JPH05304951A - 初期胚及び胚性幹細胞の培養液 - Google Patents
初期胚及び胚性幹細胞の培養液Info
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- JPH05304951A JPH05304951A JP4083867A JP8386792A JPH05304951A JP H05304951 A JPH05304951 A JP H05304951A JP 4083867 A JP4083867 A JP 4083867A JP 8386792 A JP8386792 A JP 8386792A JP H05304951 A JPH05304951 A JP H05304951A
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- insulin
- growth factor
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 限定されない動物種及び／又は系統における
未分化細胞特に動物胚の培養ならびに動物胚に由来する
ＥＳ細胞（株）及び／又はＥＣ細胞（株）の樹立、樹立
効率の向上、増殖促進及び培養維持の安定化を図るため
の培養液を提供する。 【構成】 インシュリン様成長因子II型、もしくはイン
シュリン様成長因子II型及び白血病抑制因子を含む培養
液で未分化細胞特に動物胚及び動物胚に由来する細胞を
培養することで、現在までにＥＳ細胞（株）及びＥＣ細
胞（株）の樹立が困難であった動物種及び／又は系統に
おけるＥＳ細胞（株）及びＥＣ細胞（株）の樹立を可能
とする。また、既にＥＳ細胞（株）及びＥＣ細胞（株）
が樹立されている動物種及び／又は系統においても、同
様の培養液を用いることによりＥＳ細胞（株）及びＥＣ
細胞（株）樹立効率の向上及び培養維持の安定化を図
る。
未分化細胞特に動物胚の培養ならびに動物胚に由来する
ＥＳ細胞（株）及び／又はＥＣ細胞（株）の樹立、樹立
効率の向上、増殖促進及び培養維持の安定化を図るため
の培養液を提供する。 【構成】 インシュリン様成長因子II型、もしくはイン
シュリン様成長因子II型及び白血病抑制因子を含む培養
液で未分化細胞特に動物胚及び動物胚に由来する細胞を
培養することで、現在までにＥＳ細胞（株）及びＥＣ細
胞（株）の樹立が困難であった動物種及び／又は系統に
おけるＥＳ細胞（株）及びＥＣ細胞（株）の樹立を可能
とする。また、既にＥＳ細胞（株）及びＥＣ細胞（株）
が樹立されている動物種及び／又は系統においても、同
様の培養液を用いることによりＥＳ細胞（株）及びＥＣ
細胞（株）樹立効率の向上及び培養維持の安定化を図
る。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、未分化細胞特に動物胚
の培養並びに動物胚に由来する胚性幹細胞（株）及び／
又は胚性奇形腫細胞（株）の樹立及び胚性幹細胞（株）
の増殖・維持を行うために使用される培養液に関するも
のである。
の培養並びに動物胚に由来する胚性幹細胞（株）及び／
又は胚性奇形腫細胞（株）の樹立及び胚性幹細胞（株）
の増殖・維持を行うために使用される培養液に関するも
のである。
【０００２】
【発明の背景と従来の技術】近年、発生工学並びに分子
生物学における知識の蓄積と技術の発展に伴い、人為的
に調製された外来遺伝子を初期胚に導入し、さらに個体
に発生させるトランスジェニック動物（以下ＴＧ動物）
の作製が可能となった（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７７：７３８０−７３８４，１９８０）。このよう
なＴＧ動物の作製は、遺伝子工学的手法でクローン化さ
れた遺伝子を実際に生体内において発現させることによ
り、導入された遺伝子の機能・作用を個体レベルで検討
する以外に、疾病モデルＴＧ動物や有用物質産生ＴＧ動
物が開発されるにおよび医学分野及び産業分野において
もＴＧ動物の有用性が認識されつつある。
生物学における知識の蓄積と技術の発展に伴い、人為的
に調製された外来遺伝子を初期胚に導入し、さらに個体
に発生させるトランスジェニック動物（以下ＴＧ動物）
の作製が可能となった（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７７：７３８０−７３８４，１９８０）。このよう
なＴＧ動物の作製は、遺伝子工学的手法でクローン化さ
れた遺伝子を実際に生体内において発現させることによ
り、導入された遺伝子の機能・作用を個体レベルで検討
する以外に、疾病モデルＴＧ動物や有用物質産生ＴＧ動
物が開発されるにおよび医学分野及び産業分野において
もＴＧ動物の有用性が認識されつつある。
【０００３】ＴＧ動物の作製方法としては、前核期胚に
外来遺伝子断片を極微ピペットで直接注入するマイクロ
インジェクション法、外来遺伝子を組込んだレトロウィ
ルスを初期胚に感染させるレトロウィルス法等が確立さ
れている。しかしこれらの方法ではいずれも宿主染色体
に対し外来遺伝子がランダムに組込まれるため、外来遺
伝子の組込み部位を制御することは不可能である。この
ため再現性や外来遺伝子の効率的な発現等に問題を残し
ている。
外来遺伝子断片を極微ピペットで直接注入するマイクロ
インジェクション法、外来遺伝子を組込んだレトロウィ
ルスを初期胚に感染させるレトロウィルス法等が確立さ
れている。しかしこれらの方法ではいずれも宿主染色体
に対し外来遺伝子がランダムに組込まれるため、外来遺
伝子の組込み部位を制御することは不可能である。この
ため再現性や外来遺伝子の効率的な発現等に問題を残し
ている。
【０００４】一方、発生工学上の新たな分野として、各
種個体形成組織への分化能を保持しながら未分化状態の
まま試験管内で培養可能な株化細胞、すなわち胚性奇形
腫細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃ
ｅｌｌ；ＥＣ細胞）並びに胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎ
ｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）が樹立された。
ＥＳ／ＥＣ細胞は正常初期胚に移植することにより、初
期胚由来の細胞とＥＳ／ＥＣ細胞由来細胞が混在したま
ま一つの個体すなわちキメラ動物を形成することが確認
された（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．，１４０：１９４９−１９５６，１９７４）。ま
たこのようなキメラ動物のうち精巣や卵巣の生殖細胞に
ＥＳ／ＥＣ細胞由来細胞が導入された動物は生殖系列キ
メラと呼ばれ、この動物を親として交配を継続すること
でＥＳ／ＥＣ細胞由来の細胞のみで構成される子孫を得
ることができる。このことは遺伝学的に十分制御された
人為的素質を持つ動物を獲得できるということであり、
試験管内に限らず個体レベルにおいても発生や分化のメ
カニズムの検討を可能にした。
種個体形成組織への分化能を保持しながら未分化状態の
まま試験管内で培養可能な株化細胞、すなわち胚性奇形
腫細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃ
ｅｌｌ；ＥＣ細胞）並びに胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎ
ｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）が樹立された。
ＥＳ／ＥＣ細胞は正常初期胚に移植することにより、初
期胚由来の細胞とＥＳ／ＥＣ細胞由来細胞が混在したま
ま一つの個体すなわちキメラ動物を形成することが確認
された（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．，１４０：１９４９−１９５６，１９７４）。ま
たこのようなキメラ動物のうち精巣や卵巣の生殖細胞に
ＥＳ／ＥＣ細胞由来細胞が導入された動物は生殖系列キ
メラと呼ばれ、この動物を親として交配を継続すること
でＥＳ／ＥＣ細胞由来の細胞のみで構成される子孫を得
ることができる。このことは遺伝学的に十分制御された
人為的素質を持つ動物を獲得できるということであり、
試験管内に限らず個体レベルにおいても発生や分化のメ
カニズムの検討を可能にした。
【０００５】ＥＣ細胞の研究は奇形腫（ｔｅｒａｔｏｍ
ａ）並びに悪性奇形腫（ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍ
ａ）の組織学的解析が発端となった。奇形腫はその腫瘍
組織内に特定の固有組織又は固有細胞に分化した形態を
示す構造が認められることから、正常細胞が腫瘍化しつ
つも一定の分化能を保持していると考えられ、また悪性
奇形腫では同様な腫瘍組織中に増殖力が旺盛で未分化な
幹細胞を含んでいることが観察された。これらの考察か
