CN101827933B - 治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法 - Google Patents

治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN101827933B
CN101827933B CN200880102321.5A CN200880102321A CN101827933B CN 101827933 B CN101827933 B CN 101827933B CN 200880102321 A CN200880102321 A CN 200880102321A CN 101827933 B CN101827933 B CN 101827933B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
epo
anemia
colony
kidney
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200880102321.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101827933A (zh
Inventor
A·阿塔拉
J·尤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wake Forest University Health Sciences
Original Assignee
Wake Forest University Health Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wake Forest University Health Sciences filed Critical Wake Forest University Health Sciences
Publication of CN101827933A publication Critical patent/CN101827933A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101827933B publication Critical patent/CN101827933B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1031—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects thereof, e.g. conductivity or capacity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/25—Urinary tract cells, renal cells
    • C12N2502/256—Renal cells
    • G01N15/01—
    • G01N2015/1028—

Abstract

本文提供了获自肾的分化细胞的分离的肾细胞群体，其中细胞已在体外扩增。肾细胞可包括肾的肾小管周围间质细胞，并且优选产促红细胞生成素(EPO)。还可基于EPO的产生选择肾细胞。还提供了产生分离的产生EPO的细胞群体的方法，以及提供了在有此需要的患者中治疗导致减少的EPO产量的肾病的方法，包括对患者施用所述群体，从而细胞可在体内产生EPO。

