JP3157984B2 - 初代培養肝細胞の継代培養系 - Google Patents
初代培養肝細胞の継代培養系Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、初代培養肝細胞の継
代培養系に関するものである。さらに詳しくは、これま
で実現されてこなかった肝細胞の継代を可能とする新し
い肝細胞培養系に関するものである。
代培養系に関するものである。さらに詳しくは、これま
で実現されてこなかった肝細胞の継代を可能とする新し
い肝細胞培養系に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】生体組織やそれを構成する細
胞の特徴、作用機序を解明することは極めて重要な課題
であり、この課題について検討するためには、細胞を増
殖させ、継代させることが非常に大切である。このよう
なことから、多くの細胞の継代について検討が進められ
てきているが、初代培養肝細胞の継代培養は、唯一仔ウ
シで報告されているだけであり、ラット、マウス等では
いまだ実現されていない。その理由としては、一つに
は、種々の増殖因子添加の血清無添加の培養系で、肝細
胞の接着や増殖に有効なコラーゲンコートdishが頻繁に
使われてきているため、肝細胞をdishから損傷の少ない
状態で剥すことが困難であり、また、トリプシン等の酸
素で処理した肝細胞は非常に損傷が大きいという問題が
あったことによる。
胞の特徴、作用機序を解明することは極めて重要な課題
であり、この課題について検討するためには、細胞を増
殖させ、継代させることが非常に大切である。このよう
なことから、多くの細胞の継代について検討が進められ
てきているが、初代培養肝細胞の継代培養は、唯一仔ウ
シで報告されているだけであり、ラット、マウス等では
いまだ実現されていない。その理由としては、一つに
は、種々の増殖因子添加の血清無添加の培養系で、肝細
胞の接着や増殖に有効なコラーゲンコートdishが頻繁に
使われてきているため、肝細胞をdishから損傷の少ない
状態で剥すことが困難であり、また、トリプシン等の酸
素で処理した肝細胞は非常に損傷が大きいという問題が
あったことによる。
【０００３】またさらに、血清を加えた系でコラーゲン
コートをしていないdishで培養した場合、損傷の少ない
処理で剥した肝細胞は、dishに再接着することができて
も、長期生存を可能とし、増殖することができないこと
も考慮されている。一方、最近になって、培地にニコチ
ンアミドとＥＧＦを加えた系で、コロニーを形成しなが
ら増殖する小型の肝細胞が出現することが報告されてお
り、この小型の肝細胞は、アルブミン等の成熟肝細胞の
機能を発現しており、培養４日までに２〜３回分裂する
ことや、培養２０日目においても増殖期にある細胞が存
在することが確認されている。
コートをしていないdishで培養した場合、損傷の少ない
処理で剥した肝細胞は、dishに再接着することができて
も、長期生存を可能とし、増殖することができないこと
も考慮されている。一方、最近になって、培地にニコチ
ンアミドとＥＧＦを加えた系で、コロニーを形成しなが
ら増殖する小型の肝細胞が出現することが報告されてお
り、この小型の肝細胞は、アルブミン等の成熟肝細胞の
機能を発現しており、培養４日までに２〜３回分裂する
ことや、培養２０日目においても増殖期にある細胞が存
在することが確認されている。
【０００４】この培養系の場合には、コロニーの発現頻
度は、幼若ラットで高く、週令にともなって減少するこ
と等から肝細胞の“commited progenitor cells ”では
ないかと考えられている。しかしながら、この場合に
も、継代培養は充分な状態ではなく、また損傷を防止す
ることにも問題が残されている。このため、依然とし
て、肝細胞の継代については技術的には確立していない
のが実情である。
度は、幼若ラットで高く、週令にともなって減少するこ
と等から肝細胞の“commited progenitor cells ”では
