代超过50代，仍保持前体脂肪细胞特性且可分化诱导。

以培养天数为横坐标，三孔细胞数的平均值为纵坐标绘制山永生化的前体脂肪细胞生长曲线，见图2。结果显示：永生化的前体脂肪细胞生长延滞期0-3d，对数生长期4-7d，7d后进入平台期，呈典型的S型，符合细胞生长的一般生物学规律。

对第30代的永生化前体脂肪细胞进行核型分析，大多数细胞染色体数目为60。其核型与山羊染色体图谱一致，说明所培养的细胞染色体未发生明显的变异，见图3。

实施例2、永生化羊前体脂肪细胞诱导分化

2.1获得前体脂肪细胞永生化细胞系后，进行永生化和非永生化细胞诱导分化条件的筛选。

试验共分为5个组别：对照组(不额外添加因子)、诱导因子处理组(Induce)、诱导因子和油酸组(Induce+olei)、诱导因子+油酸+罗格列酮组 (Induce+oleic+ROSI)、诱导因子+油酸+罗格列酮组+PPARG2病毒 (Induce+oleic+ROSI+PPARG2)。将生长状态良好的细胞铺板于6孔板，融合密度达到100％时继续培养24h。按图4进行细胞分化试验。每2天更换一次生长培养基，直至分化完全(大约为D15)。不同分化条件筛选组别需要添加不同的分化促进剂，添加时间点为诱导开始(包括D0)后的每次换液。油酸(CAS:112-80-1)：100μM；罗格列酮(CAS:155141-29-0)：10μM；PPARG2过表达病毒本实验室保存，添加量为MOI＝50。分化期间拍照记录。

注：

生长培养基：DMEM培养基+10％FBS+1％双抗(V900929-100ML,Sigma)；

3因子诱导培养基：生长培养基+1μMDex(CAS：50-02-2，Sigma) +0.5mMIBMX(CAS：28822-58-4，Sigma)+5μg/LInsulin(CAS：11070-73-8， Sigma)；

1因子诱导培养基：生长培养基+5μg/L Insulin(CAS：11070-73-8)。

2.2油红O染色与定量分析

待细胞分化后，取出分化完全的细胞，PBS洗涤后PFA固定10min。PBS 洗涤3次，ORO染色室温1h。PBS洗涤3次，利用倒置显微镜拍照。拍照完毕每孔加入400μL异丙醇，摇床洗涤5min。从中吸取200μL异丙醇洗涤液，酶标仪测定其OD值。

结果

D9时出现脂质滴，D15分化基本完全，在分化至D9时， Induce+oleic+ROSI+PPARG2组分化效果最好，表现为分化的细胞数量较多且分化状态较好(脂肪细胞分化率超过60％)。而Control组以及其他组别细胞几乎不分化或分化量很少。结果如图5所示。此外，比较永生化和非永生化前体脂肪细胞分化状态(约19％)，结果显示永生化脂肪细胞分化比例更高且分化更完全，故后续试验均用永生化前体脂肪细胞进行。

D15细胞基本分化完全，体积较大的脂质滴几乎占满了所有细胞质空间。对D15永生化前体脂肪细胞进行ORO染色，结果显示分化的细胞ORO着色明显、细胞体积增大、细胞膜内大脂质滴含量较多等脂肪细胞的基本形态。综上所述，永生化前体脂肪细胞分化过程大致分为15天，根据细胞分化状态将D0 定义为分化初期，D10为分化中期，D15为分化末期。因此，在分化过程中收集D0、D10、D15三个时期的培养基以供后续羊乳腺上皮细胞(GMEC)的培养试验，试验结果如图6所示。

实施例3、永生化羊前体细胞代谢通路调控实验

为探究永生化羊前体脂肪细胞分化过程中的是通过何种代谢途径达到分化目的，本实验在分化过程中添加各种抑制剂，用于阻断特定蛋白表达，观测对分化的影响。具体操作如下：

本试验共设置4个组别，分别为Control组、Adezmapimod(CAS：152121-47-6，SB203580，Selleck)组、PD169316(CAS：152121-53-4，SB203580，Selleck) 组和MK2206(CAS：1032350-13-2，SB203580，Selleck)组。诱导开始(D0)后根据不同组别，分别添加10μMSB203580、15μM PD169316、0.5μM MK2206。每2天换液均需添加相应抑制剂，直至D15分化完全。

结果显示，PI3K-AKT通路和MAPK通路在乳腺重构中脂肪细胞的自我更新过程中发挥着作用。本试验利用前体脂肪细胞永生化细胞模型，在细胞水平上验证上述2个通路在细胞分化过程中的具体作用。