Description

治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法
相关申请
本申请要求保护在2007年6月8日提交的美国临时专利申请系列号60/942,716的35U.S.C.§119(e)下的权益，其公开内容以其全文引用的方式合并入本文。
发明领域
本发明在用于恢复器官功能的选择性细胞疗法的领域内。
发明背景
慢性肾功能衰竭的特征在于肾功能的渐进丧失，并且最终可进行至终末期肾功能衰竭，此时肾不再以维持身体的水平发挥功能作用。终末期肾功能衰竭是牵涉受累者的多个器官的破坏性疾病。在美国终末期肾病的最常见病因是糖尿病。
由肾脏进行的功能之一是产生促红细胞生成素(EPO)。当肾正常发挥功能时，肾间质中的低组织氧合作用(tissue oxygenation)刺激间质细胞产生EPO。分泌的EPO接着刺激骨髓中红细胞产生，这使组织氧压恢复至正常水平。由无效造血(ineffective hematopoiesis)所致的贫血是由于肾减小的产生EPO的能力引起的慢性肾功能衰竭的不可避免的一个结果。也已报导EPO具有抗氧化应激和细胞凋亡的保护作用。
肾是身体中EPO的主要产生者，从而是治疗肾功能衰竭诱导的贫血的主要靶。虽然透析可延长许多终末期肾病患者的存活，但目前只有肾移植才可恢复正常功能。然而，肾脏移植严重受限于临床供体不足。
多年来用于缓解与肾功能衰竭相关的贫血的治疗包括反复地输入红细胞以及施用睾酮和其他促蛋白合成类固醇(anabolic steroid)。然而，此类治疗方法一直以来没有一个是完全令人满意的。接受反复输血的患者遭受铁超负荷(iron overload)，并且可产生抗主要组织相容性抗原的抗体。睾酮对骨髓中红细胞生成作用最小，并且其与不期望的男性化副作用相关。
之前减轻与肾功能衰竭相关的贫血的努力包括施用纯化的重组EPO(参见，授予例如Cheung等人的美国专利6,747,002，授予Westenfelde等人的6,784,154)。然而，重组EPO的施用只是暂时提高了血液中的EPO水平，并且可导致缺铁症。也一直在寻求其中使用转染的宿主细胞产生EPO的基因治疗方法(参见，例如，授予Selden等人的美国专利5,994,127，授予Aebischer等人的5,952,226，授予Carcagno等人的6,777,205；Rinsch等人(2002)Kidney International 62：1395-1401)。然而，这些方法牵涉非肾细胞的转染，并且需要在移植后防止抗原识别和免疫排斥的技术例如细胞包囊化(cell encapsulation)。此外，使用外源DNA的转染可能是不稳定的，随着时间的过去，细胞可丧失它们表达EPO的能力。
基于肾细胞的替换肾组织的方法受到对鉴定肾细胞和以足够的数量扩增其的需要的限制。此外，用于肾组织工程目的的肾细胞的培养因肾的独特结构和细胞异质性而特别困难。肾脏是具有多种功能(包括废物排泄、身体内环境稳定(body homeostasis)、电解质平衡、溶质运输以及激素产生)的复杂器官。
仍然存在对用于缓解肾细胞的衰竭所致的贫血以产生足够量的促红细胞生成素的备选治疗选择的巨大需要。
发明概述
在本发明的实施方案中本文提供了从已进行了传代和/或体外扩增的肾的分化细胞收获的分离的肾细胞群体。在一些实施方案中，肾细胞包括肾脏的肾小管周围间质细胞和/或内皮细胞。在一些实施方案中，肾细胞由或基本上由获自肾组织的并且体外传代的肾的肾小管周围间质细胞和/或内皮细胞组成。在一些实施方案中，细胞产生促红细胞生成素(EPO)。在另外的实施方案中，选择肾细胞来进行EPO产生。
还提供了产生分离的产生EPO的细胞群体的方法，该方法包括步骤：1)收获分化肾细胞；和2)将分化肾细胞传代，其中细胞在所述传代后产生EPO；从而产生分离的产生EPO的细胞群体。在一些实施方案中，方法还包括选择分化肾细胞来进行EPO产生的的步骤。在一些实施方案中，传代步骤包括在包含胰岛素转铁蛋白硒(ITS)的培养基中培养分化肾细胞。
还提供了治疗有此需要的受试者(例如，患者)中导致减少的EPO产量的肾病或其他不适(ailment)的方法，该方法包括步骤：1)提供分离的产生EPO的细胞群体；和2)对受试者施用所述群体(例如，以有效治疗肾病和/或减少的EPO产量的量)，从而产生EPO的细胞体可在体内产生EPO。在一些实施方案中，通过收获肾的分化肾细胞并且在体外传代细胞来进行提供步骤。在一些实施方案中，产生EPO的细胞群体包括，由或基本上由获自肾的分化细胞的并且体外传代的肾小管周围内皮细胞和/或间质细胞组成。在一些实施方案中，在适当的载体(例如，胶原凝胶)中提供所述群体以便施用。在一些实施方案中，通过将细胞群体植入患者的肾来进行施用步骤。在一些实施方案中，施用步骤通过皮下注射或植入所述组合物来进行。在一些实施方案中，产生EPO的细胞是人细胞。
还提供了分离的细胞群体，其包括获自人肾组织并且已进行体外传代的分化人肾细胞。在一些实施方案中，肾细胞由或基本上由获自肾组织的并且已进行体外传代的肾的肾小管外周间质细胞和/或内皮细胞组成。在一些实施方案中，分化人肾细胞产生促红细胞生成素(EPO)。在一些实施方案中，人肾细胞已传代1至20次。在一些实施方案中，人肾细胞已传代至少3次。在一些实施方案中，群体已被选择用于EPO产生。一些实施方案以不使用编码多肽的外源DNA转染细胞为条件。
还提供了包含如本文所述的人肾细胞群体和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，载体包括胶原。
本发明的另一个方面是如本文所述的方法用于制备组合物或药剂或用于制造如本文所述的制品的用途，所述组合物或药剂用于治疗或用于进行如本文所述的治疗方法(例如，用于治疗导致减少的EPO产量的肾病或其他不适)。
附图概述
图1.促红细胞生成素(EPO)产生的机制。肾的肾间质管周细胞(Renal interstitial peritubular cell)检测到低血氧水平，然后将EPO分泌入血液。EPO刺激红系祖细胞(erythroid progenitor)的增殖和至网织红细胞的分化，并且阻止细胞凋亡，从而引起更多的网织红细胞进入循环血液。网织红细胞分化成红细胞，从而增加了红细胞系的数量。从而增加了氧至组织的输送。
图2.与阴性对照(X400)相比较，在第一代1(P1)、第2代(P2)和第3代(P3)于肾细胞的原代培养物中确认了细胞内促红细胞生成素的免疫反应性。
图3.肾组织(左图)和培养肾细胞(右图)中促红细胞生成素表达细胞的显微镜图像。
图4.产生促红细胞生成素(EPO)的细胞的定量。表达EPO的细胞数目随着后续传代而减少(*p＜0.05)。
图5.去污剂溶解的细胞提取物的Western印迹分析检测到早期代原代培养的肾细胞(P0-P3)的EPO蛋白(34kDa)。
图6.使用FACS进行的EPO表达分析。顶行：小鼠细胞，第0至3代。底行：大鼠细胞，第0至3代。
图7A-7B.小鼠肾细胞的表征。通过免疫荧光(图7A)确认EPO表达(KNRK细胞用作正对照)。也检测到GLEPP1和Tamm Horsfall肾标记(图7B)。
图8.大鼠肾细胞的表征。培养大鼠肾细胞具有不同细胞形态学，如由相差显微镜(左图)所显示的，并且表达GLEPP1和Tamm Horsfall肾标记(右图)。
图9.通过western印迹显示EPO在HepG2细胞中的表达，将其与肾细胞中的EPO表达相比较。
图10.在低氧条件下的培养细胞的EPO蛋白的表达。在正常和低氧条件下培养Lewis大鼠肾细胞和HepG2细胞，通过细胞的western印迹估量EPO产量。34kDa＝EPO；43kDa＝β-肌动蛋白。
图11.在低氧条件下培养基中EPO蛋白质的表达。通过western印迹法估量Lewis大鼠肾细胞和HepG2细胞的培养基中的EPO。34kDa＝EPO；43kDa＝β-肌动蛋白。
图12.从第1和2代大鼠肾原代细胞制备总蛋白裂解物。处理来自含氧量正常的样品(NC)、3％O2和7％O2中的样品的培养皿，在10％SDS-PAGE上进行电泳。KNRK细胞系用作正对照。
图13.通过western印迹测量培养基浓缩物中的EPO。在各代将来自Lewis大鼠的原代培养细胞在10cm培养皿上培养至接近汇合。用KSFM饥饿细胞24小时，然后置于低氧箱(1％O2)中进行24、48或72小时。在低氧温育后，收集培养基，用10K分子量筛截amicon超离心装置(Millipore)进行浓缩。然后将40ug总蛋白上样在10％聚丙烯酰胺凝胶上。KNRK细胞用作正对照。
图14.取回的植入物的组织学分析显示肾细胞在体内存活并且形成组织。使用EPO特异性抗体在组织免疫学上确认了EPO产生细胞的存在(X400)。左图：1x106个细胞/注射的初始细胞密度。右图：1x106个细胞/注射的初始细胞密度。每一个图的顶行：2周。每一个图的底行：4周。
图15.通过实时PCR测量的培养基和低氧对肾原代细胞的作用。将肾原代细胞(p0)在10cm培养皿中培养至80％的汇合。然后用无血清KSFM或DMEM培养3个培养皿的细胞并且置于3％O2的低氧箱中。在24小时后，处理样品以进行RNA和cDNA合成。以一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。
图16.通过实时PCR测量的低氧对肾原代细胞的作用。将肾原代细胞(第0代和第2代)在10cm培养皿中培养至80％的汇合。然后将细胞培养在无血清KSFM中并且置于1％O2的低氧箱中。在24、48或72小时后，然后处理样品以进行RNA和cDNA合成。以一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。
图17.通过实时PCR测量的低氧对肾原代细胞的作用。将肾原代细胞(第0代)在10cm培养皿中培养至80％的汇合。然后将细胞置于1％O2的低氧箱中进行达到24小时。然后处理样品以进行RNA和cDNA合成。以一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。
图18.扩增原代人肾细胞。显示了第2、4、7和9代的细胞。
图19.人原代肾细胞被保持通过20次倍增。
图20.人肾细胞的表征。GLEPP1和EPO阳性细胞存在于群体中。
图21.使用20mg/ml胶原载体进行的人肾细胞体内递送。在取回时，注射后3周，注射体积得到保持，并且存在新血管形成。
图22.胶原和培养的人肾细胞的注射胶原导致表达EPO的组织在体内形成。
优选实施方案的详述
可以以两个方向：总体地和选择性地进行用于肾功能衰竭的基于细胞的疗法。本文所描述的是用于实现特定功能器官组分的恢复的选择性细胞疗法。
本文引用的所有美国专利参考资料的公开内容以它们与本文所示的公开内容相一致的程度通过引用合并入本文。如本文所使用的，在本发明的描述和所附权利要求中，除非上下文清楚地指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”旨在也包括复数形式。此外，如本文所使用的，术语“大约”和“大致”当指测量值例如化合物的量、剂量、时间、温度等时，意指包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。同样，如本文所使用的，“和/或”或“/”是指和包括一个或更多个相关列出项的任何和所有可能组合和，当在二者选一(“或”)情况下解释时表示不存在组合。