ないかと考えられている。しかしながら、この場合に
も、継代培養は充分な状態ではなく、また損傷を防止す
ることにも問題が残されている。このため、依然とし
て、肝細胞の継代については技術的には確立していない
のが実情である。
【０００５】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであって、従来の技術の欠点や限界を克服
し、初代培養肝細胞の増殖および長期維持をともなう継
代培養を可能とする新しい培養系を提供することを目的
としている。
されたものであって、従来の技術の欠点や限界を克服
し、初代培養肝細胞の増殖および長期維持をともなう継
代培養を可能とする新しい培養系を提供することを目的
としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、初代培養肝細胞の培養系であっ
て、培地にニコチンアミド類並びにアスコルビン酸類が
添加されていることを特徴とする初代培養肝細胞の継代
培養系を提供する。
を解決するものとして、初代培養肝細胞の培養系であっ
て、培地にニコチンアミド類並びにアスコルビン酸類が
添加されていることを特徴とする初代培養肝細胞の継代
培養系を提供する。
【０００７】
【作用】すなわち、この発明においては、初代培養肝細
胞の培地中に、ニコチンアミド類並びにアスコルビン酸
類を添加することにより、継代後の肝細胞増殖および肝
細胞の長期間機能維持が実現される。培地、その他添加
剤については、公知のものをはじめ適宜に使用できる
が、たとえば具体的には、ＤＭＥＭ培地にニコチンアミ
ド類並びにアスコルビン酸類が添加され、さらにはＦＣ
Ｓ、ＥＧＦが添加された培地系が例示される。
胞の培地中に、ニコチンアミド類並びにアスコルビン酸
類を添加することにより、継代後の肝細胞増殖および肝
細胞の長期間機能維持が実現される。培地、その他添加
剤については、公知のものをはじめ適宜に使用できる
が、たとえば具体的には、ＤＭＥＭ培地にニコチンアミ
ド類並びにアスコルビン酸類が添加され、さらにはＦＣ
Ｓ、ＥＧＦが添加された培地系が例示される。
【０００８】ニコチンアミド並びにアスコルビン酸類と
しては、公知のものをはじめ、ニコチンアミドのアルキ
ル、シクロアルキル、その他置換基等を持つ各種のもの
が、またアスコルコビン酸のリン酸エステル、亜リン酸
エステル、ホスホン酸エステル、それらのアルキル、そ
の他置換基等を有する類似物が適宜に用いられることは
言うまでもない。
しては、公知のものをはじめ、ニコチンアミドのアルキ
ル、シクロアルキル、その他置換基等を持つ各種のもの
が、またアスコルコビン酸のリン酸エステル、亜リン酸
エステル、ホスホン酸エステル、それらのアルキル、そ
の他置換基等を有する類似物が適宜に用いられることは
言うまでもない。
【０００９】そこで、以下、実施例を示し、さらに詳し
くこの発明について説明する。
くこの発明について説明する。
【００１０】
【実施例】図１は、この発明の継代培養系の構成を例示
したものである。この図１に沿って、４〜８週令のＦ３
４４雄ラットから、コラゲナーゼ灌流法により肝細胞を
分取した。肝細胞を、１０％ＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌ
ＥＧＦ、１０ｍＭ ニコチンアミド、０．２ｍＭ Ｌ−
アスコルビン酸２−フォスフェート添加ＤＭＥＭ培地
で、６．７×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 の濃度で培養
し、培養４日目より１％ＤＭＳＯを添加した。肝細胞を
dishより剥すために、０．０２％ＥＤＴＡを用いた。肝
細胞の増殖の指標として、ＢｒｄＵの取り込み、およ
び、位相差顕微鏡下で同一部位の写真を経時的に撮影
し、肝細胞領域の面積を測定した。また、肝細胞の機能
発現および非実質細胞の同定は、免疫細胞化学的手法、
または酵素化学的手法を用いて行った。