选择MK2206为PI3K-AKT通路抑制剂，PD169316和SB203580为MAPK 通路抑制剂。细胞分化至D15时，与对照组相比，MK2206组抑制效果不明显，而PD169316组和SB203580组细胞分化比例明显减少，结果如图7a所示。利用ImageJ软件统计ORO染色的着色面积并进行统计学分析，结果显示与Control 组相比，三个试验组别的细胞分化比例显著下降，其中PD169316和SB203580 的抑制效果更明显。结果如图7b所示。对ORO染色结果进行定量分析，540nm 处检测各组OD值。与对照组相比，3个抑制剂抑制效果均具有显著性差异(P<0.01)。结果如图7c所示。因此，本研究证实了转录组测序结果，即PI3K-AKT 通路和MAPK通路对乳腺重构中脂肪细胞的分化具有重要调节作用。

实施例4永生化前体脂肪细胞的分化对乳腺上皮细胞的影响

将生长状态良好的GMEC铺于6孔板，设置4个组别，每个组别3个重复，分别为Control组、D0组、D10组和D15组。

收集上述实施例2中Induce+oleic+ROSI+PPARG2组别的分化条件D0(更换诱导培养基前，分化初期)、D10(分化中期)、D15(分化末期)三个时期的培养基， -80℃保存，培养基收集时间点如图8蓝色箭头所示。细胞融合密度达到100％后进行划痕试验，每孔平行划3条。PBS清洗3次，去除划下的细胞，更换为 D0、D10、D15三个时期的培养基。分别于0h、24h、48h进行拍照记录。

正常培养GEMC，当细胞融合密度达到60％左右后更换培养基。D0组、D10 组和D15组培养基为实施例2所收集的培养基，Control组为DMEM生长培养基。当细胞融合密度达到80％-90％左右时(大约培养48h)进行PI染色。PI染色步骤按Riccardi等人的方法进行，本试验所用PI染料终浓度为4μM。染色完成后，利用流式细胞仪检测细胞周期。

结果

1、划痕试验。

培养48h后，Control组划痕面积明显缩小，D0组划痕面积减小，而D10 组和D15组划痕面积缩小不明显，提示GMEC培养48h后，各组别细胞均有增殖趋势。结果如图9a所示。利用ImageJ软件对3个时间点各组划痕面积进行统计，结果显示与0h相比，24h和48h各组别细胞划痕面积均减小，且3个时间点均存在显著性差异(P<0.05)，结果如图9b所示。将时间点作为横坐标，分别比较3个时间点内各处理组划痕面积变化情况。结果显示在24h和48h，D0、D10、D15这3个实验组的划痕面积仍大于Control组，结果如图9c所示。因此，永生化前体脂肪细胞分化过程中收集的培养基对于GMEC的增殖具有一定的抑制作用。

2、流式细胞技术进行GMEC细胞周期检测。

G1期DNA复制尚未开始，是指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间；S期是指DNA复制的时期；G2期是DNA复制完成到细胞分裂的一段时间。结果如图10所示，紫色面积代表G1期，黄色面积代表S期，绿色面积代表G2 期。对各时期的细胞比例进行统计学分析，结果显示各组间处于G1期的细胞比例无明显差异，但D0、D10、D15三个组G1期细胞比例由升高的趋势。与对照组相比，其他几个组别S期的细胞比例下降，且D15组细胞比例与对照组相比显著下降(P<0.05)。各组间处于G2期的细胞比例无明显差异，但试验组有升高的趋势。本试验证实，D0、D10、D15三个组别中GMEC在G1期受到阻滞而导致其比例上升，S期比例下降。因此，永生化前体脂肪细胞分化不同时期的培养基对于GMEC细胞周期的正常进行有一定的阻滞作用，从而影响GMEC的增殖。

应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (10)

1.一种制备永生化羊前体脂肪细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将携带编码人端粒酶基因的慢病毒感染羊前体脂肪细胞，所述编码人端粒酶基因为Gene ID:7015。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括添加药物，进行筛选，所述添加的药物为G418。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离培养获得原代羊前体脂肪细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分离培养包括如下步骤：

(1)新出生山羊处死，重复清洗消毒；

(2)无菌条件下取皮下脂肪组织，PBS清洗后剪碎；

(3)将剪碎的组织酶解消化；

(4)终止消化，过滤除去大块组织；

(5)过筛，离心收集细胞；

(6)加入红细胞裂解液，除去红细胞后离心弃上清；

(7)完全培养基重悬培养获得山羊原代前体脂肪细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，酶解消化的条件为：加入2倍体积的Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，置于37℃水浴锅中消化1.5h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，细胞筛孔径为100μm到45μm。

7.前述任一权利要求所述方法获得的永生化羊前体脂肪细胞。

8.权利要求7所述的永生化羊前体脂肪细胞用于分化的应用，其特征在于，取生长状态良好的永生化羊前体脂肪细胞，添加诱导因子诱导分化。

9.权利要求7所述的永生化羊前体脂肪细胞用于调控羊乳腺上皮细胞生长的用途，其特征在于，将分化过程中的永生化细胞或其培养物与羊乳腺上皮细胞接触，调整乳腺上皮细胞生长周期。

10.权利要求7所述的永生化细胞在制备细胞模型中的应用。

Images