“肾组织”是从肾分离或收获的组织，该组织包含肾细胞。在一些实施方案中，肾细胞对于一个或更多个已知的肾标记例如GLEPP1、Tamm Horsfall等是阳性的。“细胞”可以是任何适当的物种的细胞，在一些实施方案中是与向其中植入通过本文中的方法产生的组织的物种相同的物种的细胞。哺乳动物细胞(包括小鼠、大鼠、狗、猴子和人细胞)在一些实施方案中是特别优选的。如本文所使用的，“分离的”表示将细胞置于除了它们的天然环境外的环境中。当最初从受试者分离组织或细胞例如原代外植体时，它们就被“收获”。
“受试者”通常是人受试者，包括但不限于“患者”。受试者可以是男性或女性并且可以是任何种族，包括但不限于高加索人、非洲裔美国、非洲人、亚洲人、西班牙人、印度人等。受试者可以是任何年龄的人，包括新生儿、新生婴儿(neonate)、婴儿、儿童、青少年、成人和老年人。
受试者还可包括用于例如兽医学和/或药物开发目的动物受试者，特别地哺乳动物受试者例如犬科动物、猫科动物、牛族动物、山羊科动物(caprines)、马科动物、羊科动物(ovines)、猪、啮齿类动物(例如，大鼠和小鼠)、兔类动物、非人灵长类动物等。
细胞可以是同基因的(即，遗传上相同的或密切相关的，以使组织移植排斥降至最低)、同种异体的(即，来自相同物种的非遗传相同的成员)或异种的(即，来自不同物种的成员)。同基因细胞包括为自体的(即，来自待治疗的患者的)和等基因的(即，遗传上相同但不同受试者，例如来自相同双胞胎的)细胞。细胞可获自例如供体(即活的或尸体的)或来源于已建立的细胞株或细胞系。细胞可以例如使用本领域内已知的标准活检技术从供体收获。
“原代培养”是在将分离的细胞或原代外植体接种入培养容器后建立的首次培养。如本文所使用的，“扩增”是指活细胞的数目的增加。扩增可以通过例如将细胞“培养”通过一个或更多个细胞周期来实现，其中至少一部分细胞分裂，从而产生增加的细胞。
“体外传代的”或“传代的”是指将细胞培养物转移或再培养至第二培养容器，通常牵涉机械或酶促分离、再接种和取决于增殖速度，通常至两个或更多个子培养物的分配。如果就特定的基因型或表型选择群体，培养物在传代培养后变成“细胞株”，即，培养物是同质性的并且具有期望的特征(例如，表达EPO的能力)。
EPO的“表达”或“表现”意指编码EPO的基因被转录，和优选被翻译。通常，根据本发明，EPO编码区的表达将导致编码的多肽产生，这样细胞是“产生EPO的细胞”。在一些实施方案中，细胞产生EPO而无需另外的操作例如外源基因的导入。在一些实施方案中，本发明的条件是：不通过导入外源基因和/或利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理产生EPO的细胞。
在一些实施方案中，收获的细胞不进行传代。在其他实施方案中，将细胞传代一次、二次或三次。在其他实施方案中，将细胞传代3次以上。在一些实施方案中，将细胞传代0至1次、0至2次或0至3次。在一些实施方案中，将细胞传代1至2次、1至3次或1至4次或更多次。在一些实施方案中，将细胞传代2至3次、2至4次或更多次。在另外的实施方案中，将细胞传代5、8、10、12或15或更多次。在一些实施方案中，将细胞传代0、1、2、3或4至8、10、15或20或更多次。所用的传代次数可根据例如在每一次传代后细胞群体中测量的相对EPO产量来选择。
肾细胞的生长和扩增逐渐受到明显挑战，因为此类细胞易于停止生长和早期分化。在本发明的一些实施方案中通过使用包含促进它们生长的添加剂的肾细胞特异性培养基(kidney cell specific media)来克服该挑战。因此，在一些实施方案中，将肾细胞培养在包含添加剂例如生长因子和促进它们生长的其他补充剂的培养基中。此外，在一些实施方案中，将产生EPO的细胞与其他肾细胞类型共培养。
在一些实施方案中，将肾细胞培养在补充有10％胎牛血清(FBS)或fetal calf serum(FCS)和任选地青霉素-链霉素(P/S)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中。在其他实施方案中，将肾细胞培养在角质细胞无血清培养基(KSFM)中。在另外的实施方案中，将肾细胞培养在含有一种或更多种下列添加剂的KSFM中：牛垂体提取物(BPE)(例如，50g/mL)、表皮生长因子(EGF)(例如，5ng/mL)、抗生素-抗真菌药溶液(GIBCO)(例如，5mL)、胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-Product)(例如，12.5mL 2.5％)和胰岛素转铁蛋白硒(ITS)(Roche)(例如，对于5L培养基50mg)。如本领域技术人员所理解的，在上述培养基的一些实施方案中，青霉素-链霉素(P/S)与抗生素-抗真菌药溶液是可互换的。
根据本发明的肾细胞的传代可使用本领域内已知的标准方法来进行。例如，可使用胰蛋白酶/EDTA分解细胞，将其转移至其他培养皿。这是用于许多细胞类型的标准方法。简而言之，在一些实施方案中，这可使用下列步骤来进行：1)除去培养基；2)加入10ml PBS/EDTA(0.5M)进行4分钟，在相关显微镜下确认细胞连接的分离；3)除去PBS/EDTA，加入胰蛋白酶/EDTA；4)当在显微镜下80-90％的细胞浮起时加入5ml培养基；5)将细胞悬浮液抽吸入15ml试管中；6)以1000rpm离心细胞4分钟；7)除去上清液；8)将细胞重悬浮于5ml培养基中；9)用移液管吸出100μl细胞悬浮液，然后进行台盼蓝染色以进行存活率测定；10)在血细胞计数器上计数细胞的数目；11)在板上等分期望的细胞数目，使培养基的体积为总共10ml；12)将细胞置于培养箱中。
“选择”可基于将一种细胞类型与另一种相区别的任何独特性质，例如密度、大小、独特的标记、独特的代谢途径、营养需求、蛋白质表达、蛋白质分泌等。例如，可基于密度和大小使用离心梯度来选择细胞。可用荧光活化细胞分选术(fluorescent activated cell sorting)(FASC)、免疫磁珠分选术、磁性活化细胞分选术(magnetic activated cell sorting)(MASC)、淘选等来选择独特标记。可通过改变在其上(特别地在无血清环境中)培养细胞的培养基的营养成分的组成和/或量来利用独特的代谢途径和营养需求。可用不同的测定法例如ELISA检测蛋白质表达和/或分泌。
“产生EPO的细胞”是指其的至少一部分产生EPO(例如，至少20、30、40或50％或更多，或更优选60、70、80或90％或更多的细胞产生EPO)的分化细胞。在一些实施方案中，细胞产生EPO而无需另外的处理例如外源基因的导入。在一些实施方案中，本发明以不通过外源基因的导入和/或利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理产生EPO的细胞为条件。细胞可获自例如肾的肾小管周围间质细胞。在一些实施方案中，就它们产生EPO的能力来选择细胞。在其他实施方案中，通过细胞培养技术例如传代来在数量上扩增细胞。可使用来自肾和来自其他来源的具有产生EPO的特定功能的细胞。例如，EPO也可在肝中正常产生。
在肾中，通常已知EPO由肾小管周围间质细胞产生(图1)。在一些实施方案中，分离的分化肾细胞群体包括，由或基本上由肾的肾小管周围间质细胞组成，其由或基本上由80、90、95或99％或更多肾小管周围间质细胞和按数量计算不超过20、10、5或1％或更少的其他细胞类型组成。在其他实施方案中，分离的分化肾细胞群体包括其他细胞类型例如内皮管周细胞(endothelial peritubular cell)。
在一些实施方案中，分化肾细胞的分离群体包括，由或基本上由就EPO的产生而选择的肾细胞组成，其由或基本上由80、90、95或99％的或更多的产生EPO的细胞和按数目计算不超过20、10、5或1％的不表达EPO的细胞组成。选择可通过使用特异性标记选择表达EPO的细胞来实现。在一些实施方案中，细胞可包括不同的肾细胞类型，只要所述细胞表达EPO。在另外的实施方案中，可将整个肾细胞集落用于扩增和治疗。
在一些实施方案中，分离的分化肾细胞群体具有“长寿命”，这样当体外培养时它们就能够生长通过至少5、10、15、20、25或30或更多次的群体倍增。在一些实施方案中，当在体外培养时，细胞能够通过40、50或60或更多次群体倍增来增殖。
“分化的”是指具有特化功能例如EPO产生和/或已知的分化细胞的标记(例如GLEPP1和/或Tamm Horsfall肾细胞标记)的表达的细胞或包含所述细胞的群体。在该意义上，它们不是祖细胞或干细胞。本发明的一些实施方案以不在产生特化程度不太高的细胞群体的条件下对收获的分化细胞进行传代为条件。
备选地，在其他实施方案中，培养细胞以产生细胞系，该细胞系之后可分化产生更特化的细胞。与细胞株相反，“细胞系”的建立总地来说是未分化的，虽然它们可被定型至特定谱系。繁殖天然地有利于增殖表型，在一些实施方案中细胞可能需要通过例如变更培养条件来重新导入分化。存在许多本领域中已知的可在细胞系中诱导分化的分化因子(例如，细胞因子例如表皮形态发生素和HGF、维生素等)。
治疗方法
在一些实施方案中，可将产生EPO的细胞施用(例如，通过注射)至有此需要的受试者的肾(例如，施用入皮质和/或髓质)。在其他实施方案中，将产生EPO的细胞施用至身体的其他部位，例如肝、腹膜等。在一些实施方案中，经皮下、被膜下(subcapsular)等施用产生EPO的细胞。在另外的实施方案中，可通过植入本文所述的含有所述产生EPO的细胞的基质(例如，胶原凝胶支架)来施用产生EPO的细胞。在其他实施方案中，通过血管通路(vascular access)(例如，全身性或局部地)施用产生EPO的细胞。
可用本文所公开的方法治疗的疾病包括但不限于贫血。贫血包括但不限于与肾功能衰竭或终末期肾病相关的贫血、由化疗或放射治疗所致的贫血、慢性障碍例如慢性感染、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、AIDS所致贫血、恶性肿瘤所致贫血，早产儿贫血、甲状腺功能减退所致贫血、营养不良所致贫血(例如，缺铁症)和与血液病相关的贫血。
“治疗”是指为患者例如遭受或处于发生疾病(例如，肾病、贫血等)风险中的患者带来益处的任何类型的治疗。治疗包括为了改善患者的状况(例如，一个或更多个症状的缓解)、延迟疾病的发生或进展等目的而采取的行为和克制不要采取的行为。
其他内分泌系统可受益于本文公开的治疗，例如，产生维生素D的细胞疗法或血管紧张肽系统。参见，例如，授予Atala等人的美国专利申请公开号2005/0002915，其以引用的形式合并入本文。可使用来自肾和其他来源的具有特定功能的细胞，即可产生靶功能的细胞。例如，EPO也在肝中正常产生。
优选在施用前将细胞与药学上可接受的载体混合或将细胞接种至其上。“药学上可接受的”意指化合物或组合物适合于根据疾病的严重度和治疗的必要性施用至受试者以获得本文公开的治疗而无过度有害副作用。可使用本领域内熟知的技术制备这样的制剂。参见，例如，美国专利申请2003/0180289；Remington：The Science and Practice ofPharmacy，Alfonso R.Gennaro，editor，第20版Lippincott Williams &Wilkins：Philadelphia，PA，2000。载体可以是固体或液体，或两者(例如，水凝胶)，并且可以单位剂量制剂的形式与细胞一起配制。在一些实施方案中，以悬浮液的形式在载体中提供细胞来减少细胞的凝聚。在其他实施方案中，将细胞接种至生物可降解的支架或基质上。