したものである。この図１に沿って、４〜８週令のＦ３
４４雄ラットから、コラゲナーゼ灌流法により肝細胞を
分取した。肝細胞を、１０％ＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌ
ＥＧＦ、１０ｍＭ ニコチンアミド、０．２ｍＭ Ｌ−
アスコルビン酸２−フォスフェート添加ＤＭＥＭ培地
で、６．７×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 の濃度で培養
し、培養４日目より１％ＤＭＳＯを添加した。肝細胞を
dishより剥すために、０．０２％ＥＤＴＡを用いた。肝
細胞の増殖の指標として、ＢｒｄＵの取り込み、およ
び、位相差顕微鏡下で同一部位の写真を経時的に撮影
し、肝細胞領域の面積を測定した。また、肝細胞の機能
発現および非実質細胞の同定は、免疫細胞化学的手法、
または酵素化学的手法を用いて行った。
【００１１】ＦＣＳ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、Ｌ−ア
スコルビン酸２−フォスフェート、ＤＭＳＯの添加因子
のうち、それぞれ１種類ずつ除いた系で同様の操作を行
い、それぞれの添加因子の肝細胞、および非実質細胞へ
の作用を調べた。以上の結果、０．０２％ＥＤＴＡで処
理すると、肝細胞はcluster 状に剥がれ、同一視野の位
相差像を示した図２（継代１代目×４０）の通り、継代
１〜２日までにクラスターはdishに接着し（図２（ａ）
継代２日目）、継代３日頃より増殖し（図２（ｂ）継代
５日目）、継代７日目頃に１部の細胞が死んで剥がれた
（図２（ｃ）継代８日目）。
スコルビン酸２−フォスフェート、ＤＭＳＯの添加因子
のうち、それぞれ１種類ずつ除いた系で同様の操作を行
い、それぞれの添加因子の肝細胞、および非実質細胞へ
の作用を調べた。以上の結果、０．０２％ＥＤＴＡで処
理すると、肝細胞はcluster 状に剥がれ、同一視野の位
相差像を示した図２（継代１代目×４０）の通り、継代
１〜２日までにクラスターはdishに接着し（図２（ａ）
継代２日目）、継代３日頃より増殖し（図２（ｂ）継代
５日目）、継代７日目頃に１部の細胞が死んで剥がれた
（図２（ｃ）継代８日目）。
【００１２】継代８日目頃以降、生き残った肝細胞が増
殖し（図２（ｄ）継代４４日目）、継代１０日〜３０日
の間に、肝細胞クラスターの占める面積は約２倍に増え
た（図３）。継代後の肝細胞の増殖は、肝細胞クラスタ
ーの面積の増加、ＢｒｄＵの取り込み、および分裂像に
より確認した。継代３０日目の多数の肝細胞に、Ｂｒｄ
Ｕの取り込みが観察された（図４（ａ））。この図４
（ａ）（ｂ）（ｃ）は、各々、継代１代目の継代３０日
目、４６日目および５０日目を示している。以降、図中
のＰは、肝実質細胞を、また、Ｎは、非実質細胞を示し
ている。
殖し（図２（ｄ）継代４４日目）、継代１０日〜３０日
の間に、肝細胞クラスターの占める面積は約２倍に増え
た（図３）。継代後の肝細胞の増殖は、肝細胞クラスタ
ーの面積の増加、ＢｒｄＵの取り込み、および分裂像に
より確認した。継代３０日目の多数の肝細胞に、Ｂｒｄ
Ｕの取り込みが観察された（図４（ａ））。この図４
（ａ）（ｂ）（ｃ）は、各々、継代１代目の継代３０日
目、４６日目および５０日目を示している。以降、図中
のＰは、肝実質細胞を、また、Ｎは、非実質細胞を示し
ている。
【００１３】なお、図４（ａ）においては、ＢｒｄＵ
（茶色）−トランスフェリン（赤色）の二重染色（×１
００）により、図４（ｂ）では、α1 −アンチトリプシ
ン（茶色）染色（×６０６）、図４（ｃ）では、アルブ
ミン（茶色）染色（×６０６）を行い、継代後、増殖を
続けている肝細胞は、アルブミン、α1 −アンチトリプ
シン、トランスフェリンの発現が認められた。
（茶色）−トランスフェリン（赤色）の二重染色（×１
００）により、図４（ｂ）では、α1 −アンチトリプシ
ン（茶色）染色（×６０６）、図４（ｃ）では、アルブ
ミン（茶色）染色（×６０６）を行い、継代後、増殖を