ら、悪性奇形腫由来の幹細胞を分離することで、分化能
を有したまま無限増殖可能な株化細胞樹立の可能性が示
唆された。その後、正常胚盤胞を腎臓被膜下や精巣に移
植することで人為的に奇形腫を作製できることが報告さ
れ（Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｌ．Ｃ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉ
ｏｌ．，２１：３６４−３８２，１９７０）、その後腎
臓被膜下で人為的に発生させた奇形腫細胞をさらに試験
管内で培養することにより多系統のＥＣ細胞が樹立され
た（Ｓｉｌｖｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｔｅｒａｔｏ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｎ．Ｙ．，
ＵＳＡ．，１９８３）。しかし、ＥＣ細胞を用いたキメ
ラ動物の作製において、キメラ形成率や生殖系列への寄
与の低さ、キメラ個体でのＥＣ細胞に由来すると推察さ
れる腫瘍の発生などが指摘され（Ｐａｐａｉｏａｎｎｏ
ｕ，Ｖ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｏｒｐｈ．，４４：９３−１０４，１９７８）、
現在その原因はＥＣ細胞が本来腫瘍由来であるために染
色体異常やなんらかの遺伝子制御機能の異常が存在する
ためであると考えられている。
ａ）並びに悪性奇形腫（ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍ
ａ）の組織学的解析が発端となった。奇形腫はその腫瘍
組織内に特定の固有組織又は固有細胞に分化した形態を
示す構造が認められることから、正常細胞が腫瘍化しつ
つも一定の分化能を保持していると考えられ、また悪性
奇形腫では同様な腫瘍組織中に増殖力が旺盛で未分化な
幹細胞を含んでいることが観察された。これらの考察か
ら、悪性奇形腫由来の幹細胞を分離することで、分化能
を有したまま無限増殖可能な株化細胞樹立の可能性が示
唆された。その後、正常胚盤胞を腎臓被膜下や精巣に移
植することで人為的に奇形腫を作製できることが報告さ
れ（Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｌ．Ｃ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉ
ｏｌ．，２１：３６４−３８２，１９７０）、その後腎
臓被膜下で人為的に発生させた奇形腫細胞をさらに試験
管内で培養することにより多系統のＥＣ細胞が樹立され
た（Ｓｉｌｖｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｔｅｒａｔｏ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｎ．Ｙ．，
ＵＳＡ．，１９８３）。しかし、ＥＣ細胞を用いたキメ
ラ動物の作製において、キメラ形成率や生殖系列への寄
与の低さ、キメラ個体でのＥＣ細胞に由来すると推察さ
れる腫瘍の発生などが指摘され（Ｐａｐａｉｏａｎｎｏ
ｕ，Ｖ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｏｒｐｈ．，４４：９３−１０４，１９７８）、
現在その原因はＥＣ細胞が本来腫瘍由来であるために染
色体異常やなんらかの遺伝子制御機能の異常が存在する
ためであると考えられている。
【０００６】ＥＳ細胞はＥＣ細胞とは異なり正常胚盤胞
を直接試験管内培養することにより樹立された（Ｅｖａ
ｎｃｅ Ｍ．Ｊ．＆ Ｋａｕｆｍａｎ Ｋ．Ｈ．，ＮＡ
ＴＵＲＥ ２９２：７６３４−７６３８，１９８１）。
ＥＳ細胞は、形態的にも、また、試験管内及び生体内に
おける振る舞い方もＥＣ細胞に酷似している。しかしＥ
Ｃ細胞が本来腫瘍細胞であるのと比較しＥＳ細胞はその
多くが正常二倍体の核型を保持した正常細胞であり、キ
メラ形成率、生殖系列への寄与ともに高率であることが
明らかになっており（Ｂｒｅｄｌｅｙ Ａ．ｅｔ ａ
ｌ，ＮＡＴＵＲＥ３０９：２５５−２５６，１９８
６）、そのため発生学分野以外にもＥＳ細胞の利用範囲
は広がりつつある。
を直接試験管内培養することにより樹立された（Ｅｖａ
ｎｃｅ Ｍ．Ｊ．＆ Ｋａｕｆｍａｎ Ｋ．Ｈ．，ＮＡ
ＴＵＲＥ ２９２：７６３４−７６３８，１９８１）。
ＥＳ細胞は、形態的にも、また、試験管内及び生体内に
おける振る舞い方もＥＣ細胞に酷似している。しかしＥ
Ｃ細胞が本来腫瘍細胞であるのと比較しＥＳ細胞はその
多くが正常二倍体の核型を保持した正常細胞であり、キ
メラ形成率、生殖系列への寄与ともに高率であることが
明らかになっており（Ｂｒｅｄｌｅｙ Ａ．ｅｔ ａ
ｌ，ＮＡＴＵＲＥ３０９：２５５−２５６，１９８
６）、そのため発生学分野以外にもＥＳ細胞の利用範囲
は広がりつつある。
【０００７】ＥＳ／ＥＣ細胞に対しては他の株化細胞と
同様に従来法を用いて外来遺伝子を導入することがで
き、また外来遺伝子導入細胞の集団の中から後述するよ
うに相同組換え体のみを選別できるようになったこと
で、マイクロインジェクション法等とは異なるＴＧ動物
作製における特徴を確立した。
同様に従来法を用いて外来遺伝子を導入することがで
き、また外来遺伝子導入細胞の集団の中から後述するよ
うに相同組換え体のみを選別できるようになったこと
で、マイクロインジェクション法等とは異なるＴＧ動物
作製における特徴を確立した。
【０００８】従来法による外来遺伝子の細胞への導入で
は外来遺伝子は宿主染色体上のランダムな位置に組込ま
れるが、ある一定の確率で外来遺伝子と相同な宿主染色
体上の内在性遺伝子との間で相同組換えと呼ばれる染色
体変異を起こすことが知られている。すなわち目的とす
る内在性遺伝子と相同な配列部位を持つ外来遺伝子を導
入すれば、ランダムな組換え体と同時に、標的とした内
在性遺伝子配列に対して相同組換えを起こした相同組換
え体をも生じさせることが可能である。またこのような
相同組換え体を選別するために考案された外来遺伝子を
導入することにより全組換え細胞集団より相同組換え体
のみを選別し、最終的に宿主染色体上の任意の遺伝子を
標的として変異を組込んだ相同組換え細胞クローンを獲
得することができる（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ
ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ，３３６：３４８−３５２，１９８
８）。このような方法は導入遺伝子の構造や相同組換え
体の選抜方法などにより数種考案されているが（Ｃａｐ
ｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，ＴＩＧ，５：７０−７６，１９
８９）、一般にジーンターゲッティングと総称されてい
る。ジーンターゲッティングの方法を相同組換えＥＳ／
ＥＣ細胞の選抜に応用することで、マイクロインジェク
ション法など従来のＴＧ動物作製方法では不可能であっ
た、任意の位置に外来遺伝子を挿入した相同組換えＴＧ
動物作製の可能性が示された。現在、キメラ動物を介し
たＴＧ動物作製のためのＥＳ／ＥＣ細胞に対する期待が
高まっている。
は外来遺伝子は宿主染色体上のランダムな位置に組込ま
れるが、ある一定の確率で外来遺伝子と相同な宿主染色
体上の内在性遺伝子との間で相同組換えと呼ばれる染色
体変異を起こすことが知られている。すなわち目的とす
る内在性遺伝子と相同な配列部位を持つ外来遺伝子を導
入すれば、ランダムな組換え体と同時に、標的とした内
在性遺伝子配列に対して相同組換えを起こした相同組換
え体をも生じさせることが可能である。またこのような
相同組換え体を選別するために考案された外来遺伝子を
導入することにより全組換え細胞集団より相同組換え体
のみを選別し、最終的に宿主染色体上の任意の遺伝子を
標的として変異を組込んだ相同組換え細胞クローンを獲
得することができる（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ
ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ，３３６：３４８−３５２，１９８
８）。このような方法は導入遺伝子の構造や相同組換え
体の選抜方法などにより数種考案されているが（Ｃａｐ
ｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，ＴＩＧ，５：７０−７６，１９
８９）、一般にジーンターゲッティングと総称されてい
る。ジーンターゲッティングの方法を相同組換えＥＳ／
ＥＣ細胞の選抜に応用することで、マイクロインジェク
ション法など従来のＴＧ動物作製方法では不可能であっ
た、任意の位置に外来遺伝子を挿入した相同組換えＴＧ
動物作製の可能性が示された。現在、キメラ動物を介し
たＴＧ動物作製のためのＥＳ／ＥＣ細胞に対する期待が
高まっている。