在一些实施方案中，将细胞与适当的凝胶混合以便施用。可用于本发明的适当的凝胶包括但不限于琼脂、胶原、血纤蛋白、水凝胶等。除了凝胶以外，还可在本发明中使用其他支持性化合物。例如可将细胞外基质与支持性凝胶组合以最优化或功能化凝胶。还可将一种或更多种生长因子导入细胞悬浮液。
本发明的制剂包括通过注射或植入进行的胃肠外施用(例如，皮下、肌内、皮内、静脉内、动脉内、腹膜内注射)的制剂。在一个实施方案中，通过简单注射或通过置于适当的血管例如肾动脉中的导管进行的注射来进行施用。在一些实施方案中，通过“输注”进行施用，从而组合物经由静脉(例如，门静脉)被导入身体。在另一个实施方案中，以移植物的形式进行至如上所论述的待增强的器官或组织，例如肾和/或肝的施用。
“可生物降解的支架或基质”是对生物功能不具有毒性或有害作用并且能够被宿主降解成基本组成的任何物质。优选，支架或基质是多孔的，从而允许细胞沉积在基质的孔上和孔内。这样的制剂可通过将至少一个细胞群体提供至生物可降解支架以将该细胞群体接种在和/或接种入支架来制备。然后将接种的支架植入受体受试者的体内。
在一些实施方案中，通过将细胞(例如，存在于适当的载体中)直接注射入受试者的组织内来施用细胞。例如，可将细胞注射入肾(例如，肾的被膜下空间)。因为EPO产生的功能效应将是全身性的，因此还可通过注射入其他组织(例如，肝，皮下注射，等)来施用细胞。
还可被全身性递送细胞。在另外的实施方案中，将细胞递送至肾外组织(例如，肝)，因为EPO产生的功能效应的结果将是全身性的。参见，例如，the″Edmonton protocol，″an established delivery method，where cellsare infused into a patient′s portal vein(Shapiro等人(2000)N Engl J Med343：230-238)。
根据一个实施方案，如上所述，相对于将要治疗的受试者，给受试者施用的细胞可以是同基因的(即，遗传上相同的或密切相关的，从而将组织移植排斥降至最低)、同种异体的(即，来自相同物种的非遗传上相同的成员)或异种的(即，来自不同物种的成员)，这取决于其他步骤例如包囊化的存在或不存在或细胞的免疫抑制疗法的施用。同基因细胞包括为自体的(即，来自待治疗的患者)和等基因的(即，遗传上相同但不同受试者，例如来自相同双胞胎的)细胞。细胞可获自例如供体(即活的或尸体的)或来源于已建立的细胞株或细胞系。例如可使用可用于从供体(例如，生物支架移植物的潜在受者)获得细胞的方法，本领域内已知的标准活检技术。备选地，可从受试者收获细胞，对其进行体外扩增/选择，然后再导入相同的受试者(即，自体的)。
在一些实施方案中，以治疗有效量施用细胞。细胞的治疗有效剂量在受试者个体间将会有少许变化，并且将取决于因素例如受试者的年龄、体重和状况以及递送途径。可根据本领域技术人员已知的方法来测定这样的剂量。通常，在一些实施方案中，可以以单次一起施用或以数次分开的施用来提供1x105、1x106或5x106至1x107、1x108或1x109个细胞或更多个细胞/受试者的剂量。在其他实施方案中，可以以单次一起施用或以数次分开的施用来提供1至100x108个细胞/千克受试者体重的剂量。当然，必要时可提供后续施用(follow-up administration)。
可按照一些实施方案施用细胞来获得靶血细胞比容范围。理想的或靶血细胞比容范围在受试者个体之间会有变化，其取决于例如特定共病(comorbidities)。在一些实施方案中，靶血细胞比容是30至40％，在一些实施方案中，靶血细胞比容是33至38％，以及在一些实施方案中，靶血细胞比容是33至36％。当施用根据本发明的细胞时，可测量血细胞比容以及，如果想要或必要时，通过例如细胞的进一步植入和/或本领域内已知的其他方法(例如，补充以重组EPO)来校正血细胞比容。可将用于贫血和/或肾病治疗的其他方法与本文提供的治疗方法例如定制的蛋白质-热量摄入饮食(adapted protein-caloric intake diet)结合使用。
在另外的实施方案中，如果想要或必要时，可按照已知的技术对受试者施用抑制施用的细胞的移植排斥的药剂例如雷帕霉素、氮杂硫代嘌呤(azathioprine)、皮质类固醇、环孢霉素和/或FK506。参见，例如，R.Calne，美国专利5,461,058、5,403,833和5,100,899；也参见美国专利6,455,518、6,346,243和5,321,043。一些实施方案使用植入和免疫抑制的组合，这可使移植物排斥降至最低水平。可按需要重复植入以产生足够量的移植组织。
本发明将在下面非限定性实施例中进行更详细地解释。
实施例
贫血是因肾减小的通过肾小管周围间质细胞产生促红细胞生成素(EPO)的能力而引起的慢性肾功能衰竭的不可避免的结果。我们通过检查选择和扩增产生促红细胞生成素的细胞以用于基于细胞的治疗的可行性来研究产生促红细胞生成素的细胞的补充是否是肾功能衰竭诱导的贫血的可能治疗选择。
下列实施例证明产生EPO产生的细胞存在于获自小鼠和大鼠肾的肾细胞中。此外，使用下面描述的方法分离和扩增的细胞包括在检查的每一个培养阶段表达EPO的细胞。此外，培养物中表达EPO标记的细胞的实际百分比与正常肾组织中存在的该细胞群体一致(参见Yamaguchi-Yamada等人，J Vet Med Sci，67：891，2005；Sasaki等人，BiosciBiotechnol Biochem，64：1775，2000；Krantz，Blood，77：419，1991)。
实施例1.肾细胞原代培养物的扩增。培养扩增7至10天龄小鼠C57BL/6的肾细胞。将切碎的肾(小鼠的1个肾)置于装有15ml胶原酶/分散酶(0.2mg/ml)的50cc管中。将肾组织碎片与胶原酶/分散酶混合物(0.2mg/ml；15ml)一起在37℃振荡器中温育30分钟。向降解溶液中加入含有明胶的无菌PBS(20ml)(和明胶(DIFCO)2mg/ml)。将混合物通过70微米滤器过滤以除去未降解的组织碎片。充分混合收集的溶液(小心不要产生气泡)，将其分配至2个50cc管中。以1000(-1500)RPM离心管5分钟。弃去上清液，将每个管的沉淀重悬浮于3ml KSFM培养基。将DMEM培养基(10％FBS，5ml P/S)用于基质细胞，和将具有BPE、EGF、5ml抗生素-抗真菌药、12.5ml FBS(Gemini Bio-Product，2.5％)、含有BPE和EGF的胰岛素转铁蛋白硒(Roche)(50mg，用于5L培养基)的KSFM用于上皮组分。还可加入P/S或抗生素-抗真菌药(GIBCO)。将各组织接种在25mm培养皿上，加入培养基(总共3ml)。
通过第二天更换培养基，然后取决于细胞密度每2天更换一次培养基来维持细胞。当细胞达到80-90％汇合时，通过使用胰蛋白酶/EDTA使其脱离，然后利用下列步骤将其转移至其他培养皿来传代细胞：1)除去培养基；2)加入10ml PBS/EDTA(0.5M)进行4分钟，在相关显微镜下确认细胞连接的分离；3)除去PBS/EDTA，然后加入7ml胰蛋白酶/EDTA；4)当在显微镜下80-90％的细胞浮起时，加入5ml培养基；5)将细胞悬浮液吸入15ml试管；6)以1000rpm离心细胞4分钟；7)除去上清液；8)将细胞重悬浮于5ml培养基中；9)用移液器吸取100μl细胞悬浮液，进行台盼蓝染色以进行存活率测定；10)在血细胞计数器上计数细胞的数目；11)在板上等分期望的细胞数目，使培养基的体积为总共10ml；12)将细胞置于培养箱中。
备选地，使用下列方案。在含有10％的抗生素/抗真菌药(GibcoInvitrogen，Carlsbad，CA USA)的Krebs缓冲液(Sigma Aldrich，St.Louis，MO USA)中收集10天龄雄性C57BL/6小鼠的肾以避免感染的风险。立即将肾运送至培养通风柜(hood)，在培养通风柜中除去被膜。除去肾的髓状区，只将皮质组织用于分离之前已被鉴定为产生EPO的细胞的细胞(Maxwell等人，Kidney International，44：1149，1993)。切碎肾组织，使用Liberase Blendzyme(Roche，Mannheim，Germany)将其在37摄氏度下于摇动的水浴中酶促降解25分钟。移去上清液，将细胞沉淀通过100μm细胞过滤网以获得用于培养的单细胞悬浮液。
然后，将细胞以5x105个细胞/ml的密度涂板在10cm充满培养基的组织培养用培养皿中。培养基由比例为1∶1的角质细胞无血清培养基(KSFM)和预混合的达尔伯克氏改良伊格尔氏培(DMEM)的混合物组成。预混合的DMEM培养基包含3/4DMEM和1/4HAM’s F12营养混合物，其补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺100x(Gibco)、1ml的0.4μg/ml氢化可的松、5ml的10-10M霍乱毒素溶液、0.5ml的5mg/ml胰岛素溶液、12.5ml/500ml的1.2mg/ml腺嘌呤溶液、0.5ml的2.5mg/ml转铁蛋白+0.136mg/ml三碘甲腺原氨酸混合物和0.5ml的10μg/ml表皮生长因子(EGF)溶液。除非另外指出，否则所有组织培养试剂均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO USA)。将细胞在37℃于5％CO2下温育，每3天更换培养基一次，当汇合时以1∶3的比率传代培养细胞以进行扩增。
实施例2.EPO产生的表征。利用特异性抗EPO抗体(兔多克隆抗EPO抗体，sc-7956，Santa Cruz Technologies，Santa Cruz，California)使用免疫细胞化学和western印迹分析就EPO表达来表征来自早期代(1、2和3)的细胞。
将肾细胞以每孔3000个细胞的密度涂板在8孔培养腔室玻片(chamber slide)中。将细胞在37℃于5％CO2下温育24小时以允许附着。然后在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟。通过加入0.1％的PBS中的Triton-X 100在室温下进行3分钟来透化细胞膜。然后将细胞在室温下于山羊血清中温育30分钟。清洗后，将细胞在室温下与一抗一起温育1小时(1∶50)。第二次清洗细胞，加入生物素化山羊多克隆抗兔抗体(多克隆抗兔IgG，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，California)(1∶200)，然后在室温下温育45分钟。按照厂商说明书使用Vector ABC试剂盒(VectorLaboratories，Inc.，Burlingame，California)进行终清洗步骤后的EPO的显色检测。无一抗的玻片用作内部阴性对照，正常小鼠肾组织用作阳性对照。
培养中的肾细胞在显微镜下显示多个表型。细胞在涂板的7至10天内达到汇合。与阴性对照相(其显示无背景或非特异性染色)相比较，在从肾分离后的前3代中观察到许多细胞对于EPO呈阳性染色(图2)，这表明观察到的染色可能归因于EPO在培养物中的存在。对于EPO呈阳性染色的细胞的数目在研究的3代中保持恒定，甚至当在相同时期中在培养物中观察到表型变化时亦如此。肾组织的免疫组织化学染色显示与在培养细胞中观察到的相似的EPO表达量(图3)。
表达EPO的细胞的数目随着后续传代略微减少(图4)。这极可能归因于增加的传代次数和细胞/功能随时间流逝而丢失。然而，相对百分比在第1代后似乎保持稳定。
EPO表达也通过western印迹法来确认，示于图5中。