続けている肝細胞は、アルブミン、α1 −アンチトリプ
シン、トランスフェリンの発現が認められた。
【００１４】また、図５（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）には
継代２代目の肝細胞クラスターの状態を示した。図５
（ａ）では、継代４日目を、図５（ｂ）では継代４２日
目の同一視野の位相差像（×４０）を示している。ま
た、図５（ｃ）では、継代５２日目のアルブミン（茶
色）染色（×６０６）、図５（ｄ）では同じく継代の５
２日目のトランスフェリン（茶色）染色（×６０６）を
行った。継代３５日目の肝細胞を０．０２％ＥＤＴＡで
剥すと、dishに再接着し肝細胞の増殖が認められた。
尚、継代２代目の肝細胞も、アルブミン、トランスフェ
リン陽性であった。
継代２代目の肝細胞クラスターの状態を示した。図５
（ａ）では、継代４日目を、図５（ｂ）では継代４２日
目の同一視野の位相差像（×４０）を示している。ま
た、図５（ｃ）では、継代５２日目のアルブミン（茶
色）染色（×６０６）、図５（ｄ）では同じく継代の５
２日目のトランスフェリン（茶色）染色（×６０６）を
行った。継代３５日目の肝細胞を０．０２％ＥＤＴＡで
剥すと、dishに再接着し肝細胞の増殖が認められた。
尚、継代２代目の肝細胞も、アルブミン、トランスフェ
リン陽性であった。
【００１５】さらにまた、非実質細胞の染色（継代１代
目）により、たとえば図６（ａ）の継代３０日目のデス
ミン（茶色）染色（×２００）における陽性の確認、図
６（ｂ）の継代３８日目のエステラーゼ（茶色）染色
（×２４２）における陰性（ただし肝細胞は一部陽性）
の確認に示されている通り、継代４日目頃より、肝細胞
クラスターの周囲に非実質細胞が増殖しはじめ、継代３
０日頃には、肝細胞クラスターの周囲をほぼ埋め尽くし
た。この非実質細胞は、desminの抗体で強陽性に染まる
ことから、星細胞と考えられた。尚、エステラーゼ活性
は陰性であったことから、Kuppfer 細胞ではないと考え
られた。
目）により、たとえば図６（ａ）の継代３０日目のデス
ミン（茶色）染色（×２００）における陽性の確認、図
６（ｂ）の継代３８日目のエステラーゼ（茶色）染色
（×２４２）における陰性（ただし肝細胞は一部陽性）
の確認に示されている通り、継代４日目頃より、肝細胞
クラスターの周囲に非実質細胞が増殖しはじめ、継代３
０日頃には、肝細胞クラスターの周囲をほぼ埋め尽くし
た。この非実質細胞は、desminの抗体で強陽性に染まる
ことから、星細胞と考えられた。尚、エステラーゼ活性
は陰性であったことから、Kuppfer 細胞ではないと考え
られた。
【００１６】そして、肝細胞の索状様構造を継代３２日
目（継代１代目）の位相差像として示した図７（×１０
０）より明らかなように、継代後、肝細胞の重層構造が
観察され、一部に索状構造を思わせる配列が観察され
た。図８（コントロール）、図９（ＥＧＦ−）、図１０
（ニコチンアミド−）、図１１（Ｌ−アスコルビン酸−
２−フォスフェート−）および図１２（ＤＭＳＯ−）
は、各添加因子の肝細胞、肝実質細胞への影響を、継代
１５日目の位相差像（×４０）および２２日目のトラン
スフェリン染色像（赤）（×３０）として示したもので
ある。
目（継代１代目）の位相差像として示した図７（×１０
０）より明らかなように、継代後、肝細胞の重層構造が
観察され、一部に索状構造を思わせる配列が観察され
た。図８（コントロール）、図９（ＥＧＦ−）、図１０
（ニコチンアミド−）、図１１（Ｌ−アスコルビン酸−
２−フォスフェート−）および図１２（ＤＭＳＯ−）
は、各添加因子の肝細胞、肝実質細胞への影響を、継代
１５日目の位相差像（×４０）および２２日目のトラン
スフェリン染色像（赤）（×３０）として示したもので
ある。
【００１７】また、図１３は、各添加因子の影響を肝細
胞クラスターの面積の経時的変化として示している。継
代１日目を１００％とした。図１４は、同じく、各添加