【０００９】従来法によるＥＳ細胞（株）の樹立におい
ては支持細胞層として胎仔線維芽細胞を使用し、以下の
過程により行われる。まず支持細胞層上で初期胚特に胚
盤胞もしくは着床遅延胚盤胞を培養することで初期胚が
支持細胞層に定着した後、胚外周の栄養芽細胞の伸展成
長が始まる。さらに初期胚内部に存在する内部細胞塊
（Ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ：ＩＣＭ）が伸展し
た栄養芽細胞上でドーム状に増殖を開始、十分にＩＣＭ
が増殖した時点でＩＣＭのみを分離・分散して新たな支
持細胞層上に継代する。継代されたＩＣＭ由来細胞の
内、未分化形態を維持したまま増殖を続けるものがごく
わずかに出現するようになる。この未分化細胞をさらに
継代・増殖していくことでＥＳ細胞（株）が樹立される
（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｔｅｒａｔｏｃａｒ
ｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅ
ｍ ｃｅｌｌｓ，ｐｐ７１−１１２，Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ，Ｅ．Ｊ．ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍ．，
Ｏｘｆｏｒｄ．，１９８７）。
ては支持細胞層として胎仔線維芽細胞を使用し、以下の
過程により行われる。まず支持細胞層上で初期胚特に胚
盤胞もしくは着床遅延胚盤胞を培養することで初期胚が
支持細胞層に定着した後、胚外周の栄養芽細胞の伸展成
長が始まる。さらに初期胚内部に存在する内部細胞塊
（Ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ：ＩＣＭ）が伸展し
た栄養芽細胞上でドーム状に増殖を開始、十分にＩＣＭ
が増殖した時点でＩＣＭのみを分離・分散して新たな支
持細胞層上に継代する。継代されたＩＣＭ由来細胞の
内、未分化形態を維持したまま増殖を続けるものがごく
わずかに出現するようになる。この未分化細胞をさらに
継代・増殖していくことでＥＳ細胞（株）が樹立される
（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｔｅｒａｔｏｃａｒ
ｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅ
ｍ ｃｅｌｌｓ，ｐｐ７１−１１２，Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ，Ｅ．Ｊ．ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍ．，
Ｏｘｆｏｒｄ．，１９８７）。
【００１０】ＥＳ細胞株を樹立、維持、増殖するための
培養液としてはＤＭＥ培養液を基礎培養液とし、これに
非必須アミノ酸混合液・核酸混合液・メルカプトエタノ
ール・新生児牛血清及び／又は牛胎児血清を加えたもの
が利用されている（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．Ｃ．，
Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，８７：２
７−４５，１９８５）。またマウスＥＳ／ＥＣ細胞
（株）を樹立・維持するさいにＥＣ細胞培養上清（Ｍａ
ｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４−７６３８，１９８
１）またはバッファローラット肝臓細胞培養上清（ＢＲ
Ｌ−ＣＭ）を一定量上記培養液に添加することで分化抑
制及び増殖が同時に促進されることが報告され（Ｓｍｉ
ｔｈ，Ａ．Ｇ．＆ Ｈｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｄｅｖ．
Ｂｉｏｌ．，１２１：１−９，１９８７）、これらの培
養上清に含まれる活性は分化抑制因子（ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ：ＤＩＡ）と呼ばれた。さらにその後ＤＩＡは白
血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ
ｇｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）という一種のサイトカインで
あることが判明した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ
ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ，３３６：６８４−６８７，１９
８８）。ＬＩＦは特定なマウスの系統においてはＬＩＦ
無添加の場合に比較してＥＳ細胞（株）の樹立効率を向
上させ、また既に樹立されているＥＳ／ＥＣ細胞（株）
に対しても分化抑制活性及び増殖促進活性を示す（Ｐｅ
ａｓｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１４
４：３４４−３５２，１９９０）。しかし他のマウスの
系統や他種動物においては顕著な効果は見られない。こ
のため現在に至る研究においてもＬＩＦ添加、無添加に
関わらず従来の培養液によるＥＳ細胞（株）の樹立は１
２９／ｓｖ系（Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ，
Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９
８：４８−５６，１９８９）、Ｃ５７ＢＬ／６系（Ｄｏ
ｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｍｂｒ
ｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，８７：２７−４５，１
９８５）といったマウスの特定系統におけるものが主で
あり、他種動物ではＥＳ様細胞として牛（Ｓｃｈｅｌｌ
ａｎｄｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌ
ｏｇｙ，３１：１５−１７，１９８９）、豚（Ｓｔｒｏ
ｊｅｋ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌ
ｏｇｙ，３３：９０１−９１４，１９９０）、羊（Ｈａ
ｎｄｙｓｉｄｅ，Ａ．，Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅ
ｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：１８５−１９０，１９８
７）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７：２２４−２２７，
１９８８）におけるごくわずかな報告があるだけであ
る。さらに、同一動物種かつ同一系統で樹立されたＥＳ
／ＥＣ細胞（株）であっても、異なるＥＳ／ＥＣ細胞ク
ローン間では外来遺伝子の導入効率、導入遺伝子の発現
効率、キメラ動物形成能及びキメラ動物におけるＥＳ細
胞由来細胞の組織分布、特に生殖系列へのＥＳ細胞由来
細胞の導入効率に相違があるということが報告されてお
り、同一系統であっても多くのＥＳ／ＥＣ細胞クローン
を樹立しておく必要がある。このような現状から、動物
種／系統を問わず樹立効率が高く、維持・増殖を容易に
する培養液の開発が待たれている。インシュリン様成長
因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ；ＩＧＦ）は、最初、ヒト血清中において抗イ
ンシュリン抗体により抑制されないインシュリン様作用
を示す物質として報告され（Ｆｒｏｅｓｈ Ｅ．Ｒ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４２：１
８１６，１９６３）、ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｂｌ
ｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓ
ｏｌｕｂｌｅ（ＮＳＩＬＡ−Ｓ）と呼ばれた。さらに，
ＮＳＩＬＡ−ＳはＩとIIに純化され、そのアミノ酸配列
も確定された（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ Ｅ．＆ Ｈ
ｕｍｂｅｌ Ｒ．Ｅ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２５３：２７６９，１９７８）。その後、確定されたア
ミノ酸配列がインシュリンに類似であること、インシュ
リン様作用がみられることなどから、ＮＳＩＬＡ−Ｓ
は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−IIと改名されている。さら
に、ＩＧＦはその立体構造においてもインシュリンと類
似しているため、同じようにアミノ酸配列、立体構造が
インシュリンと類似しているリラキシンとともにインシ
ュリン・ファミリ−として分類されている。ヒトの場合
ＩＧＦ−IIは酸性のポリペプチドで６７個のアミノ酸よ
り構成され、ＩＧＦ−Ｉと約６０％の相同性を持つ分子
量約７０００のペプチドである。また、ＩＧＦ−II遺伝
子は第１１染色体の短腕に局在しインシュリン遺伝子に
近接していることが明らかになっており（Ｂｒｉｓｓｅ
ｎｄｅｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，３１
０：７８１−７８４，１９８４，Ｔｒｉｃｏｌｉ，Ｊ．
Ｖ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，３１０：７８４−７
８６，１９８４）、そのｃＤＮＡは１８０個からなる前
駆体プレプロＩＧＦ−IIをコードしていることから、Ｉ
ＧＦ−IIもインシュリンと同様にプレプロペプチド・ホ
ルモンとして生合成され、プロセッシングを受けること
により最終的にＩＧＦ−IIが生成されることが報告され
ている（Ｂｅｌｌ，Ｇ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲ
Ｅ，３１０：７７５−７７７，１９８４）。
培養液としてはＤＭＥ培養液を基礎培養液とし、これに
非必須アミノ酸混合液・核酸混合液・メルカプトエタノ
ール・新生児牛血清及び／又は牛胎児血清を加えたもの
が利用されている（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．Ｃ．，
Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，８７：２
７−４５，１９８５）。またマウスＥＳ／ＥＣ細胞
（株）を樹立・維持するさいにＥＣ細胞培養上清（Ｍａ
ｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４−７６３８，１９８
１）またはバッファローラット肝臓細胞培養上清（ＢＲ
Ｌ−ＣＭ）を一定量上記培養液に添加することで分化抑
制及び増殖が同時に促進されることが報告され（Ｓｍｉ
ｔｈ，Ａ．Ｇ．＆ Ｈｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｄｅｖ．
Ｂｉｏｌ．，１２１：１−９，１９８７）、これらの培
養上清に含まれる活性は分化抑制因子（ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ：ＤＩＡ）と呼ばれた。さらにその後ＤＩＡは白
血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ
ｇｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）という一種のサイトカインで
あることが判明した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ
ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ，３３６：６８４−６８７，１９
８８）。ＬＩＦは特定なマウスの系統においてはＬＩＦ
無添加の場合に比較してＥＳ細胞（株）の樹立効率を向
上させ、また既に樹立されているＥＳ／ＥＣ細胞（株）
に対しても分化抑制活性及び増殖促進活性を示す（Ｐｅ
ａｓｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１４
４：３４４−３５２，１９９０）。しかし他のマウスの
系統や他種動物においては顕著な効果は見られない。こ
のため現在に至る研究においてもＬＩＦ添加、無添加に
関わらず従来の培養液によるＥＳ細胞（株）の樹立は１
２９／ｓｖ系（Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ，
Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９
８：４８−５６，１９８９）、Ｃ５７ＢＬ／６系（Ｄｏ
ｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｍｂｒ
ｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，８７：２７−４５，１
９８５）といったマウスの特定系統におけるものが主で
あり、他種動物ではＥＳ様細胞として牛（Ｓｃｈｅｌｌ
ａｎｄｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌ
ｏｇｙ，３１：１５−１７，１９８９）、豚（Ｓｔｒｏ
ｊｅｋ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌ
ｏｇｙ，３３：９０１−９１４，１９９０）、羊（Ｈａ
ｎｄｙｓｉｄｅ，Ａ．，Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅ
ｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：１８５−１９０，１９８
７）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７：２２４−２２７，
１９８８）におけるごくわずかな報告があるだけであ
る。さらに、同一動物種かつ同一系統で樹立されたＥＳ
／ＥＣ細胞（株）であっても、異なるＥＳ／ＥＣ細胞ク
ローン間では外来遺伝子の導入効率、導入遺伝子の発現
効率、キメラ動物形成能及びキメラ動物におけるＥＳ細
胞由来細胞の組織分布、特に生殖系列へのＥＳ細胞由来
細胞の導入効率に相違があるということが報告されてお
り、同一系統であっても多くのＥＳ／ＥＣ細胞クローン
を樹立しておく必要がある。このような現状から、動物
種／系統を問わず樹立効率が高く、維持・増殖を容易に
する培養液の開発が待たれている。インシュリン様成長
因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ；ＩＧＦ）は、最初、ヒト血清中において抗イ
ンシュリン抗体により抑制されないインシュリン様作用
を示す物質として報告され（Ｆｒｏｅｓｈ Ｅ．Ｒ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４２：１
８１６，１９６３）、ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｂｌ
ｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓ
ｏｌｕｂｌｅ（ＮＳＩＬＡ−Ｓ）と呼ばれた。さらに，
ＮＳＩＬＡ−ＳはＩとIIに純化され、そのアミノ酸配列
も確定された（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ Ｅ．＆ Ｈ
ｕｍｂｅｌ Ｒ．Ｅ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２５３：２７６９，１９７８）。その後、確定されたア
ミノ酸配列がインシュリンに類似であること、インシュ
リン様作用がみられることなどから、ＮＳＩＬＡ−Ｓ
は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−IIと改名されている。さら
に、ＩＧＦはその立体構造においてもインシュリンと類
似しているため、同じようにアミノ酸配列、立体構造が
インシュリンと類似しているリラキシンとともにインシ
ュリン・ファミリ−として分類されている。ヒトの場合
ＩＧＦ−IIは酸性のポリペプチドで６７個のアミノ酸よ
り構成され、ＩＧＦ−Ｉと約６０％の相同性を持つ分子
量約７０００のペプチドである。また、ＩＧＦ−II遺伝
子は第１１染色体の短腕に局在しインシュリン遺伝子に
近接していることが明らかになっており（Ｂｒｉｓｓｅ
ｎｄｅｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，３１
０：７８１−７８４，１９８４，Ｔｒｉｃｏｌｉ，Ｊ．
Ｖ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，３１０：７８４−７
８６，１９８４）、そのｃＤＮＡは１８０個からなる前
駆体プレプロＩＧＦ−IIをコードしていることから、Ｉ
ＧＦ−IIもインシュリンと同様にプレプロペプチド・ホ
ルモンとして生合成され、プロセッシングを受けること
により最終的にＩＧＦ−IIが生成されることが報告され
ている（Ｂｅｌｌ，Ｇ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲ
Ｅ，３１０：７７５−７７７，１９８４）。
【００１１】ＩＧＦ−Ｉについてはインシュリン様作用
以外にも生体内において成長ホルモンの持つ成長促進作
用を仲介していることが実証されており（Ｓｃｈｏｅｎ
ｌｅ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，２９６：２５
２，１９８２）、また、試験管内においても各種動物の
軟骨細胞の増殖、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成、タンパク合成、
プロテオグリカン／コラ−ゲン合成、グリコ−ゲン合成
を促進することが報告されている（Ｚａｐｆ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８７：２８
５，１９７８）。さらに、アガロ−スゲル内での軟骨細
胞コロニ−形成の刺激作用（Ｌｉｎｄａｈｌ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２１：１０
６１−１０６９，１９８７）、骨芽細胞の増殖促進・コ
ラ−ゲン合成の促進作用も示すが、骨芽細胞の分化指標
のひとつであるアルカリフォスファタ−ゼ活性を誘導す
る作用も持つことが報告されている（Ｚａｐｆ，Ｊ．ｅ
ｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａ
ｂ．，１３：３，１９８４）。このように作用が解明さ
れているＩＧＦ−Ｉに対し、ＩＧＦ−IIには生体内での
明確な作用が認められないため、その生理学的意義は未
だ不明である。ラットでは胎児期に血清中ＩＧＦ−II濃
度が高値を示し、出生後に次第に減少することから、胎
児期の主要な成長因子はＩＧＦ−IIであると考えられて
いる。また、試験管内ではＩＧＦ−Ｉとほぼ同様な作用
を示すが、ＩＧＦ−Ｉと比較してその活性は低い。しか
し、ＩＧＦ−IIは培養細胞に対しては明確な増殖促進作
用を有しているため（Ｒｅｃｈｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．＆Ｎｉ
ｓｓｌｅｙ，Ｓ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，４７：４２５−４４２，１９８５）、その作用
は主に培養細胞を用いて調べられてきた。ＩＧＦ−IIに
応答性の細胞は線維芽細胞や血球系細胞が多い。また、
褐色細胞腫でＮＧＦ様作用がみられることは神経芽細胞
での神経突起伸長作用の報告や脳脊髄液中に見いだされ
るＩＧＦ−IIの主要な産生部位が脈絡叢と考えられるこ
とと共に、脳神経系におけるＩＧＦ−IIの作用をも示唆
している。
以外にも生体内において成長ホルモンの持つ成長促進作
用を仲介していることが実証されており（Ｓｃｈｏｅｎ
ｌｅ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，２９６：２５
２，１９８２）、また、試験管内においても各種動物の
軟骨細胞の増殖、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成、タンパク合成、
プロテオグリカン／コラ−ゲン合成、グリコ−ゲン合成
を促進することが報告されている（Ｚａｐｆ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８７：２８
５，１９７８）。さらに、アガロ−スゲル内での軟骨細
胞コロニ−形成の刺激作用（Ｌｉｎｄａｈｌ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２１：１０
６１−１０６９，１９８７）、骨芽細胞の増殖促進・コ
ラ−ゲン合成の促進作用も示すが、骨芽細胞の分化指標
のひとつであるアルカリフォスファタ−ゼ活性を誘導す
る作用も持つことが報告されている（Ｚａｐｆ，Ｊ．ｅ
ｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａ
ｂ．，１３：３，１９８４）。このように作用が解明さ
れているＩＧＦ−Ｉに対し、ＩＧＦ−IIには生体内での
明確な作用が認められないため、その生理学的意義は未
だ不明である。ラットでは胎児期に血清中ＩＧＦ−II濃
度が高値を示し、出生後に次第に減少することから、胎
児期の主要な成長因子はＩＧＦ−IIであると考えられて
いる。また、試験管内ではＩＧＦ−Ｉとほぼ同様な作用
を示すが、ＩＧＦ−Ｉと比較してその活性は低い。しか
し、ＩＧＦ−IIは培養細胞に対しては明確な増殖促進作
用を有しているため（Ｒｅｃｈｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．＆Ｎｉ
ｓｓｌｅｙ，Ｓ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，４７：４２５−４４２，１９８５）、その作用
は主に培養細胞を用いて調べられてきた。ＩＧＦ−IIに
応答性の細胞は線維芽細胞や血球系細胞が多い。また、
褐色細胞腫でＮＧＦ様作用がみられることは神経芽細胞
での神経突起伸長作用の報告や脳脊髄液中に見いだされ
るＩＧＦ−IIの主要な産生部位が脈絡叢と考えられるこ
とと共に、脳神経系におけるＩＧＦ−IIの作用をも示唆
している。
【００１２】一方、ＩＧＦ受容体に関する研究の進展に
伴い、インシュリンとＩＧＦ−Ｉの受容体がα2 β2 の
サブユニット構造からなる四量体であり、また細胞内ド
メインにチロシンキナーゼ活性部位が存在する類似構造
を持つことが明かとなった。しかし、ＩＧＦ−II受容体
（以下ＩＧＦ−IIＲ）は上記受容体とはまったく異なる
構造を持つことが解明されている。すなわちＩＧＦ−II
Ｒは分子量２２０〜２７０Ｋのサブユニット構造を持た
ない単一タンパク質の受容体で、細胞内ドメインも短く
チロシンキナーゼ活性部位も存在しない。ＩＧＦ−IIＲ
細胞内ドメインに細胞内伝達機構に関連するような酵素
活性が認められないことで、一時期ＩＧＦ−IIＲはＩＧ
Ｆ−IIと結合はするが情報の伝達には関与しておらず、
ＩＧＦ−IIで認められる作用は全てインシュリン及びＩ
ＧＦ−Ｉ受容体への交差結合によるものであると考えら
れていた。その後、ＩＧＦ−IIＲがＩＧＦ−II及びマン
ノース−６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）両者に対する結
合部位を持ち、さらにＩＧＦ−IIに対しては細胞内ドメ
インがＧＴＰ結合Ｇ蛋白質との共役によりＣａ2+チャン
ネルを活性化することが示された。また、Ｃａ2+チャン
ネルをＩＧＦ−II以外の他の物質で活性化することによ
っても細胞の増殖が刺激されることから、ＩＧＦ−IIの
増殖刺激作用は最終的に細胞外Ｃａ2+の細胞内への流入
によって引き起こされることが実験的に証明された（Ｎ
ｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６２：１２１２０−１２１２６，１９８７／西本育
夫、蛋白質核酸酵素；臨時増刊、細胞増殖因子の基礎と
臨床、ｐｐ５２−６０、清水信義、高久史麿編、共立出
版、１９９１）
伴い、インシュリンとＩＧＦ−Ｉの受容体がα2 β2 の
サブユニット構造からなる四量体であり、また細胞内ド
メインにチロシンキナーゼ活性部位が存在する類似構造
を持つことが明かとなった。しかし、ＩＧＦ−II受容体
（以下ＩＧＦ−IIＲ）は上記受容体とはまったく異なる
構造を持つことが解明されている。すなわちＩＧＦ−II
Ｒは分子量２２０〜２７０Ｋのサブユニット構造を持た
ない単一タンパク質の受容体で、細胞内ドメインも短く
チロシンキナーゼ活性部位も存在しない。ＩＧＦ−IIＲ
細胞内ドメインに細胞内伝達機構に関連するような酵素
活性が認められないことで、一時期ＩＧＦ−IIＲはＩＧ
Ｆ−IIと結合はするが情報の伝達には関与しておらず、
ＩＧＦ−IIで認められる作用は全てインシュリン及びＩ
ＧＦ−Ｉ受容体への交差結合によるものであると考えら
れていた。その後、ＩＧＦ−IIＲがＩＧＦ−II及びマン
ノース−６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）両者に対する結
合部位を持ち、さらにＩＧＦ−IIに対しては細胞内ドメ
インがＧＴＰ結合Ｇ蛋白質との共役によりＣａ2+チャン
ネルを活性化することが示された。また、Ｃａ2+チャン
ネルをＩＧＦ−II以外の他の物質で活性化することによ
っても細胞の増殖が刺激されることから、ＩＧＦ−IIの
増殖刺激作用は最終的に細胞外Ｃａ2+の細胞内への流入
によって引き起こされることが実験的に証明された（Ｎ
ｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６２：１２１２０−１２１２６，１９８７／西本育
夫、蛋白質核酸酵素；臨時増刊、細胞増殖因子の基礎と
臨床、ｐｐ５２−６０、清水信義、高久史麿編、共立出
版、１９９１）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、限定