实施例3.小鼠和大鼠肾细胞的表征。将FACS分析用于在各代(1-3代)定量已建立的肾细胞培养物中产生EPO的细胞的数目。通过胰蛋白酶消化和离心收集细胞，将其重悬浮于培养基中，然后通过70μm细胞过滤网以确保单细胞悬浮物。在计数细胞后，将它们离心，然后以5-7.5x105个细胞/管重悬浮于PBS中以从细胞除去FBS。用2％多聚甲醛在4℃下固定细胞10分钟，在室温下用100％甲醇透化10分钟。然后，将细胞重悬浮于3％的PBS中的山羊血清中，之后在冰上与兔抗EPO一抗sc-7956(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，California)一起温育45分钟。用3％的PBS中的山羊血清清洗细胞2次，然后将其与异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的山羊抗兔第二抗体一起温育1小时。然后用3％的PBS中的血清充分清洗细胞，将其转移至FACS机器(FACS Calibur E6204，Becton-Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey)。
荧光活化细胞分选实验显示44％的第1代(P1)细胞是EPO阳性的。该百分比在第2代(P2)增加至82％，然后在第3代(P3)降回至42％。这可以表明，在培养的前几天中，产生EPO的细胞的增殖和/或EPO基因表达的上调响应培养基中的低氧浓度(与正常活组织相比较)而发生。然后此类反应在随后几天中可恢复正常，从而导致与在肾组织中发现的产生EPO的细胞的数目接近的产生EPO的细胞的数目(图6，顶行)。
FACS数据表明EPO表达在数代内得到维持。应当指出，在第2代培养中存在表达EPO的细胞数目(82％)的波动，这通过几次重复实验得以确认。虽然不希望受任何特定理论束缚，该现象的一个可能的解释可能是EPO表达是所有肾细胞的可在需要时打开和关闭的固有性状。在该情况下，在身体和培养皿之间的存活条件发生急剧改变后，细胞可能已被驱动至随时表达EPO直至培养的稳定化发生。与此相符，EPO的波动很快被逆转，第3代分析显示更低的产生EPO的细胞百分比(42％)。
通过免疫荧光进行的小鼠细胞表征确认了EPO表达(图7A)。细胞群体对于肾细胞标记GLEPP1和Tamm Horsfall是阳性的(图7B)。
也使用荧光活化细胞分选术(FACS)(图6，底行)就EPO的产生分析大鼠细胞第0、1和2代。培养的大鼠细胞具有不同的细胞形态学并且对于GLEPP1和Tamm Horsfall肾细胞标记呈阳性(图8)。
实施例4.产生EPO的培养物对低氧条件的暴露。虽然表型特征的维持在细胞扩增阶段是必需的，但确保细胞治疗的成功的关键组分是产生EPO的细胞调节和维持正常EPO水平的能力。EPO属于造血细胞因子家族，其控制骨髓中红细胞生成，并且通过EPO受体(EPOR)介导的信号转导调控红系祖细胞(erythroid progenitor cell)的增殖、分化和存活。EPO主要在肾中产生，当该器官功能衰竭时，EPO产量下降，从而导致贫血。身体中EPO的表达极大地依赖于能够产生EPO的细胞的周围环境中的氧张力。影响氧水平的因素包括环境空气中氧的缺乏和减少的肾血流量。
为了确定培养中的EPO表达性细胞是否可对变化的氧水平作出反应，进行了其中将细胞血清饥饿24小时，然后将其在体外暴露于不同的氧水平的实验。将Lewis大鼠肾细胞和HepG2(人肝细胞肝癌细胞系)细胞在正常和低氧条件下培养，利用细胞的western印迹法估量EPO产量和确认其。还通过使用
Figure GSB00000107151500172
Erythropoietin ELISA试剂盒(R&D
Figure GSB00000107151500173
Minneapolis，Minnesota)，利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定分析来自在含氧量正常和低氧条件下培养的肾细胞的上清液来测量和确认EPO在培养基中的存在。
在实验前，将细胞置于无血清培养基中进行24小时。然后将培养皿转移至低氧箱并且暴露于不同低氧条件(1％、3％、5％和7％的氧)。HepG2细胞用作正对照，因为之前已报导它们在培养中产生高水平的EPO(Horiguchi等人，Blood，96：3743)。通过EPO western印迹法确认HepG2的EPO表达(图9)。在含有NP-40的裂解缓冲液中收获所有细胞。使用Bio-Rad蛋白质测定法测量各样品中蛋白质浓度。通过使用SDS-PAGE，将40μg总蛋白在10％丙烯酰胺凝胶上进行电泳。然后将蛋白质转移至PVDF膜(Millipore Corp.)上。裂解物中β-肌动蛋白表达的检测用作上样对照。以1∶200使用EPO抗体(兔多克隆sc-7956，Santa CruzBiotechnology)以及以1∶2000使用二抗(山羊抗-兔7074，Cell SignalingTechnology，Beverly，Massachusetts)。为了测量原代肾培养物分泌入培养基的EPO的量，收集培养基，使用Amicon超速离心过滤装置(MilliporeCorporation，Billerica，Massachusetts)将其浓缩减少至500ul。将该培养基的样品在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。以1∶100使用EPO抗体(兔多克隆sc-7956，Santa Cruz Biotechnology)以及以1∶2000使用二抗(山羊抗-兔7074，Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA)。
Western印迹显示在低氧后细胞裂解物中EPO表达的少量增加(图10)。然而当将培养基浓缩物用于测量EPO时未看到这些结果O(图11)。培养基检测表明所有培养基浓缩物(低氧和含氧量正常的条件)包含相同的低EPO量。
备选地，在第1和2代从大鼠肾原代细胞制备总蛋白质裂解物。处理来自含氧量正常的样品(NC)、3％O2和7％O2中的样品的培养皿，然后在10％SDS-PAGE上进行电泳。KNRK细胞系用作正对照。结果示于图12中。
不希望受任何特定理论束缚，这可表明24小时可能是不足以使分泌的EPO水平升高至可被western印迹法检测到的水平的时间。细胞开始分泌EPO可能需要更长的暴露时间，因为从头的蛋白质产生可能要花费数小时才变得明显。因此进行下列实验，其中将细胞置于低氧条件进行24、48和72小时。
在各代在10cm培养皿中培养来自Lewis大鼠的原代培养细胞至接近汇合。将细胞置于低氧箱(1％O2)进行24、48或72小时。在低氧温育后，收集培养基，并且用10K分子量筛截Amicon超速离心装置(Millipore)进行浓缩。然后将40μg总蛋白上样于10％聚丙烯酰胺凝胶上。KNRK细胞用作正对照。结果示于图13。
概括地，所有实验表明原代培养细胞中的EPO水平高于或等于在HepG2阳性对照中测量的水平，并且产生EPO的细胞能够响应变化的环境。
实施例5.产生EPO的细胞的体内施用。为了确定产生EPO的细胞在体内是否存活和形成组织，将与胶原凝胶混合的肾细胞以1x106和5x106的浓度皮下植入于无胸腺小鼠，然后在植入后第14和28天取回以进行分析。使用处于1至5代的不同代的细胞。将细胞悬浮于胶原凝胶以便容易注射(浓度：0.1mg/ml)。
在组织学上，取回的植入物显示存活的肾细胞继续表达EPO蛋白，使用EPO特异性抗体在组织学上对其进行了确认(图14)。
这些结果证明在培养中生长和扩增的产生EPO的肾细胞稳定地体内表达EPO。因此，产生EPO的细胞可用作由慢性肾功能衰竭所致贫血的治疗选择。
实施例6.使用实时PCR进行的EPO表达的分析。进行实时PCR来估量响应低氧条件的EPO的大鼠细胞表达。
为了检测培养基的作用，将培养在KSFM和DMEM中的细胞暴露于低氧条件(3％O2)。将肾原代细胞(第0代)于10cm培养皿中培养至80％汇合。用无血清KSFM或DMEM培养3个培养皿的细胞，将其置于3％O2的低氧箱。在24小时后，处理样品以进行总RNA和cDNA合成。以一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。结果示于图15中。
利用实时PCR横跨24、48和72小时比较大鼠肾培养物的EPO表达。将肾原代细胞(第0和2代)在10cm培养皿中培养至80％汇合。然后将细胞培养在无血清KSFM中，并且置于1％O2的低氧箱中。在24、48或72小时后，处理样品以进行总RAN和cDNA合成。以一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。结果示于图16。
检测时间点直至24小时，将肾原代细胞(第0代)在10cm板中培养至80％汇合。然后将细胞置于1％O2的低氧箱中进行长达24小时。然后处理样品以进行总RNA和cDNA合成。以一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。结果示于图17中。
实施例7.人肾细胞的扩增。也使用上述培养基和条件证明原代人肾细胞的生长和可扩增性。来自第2、4、7和9代的培养物示于图18中。证明了人原代肾细胞可保持通过20次倍增(图19)。就EPO和GLEPP1表达表征人肾细胞培养物(图20)。
实施例8.通过胶原注射的人肾细胞递送。如上面实施例5中所述将在胶原凝胶中混合的人肾细胞皮下植入无胸腺小鼠。比较1mg/ml、2mg/ml和20mg/ml的胶原浓度。在1和2mg/ml上，在施用后体内体积消失。在20mg/ml上，体内注射体积得到保持，并且看到新血管形成图21。组织学确认在体内形成了表达EPO的组织(图22)。
实施例9.使用磁性细胞分选术进行的产生EPO的细胞的选择。使用磁性细胞分选术选择表达EPO的细胞。使用标准制备方法分离单细胞悬浮物。在制备单细胞悬浮物后，计数细胞的总数，离心细胞样品以获得沉淀。用10％的山羊血清(在其中制备二抗的动物的)封闭细胞，进行10分钟。加入1或2mL封闭溶液。在10分钟的离心后，将细胞重悬浮于EPO的一抗中(使用1μg的一抗/百万细胞)。通常，在4-8℃下标记15分钟就足够了。通过每107个细胞1-2mL缓冲液和在300×g下离心10分钟来清洗细胞2次以除去任何多余的一抗。在两次连续清洗后，以80μL的PBS(0.5％的BSA和2mM EDTA，pH 7.2)/107个细胞重悬浮细胞。每107个细胞加入20μL山羊抗兔MicroBead。充分混合，在4-8℃下温育15分钟。通过每107个细胞加入1-2mL缓冲液和在300×g下离心10分钟来清洗细胞两次。用移液器完全吸出上清液。于500μL缓冲液中重悬浮至108个细胞(注意：对于更高的细胞数目，相应地按比例扩增缓冲液体积；为了使用LD柱耗尽，将细胞沉淀重悬浮于500μL缓冲液至1.25×108个细胞).进行磁性细胞分离。
注意：操作要快，使细胞保持冷却，以及使用预冷溶液。这可防止抗体在细胞表面上的罩盖和非特异性细胞标记。下面给出的用于磁性标记的体积达到107个总细胞。当用少于107个细胞进行时，使用如所指定的相同体积。当用更高的细胞数目进行时，相应地按比例扩大所有试剂体积和总体积(例如，对于2×107总个细胞，使用2倍体积的所有指定的试剂体积和总体积)。在冰上的操作可能需要增加的温育时间。更高的温度和/或更长的温育时间导致非特异性细胞标记。
上述内容是本发明的举例说明，并且不被解释为其的限定。本发明由下列权利要求界定，权利要求的等同物包括在其中。