因子の影響を継代２２日目の抗トランスフェリン陽性細
胞の占める面積で示し、コントロールを１００％として
いる。これらの図から明らかなように、ＥＧＦ、ニコチ
ンアミド、Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェートのう
ちいずれをのぞいた系においても、継代後の肝細胞の増
殖抑制が認められた。ＥＧＦを除いた系では、非実質細
胞の増殖抑制が、ニコチンアミドを除いた系では、非実
質細胞の増殖促進が認められた。また、ＤＭＳＯを除い
た系では、非実質細胞の増殖が最も早く、継代２２日目
頃より、肝細胞クラスターはdishより剥がれ始めた。い
ずれの系の肝細胞もトランスフェリン陽性であった。さ
らに、ＦＣＳを除いた系では、肝細胞、非実質細胞の著
しい増殖抑制が認められた。
胞クラスターの面積の経時的変化として示している。継
代１日目を１００％とした。図１４は、同じく、各添加
因子の影響を継代２２日目の抗トランスフェリン陽性細
胞の占める面積で示し、コントロールを１００％として
いる。これらの図から明らかなように、ＥＧＦ、ニコチ
ンアミド、Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェートのう
ちいずれをのぞいた系においても、継代後の肝細胞の増
殖抑制が認められた。ＥＧＦを除いた系では、非実質細
胞の増殖抑制が、ニコチンアミドを除いた系では、非実
質細胞の増殖促進が認められた。また、ＤＭＳＯを除い
た系では、非実質細胞の増殖が最も早く、継代２２日目
頃より、肝細胞クラスターはdishより剥がれ始めた。い
ずれの系の肝細胞もトランスフェリン陽性であった。さ
らに、ＦＣＳを除いた系では、肝細胞、非実質細胞の著
しい増殖抑制が認められた。
【００１８】以上の結果から明らかなように、初代培養
肝細胞をＤＭＥＭに、ＦＣＳ、ＥＧＦ、ニコチンアミ
ド、Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェート、ＤＭＥＭ
を加えた系で培養し、confluent の状態で０．０２％Ｅ
ＤＴＡで処理することにより、肝細胞はクラスターの状
態で剥がれ、dishに接着し、増殖することができた。そ
して、dishにコラーゲンコートを施していないため、
０．０２％ＥＤＴＡにより肝細胞を剥すことができた。
０．０２％ＥＤＴＡ、０．２５％トリプシンで処理する
と、肝細胞は、single cell の状態で剥がれ、dishに接
着し、多数のＢｒｄＵの取り込みも認められたが、７日
目頃一部の肝細胞が死んで剥がれた後、残った肝細胞の
増殖、維持の状態が、０．０２％ＥＤＴＡに比べて悪か
った。
肝細胞をＤＭＥＭに、ＦＣＳ、ＥＧＦ、ニコチンアミ
ド、Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェート、ＤＭＥＭ
を加えた系で培養し、confluent の状態で０．０２％Ｅ
ＤＴＡで処理することにより、肝細胞はクラスターの状
態で剥がれ、dishに接着し、増殖することができた。そ
して、dishにコラーゲンコートを施していないため、
０．０２％ＥＤＴＡにより肝細胞を剥すことができた。
０．０２％ＥＤＴＡ、０．２５％トリプシンで処理する
と、肝細胞は、single cell の状態で剥がれ、dishに接
着し、多数のＢｒｄＵの取り込みも認められたが、７日
目頃一部の肝細胞が死んで剥がれた後、残った肝細胞の
増殖、維持の状態が、０．０２％ＥＤＴＡに比べて悪か
った。
【００１９】また、ＥＧＦは、肝細胞、非実質細胞の増
殖促進作用、および継代後の肝細胞を生存維持させる作
用があり、ニコチンアミドは、“commited progenitor
cells ”の増殖促進作用があり、今回の系に必須であっ
た。Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェートは、肝細胞
の増殖促進作用、継代後の肝細胞を生存維持させる作用