されない動物種及び／又は系統における未分化細胞特に
動物胚の培養並びに動物胚に由来するＥＳ細胞（株）及
び／又はＥＣ細胞（株）の樹立、樹立効率の向上、増殖
促進及び培養維持の安定化を図るために使用される培養
液に関するものである。
されない動物種及び／又は系統における未分化細胞特に
動物胚の培養並びに動物胚に由来するＥＳ細胞（株）及
び／又はＥＣ細胞（株）の樹立、樹立効率の向上、増殖
促進及び培養維持の安定化を図るために使用される培養
液に関するものである。
【００１４】
【課題を解決する手段及び作用】本発明者は上記の目的
を達成するために特許請求の範囲の各請求項に記載の発
明を完成した。
を達成するために特許請求の範囲の各請求項に記載の発
明を完成した。
【００１５】本発明におけるＩＧＦ−IIはいかなる動物
種由来のものでもよく、また自然界に存在する材料より
精製・抽出される天然型、遺伝子工学的に生産される組
換え型いずれでもよい。またラットＩＧＦ−IIとも呼ば
れる ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＭＳＡ）（Ｍｏｓｅｓ
Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１０３：３８７，１９８０）のようなヒト以外の動物種
におけるＩＧＦ−IIの相同物質（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）
でもよい。さらにＩＧＦ−IIの基本構造及び／又はアミ
ノ酸配列を基礎とするいかなる部分ペプチド、変異体及
び修飾体をも使用することができる。
種由来のものでもよく、また自然界に存在する材料より
精製・抽出される天然型、遺伝子工学的に生産される組
換え型いずれでもよい。またラットＩＧＦ−IIとも呼ば
れる ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＭＳＡ）（Ｍｏｓｅｓ
Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１０３：３８７，１９８０）のようなヒト以外の動物種
におけるＩＧＦ−IIの相同物質（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）
でもよい。さらにＩＧＦ−IIの基本構造及び／又はアミ
ノ酸配列を基礎とするいかなる部分ペプチド、変異体及
び修飾体をも使用することができる。
【００１６】本発明における培養液はＥＳ／ＥＣ細胞
（株）の樹立及びＥＳ／ＥＣ細胞（株）の維持・増殖の
ためにＩＧＦ−IIもしくはＩＧＦ−II及びＬＩＦを含む
ことを特徴とする。該培養液の基礎培養液は既知の組成
からなるどのような培養液の選択も可能である。例えば
１９９、ＮＴＣＴ１３５，ＣＭＲＬ１０６６，ＢＭＥ，
ＭＥＭ，ＤＭＥ，ＭＢ７５２／１，５Ａ，ＲＩＴＣ８０
−７，Ｆ−１０，Ｆ−１２，Ｌ−１５，ＭＣＤＢ１０４
等の各種培養液及びその変法による培養液があげられ、
好ましくは高グルコ−ス含有培養液、さらに好ましくは
非必須アミノ酸混合液（ＮＥＡＡ）・核酸混合液（ＮＭ
Ｓ）・メルカプトエタノール・セレン化合物・副腎皮質
ホルモン及びその化合物・トランスフェリン・インシュ
リンの内から選ばれる添加物を添加した高グルコ−ス含
有培養液を用いる。このような培養液にさらに新生児牛
血清（ＮＣＳ）及び／又は牛胎児血清（ＦＣＳ）を１〜
５０％、好ましくは５〜３０％添加する。ＩＧＦ−IIは
１〜１００００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００
０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍ
ｌの濃度で使用され、ＬＩＦを使用する場合には１〜１
００００００ｕｎｉｔ／ｍｌ、好ましくは１００〜１０
００００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは１０００〜
１００００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度が用いられる。
（株）の樹立及びＥＳ／ＥＣ細胞（株）の維持・増殖の
ためにＩＧＦ−IIもしくはＩＧＦ−II及びＬＩＦを含む
ことを特徴とする。該培養液の基礎培養液は既知の組成
からなるどのような培養液の選択も可能である。例えば
１９９、ＮＴＣＴ１３５，ＣＭＲＬ１０６６，ＢＭＥ，
ＭＥＭ，ＤＭＥ，ＭＢ７５２／１，５Ａ，ＲＩＴＣ８０
−７，Ｆ−１０，Ｆ−１２，Ｌ−１５，ＭＣＤＢ１０４
等の各種培養液及びその変法による培養液があげられ、
好ましくは高グルコ−ス含有培養液、さらに好ましくは
非必須アミノ酸混合液（ＮＥＡＡ）・核酸混合液（ＮＭ
Ｓ）・メルカプトエタノール・セレン化合物・副腎皮質
ホルモン及びその化合物・トランスフェリン・インシュ
リンの内から選ばれる添加物を添加した高グルコ−ス含
有培養液を用いる。このような培養液にさらに新生児牛
血清（ＮＣＳ）及び／又は牛胎児血清（ＦＣＳ）を１〜
５０％、好ましくは５〜３０％添加する。ＩＧＦ−IIは
１〜１００００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００
０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍ
ｌの濃度で使用され、ＬＩＦを使用する場合には１〜１
００００００ｕｎｉｔ／ｍｌ、好ましくは１００〜１０
００００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは１０００〜
１００００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度が用いられる。
【００１７】本発明によれば、該培養液を使用する動物
胚及び動物胚に由来する細胞（株）の培養は既知のいか
なる培養方法をも用いることができる。また現在までに
ＥＳ／ＥＣ細胞（株）が樹立されていない動物種及び／
又は系統においてもＥＳ／ＥＣ細胞（株）の樹立が可能
となる。また既にＥＳ／ＥＣ細胞（株）が樹立されてい
る動物種及び／又は系統においても新規なＥＳ／ＥＣ細
胞（株）樹立効率の向上、培養維持の安定化及び増殖の
促進を図ることができる。このようにして多種多様なＥ
Ｓ／ＥＣ細胞（株）及びＥＳ／ＥＣ細胞クロ−ンを容易
に提供できるような培養液の開発は、ＥＳ／ＥＣ細胞を
用いたキメラ動物の作製及びキメラ動物を介するＴＧ動
物の作製を大きく進展させることが期待される。
胚及び動物胚に由来する細胞（株）の培養は既知のいか
なる培養方法をも用いることができる。また現在までに
ＥＳ／ＥＣ細胞（株）が樹立されていない動物種及び／
又は系統においてもＥＳ／ＥＣ細胞（株）の樹立が可能
となる。また既にＥＳ／ＥＣ細胞（株）が樹立されてい
る動物種及び／又は系統においても新規なＥＳ／ＥＣ細
胞（株）樹立効率の向上、培養維持の安定化及び増殖の
促進を図ることができる。このようにして多種多様なＥ
Ｓ／ＥＣ細胞（株）及びＥＳ／ＥＣ細胞クロ−ンを容易
に提供できるような培養液の開発は、ＥＳ／ＥＣ細胞を
用いたキメラ動物の作製及びキメラ動物を介するＴＧ動
物の作製を大きく進展させることが期待される。
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、従来特定の動物種及び
／又は系統のみに限定されていた未分化細胞特に動物胚
の培養並びに動物胚に由来するＥＳ／ＥＣ細胞（株）の
樹立が、多種多様な動物種及び／又は系統において可能
となり、また既にＥＳ／ＥＣ細胞（株）が樹立されてい
る動物種及び／又は系統においても新規なＥＳ／ＥＣ細
胞（株）樹立効率の向上並びに培養維持の安定化及び増
殖の促進を図ることができるようになるという効果があ
る。
／又は系統のみに限定されていた未分化細胞特に動物胚
の培養並びに動物胚に由来するＥＳ／ＥＣ細胞（株）の
樹立が、多種多様な動物種及び／又は系統において可能
となり、また既にＥＳ／ＥＣ細胞（株）が樹立されてい
る動物種及び／又は系統においても新規なＥＳ／ＥＣ細
胞（株）樹立効率の向上並びに培養維持の安定化及び増
殖の促進を図ることができるようになるという効果があ
る。
【００１９】
【実施例】以下に実施例を示す。但し、以下の実施例
は、上記の特許の請求範囲を制限するものではない。
は、上記の特許の請求範囲を制限するものではない。
【００２０】実施例１：初期胚及び／又はＥＳ細胞培養液の調製 高グルコ−ス含有ＤＭＥ培養液（ＤＭＥ；ＧＩＢＣＯ，
３２０−１９６５ＰＪ）を基礎培養液とし、これに表１
に示す組成の核酸混合液（ＮＭＳ）、非必須アミノ酸溶
液（ＮＥＡＡ；ＳＩＧＭＡ，Ｍ７１４５）、牛胎児血清
（ＦＣＳ；ＣＣＴ）、組換えマウスＬＩＦ（ｒｍＬＩ
Ｆ；和光純薬）をそれぞれ表２及び表３に示す量・濃度
で加えて調製した。なお培養液に添加される天然型ラッ
トＩＧＦ−II（ｎｒＩＧＦ−II；ＳＩＧＭＡ，Ｉ−２６
３９）濃度によって、１００ｎｇ／ｍｌとしたＥＳＭ／
ＮＲ１（表２）並びに５０ｎｇ／ｍｌとしたＥＳＭ／Ｎ
Ｒ２（表３）に示す二種類の培養液を調製した。
３２０−１９６５ＰＪ）を基礎培養液とし、これに表１
に示す組成の核酸混合液（ＮＭＳ）、非必須アミノ酸溶
液（ＮＥＡＡ；ＳＩＧＭＡ，Ｍ７１４５）、牛胎児血清
（ＦＣＳ；ＣＣＴ）、組換えマウスＬＩＦ（ｒｍＬＩ
Ｆ；和光純薬）をそれぞれ表２及び表３に示す量・濃度
で加えて調製した。なお培養液に添加される天然型ラッ
トＩＧＦ−II（ｎｒＩＧＦ−II；ＳＩＧＭＡ，Ｉ−２６
３９）濃度によって、１００ｎｇ／ｍｌとしたＥＳＭ／
ＮＲ１（表２）並びに５０ｎｇ／ｍｌとしたＥＳＭ／Ｎ
Ｒ２（表３）に示す二種類の培養液を調製した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
【表３】
【００２４】実施例２：支持細胞層の調製 Ｗｉｓｔａｒ系ラットとＡＣＩ系ラットを交配して得ら
れる妊娠１５日齢胎仔を摘出、試験管内で細切し、さら
にトリプシン−ＥＤＴＡ処理により消化・分散した後、
１０％牛新生児血清（ＮＣＳ；ＧＩＢＣＯ）添加ＤＭＥ
培養液に浮遊させた。次に細胞浮遊液をプラスティック
ディッシュに分注し、３７℃、５％ＣＯ2 の環境下で１
時間培養した。培養１時間後ディッシュをＣａ2+／Ｍｇ
2+不含ダルベッコ変法リン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ
（−））で洗浄して浮遊細胞を除去、底面に付着した線
維芽細胞のみを培養した。
れる妊娠１５日齢胎仔を摘出、試験管内で細切し、さら
にトリプシン−ＥＤＴＡ処理により消化・分散した後、
１０％牛新生児血清（ＮＣＳ；ＧＩＢＣＯ）添加ＤＭＥ
培養液に浮遊させた。次に細胞浮遊液をプラスティック
ディッシュに分注し、３７℃、５％ＣＯ2 の環境下で１
時間培養した。培養１時間後ディッシュをＣａ2+／Ｍｇ
2+不含ダルベッコ変法リン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ
（−））で洗浄して浮遊細胞を除去、底面に付着した線
維芽細胞のみを培養した。
【００２５】胎仔線維芽細胞を支持細胞層として使用す
るためマイトマイシンＣ処理を行った。線維芽細胞が十
分に増殖し単層シートを形成したディッシュに、１０ｕ
ｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含む１０％ＮＣＳ添加Ｄ
ＭＥ培養液を分注し、２〜３時間、３７℃、５％ＣＯ2
の環境下に放置した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄、
次にトリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を分散した。
分散した細胞を遠心により沈澱回収後、１０％ＮＣＳ添
加ＤＭＥ培養液に再浮遊し、この細胞浮遊液を６穴プレ
ートの各ウェルに分注して支持細胞層とした。
るためマイトマイシンＣ処理を行った。線維芽細胞が十
分に増殖し単層シートを形成したディッシュに、１０ｕ
ｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含む１０％ＮＣＳ添加Ｄ
ＭＥ培養液を分注し、２〜３時間、３７℃、５％ＣＯ2
の環境下に放置した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄、
次にトリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を分散した。
分散した細胞を遠心により沈澱回収後、１０％ＮＣＳ添
加ＤＭＥ培養液に再浮遊し、この細胞浮遊液を６穴プレ
ートの各ウェルに分注して支持細胞層とした。
【００２６】実施例３：ＥＳＭ／ＮＲによるＷｉｓｔａｒ系ＥＳ細胞株の樹立 Ｗｉｓｔａｒ系ラット同士を交配し、交配確認翌日をｄ
ａｙ１としてｄａｙ４に子宮潅流によって脱出胚盤胞を
得た（図１）。脱出胚盤胞を上記の支持細胞層上でＥＳ
Ｍ／ＮＲ１を用いて培養することにより、培養開始後３
〜４日目に全ての胚盤胞においてＩＣＭの増殖が観察さ
れ（図２）、増殖したＩＣＭをマイクロピペットで分離
して新たな支持細胞層上に移した（図３）。分離ＩＣＭ
以降の培養にはＥＳＭ／ＮＲ２を使用し、未分化形態を
示すコロニーを１〜３回クローニングすることにより未
分化形態を示す細胞のみからなる細胞集団を得た（図
４）。
ａｙ１としてｄａｙ４に子宮潅流によって脱出胚盤胞を
得た（図１）。脱出胚盤胞を上記の支持細胞層上でＥＳ
Ｍ／ＮＲ１を用いて培養することにより、培養開始後３
〜４日目に全ての胚盤胞においてＩＣＭの増殖が観察さ
れ（図２）、増殖したＩＣＭをマイクロピペットで分離
して新たな支持細胞層上に移した（図３）。分離ＩＣＭ
以降の培養にはＥＳＭ／ＮＲ２を使用し、未分化形態を
示すコロニーを１〜３回クローニングすることにより未
分化形態を示す細胞のみからなる細胞集団を得た（図
４）。
【００２７】実施例４：ＥＳＭ／ＮＲによるＡＣＩ系ＥＳ細胞株の樹立 上記Ｗｉｓｔａｒ系ラットの場合と同様に、ＡＣＩ系ラ
ット同士を交配し、交配確認翌日をｄａｙ１としてｄａ
ｙ４に子宮潅流によって胚盤胞を得た。胚盤胞を上記の
支持細胞層上でＥＳＭ／ＮＲ１を用いて培養することに
より、培養開始後３〜４日目に全ての胚盤胞においてＩ
ＣＭの増殖が観察され、増殖したＩＣＭをマイクロピペ
ットで分離して新たな支持細胞層上に移した。分離ＩＣ
Ｍ以降の培養にはＥＳＭ／ＮＲ２を使用し、未分化形態
を示すコロニーを１〜３回クローニングすることにより
未分化形態を示す細胞のみからなる細胞集団を得た。Ｅ
ＳＭ／ＮＲを使用したＡＣＩ系ＥＳ細胞株の樹立結果を
表４に示す。
ット同士を交配し、交配確認翌日をｄａｙ１としてｄａ
ｙ４に子宮潅流によって胚盤胞を得た。胚盤胞を上記の
支持細胞層上でＥＳＭ／ＮＲ１を用いて培養することに
より、培養開始後３〜４日目に全ての胚盤胞においてＩ
ＣＭの増殖が観察され、増殖したＩＣＭをマイクロピペ
ットで分離して新たな支持細胞層上に移した。分離ＩＣ
Ｍ以降の培養にはＥＳＭ／ＮＲ２を使用し、未分化形態
を示すコロニーを１〜３回クローニングすることにより
未分化形態を示す細胞のみからなる細胞集団を得た。Ｅ
ＳＭ／ＮＲを使用したＡＣＩ系ＥＳ細胞株の樹立結果を
表４に示す。
【００２８】
【表４】
【００２９】実施例５：ＥＳＭ／ＮＲによるラットＥＳ細胞の維持及び増殖 ＥＳＭ／ＮＲ２及びＥＳＭ／ＮＲ２からｎｒＩＧＦ−II
を除いたＥＳＭ／ＮＲ２Ｉ(-) を使用し、それぞれ６穴
プレ−トに作製した支持細胞層上でＡＣＩ系ＥＳ細胞を
培養した。培養２日目においてＥＳＭ／ＮＲ２を使用し
た培養ではＥＳ細胞は未分化形態を保持したまま増殖し
たが（図５）、ＥＳＭ／ＮＲ２Ｉ(-) を使用した培養で
は大部分の細胞が分化した（図６）。以上の比較培養の
結果から、ＥＳ細胞の維持・増殖にはＩＧＦ−IIが不可
欠であることが判明した。
を除いたＥＳＭ／ＮＲ２Ｉ(-) を使用し、それぞれ６穴
プレ−トに作製した支持細胞層上でＡＣＩ系ＥＳ細胞を
培養した。培養２日目においてＥＳＭ／ＮＲ２を使用し
た培養ではＥＳ細胞は未分化形態を保持したまま増殖し
たが（図５）、ＥＳＭ／ＮＲ２Ｉ(-) を使用した培養で
は大部分の細胞が分化した（図６）。以上の比較培養の
結果から、ＥＳ細胞の維持・増殖にはＩＧＦ−IIが不可
欠であることが判明した。
【００３０】実施例６：ラットＥＳ細胞の分化誘導培養 ＥＳＭ／ＮＲで樹立した Ｗｉｓｔａｒ系ＥＳ細胞を浮
遊培養することにより、分化能保持の指標となる胚様体
（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）の形成について検討し
た。
遊培養することにより、分化能保持の指標となる胚様体
（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）の形成について検討し
た。
【００３１】未分化コロニーが十分に増殖しているｗｅ
ｌｌをトリプシン−ＥＤＴＡ処理により支持細胞層と共
に消化・分散し、さらに遠心によって細胞を沈澱・回
収、１０％ＮＣＳ添加ＤＭＥ培養液に再浮遊した。細胞
浮遊液をプラスティックディッシュに分注し、３７℃，
５％ＣＯ2 の環境下で１時間培養し、次にディッシュを
Ｄ−ＰＢＳ（−）で洗浄、非付着細胞のみを回収した。
洗浄液を遠心して浮遊細胞を沈澱・回収、１０％ＮＣＳ
添加ＤＭＥ培養液に再浮遊、この細胞浮遊液を浮遊培養
用ディッシュに分注することにより、ＥＳ細胞のみを浮
遊培養した。
ｌｌをトリプシン−ＥＤＴＡ処理により支持細胞層と共
に消化・分散し、さらに遠心によって細胞を沈澱・回
収、１０％ＮＣＳ添加ＤＭＥ培養液に再浮遊した。細胞
浮遊液をプラスティックディッシュに分注し、３７℃，
５％ＣＯ2 の環境下で１時間培養し、次にディッシュを
Ｄ−ＰＢＳ（−）で洗浄、非付着細胞のみを回収した。
洗浄液を遠心して浮遊細胞を沈澱・回収、１０％ＮＣＳ
添加ＤＭＥ培養液に再浮遊、この細胞浮遊液を浮遊培養
用ディッシュに分注することにより、ＥＳ細胞のみを浮
遊培養した。
【００３２】以上の操作により、Ｗｉｓｔａｒ系ＥＳ細
胞を浮遊培養した結果、培養開始後１〜２日目に分散し
ていた細胞が凝集し始め、さらに５〜７日目には球形で
内部が中空の胚様体へと分化した（図７）。
胞を浮遊培養した結果、培養開始後１〜２日目に分散し
ていた細胞が凝集し始め、さらに５〜７日目には球形で
内部が中空の胚様体へと分化した（図７）。
【図１】図１は、Ｗｉｓｔａｒ系ラットより採取した脱
出胚盤胞を示す。
出胚盤胞を示す。
【図２】図２は、支持細胞層上で胚盤胞より増殖してい
る内部細胞塊（ＩＣＭ）を示す。
る内部細胞塊（ＩＣＭ）を示す。
【図３】図３は、新たな支持細胞層上に移された内部細
胞塊（ＩＣＭ）を示す。
胞塊（ＩＣＭ）を示す。
【図４】図４は、コロニークローニングにより得られた
未分化形態細胞コロニーを示す。
未分化形態細胞コロニーを示す。
【図５】図５は、ＩＧＦ−II添加培養液（ＥＳＭ／ＮＲ
２）により増殖した未分化形態コロニーを示す。
２）により増殖した未分化形態コロニーを示す。
【図６】図６は、ＩＧＦ−II未添加培養液（ＥＳＭ／Ｎ
Ｒ２Ｉ(-) ）により出現した分化形態コロニーを示す。
Ｒ２Ｉ(-) ）により出現した分化形態コロニーを示す。
【図７】図７は、浮遊培養により形成された胚様体を示
す。
す。
Claims (12)
- 【請求項１】 多能性及び／又は全能性分化能を持つ未
分化細胞に対して分化抑制及び／又は増殖促進効果を有
するインシュリン様成長因子II型。 - 【請求項２】 請求項１において、未分化細胞である動
物胚に対して分化抑制及び／又は増殖促進効果を有する
インシュリン様成長因子II型。 - 【請求項３】 請求項１において、動物胚に由来する未
分化細胞に対して分化抑制及び／又は増殖促進効果を有
するインシュリン様成長因子II型。 - 【請求項４】 請求項３において、動物胚に由来する細
胞が胚性奇形腫細胞（株）である、未分化細胞に対して
分化抑制及び／又は増殖促進効果を有するインシュリン
様成長因子II型。 - 【請求項５】 請求項３において、動物胚に由来する細
胞が胚性幹細胞（株）である、未分化細胞に対して分化
抑制及び／又は増殖促進効果を有するインシュリン様成
長因子II型。 - 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれかのインシュ
リン様成長因子II型、又はこれに加えて白血病抑制因子
を有効成分として含有することを特徴とする試験管内培
養において動物胚より胚性奇形腫細胞を樹立するために
用いる培養液。 - 【請求項７】 請求項１ないし５のいずれかのインシュ
リン様成長因子II型、又はこれに加えて白血病抑制因子
を有効成分として含有することを特徴とする試験管内培
養において動物胚より胚性幹細胞を樹立するために用い
る培養液。 - 【請求項８】 請求項１ないし５のいずれかのインシュ
リン様成長因子II型、又はこれに加えて白血病抑制因子
を有効成分として含有することを特徴とする試験管内培
養において胚性胚性奇形腫細胞を増殖及び／または維持
するために用いる培養液。 - 【請求項９】 請求項１ないし５のいずれかのインシュ
リン様成長因子II型、又はこれに加えて白血病抑制因子
を有効成分として含有することを特徴とする試験管内培
養において胚性幹細胞を増殖及び／または維持するため
に用いる培養液。 - 【請求項１０】 請求項６ないし９のいずれかにおい
て、インシュリン様成長因子II型及び／又は白血病抑制
因子が天然型であることを特徴とする培養液。 - 【請求項１１】 請求項６ないし９のいずれかにおい
て、インシュリン様成長因子II型及び／又は白血病抑制
因子が組換え型であることを特徴とする培養液。 - 【請求項１２】 請求項６ないし１１のいずれかにおい
て、インシュリン様成長因子II型または白血病抑制因子
がその活性を有するアミノ酸配列の全長を含むかもしく
はその活性を有する断片長ペプチドを含むことを特徴と
する培養液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4083867A JPH05304951A (ja) | 1992-04-06 | 1992-04-06 | 初期胚及び胚性幹細胞の培養液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4083867A JPH05304951A (ja) | 1992-04-06 | 1992-04-06 | 初期胚及び胚性幹細胞の培養液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05304951A true JPH05304951A (ja) | 1993-11-19 |
Family
ID=13814622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4083867A Pending JPH05304951A (ja) | 1992-04-06 | 1992-04-06 | 初期胚及び胚性幹細胞の培養液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05304951A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997030151A1 (en) * | 1996-02-16 | 1997-08-21 | The University Of Edinburgh | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| WO1997045127A1 (en) * | 1996-05-28 | 1997-12-04 | Polifarma S.P.A. | Uridine-comprising therapeutic active agent for treatment of neurodegenerative disorders |
| JP2002525042A (ja) * | 1998-09-11 | 2002-08-13 | ユニヴァーシティー オブ エディンバラ | 胚幹細胞の増殖および／または誘導 |
| US8137966B2 (en) | 2004-03-04 | 2012-03-20 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Rat embryonic stem cell |
-
1992
- 1992-04-06 JP JP4083867A patent/JPH05304951A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997030151A1 (en) * | 1996-02-16 | 1997-08-21 | The University Of Edinburgh | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| WO1997045127A1 (en) * | 1996-05-28 | 1997-12-04 | Polifarma S.P.A. | Uridine-comprising therapeutic active agent for treatment of neurodegenerative disorders |
| JP2002525042A (ja) * | 1998-09-11 | 2002-08-13 | ユニヴァーシティー オブ エディンバラ | 胚幹細胞の増殖および／または誘導 |
| US8137966B2 (en) | 2004-03-04 | 2012-03-20 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Rat embryonic stem cell |
| US8628957B2 (en) | 2004-03-04 | 2014-01-14 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Rat embryonic stem cell |
| US9700023B2 (en) | 2004-03-04 | 2017-07-11 | Ds Pharma Biomedical Co., Ltd. | Rat embryonic stem cell |
| US10561122B2 (en) | 2004-03-04 | 2020-02-18 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Genetically modified rat derived from rat embryonic stem cell |
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