Claims (43)

1.分离的细胞群体，其包含从哺乳动物肾组织收获的且体外传代的分化肾小管周围间质细胞，其中所述群体的至少20%或更多细胞产生促红细胞生成素(EPO)。
2.权利要求1的细胞群体，其中所述群体的至少40%或更多细胞产生EPO。
3.权利要求1的细胞群体，其中所述群体的至少60%或更多细胞产生EPO。
4.权利要求1至3的任一项的细胞群体，其中所述群体进一步包括肾的内皮细胞。
5.权利要求1至3的任一项的细胞群体，其中所述群体已传代3次以上。
6.权利要求1至3的任一项的细胞群体，其中所述细胞是人细胞。
7.权利要求1至3的任一项的细胞群体，其中，条件是不用编码多肽的外源DNA转染所述细胞群体。
8.组合物，其包含权利要求1至7的任一项的细胞群体和药学上可接受的载体。
9.产生分离的产生EPO的细胞群体的方法，所述方法包括步骤：
提供分化肾细胞；和
将所述分化肾细胞传代，其中所述细胞在所述传代后产生EPO；
从而产生分离的产生EPO的细胞群体，其中所述群体的至少20%或更多细胞产生促红细胞生成素(EPO)。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞是人细胞。
11.权利要求9或10的方法，其中所述传代步骤包括在包含胰岛素转铁蛋白硒(ITS)的培养基中培养分化肾细胞。
12.权利要求9或10的方法，其中所述提供分化肾细胞的步骤中的所述分化肾细胞进一步包括肾的内皮细胞。
13.权利要求9或10的方法，其中，条件是不使用编码多肽的外源DNA转染所述产生EPO的细胞群体。
14.包含在药学上可接受的载体中的权利要求1的细胞的组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗有此需要的患者中的肾病，其中所述肾病的特征在于导致患者的EPO产量减少。
15.权利要求14的用途，其中所述药学上可接受的载体包含胶原凝胶。
16.权利要求14或15的用途，其中通过将所述药物注射入所述患者的肾或肝来施用所述药物。
17.权利要求14或15的用途，其中通过血管内注射或输注所述药物来施用所述药物。
18.权利要求14或15的用途，其中通过将所述药物输注入所述患者的门静脉来施用所述药物。
19.权利要求14的用途，其中所述药学上可接受的载体包含生物可降解的支架，并且通过将所述药物植入所述患者的肾来施用所述药物。
20.权利要求14或15的用途，其中所述细胞在不利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理的条件下产生EPO。
21.权利要求14或15的用途，其中，条件是不用编码多肽的外源DNA转染所述细胞。
22.权利要求14或15的用途，其中所述肾病是选自下列的贫血：肾功能衰竭所致贫血、终末期肾病所致贫血、化学治疗所致贫血、放射治疗所致贫血、慢性感染所致贫血、自身免疫性疾病所致贫血、类风湿性关节炎所致贫血、AIDS所致贫血、恶性肿瘤所致贫血、早产贫血、甲状腺功能减退所致贫血、营养不良所致贫血和血液病所致贫血。
23.权利要求14或15的用途，其中通过注射或植入所述药物来施用所述药物。
24.权利要求14或15的用途，其中所述细胞是同基因的。
25.分离的细胞群体，其包含体外传代的分化人肾细胞，其中所述分化人肾细胞产生促红细胞生成素(EPO)。
26.权利要求25的细胞群体，其中所述细胞在不利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理的条件下产生EPO。
27.权利要求25或26的细胞群体，其中所述人肾细胞已在体外传代1至20次。
28.权利要求25或26的细胞群体，其中所述人肾细胞已在体外传代至少3次。
29.权利要求25或26的细胞群体，其中所述群体包括肾小管周围间质细胞和肾的内皮细胞。
30.权利要求25或26的细胞群体，其中，条件是不用编码多肽的外源DNA转染所述细胞。
31.权利要求25的分离的细胞群体，其中所述细胞已经在体外扩增。
32.组合物，其包含权利要求25至31的任一项的细胞群体和药学上可接受的载体。
33.权利要求32的组合物，其中所述载体包含胶原。
34.包含权利要求25的细胞群体的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗有此需要的患者中的贫血。
35.权利要求34的用途，其中通过将所述药物注射或植入所述患者来施用所述药物。
36.权利要求34或权利要求35的用途，其中所述贫血选自：肾功能衰竭所致贫血、终末期肾病所致贫血、化学治疗所致贫血、放射治疗所致贫血、慢性感染所致贫血、自身免疫性疾病所致贫血、类风湿性关节炎所致贫血、AIDS所致贫血、恶性肿瘤所致贫血、早产贫血、甲状腺功能减退所致贫血、营养不良所致贫血和血液病所致贫血。
37.权利要求34或35的用途，其中所述细胞是同基因的。
38.权利要求34或35的用途，其中所述细胞是自体的。
39.权利要求1-3的任一项的细胞群体，其中所述群体在不通过导入外源基因或利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理的条件下表达EPO。
40.权利要求7的细胞群体，其中所述群体在不通过导入外源基因或利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理的条件下表达EPO。
41.权利要求9或权利要求10的方法，其中所述群体在不通过导入外源基因或利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理的条件下表达EPO。
42.权利要求13的方法，其中所述群体在不通过导入外源基因或利用刺激EPO的产生的外源化学试剂来处理的条件下表达EPO。
43.权利要求32的组合物，其中所述载体包含水凝胶。
CN200880102321.5A 2007-06-08 2008-06-06 治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法 Active CN101827933B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94271607P 2007-06-08 2007-06-08
US60/942716 2007-06-08
US60/942,716 2007-06-08
PCT/US2008/007161 WO2008153970A1 (en) 2007-06-08 2008-06-06 Selective cell therapy for the treatment of renal failure