があり、今回の系に必須であった。また、Ｌ−アスコル
ビン酸２−フォスフェートは肝細胞、線維芽細胞に対す
る種々の効果が報告されているが、この発明の系では、
非実質細胞と肝細胞のinteraction および、三次元構築
に寄与したと考えられる。
殖促進作用、および継代後の肝細胞を生存維持させる作
用があり、ニコチンアミドは、“commited progenitor
cells ”の増殖促進作用があり、今回の系に必須であっ
た。Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェートは、肝細胞
の増殖促進作用、継代後の肝細胞を生存維持させる作用
があり、今回の系に必須であった。また、Ｌ−アスコル
ビン酸２−フォスフェートは肝細胞、線維芽細胞に対す
る種々の効果が報告されているが、この発明の系では、
非実質細胞と肝細胞のinteraction および、三次元構築
に寄与したと考えられる。
【００２０】ＤＭＳＯは、非実質細胞の増殖抑制作用が
ある。この発明の系では、肝細胞の“commited progeni
tor cells ”が増殖する培養条件下で、肝細胞を継代培
養することにより、“commited progenitor cells ”を
選択して培養することができたと考えられる。
ある。この発明の系では、肝細胞の“commited progeni
tor cells ”が増殖する培養条件下で、肝細胞を継代培
養することにより、“commited progenitor cells ”を
選択して培養することができたと考えられる。
【００２１】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
り、はじめて初代培養肝細胞の継代培養が可能となる。
り、はじめて初代培養肝細胞の継代培養が可能となる。
【図１】この発明の培養系の構成を例示した手順フロー
図である。
図である。
【図２】（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）は、継代１代目の、
２日、５日、８日および４４日目の培養例を例示した位
相差像の図面に代わる顕微鏡写真である。
２日、５日、８日および４４日目の培養例を例示した位
相差像の図面に代わる顕微鏡写真である。
【図３】肝細胞クラスターの面積の増加を示した図であ
る。
る。
【図４】（ａ）（ｂ）（ｃ）は、肝細胞へのＢｒｄＵの
組込みとトランスフェリンの発現、アルブミン、アンチ
トリプシンの発現を示した免疫染色像（各々、継代１代
目の３０日目、４６日目、５０日目）の図面に代わる顕
微鏡写真である。
組込みとトランスフェリンの発現、アルブミン、アンチ
トリプシンの発現を示した免疫染色像（各々、継代１代
目の３０日目、４６日目、５０日目）の図面に代わる顕
微鏡写真である。
【図５】（ａ）（ｂ）は、継代２代目の肝細胞クラスタ
ーの４日目、４２日目の位相差像を示した図面に代わる
写真である。（ｃ）（ｄ）は、５２日目のアルブミンと
トランスフェリンの発現を示した免疫染色像の図面に代
わる顕微鏡写真である。
ーの４日目、４２日目の位相差像を示した図面に代わる
写真である。（ｃ）（ｄ）は、５２日目のアルブミンと
トランスフェリンの発現を示した免疫染色像の図面に代
わる顕微鏡写真である。
【図６】（ａ）（ｂ）は、継代１代目の非実質肝細胞の
状態を示した、３０日目のデスミン免疫染色像、および
３８日目のエステラーゼ酵素化学染色像の図面に代わる
顕微鏡写真である。
状態を示した、３０日目のデスミン免疫染色像、および
３８日目のエステラーゼ酵素化学染色像の図面に代わる
顕微鏡写真である。
【図７】肝細胞の索状様構造を示した継代１代目の３２
日目の位相差像の図面に代わる顕微鏡写真である。
日目の位相差像の図面に代わる顕微鏡写真である。
【図８】（ａ）（ｂ）は、各々、継代１代目の１５日目
および２２日目の状態をコントロールとして示した位相
差像およびトランスフェリン免疫染色像の図面に代わる
顕微鏡写真である。
および２２日目の状態をコントロールとして示した位相
差像およびトランスフェリン免疫染色像の図面に代わる
顕微鏡写真である。
【図９】図８に対応するＥＧＦを除いた時の肝細胞、非
実質肝細胞への影響を示した図面に代わる顕微鏡写真で
ある。
実質肝細胞への影響を示した図面に代わる顕微鏡写真で
ある。
【図１０】図９と同様のニコチンアミドを除いた時の図
面に代わる顕微鏡写真である。
面に代わる顕微鏡写真である。
【図１１】図９と同様のＬ−アスコルビン酸２−フォス
フェートを除いた時の図面に代わる顕微鏡写真である。
フェートを除いた時の図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１２】図９と同様のＤＭＳＯを除いた時の図面に代
わる顕微鏡写真である。
わる顕微鏡写真である。
【図１３】ＥＧＦ、ニコチンアミド、Ｌ−アスコルビン
酸２−フォスフェート、ＤＭＳＯをそれぞれ除いた時の
継代の後の肝細胞クラスターの面積の経時的変化を例示
した図である。
酸２−フォスフェート、ＤＭＳＯをそれぞれ除いた時の
継代の後の肝細胞クラスターの面積の経時的変化を例示
した図である。
【図１４】ＥＧＦ、ニコチンアミド、Ｌ−アスコルビン
酸２−フォスフェート、ＤＭＳＯをそれぞれ除いた時の
継代２２日目の抗トランスフェリン陽性細胞の占める面
積を示した図である。
酸２−フォスフェート、ＤＭＳＯをそれぞれ除いた時の
継代２２日目の抗トランスフェリン陽性細胞の占める面
積を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ＤＭＥＭ培地にニコチンアミド類並びに
アスコルビン酸類が添加されていることを特徴とする初
代培養肝細胞の継代培養培地。 - 【請求項２】 ＦＣＳ、ＥＧＦが添加されている請求項
１の継代培養培地。
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| CA002146735A CA2146735C (en) | 1994-04-11 | 1995-04-10 | Liver parenchymal cells having clonal growth ability, method for obtaining same, method for subculturing same, and subculturing system of primary hepatocytes |
| DE69533212T DE69533212T2 (de) | 1994-04-11 | 1995-04-11 | Leberparenchymzellen mit klonaler Wachstumsfähigkeit, Verfahren zu ihrer Herstellung und Kultursystem der primären Hepatocyten |
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Cited By (2)
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-
1994
- 1994-04-11 JP JP09805694A patent/JP3157984B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| WO2022181660A1 (ja) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 株式会社フェニックスバイオ | スクリーニング方法に使用するためのヒト脂肪肝モデル細胞 |
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| JPH07274951A (ja) | 1995-10-24 |
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