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310717515.9A Division CN103865871A (zh) 2007-06-08 2008-06-06 治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101827933A CN101827933A (zh) 2010-09-08
CN101827933B true CN101827933B (zh) 2014-01-29

Family

ID=39745597

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310717515.9A Pending CN103865871A (zh) 2007-06-08 2008-06-06 治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法
CN200880102321.5A Active CN101827933B (zh) 2007-06-08 2008-06-06 治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310717515.9A Pending CN103865871A (zh) 2007-06-08 2008-06-06 治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20080305146A1 (zh)
EP (1) EP2162529B1 (zh)
JP (3) JP2010528658A (zh)
KR (3) KR101804287B1 (zh)
CN (2) CN103865871A (zh)
AU (1) AU2008262333B2 (zh)
CA (1) CA2688265C (zh)
DK (1) DK2162529T3 (zh)
ES (1) ES2725502T3 (zh)
HK (1) HK1199059A1 (zh)
WO (1) WO2008153970A1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003043674A1 (en) * 2001-11-16 2003-05-30 Children's Medical Center Corporation ¨ Augmentation of organ function
JP2010528658A (ja) * 2007-06-08 2010-08-26 ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ 腎不全の治療のための選択的細胞治療
KR20220112862A (ko) * 2008-11-12 2022-08-11 인리젠 분리된 신장 세포 및 이의 용도
WO2010057013A1 (en) 2008-11-14 2010-05-20 Wake Forest University Health Sciences Selective cell therapy for the treatment of renal failure
WO2011026939A2 (de) * 2009-09-04 2011-03-10 Fachhochschule Giessen-Friedberg Vorrichtung und verfahren zur expansion, ernte und differenzierung von stammzellen
HUE058155T2 (hu) * 2010-05-12 2022-07-28 Prokidney Bioaktív vesesejtek
JP2013116854A (ja) * 2010-06-10 2013-06-13 Kyoto Univ エリスロポエチンの製造方法およびエリスロポエチン産生細胞の単離方法
AU2011326767B2 (en) 2010-11-10 2016-02-11 Prokidney Injectable formulations for organ augmentation
WO2013071151A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Essential Pharmaceuticals, Llc Kit comprising serum replacement and labile factors
PL3567099T3 (pl) * 2012-10-24 2021-11-29 Prokidney Populacje komórek nerkowych i ich zastosowania
EP3484409A4 (en) 2016-07-14 2020-08-19 Qidni Labs, Inc. BIOCOMPATIBLE AND HEMOCOMPATIBLE MATERIAL AND FILTER
US11123372B2 (en) 2016-07-29 2021-09-21 Prokidney Bioactive renal cells for the treatment of chronic kidney disease
KR101782768B1 (ko) 2016-08-26 2017-09-28 주식회사 피시피아비아이티 신장질환 조기 진단용 바이오마커 sbp1 및 이의 이용
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
CN109157691A (zh) * 2018-06-15 2019-01-08 翁炳焕 猴-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
US11194429B2 (en) 2019-09-05 2021-12-07 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. Information display terminal

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1044496A (zh) * 1989-01-19 1990-08-08 南京大学 细胞培养生产促红细胞生成素的方法
EP1548031A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Nature-identical erythropoietin

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3463158A (en) * 1963-10-31 1969-08-26 American Cyanamid Co Polyglycolic acid prosthetic devices
JPS5492580A (en) 1977-12-29 1979-07-21 Nippon Zeon Co Ltd Hollow fiber type material transferring apparatus
US4182339A (en) * 1978-05-17 1980-01-08 Hardy Thomas G Jr Anastomotic device and method
JPS6045849B2 (ja) 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
SU1034717A1 (ru) 1981-04-22 1983-08-15 Рижский Медицинский Институт Способ наложени сосудистого анастомоза
US4458678A (en) * 1981-10-26 1984-07-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-seeding procedures involving fibrous lattices
US4520821A (en) * 1982-04-30 1985-06-04 The Regents Of The University Of California Growing of long-term biological tissue correction structures in vivo
US4594407A (en) * 1983-09-20 1986-06-10 Allied Corporation Prosthetic devices derived from krebs-cycle dicarboxylic acids and diols
FR2577807B1 (fr) 1985-02-22 1993-12-03 Ethnor Materiau chirurgical composite absorbable, procede de preparation, prothese resorbable realisee a partir d'un tel materiau et utilisation d'une telle prothese
US5160490A (en) * 1986-04-18 1992-11-03 Marrow-Tech Incorporated Three-dimensional cell and tissue culture apparatus
US4963489A (en) * 1987-04-14 1990-10-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5032508A (en) * 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5266480A (en) * 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
US5902741A (en) * 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
US4769037A (en) * 1986-10-28 1988-09-06 Midcalf Robert J Artificial replacement kidney implant and method of dialyzing blood
US5567612A (en) * 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5759830A (en) * 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
WO1989001967A1 (en) 1987-09-03 1989-03-09 Brown University Research Foundation Blood purification with cultured renal cells
GB8722854D0 (en) * 1987-09-29 1987-11-04 Hardy S M Implantable artificial kidney
US5085629A (en) * 1988-10-06 1992-02-04 Medical Engineering Corporation Biodegradable stent
DE3913756A1 (de) 1989-04-21 1990-10-25 Schering Ag 8(beta)-substituierte ergoline, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5429936A (en) * 1989-04-21 1995-07-04 The Regents Of The University Of California Antibody-mediated juxtaposition of reactive moieties
JP3073766B2 (ja) 1989-04-25 2000-08-07 チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 重合マトリックス上の大容量の細胞の移植方法
US4996154A (en) * 1989-05-04 1991-02-26 Millipore Corporation Method for growing cellular tissue
WO1991009625A1 (en) 1989-12-21 1991-07-11 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize hiv-1 infection and their anti-idiotypes
US5261898A (en) * 1990-11-13 1993-11-16 Polin Stanton G Temporary colostomy apparatus
US5192312A (en) 1991-03-05 1993-03-09 Colorado State University Research Foundation Treated tissue for implantation and methods of treatment and use
AU2900792A (en) * 1991-10-24 1993-05-21 Children's Medical Center Corporation Neomorphogenesis of urological structures in vivo from cell culture
PT101031B (pt) * 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
US5376376A (en) * 1992-01-13 1994-12-27 Li; Shu-Tung Resorbable vascular wound dressings
US6060270A (en) * 1992-03-02 2000-05-09 The University Of Michigan Methods and compositions for isolation and growth of kidney tubule stem cells, in vitro kidney tubulogenesis and ex vivo construction of renal tubules
US5429938A (en) * 1992-03-02 1995-07-04 University Of Michigan Methods and compositions for isolation and growth of kidney tubule stem cells, in vitro kidney tubulogenesis and ex vivo construction of renal tubules
US6410320B1 (en) * 1992-03-02 2002-06-25 The University Of Michigan Method and compositions for isolation and growth of kidney tubule stem cells, in vitro kidney tubulogenesis and ex vivo construction of renal tubules
US5549674A (en) 1992-03-02 1996-08-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions of a bioartificial kidney suitable for use in vivo or ex vivo
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
ES2187506T3 (es) * 1992-04-24 2003-06-16 Chienna Bv Dispositivos para la prevencion de adhesiones de tejidos.
US5224953A (en) * 1992-05-01 1993-07-06 The Beth Israel Hospital Association Method for treatment of obstructive portions of urinary passageways
US5800537A (en) * 1992-08-07 1998-09-01 Tissue Engineering, Inc. Method and construct for producing graft tissue from an extracellular matrix
US5957972A (en) * 1992-09-29 1999-09-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Implants possessing a surface of endothelial cells genetically-modified to inhibit intimal thickening
US5514378A (en) * 1993-02-01 1996-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Biocompatible polymer membranes and methods of preparation of three dimensional membrane structures
US5433996A (en) * 1993-02-18 1995-07-18 W. L. Gore & Associates, Inc. Laminated patch tissue repair sheet material
US5709854A (en) * 1993-04-30 1998-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo
ATE265191T1 (de) 1994-03-14 2004-05-15 Cryolife Inc Herstellungsverfahren von gewebe zur implantation
US5916265A (en) * 1994-03-30 1999-06-29 Hu; Jie Method of producing a biological extracellular matrix for use as a cell seeding scaffold and implant
US5626861A (en) * 1994-04-01 1997-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Polymeric-hydroxyapatite bone composite
US5947893A (en) * 1994-04-27 1999-09-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of making a porous prothesis with biodegradable coatings
US5545131A (en) * 1994-04-28 1996-08-13 White Eagle International Technologies, Lp Artificial kidney
US5429674A (en) * 1994-09-12 1995-07-04 Ppg Industries, Inc. N-acyl aminomethylene phosphonates and their use in waterborne coating compositions
AU700911B2 (en) 1994-09-12 1999-01-14 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional human cell cultures on cardiac valve frameworks and their uses
US5654273A (en) * 1994-09-22 1997-08-05 Children's Medical Center Corporation Synducin mediated modulation of tissue repair
US5695996A (en) * 1994-09-23 1997-12-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Artificial organ culture system
US5716404A (en) * 1994-12-16 1998-02-10 Massachusetts Institute Of Technology Breast tissue engineering
JPH11508151A (ja) 1995-04-07 1999-07-21 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 膀胱再建方法及び膀胱再建用組織グラフト
US5855610A (en) * 1995-05-19 1999-01-05 Children's Medical Center Corporation Engineering of strong, pliable tissues
US6171344B1 (en) * 1996-08-16 2001-01-09 Children's Medical Center Corporation Bladder submucosa seeded with cells for tissue reconstruction
ATE237371T1 (de) 1996-08-16 2003-05-15 Childrens Medical Center Blasenmukosa mit zellen für die rekonstruktion von geweben
US6673339B1 (en) * 1996-09-05 2004-01-06 Children's Medical Center Corporation Prosthetic kidney and its use for treating kidney disease
DE69727817T2 (de) * 1996-09-05 2005-01-05 Children's Medical Center Corp., Boston Nierenprothese und ihre Verwendung zum Behandeln einer Nierenkrankheit
US5952226A (en) * 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
US5967972A (en) * 1997-03-28 1999-10-19 Kapp Surgical Instrument, Inc. Minimally invasive surgical retractor and method of operation
CA2286655C (en) 1997-04-11 2009-02-24 Cryolife, Inc. Tissue decellularization
ES2175753T3 (es) 1997-06-27 2002-11-16 Augustinus Bader Injerto biosintetico y metodo para su produccion.
DE69817863T2 (de) 1997-10-31 2004-07-15 Children's Medical Center Corp., Boston Blasenrekonstruktion
CA2307637C (en) 1997-10-31 2008-10-07 Children's Medical Center Corporation Penile reconstruction
EP0984062A1 (en) 1998-09-04 2000-03-08 Cytos Biotechnology AG Production of human erythropoietin
US6777205B1 (en) * 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
DE19919625C2 (de) 1999-04-29 2002-10-31 Symetis Ag Zuerich In-vitro-Verfahren zum Herstellen einer homologen Herzklappe und durch dieses Verfahren herstellbare Klappe
AU772484B2 (en) 1999-04-30 2004-04-29 Massachusetts General Hospital Fabrication of vascularized tissue using microfabricated two-dimensional molds
GB9910377D0 (en) 1999-05-05 1999-06-30 Univ Westminster Tissue engineering
BR0010316A (pt) * 1999-05-11 2004-04-27 Ortho Mcnell Pharmaceutical In Método e sistema para obtenção de regimes de dosagem otimizados de epo para uma resposta farmacodinâmica/farmacocinética desejada em um paciente
US20040167634A1 (en) * 1999-05-26 2004-08-26 Anthony Atala Prosthetic kidney and its use for treating kidney disease
KR100369788B1 (ko) * 1999-09-03 2003-01-29 동아제약 주식회사 재조합 인간 에리트로포이에틴의 제조방법
JP3603179B2 (ja) 1999-09-09 2004-12-22 グンゼ株式会社 心血管系組織培養用基材および組織再生法
US20030180289A1 (en) * 1999-09-23 2003-09-25 Foster Keith Alan Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US6503330B1 (en) * 1999-12-22 2003-01-07 Genus, Inc. Apparatus and method to achieve continuous interface and ultrathin film during atomic layer deposition
US6376244B1 (en) 1999-12-29 2002-04-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for organ decellularization
US6428802B1 (en) 1999-12-29 2002-08-06 Children's Medical Center Corp. Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate
US6479064B1 (en) 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
US6368859B1 (en) * 1999-12-29 2002-04-09 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for producing a fascial sling
US7326570B2 (en) * 2000-06-16 2008-02-05 The Regents Of The University Of California Induction of tubular morphogenesis using pleiotrophin
US7030218B2 (en) 2000-09-08 2006-04-18 Gryphon Therapeutics Pseudo native chemical ligation
WO2002061053A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-08 The General Hospital Corporation Renal stem cells and uses thereof
US6656488B2 (en) * 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
FR2824072B1 (fr) 2001-04-27 2004-03-12 Centre Nat Rech Scient Procede de replication et de production du virus de l'hepatite c
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
WO2003043674A1 (en) * 2001-11-16 2003-05-30 Children's Medical Center Corporation ¨ Augmentation of organ function
US20030180268A1 (en) * 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
WO2004009768A2 (en) 2002-07-18 2004-01-29 Invitrogen Corporation Viral vectors containing recombination sites
US8940292B2 (en) * 2003-01-28 2015-01-27 Wake Forest University Health Sciences Enhancement of angiogenesis to grafts using cells engineered to produce growth factors
CA2521979A1 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods related to production of erythropoietin
WO2005007175A2 (en) * 2003-06-09 2005-01-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Cadherin directed molecular and cellular localization
AU2003903896A0 (en) 2003-07-28 2003-08-07 Queensland University Of Technology Skin regeneration system
US20050136042A1 (en) * 2003-08-12 2005-06-23 Betz Oliver B. Methods and compositions for tissue repair
KR20130066707A (ko) 2005-09-21 2013-06-20 다스크 테크날러지, 엘엘씨 장기 및 조직 기능성을 위한 방법 및 조성물
PL2078073T3 (pl) * 2006-10-12 2013-12-31 Ethicon Inc Komórki pochodzące z nerki oraz sposoby ich zastosowania w leczeniu i regeneracji tkanki
US9824107B2 (en) * 2006-10-25 2017-11-21 Entit Software Llc Tracking changing state data to assist in computer network security
JP2010528658A (ja) * 2007-06-08 2010-08-26 ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ 腎不全の治療のための選択的細胞治療
KR20220112862A (ko) 2008-11-12 2022-08-11 인리젠 분리된 신장 세포 및 이의 용도
JP6147540B2 (ja) * 2013-03-29 2017-06-14 本田技研工業株式会社 鞍乗り型車両

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1044496A (zh) * 1989-01-19 1990-08-08 南京大学 细胞培养生产促红细胞生成素的方法
EP1548031A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Nature-identical erythropoietin

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATTHEW D.PLOTKIN , ET AL,.MESENCHYMAL CELLS FROM ADULT KIDNEY SUPPORT ANGIOGENESIS AND DIFFERENTIATE INTO MULTIPLE INTERSTITIAL CELL TYPES INCLUDING ERYTHROPOIETIN-PRODUCING FIBROBALSTS.《AM J PHYSIOL RENAL PHYSIOL 》.2006,第291卷F902-F912, 公开于2006－4－18，具体参见摘要、方法第一段、结果第一段、F906页右栏倒数两段.
MATTHEW D.PLOTKIN, ET AL,.MESENCHYMAL CELLS FROM ADULT KIDNEY SUPPORT ANGIOGENESIS AND DIFFERENTIATE INTO MULTIPLE INTERSTITIAL CELL TYPES INCLUDING ERYTHROPOIETIN-PRODUCING FIBROBALSTS.《AM J PHYSIOL RENAL PHYSIOL 》.2006,第291卷F902-F912, 公开于2006-4-18,具体参见摘要、方法第一段、结果第一段、F906页右栏倒数两段. *
傅博,等.用微分离方法培养肾皮质近曲小管和髓质集合管上皮细胞及其生物学特征的研究.《CHINESE JOURNAL FO ANATOMY》.1999,第22卷(第1期),63-66. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101632372B1 (ko) 2016-07-01
JP6461216B2 (ja) 2019-01-30
EP2162529A1 (en) 2010-03-17
ES2725502T3 (es) 2019-09-24
CA2688265C (en) 2021-02-16
AU2008262333A1 (en) 2008-12-18
CN101827933A (zh) 2010-09-08
KR20100035637A (ko) 2010-04-05
JP2017131226A (ja) 2017-08-03
US20080305146A1 (en) 2008-12-11
CN103865871A (zh) 2014-06-18
US20160002603A1 (en) 2016-01-07
EP2162529B1 (en) 2019-03-27
KR20140147150A (ko) 2014-12-29
JP2015062415A (ja) 2015-04-09
JP2010528658A (ja) 2010-08-26
WO2008153970A1 (en) 2008-12-18
AU2008262333B2 (en) 2014-07-17
KR20160038083A (ko) 2016-04-06
KR101804287B1 (ko) 2017-12-04
DK2162529T3 (da) 2019-07-01
HK1199059A1 (zh) 2015-06-19
CA2688265A1 (en) 2008-12-18
US9534203B2 (en) 2017-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101827933B (zh) 治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法
CN103989710B (zh) 分离的肝脏干细胞
US9580688B2 (en) Kidney structures and methods of forming the same
US10590391B2 (en) Selective cell therapy for the treatment of renal failure
KR20060036933A (ko) 지방-유래 전구세포의 세포 분화
CN108779440A (zh) 改进的成体肝脏祖细胞制备物
CN101356264B (zh) 分离的肝脏干细胞
WO2021038892A1 (ja) ヒト脂肪肝モデル細胞
CN103619342B (zh) 用于治疗肥胖症和/或代谢综合征的方法
US20240108590A1 (en) Maintenance of programmed chronic liver injury of fah gene-deficient animals and application thereof in preparation of heterologous liver models
WO2022181660A1 (ja) スクリーニング方法に使用するためのヒト脂肪肝モデル細胞
Liang et al. Amniotic fluid transplantation alleviates hematopoietic deficits in experimental rat aplastic anemia
Patton et al. Intramammary infusion technique for genetic engineering of the mammary gland
Wen et al. Determination of the biodistribution of chimeric antigen receptor-modified T cells against CD19 in NSG mice
AU2017204345A1 (en) Selective cell therapy for the treatment of renal failure

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant