JP2023137653A - リポタンパク質中のステロールを測定する方法、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬及び試薬キット - Google Patents
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Abstract
【課題】リポタンパク質中のステロールを測定するための新規な方法、試薬及び試薬キットを提供することを課題とする。【解決手段】被検者から得られた試料中のリポタンパク質と、ステロール骨格のC3位にタグが付加されたタグ付加ステロールと、タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体とを接触させることにより、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質及び第１の捕捉体を含む複合体を形成させ、この複合体に含まれる標識物質により生じるシグナルを検出することにより、上記の課題を解決する。【選択図】図３Ｂ
Description
本発明は、リポタンパク質中のステロールを測定する方法に関する。本発明は、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬に関する。本発明は、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬キットに関する。
近年、リポタンパク質の機能を反映する指標が注目されている。リポタンパク質の機能を調べる方法として、例えば、特許文献１及び２に記載の方法が知られている。当該方法では、リポタンパク質の質的活性であるコレステロール取り込み能を測定する。これらの文献には、試料中のリポタンパク質とタグ付加コレステロールとを接触して、試料中のレシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)によりエステル化されたタグ付加コレステロールを取り込んだリポタンパク質を形成し、取り込まれたタグ付加コレステロールに由来するシグナルを検出することにより、リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定したことが開示されている。
特許文献１及び２に記載のタグ付加コレステロールでは、ステロール骨格のC17位にある炭化水素鎖を介してタグが付加されており、C3位にあるヒドロキシ基がLCATによりエステル化され得る。特許文献１及び２に記載の方法では、ステロール骨格の他の部位にタグが付加されたコレステロールは用いられていない。リポタンパク質の機能解析法として、リポタンパク質中のステロールを測定する方法はまだ少なく、さらなる測定方法の開発が求められる。
本発明は、試料中のリポタンパク質と、タグ付加ステロールと、タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体とを接触させることにより、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質及び第１の捕捉体を含む複合体を形成する工程と、複合体に含まれる標識物質により生じるシグナルを検出する工程とを含み、タグ付加ステロールにおいて、タグがステロール骨格のC3位に付加されている、リポタンパク質中のステロールを測定する方法を提供する。
本発明は、タグ付加ステロールを含む試薬であって、タグ付加ステロールにおいて、タグがステロール骨格のC3位に付加されている、上記の方法に用いられる、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬を提供する。
本発明は、タグ付加ステロールを含む第１試薬と、タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体を含む第２試薬とを備える試薬キットであって、タグ付加ステロールにおいて、タグがステロール骨格のC3位に付加されている、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬キットを提供する。
本発明によれば、リポタンパク質中のステロールを測定する方法、並びにその方法に用いることができる試薬及び試薬キットが提供される。
天然に存在するコレステロールは、生体内においてリポタンパク質と接触すると、当該リポタンパク質に取り込まれる。血中の遊離コレステロールは初め、リポタンパク質の表層(リン脂質膜)に結合する。ここで、コレステロールのC3位のヒドロキシ基がLCATによりエステル化されると、親油性が向上して、コレステロールは、リポタンパク質粒子の表層から中心部へと移動する。一方、本実施形態のリポタンパク質中のステロールを測定する方法(以下、「本実施形態の測定方法」ともいう)に用いられるタグ付加ステロールは、タグがステロール骨格のC3位に付加されているので、LCATによるエステル化がなされない。本明細書において「ステロール骨格」とは、下記の式で表される骨格をいう。
生体から得られた試料中のリポタンパク質の表層には、生体に由来する内因性コレステロールが含まれる。また、当該試料中には、生体に由来する内因性LCATも含まれる。リポタンパク質の表層の内因性コレステロールは、LCATによりエステル化されてコレステロールエステルが生成する。そして、コレステロールエステルはリポタンパク質内部に移動する。内因性コレステロールが表層から内部に移動したことにより、表層においてタグ付加コレステロールが結合する余地が生じる。タグ付加コレステロールは、LCATと接触し得るが、上記のとおり、タグ付加ステロールはLCATによってエステル化されないと考えられる。そのため、タグ付加ステロールは、リポタンパク質の表層にとどまると考えられる。リポタンパク質がより多くの内因性コレステロールを表層から内部に移動させることができる場合、表層において、より多くのタグ付加ステロールが結合できると考えられる。リポタンパク質の表層において、より多くのタグ付加ステロールが結合すると、当該リポタンパク質からはより強いシグナルが検出されることになる。したがって、本実施形態の測定方法により取得されるシグナルは、リポタンパク質の機能をあらわす指標となり得る。
試料とタグ付加ステロールが接触すると、タグ付加ステロールはリポタンパク質の表層に結合すると考えられ、タグ部分は、リポタンパク質の外表面に露出していると考えられる。ここで、「リポタンパク質の外表面」とは、リポタンパク質粒子の外側の面をいう。「外表面に露出している」とは、リポタンパク質の外表面上に存在すること、及び、リポタンパク質の外表面から突出していることの両方を意味する。タグ付加ステロールを含むリポタンパク質の外表面に露出しているタグと、該タグに特異的に結合する第１の捕捉体とを結合させることにより、リポタンパク質中のタグ付加ステロールを検出する。以下に、本実施形態の測定方法における各工程について説明する。
本実施形態の測定方法では、試料中のリポタンパク質と、タグ付加ステロールと、タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体とを接触させることにより、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質及び第１の捕捉体を含む複合体を形成する。
試料は、リポタンパク質を含むかぎり、特に限定されない。そのような試料としては、例えば血液試料が挙げられる。血液試料としては、例えば血液(全血)、血漿、血清などが挙げられる。リポタンパク質を含む試料を、超遠心分離法、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿法などの公知の方法によって分離又は分画して、所定のリポタンパク質を含む画分を取得してもよい。このようにして得られた所定のリポタンパク質を含む画分を、リポタンパク質を含む試料として用いてもよい。
リポタンパク質は、高比重リポタンパク質(HDL)、低比重リポタンパク質(LDL)、中間比重リポタンパク質(IDL)、超低比重リポタンパク質(VLDL)、又はカイロミクロン(CM)のいずれであってもよい。HDLは、1.063 g/mL以上の密度を有するリポタンパク質である。LDLは、1.019 g/mL以上1.063 g/mL未満の密度を有するリポタンパク質である。IDLは、1.006 g/mL以上1.019g/mL未満の密度を有するリポタンパク質である。VLDLは、0.95 g/mL以上1.006 g/mL未満の密度を有するリポタンパク質である。CMは、0.95 g/mL未満の密度を有するリポタンパク質である。好ましいリポタンパク質はHDLである。
リポタンパク質を含む試料は希釈されてもよい。例えば、リポタンパク質濃度を調整するために、上記の血液試料又は所定のリポタンパク質を含む画分を水性媒体で希釈して得た液を、試料として用いてもよい。水性媒体としては、例えば水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Tris-HCl、グッドバッファーなどが挙げられる。
リポタンパク質の構成成分であるアポリポタンパク質の濃度は、試料中のリポタンパク質の濃度の指標となる。アポリポタンパク質の濃度に基づいて、リポタンパク質を含む試料を希釈することにより、試料中のリポタンパク質濃度を調整してもよい。アポリポタンパク質の濃度は、公知の免疫学的測定法(例えば免疫比濁法)により測定できる。アポリポタンパク質としては、ApoAI又はApoEが好ましい。
試料には、必要に応じてブロッキング剤を添加してもよい。ブロッキング剤としては，例えばカゼイン、ウシ血清アルブミン(BSA)、環状オリゴ糖(例えばシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリンなど)、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン系重合体(例えば日油株式会社のリピジュア(商標)のシリーズ、特にリピジュア-BL203)などが挙げられる。また、リポタンパク質によるコレステロールのエステル化反応に必要となる脂肪酸又はそれを含む組成物(例えばリポソーム)を試料に添加してもよい。リポソームは、例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、コレステロール及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを混合することにより調製できる。
タグ付加ステロールは、上記の式で表されるステロール骨格を有し、そのC3位の炭素原子に直接又は間接的にタグが付加されたステロールをいう。ここで、「C3位の炭素原子に間接的にタグが付加される」とは、リンカーを介してステロールのC3位の炭素原子にタグが付加されること、ステロールのC3位の炭素原子に置換基が結合している場合は当該置換基を介してタグが付加されること、及び、上記のC3位の置換基にリンカーを介してタグが付加されることを包含する。好ましくは、タグ付加ステロールは、上記の式で表されるステロール骨格のC17位に、置換基を有してもよい炭化水素鎖を有する。
タグ付加ステロールは、ステロールのC3位にタグを付加することにより調製できる。タグは、ステロールのC3位の炭素原子に直接又はリンカーを介して付加されてもよい。ステロールのC3位の炭素原子に置換基が結合している場合、タグは、この置換基に付加されてもよい。あるいは、ステロールのC3位の置換基にリンカーを介してタグが付加されてもよい。例えば、コレステロールのようにC3位にヒドロキシ基を有するステロールを用いる場合、タグは、C3位のヒドロキシ基に直接又はリンカーを介して付加されてもよい。タグ付加ステロールの調製に用いられるステロールは、リポタンパク質の表層に結合することが好ましい。ステロールとしては、例えばコレステロール及びその類似体が挙げられる。コレステロールの類似体としては、例えばエピコレステロール、アロコレステロール、コレスタノール、コプロスタノール、7-デヒドロコレステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、α-スピナステロール、ブラシカステロール、24-メチレンステロールなどが挙げられる。
タグ付加ステロールとしては、例えば、下記の式(I)で表される化合物(以下、「式(I)のタグ付加ステロール」とも呼ぶ)が挙げられる。
R1は、置換基を有してもよい炭素数１以上６以下のアルキル基、又は、置換基を有してもよい炭素数２以上６以下のアルケニル基であり、
X及びYは、同一又は異なって、-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C=O)-NH-、-(C=O)-NH-R2-、-R2-NH-(C=O)-、-NH-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-、-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-O-、-(C=O)-O-R2-、-R2-O-(C=O)-、-O-(C=O)-R2-、-R2-(C=S)-NH-、-(C=S)-NH-R2-、-R2-NH-(C=S)-、-NH-(C=S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、又は-S-R2-で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有してもよい炭素数１以上10以下のアルキレン基、置換基を有してもよい炭素数６以上12以下のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有してもよい炭素数３以上８以下のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、又は-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、-NH-、-NH-(C=O)-、-(C=O)-NH-又は結合手であり、
Zは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、０以上６以下の整数であり、
bは、０又は１であり、
d及びeは、同一又は異なって、０以上12以下の整数であり、
fは、０以上24以下の整数である。)
式(I)において、「-[X]a-[L]b-[Y]c-」で表される部分は、タグとステロール部分とを連結するリンカーに相当する。式(I)において、a、b及びcがいずれも０であるとき、この式で表されるタグ付加ステロールはリンカーを有さない。すなわち、タグは、ステロール部分のC3位の酸素原子(以下、「C3位のO」とも呼ぶ)に結合している。式(I)において、a、b及びcのいずれかが０でないとき、式(I)のタグ付加ステロールは、タグとステロール部分との間にリンカーを有する。リンカーにより、リポタンパク質の外表面に露出したタグと第１の捕捉体とがより結合しやすくなると考えられる。以下に、式(I)の各置換基について説明する。
好ましくは、式(I)において、C5位とC6位との間の結合及びC7位とC8位との間の結合のいずれか一方が二重結合であるか、又は、C5位とC6位との間の結合及びC7位とC8位との間の結合の両方が単結合である。特に好ましくは、式(I)において、C5位とC6位との間の結合が二重結合であり、且つC7位とC8位との間の結合が単結合である。
R1は、炭素数１以上６以下のアルキル基又は炭素数２以上６以下のアルケニル基を主鎖とし、いずれかの位置に置換基を有していてもよい。R1が置換基を有するとき、上記の炭素数には、置換基の炭素数は含まれない。炭素数１以上６以下のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどの基が挙げられる。炭素数２以上６以下のアルケニル基としては、例えばビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどの基が挙げられる。
R1における置換基としては、例えばメチル、エチル、フェニル、ナフチル、ベンジル、アルコキシ、ニトロ、ハロゲン、ハロアルキル、チオエーテルなどの基が挙げられる。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を表す。アルコキシは、-O-アルキル基を示し、このアルキル基は、炭素数１以上５以下、好ましくは炭素数１又は２の直鎖状又は分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素基である。R1は、複数の置換基を有してもよい。R1における置換基としては、メチル基が特に好ましい。置換基がメチル基である場合、好ましいR1は、1, 5-ジメチルヘキシル基である。これは、天然に存在するコレステロールのC20位～C27位のアルキル鎖と同じである。
aが１以上の整数であるとき、[X]aは、C3位のOと、L、[Y]c又はZ(タグ)との連結部分に相当する。Lはスペーサーに相当し、リンカーに所定の長さを付与する直鎖状構造を有する。cが１以上の整数であるとき、[Y]cは、Z(タグ)と、L、[X]a又はC3位のOとの連結部分に相当する。X及びYは、ステロール部分とリンカーとを結合する反応及びリンカーとタグとを結合する反応の種類に応じて決定される。
R2及びR3関して、結合手とは、間に他の原子を介さずに直接結合することをいう。
R2が、炭素数１～10のアルキレン基であるとき、そのようなアルキレン基としては、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、2-エチルヘキシレン、ノニレン及びデシレンなどの基が挙げられる。それらの中でも、炭素数１以上４以下のアルキレン基が好ましい。R2が、置換基を有するアルキレン基であるとき、上記の炭素数には、置換基の炭素数は含まれない。
R2が、アリーレン基若しくはヘテロアリーレン基であるとき、そのような基は、Ｎ、Ｓ、Ｏ及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６以上12以下の芳香環であればよい。例えば、フェニレン、ナフチレン、ビフェニリレン、フラニレン、ピローレン、チオフェニレン、トリアゾーレン、オキサジアゾーレン、ピリジレン、ピリミジレンなどの基が挙げられる。R2が、置換基を有するアリーレン基又はヘテロアリーレン基であるとき、上記の炭素数には、置換基の炭素数は含まれない。
R2が、シクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であるとき、そのような基は、Ｎ、Ｓ、Ｏ及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３以上８以下の非芳香環であればよい。例えば、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレン、ピロリジニレン、ピペリジニレン、モルホリニレンなどの基が挙げられる。R2が、置換基を有するシクロアルキレン基又はヘテロシクロアルキレン基であるとき、上記の炭素数には、置換基の炭素数は含まれない。
R2における置換基としては、例えばヒドロキシ、シアノ、アルコキシ、ニトロ、=O、=S、-SH、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、カルボキシアルキル、アミン、アミド、チオエーテルなどの基が挙げられる。R2は、置換基を複数有していてもよい。ここで、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を表す。アルコキシは、-O-アルキル基を示し、このアルキル基は、炭素数１以上５以下、好ましくは炭素数１又は２の直鎖状又は分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素基である。
Lは、リポタンパク質とコレステロールの結合を阻害せず、且つ、リンカー部分がリポタンパク質に取り込まれにくい性質を有する構造であることが好ましい。そのような構造としては、親水性ポリマーを含む構造が挙げられる。例えば、式(I)において、bが１であり、R3が酸素原子であることが好ましい。このとき、Lは、-(CH2)d-[O-(CH2)e]f-又は-[(CH2)e-O]f-(CH2)d-で表わされる。ここで、dは０以上12以下の整数であり、eは１以上６以下の整数であり、fは１～24の整数である。好ましくは、d及びeは、同一又は異なって、１以上４以下の整数である。より好ましくは、d及びeは２である。fは、好ましくは１以上23以下の整数であり、より好ましくは３以上23以下の整数であり、特に好ましくは３以上11以下の整数である。
好ましい実施形態では、式(I)において、aは０又は１であり、b及びcは１であり、Xは-NH-(C=O)-R2-で表され、Yは-R2-(C=O)-NH-で表され、R2は、それぞれ独立して、置換基を有さない炭素数１以上６以下のアルキレン基であり、Lは-[(CH2)2-O]f-(CH2)d-で表わされ、dは１以上６以下の整数であり、fは０以上24以下の整数である。さらに、R1が1, 5-ジメチルヘキシル基であることがより好ましい。
例えば、式(I)において、a、b及びcは１であり、Xは-NH-(C=O)-(CH2)n-で表され(ただし、nは１以上６以下の整数、好ましくは２、３又は４である)、Yは-(CH2)4-(C=O)-NH-で表され、Lは-[(CH2)2-O]f-(CH2)2-で表わされ、fは１以上23以下の整数である。あるいは、式(I)において、a、b及びcは１であり、Xは-NH-(C=O)-(CH2)n-で表され(ただし、nは１以上６以下の整数、好ましくは２、３又は４である)、Yは-(CH2)4-(C=O)-NH-で表され、Lは-(CH2)f-で表わされ、fは１以上６以下の整数、好ましくは２以上５以下の整数である。あるいは、式(I)において、aは０であり、b及びcは１であり、Yは-(CH2)4-(C=O)-NH-で表され、Lは-[(CH2)2-O]f-(CH2)2-で表わされ、fは１以上23以下の整数である。いずれの場合も、R1が1, 5-ジメチルヘキシル基であることがより好ましい。
タグは、これと特異的に結合できる物質が存在するか又は得られるかぎり、特に限定されない。タグは、天然由来の物質及び合成された物質のいずれであってもよく、例えば化合物、ペプチド、タンパク質、核酸及びそれらの複合体などが挙げられる。タグと該タグに特異的に結合できる物質との組み合わせとしては、例えば、抗原と該抗原を認識する抗体、ハプテンと抗ハプテン抗体、ペプチド又はタンパク質とそれらを認識するアプタマー、リガンドとその受容体、オリゴヌクレオチドとその相補鎖を有するオリゴヌクレオチド、ビオチン類とアビジン類、ヒスチジンタグ(６～10残基のヒスチジンを含むペプチド)とNi-NTA(ニッケルイオンとキレートを形成したニトリロ三酢酸)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)とグルタチオンなどが挙げられる。タグとしての抗原は、当該技術において公知のペプチドタグ及びプロテインタグであってもよく、例えばFLAG(登録商標)、ヘマグルチニン(HA)、Mycタンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)などが挙げられる。タグとしてのハプテンは、例えば2, 4-ジニトロフェル(DNP)基などが挙げられる。DNPに特異的に結合する捕捉体としては、抗DNP抗体が適している。
本明細書において「ビオチン類」とは、ビオチンとその類縁体を包含する。ビオチンの類縁体としては、例えばデスチオビオチン、ビオシチンなどが挙げられる。本明細書において「アビジン類」とは、アビジンとその類縁体を包含する。アビジンの類縁体としては、例えばストレプトアビジン、タモギタケ由来アビジン様タンパク質(タマビジン(登録商標))、ブラダビジン、リザビジンなどが挙げられる。
タグとしての化合物は、例えば、当該技術分野において公知の標識化合物であってもよい。そのような化合物としては、例えばビオチン基、色素化合物などが挙げられる。本明細書において「ビオチン基」とは、ビオチン類の化学構造のうち、少なくともイミダゾリジン環を含む複素環部分をいう。好ましいビオチン基は、ビオチンのビオチン基である。ビオチン基に特異的に結合する捕捉体としては、アビジン類が適している。色素化合物としては、例えばボロンジピロメテン(BODIPY(登録商標))が挙げられる。BODIPYに結合する捕捉体としては、抗BODIPY抗体(BODIPY FL Rabbit IgG Fraction、A-5770、Lifetechnologies社)が市販されている。それらの中でも、ビオチン基がタグとして好ましい。
タグ付加ステロールは、好ましくはタグ付加コレステロールである。タグ付加コレステロールとしては、例えば、下記の式(II)、(III)又は(IV)で表されるビオチン付加コレステロールが挙げられる。
タグ付加ステロールにおいて、ステロール部分とタグとの結合様式は特に限定されないが、共有結合が好ましい。例えば、ステロール部分のC3位にタグを共有結合させてもよいし、ステロール部分のC3位とタグとをリンカーを介して共有結合させてもよい。結合手段は特に限定されないが、例えば、官能基を利用したクロスリンクが簡便で好ましい。官能基は特に限定されないが、例えばアミノ基、カルボキシル基及びスルフヒドリル基は、市販のクロスリンカーを利用できるので好ましい。
ステロールとしてコレステロールを用いる場合、C3位のヒドロキシ基は官能基として反応性に乏しい。そこで、例えば下図の第１ステップに示すように、C3位のヒドロキシ基と塩化トシルとを反応させてトシラートを生成してもよい(図中、R-OHはコレステロールである)。そして、下図の第２ステップに示すように、トシラートと、タグを有するアルコールとを反応させることにより、トシル基が脱離して、タグ付加コレステロールが得られる(図中、R’-OHは、タグを有するアルコールである)。
あるいは、下図の第１ステップに示すように、コレステロールのC3位のヒドロキシ基と、ブロモ酢酸エチル、ブロモプロピオン酸エチル、ブロモ酪酸エチルなどのアルキル化剤とを反応させてエーテルを生成してもよい(図中、R-OHはコレステロールであり、R’は例えばメチレン基、エチレン基又はプロピレン基であり、Etはエチル基である)。そして、下図の第２ステップに示すように、生成物を、水酸化カリウムなどのアルカリによって加水分解することにより、コレステロールのC3位にカルボキシ基を付与してもよい。このC3位のカルボキシ基に対して、クロスリンク反応によりタグを結合することで、タグ付加コレステロールを得ることができる。
タグが有する官能基は、タグの種類に応じて異なる。例えば、ペプチド又はタンパク質をタグに用いる場合は、アミノ基、カルボキシル基及びスルフヒドリル基(SH基)が利用できる。ビオチンをタグに用いる場合は、ビオチンの側鎖のカルボキシル基が利用できる。リンカーは、両端に官能基を有する鎖状構造の化合物(例えばポリマー化合物)が好ましい。ビオチンをタグとして付加する場合、市販のビオチン標識試薬を用いてもよい。この試薬は、末端に官能基を有する様々な長さのスペーサーアーム(例えばPEG鎖)を結合させたビオチンが含まれる。
以下に、代表的な官能基のクロスリンクの反応を説明する。官能基としてカルボキシル基を有する化合物は、下図に示される３つのステップを経て、反応基としてアミノ基を有する化合物と結合できる。まず、下図の第１ステップに示すように、カルボキシル基を有する化合物と、カルボジイミド基(-N=C=N-)を有する化合物(下図では、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド(WSC))と反応させる。次いで、下図の第２ステップに示すように、第１ステップの生成物とNHSとを反応させることで、不安定なNHSエステルを形成させる。そして、下図の第３ステップに示すように、第２ステップの生成物と、アミノ基を有する化合物とを反応させることにより、両者をクロスリンクできる。例えば、カルボキシル基を有するステロール又はリンカーと、アミノ基を有するタグとを結合する場合は、このようにしてクロスリンクできる。また、カルボキシル基を有するステロール又はリンカーと、カルボキシル基を有するタグとをクロスリンクする場合は、両端にアミノ基を有するクロスリンク試薬を用いてもよい。
官能基としてアミノ基を有する化合物は、下図に示すように、反応基としてN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル又はイソチオシアノ基を有する化合物とクロスリンクできる。例えば、アミノ基を有するリンカーと、アミノ基を有するタグとをクロスリンクする場合は、両端にNHSエステルを有するクロスリンク試薬を用いてもよい。
官能基としてスルフヒドリル基を有する化合物は、下図に示すように、反応基としてマレイミド基又はブロモ(もしくはヨード)アセトアミド基を有する化合物とクロスリンクできる。例えば、スルフヒドリル基を有するリンカーと、スルフヒドリル基を有するタグとをクロスリンクする場合は、両端にマレイミドを有するクロスリンク試薬を用いてもよい。
官能基としてカルボキシル基を有する化合物と、反応基としてアミノ基を有する化合物とを共有結合させる場合、公知の縮合剤によるアミド化反応を利用してもよい。そのような縮合剤としては、例えばO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1，1，3，3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート(HATU)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド、2-クロロ-1, 3-ジメチルイミダゾリニウム、1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホ二ウムヘキサフルオロリン酸塩、ジフェニルホスホリルアジド、クロロトリピロリジノホスホ二ウムヘキサフルオロリン酸塩、N, N’-ジイソプロピルカルボジイミドなどが挙げられる。
上記のクロスリンク反応及びアミド化反応は、常温常圧下で行うことができる。反応に用いる溶媒は、上記の反応に対して不活性であって、且つ反応に付される各化合物を溶解又は分散できるかぎり特に限定されない。そのような溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン(THF)、ジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、1, 4-ジオキサンなどのエーテル類、N, N-ジメチルホルムアミド(DMF)などのアミド類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類などが挙げられる。これらの溶媒を単独又は混液として使用できる。
タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体は、標識物質で標識された、タグに特異的に結合する捕捉体である。タグに特異的に結合する捕捉体は、タグの種類に応じて適宜決定できる。例えば、上述したタグと該タグに特異的に結合できる物質との組み合わせを参照して、抗体、アプタマー、リガンド受容体、オリゴヌクレオチド、ビオチン類、アビジン類、ヒスチジンタグ、Ni-NTA、GST、グルタチオンなどから選択できる。それらの中でも、アビジン類又は抗体が好ましい。アビジン類としては、アビジン又はストレプトアビジンが好ましい。
本明細書において「抗体」との用語は、抗体フラグメントも包含する。抗体フラグメントとしては、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、scFv、ドメイン抗体(dAb)、還元型IgG(rIgG)、ダイアボディ、トリアボディなどなどが挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもよい。抗体の由来は特に限定されず、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダなどのいずれの哺乳動物に由来する抗体であり得る。抗体のアイソタイプはIgG、IgM、IgE、IgAなどのいずれでもよいが、好ましくはIgGである。タグに特異的に結合する抗体は、市販の抗体であってもよいし、当該技術分野において公知の方法により作製した抗体であってもよい。
標識物質は特に限定されず、例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質などが挙げられる。シグナル発生物質としては、例えば蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば酵素が挙げられる。酵素は適切な基質と反応することにより、光、色などのシグナルを発生させる。酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ(ALP)、ペルオキシダーゼ(POD)、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。標識物質としては、酵素が好ましく、ALP及びPODが特に好ましい。
タグに特異的に結合する捕捉体の標識物質による標識は、当該捕捉体に標識物質を直接又は間接的に結合することにより行うことができる。標識物質が直接結合した捕捉体は、例えば、標識物質が共有結合した捕捉体である。これは、例えば市販のラベリングキットやクロスリンカーなどを用いて、標識物質と捕捉体とを共有結合させることにより得ることができる。捕捉体及び標識物質がいずれもタンパク質である場合、標識物質が直接結合した捕捉体は、捕捉体と標識物質との融合タンパク質であり得る。これは、当該技術分野において公知の遺伝子組み換え技術により作製できる。
標識物質を捕捉体に間接的に結合する場合は、標識物質が共有結合され且つ捕捉体に特異的に結合する物質を用いることができる。例えば、タグに特異的に結合する捕捉体がアビジン類である場合、標識物質が共有結合したビオチン類(標識ビオチン類)を用いることができる。アビジン類は通常、四量体を形成しており、４分子のビオチン類と結合できる。四量体のアビジン類に対して１又は２分子の標識ビオチン類が結合するような比率で、アビジン類と標識ビオチン類とを混合することで、標識ビオチン類が結合したアビジン類が得られる。タグに特異的に結合する捕捉体が抗体である場合、標識物質が共有結合され且つ当該抗体に特異的に結合する抗体(標識二次抗体)を用いることができる。
好ましい実施形態では、第１の捕捉体は、タグに特異的に結合する標識抗体、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンである。標識抗体としては、標識物質が共有結合した抗体又は標識物質が融合した抗体が好ましい。標識アビジン及び標識ストレプトアビジンとしては、標識物質が共有結合したアビジン及びストレプトアビジン、標識物質が融合したアビジン及びストレプトアビジン、１又は２分子の標識ビオチン類が結合したアビジン及びストレプトアビジンが好ましい。
試料中のリポタンパク質とタグ付加ステロールと第１の捕捉体との接触は、試料とタグ付加ステロールと第１の捕捉体とを混合することにより行うことができる。この混合により、タグ付加ステロールがリポタンパク質に結合し、当該リポタンパク質の外表面に露出したタグに第１の捕捉体が結合すると考えられる。その結果、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質及び第１の捕捉体を含む複合体が形成する。混合の順序は特に限定されず、試料とタグ付加ステロールと第１の捕捉体とを実質的に同時に混合してもよいし、逐次混合してもよい。
タグ付加ステロールの添加量は、特に限定されない。例えば、タグ付加ステロールを終濃度10 nM～10μM、好ましくは20 nM～５μMとなるように試料に添加できる。第１の捕捉体の添加量は特に限定されず、当該捕捉体及び標識物質の種類などに応じて適宜設定できる。
好ましい実施形態では、まず、試料中のリポタンパク質とタグ付加ステロールとを接触させる。これにより、リポタンパク質にタグ付加ステロールが結合する。その後、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、第１の捕捉体とを接触させる。これにより、第１の捕捉体がリポタンパク質の外表面に露出したタグに結合して、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質及び第１の捕捉体を含む複合体が形成される。試料とタグ付加ステロールとの混合における温度及び時間の条件は、特に限定されない。例えば、試料とタグ付加ステロールとの混合液を20～48℃、好ましくは25～42℃にて、１分間～24時間、好ましくは10分間～２時間インキュベーションしてもよい。インキュベーションの間、混合液は静置してもよいし、撹拌又は振とうしてもよい。タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第１の捕捉体との混合における温度及び時間の条件も特に限定されず、上記の範囲から適宜決定できる。
好ましい実施形態では、リポタンパク質に特異的に結合する第２の捕捉体を、リポタンパク質とタグ付加ステロールと第１の捕捉体との接触に用いる。具体的には、試料とタグ付加ステロールと第１の捕捉体と第２の捕捉体とを混合する。混合の順序は特に限定されない。また、第２の捕捉体の添加量は特に限定されず、当該捕捉体の種類などに応じて適宜設定できる。
第２の捕捉体は、リポタンパク質の表面の一部と特異的に結合できる物質であれば特に限定されない。そのような物質としては、例えば抗体、アプタマーなどが挙げられる。第２の捕捉体としては、リポタンパク質に特異的に結合する抗体が好ましく、リポタンパク質の構成成分であるアポリポプロテインと特異的に結合できる抗体がより好ましい。そのような抗体としては、例えば、抗ApoA抗体(抗ApoAI抗体及び抗ApoAII抗体)、抗ApoB抗体及び抗ApoE抗体(抗ApoE2抗体、抗ApoE3抗体及び抗ApoE4抗体)などが挙げられる。それらの中でも、抗ApoAI抗体が特に好ましい。市販の抗リポタンパク質抗体又は抗ApoAI抗体を用いてもよい。
リポタンパク質とタグ付加ステロールと第１の捕捉体との接触において、第２の捕捉体をさらに接触させることにより、第１の捕捉体と、タグ付加ステロールが結合したリポタンパク質と、第２の捕捉体との複合体が形成される。この複合体において、第１の捕捉体は、リポタンパク質の外表面に露出したタグに結合し、第２の捕捉体は、当該リポタンパク質の表面に結合する。すなわち、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質は、第１の捕捉体及び第２の捕捉体で挟まれた状態にある。本実施形態では、第１の捕捉体と、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、第２の捕捉体との複合体を、以下、「サンドイッチ複合体」ともいう。
サンドイッチ複合体の形成における、好ましい接触の順序は次のとおりである。まず、試料中のリポタンパク質とタグ付加ステロールとを接触させる。これにより、リポタンパク質にタグ付加ステロールが結合する。次いで、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、第２の捕捉体とを接触させる。これにより、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質の表面に第２の捕捉体が結合して、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との複合体が形成される。その後、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との複合体と、第１の捕捉体とを接触させる。これにより、第１の捕捉体がリポタンパク質の外表面に露出したタグに結合して、サンドイッチ複合体が形成される。
タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との混合における温度及び時間の条件は特に限定されない。例えば、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との混合液を20～48℃、好ましくは25～42℃にて、１分間～24時間、好ましくは10分間～２時間インキュベーションしてもよい。インキュベーションの間、混合液は静置してもよいし、撹拌又は振とうしてもよい。
タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との複合体は、固相上に形成されてもよい。例えば、試料中のリポタンパク質と、タグ付加ステロールと、第２の捕捉体と、固相とを接触させることにより、上記の複合体が固相上に形成される。接触の順序は特に限定されないが、例えば、試料中のリポタンパク質とタグ付加ステロールとを接触した後、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、第２の捕捉体と、固相とを接触してもよい。あるいは、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、第２の捕捉体とを接触した後、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との複合体と、固相とを接触させてもよい。
第２の捕捉体は、あらかじめ固相上に固定化されていてもよい。例えば、試料中のリポタンパク質とタグ付加ステロールとを接触した後、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、第２の捕捉体が固定化された固相とを接触してもよい。あるいは、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、第２の捕捉体が固定化された固相とを接触させてもよい。固相を用いる場合の温度及び時間の条件は、特に限定されない。例えば、上記のタグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との混合と同じ条件であってもよい。
固相は、第２の捕捉体を固定可能な不溶性の担体であればよい。例えば、固相と第２の捕捉体とが直接又は間接的に結合することにより、捕捉体を固相に固定化できる。固相と第２の捕捉体との直接結合としては、例えば、疎水性相互作用による固相表面への吸着又は共有結合が挙げられる。例えば、第２の捕捉体が抗体であり、固相がELISA用マイクロプレートである場合、吸着により抗体をプレートのウェル内に固定化できる。また、第２の捕捉体が抗体であり、固相が表面に官能基を有する場合、官能基を利用した共有結合により、抗体を固相表面に固定化できる。例えば、固相がカルボキシル基を有する粒子である場合、上述のカルボキシル基を有する化合物のクロスリンク反応を利用できる。具体的には、粒子表面のカルボキシル基をWSCで活性化し、次いでNHSと反応させてNHSエステルを形成する。そして、NHSエステルを有する粒子と抗体とを接触させると、NHSエステルと抗体のアミノ基とが反応して、抗体が粒子表面に共有結合で固定化される。
固相と第２の捕捉体との間接結合としては、第２の捕捉体に特異的に結合する分子を介した結合が挙げられる。そのような分子を固相表面にあらかじめ固定化しておくことで、第２の捕捉体を固相に固定化できる。例えば、第２の捕捉体が抗体であるとき、第２の捕捉体に特異的に結合する分子としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体を特異的に認識する抗体(二次抗体)などが挙げられる。また、第２の捕捉体と固相との間を介在する物質の組み合わせを用いて、両者を結合することもできる。そのような物質の組み合わせとしては、ビオチン類とアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体などの組み合わせが挙げられる。例えば、第２の捕捉体をあらかじめDNPで修飾している場合、抗DNP抗体が固定化された固相によって、第２の捕捉体を当該固相に固定化できる。
固相の素材は、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム、コバルト及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。
固相の形状は特に限定されず、例えば粒子、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも、粒子及びマイクロプレートが好ましく、磁性粒子が特に好ましい。固相の形状が粒子である場合、固相として、粒子の懸濁液を上記の複合体の形成に用いることができる。固相の形状がマイクロプレートなどの容器である場合、固相としての容器内で上記の複合体の形成を行うことができる。磁性粒子に固定化された第２の捕捉体を用いる場合、測定は、HISCL(登録商標)シリーズ(シスメックス株式会社)などの市販の全自動免疫測定装置を用いて行ってもよい。
タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との接触と、形成した複合体と第１の捕捉体との接触との間に、未反応の遊離成分を除去するB/F(Bound/Free)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分としては、タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と第２の捕捉体との複合体を構成しない成分である。例えば、リポタンパク質に結合しなかった遊離のタグ付加ステロール、リポタンパク質と結合しなかった遊離の第２の捕捉体、試料中の夾雑物などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、例えば、超遠心分離法などにより複合体だけを回収することで、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。複合体を固相上に形成している場合、固相が粒子であれば、遠心分離や磁気分離により粒子を回収し、上清を除去することにより、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することにより、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。
未反応の遊離成分を除去した後、回収した複合体又は当該複合体を固定化した固相を適切な水性媒体で洗浄できる。そのような水性媒体としては、例えば水、生理食塩水、PBS及びTris-HCl、グッドバッファーなどが挙げられる。必要に応じて、水性媒体に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤は特に限定されず、例えば、生化学や分子生物学の分野において洗浄バッファーに用いられる界面活性剤から適宜選択できる。
本実施形態の測定方法では、標識物質により生じるシグナルを検出する。当該標識物質は、リポタンパク質の外表面に露出したタグに結合した第１の捕捉体が有する標識物質である。したがって、この標識物質により生じるシグナルは、リポタンパク質中のタグ付加ステロールの量を反映する。すなわち、当該シグナルの検出結果は、リポタンパク質のステロール取り込み能の指標となる。
本明細書において「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナルの強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。「シグナルの強度を半定量的に検出する」とは、シグナル強度を「シグナル発生せず」、「弱」、「強」などのように複数の段階に検出することをいう。好ましくは、上記の複合体に含まれる標識物質により生じるシグナルの強度を定量して、測定値を取得する。必要に応じて、シグナル強度の測定値からバックグラウンドの値を差し引いた値を取得してもよい。バックグラウンドの値としては、例えば、試料、タグ付加ステロール、第１の捕捉体及び第２の捕捉体のいずれか１つを用いない測定により得たシグナル強度の測定値が挙げられる。
シグナルを検出する方法自体は、当該技術分野において公知である。本実施形態では、標識物質に由来するシグナルの種類に応じて、適切な測定方法を選択できる。例えば、標識物質が酵素である場合、酵素と該酵素に対する基質とが反応することによって発生する光、色などのシグナルを、公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。そのような測定装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択することができる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質としては、ルミノール及びその誘導体などの化学発光基質、2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)(ABTS)、1, 2-フェニレンジアミン(OPD)、3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などの発色基質が挙げられる。また、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としては、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。好ましい実施形態では、シグナルは、酵素と基質とを接触させることにより生じる化学発光シグナルである。
標識物質が放射性同位体である場合、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
シグナルの検出を行う前に、未反応の遊離成分を除去するB/F分離を行ってもよい。未反応の遊離成分としては、例えば、タグに結合しなかった遊離の第１の捕捉体などが挙げられる。B/F分離の具体的な手法及び洗浄液については、上述の洗浄工程と同様である。
上述の各工程は、インビトロで実施される。また、上述の各工程は、実質的に無細胞系で行われる。実質的に無細胞系とは、リポタンパク質中のステロールの測定に利用する目的で、細胞を積極的に添加することがないことを意味する。例えば、従来のコレステロール排出機能の測定法では、マクロファージなどのコレステロールを溜め込んだ細胞を用いる。しかし、本実施形態の測定方法では、試料中のリポタンパク質にタグ付加ステロールが直接結合するので、そのような細胞を用いる必要がない。試料に生体由来の細胞が含まれている場合であっても、その細胞自体はリポタンパク質とタグ付加ステロールの結合にほとんど影響しないと考え、測定方法は無細胞系であるとみなす。
本発明のさらなる実施形態は、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬(以下、「本実施形態の試薬」ともいう)に関する。本実施形態の試薬は、タグ付加ステロールを含み、上記の本実施形態の測定方法に用いられる。タグ付加ステロールの詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同じである。
本実施形態の試薬は、タグ付加ステロールを容器に収容して、ユーザーに提供されてもよい。本実施形態の試薬の一例を、図１に示す。図１を参照して、１０は、容器に収容された本実施形態の試薬示す。試薬中のタグ付加ステロールは、固体(例えば粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。タグ付加ステロールを液体の形態で試薬に含む場合、溶媒としては、例えば上記の水性媒体が挙げられる。必要に応じて、水性媒体にカゼイン、BSAなどの安定化剤を添加してもよい。
本発明のさらなる実施形態は、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬の製造のためのタグ付加ステロールの使用であって、前記タグ付加ステロールにおいて、前記タグがステロール骨格のC3位に付加されている、前記使用に関する。タグ付加ステロールの詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同じである。
本発明のさらなる実施形態は、タグ付加ステロールを含む試薬を備える、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬キット(以下、「本実施形態の試薬キット」ともいう)に関する。本実施形態の試薬キットは、上記の本実施形態の測定方法に用いられる。タグ付加ステロールの詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同じである。例えば、タグ付加ステロールを含む試薬を収容した容器を箱に梱包して、本実施形態の試薬キットとしてユーザーに提供されてもよい。箱には、添付文書を同梱してもよい。添付文書には、試薬の組成、タグ付加ステロールの構造、試薬の使用方法、試薬の保管方法などが記載されてもよい。本実施形態の試薬キットの一例を、図２Ａに示す。図２Ａを参照して、１１は、本実施形態の試薬キットを示し、１２は、タグ付加ステロールを含む試薬を収容した容器を示し、１３は、梱包箱を示し、１４は、添付文書を示す。
本実施形態の試薬キットは、タグ付加ステロールを含む第１試薬と、タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体を含む第２試薬とを備えてもよい。また、本実施形態の試薬キットは、リポタンパク質に特異的に結合する第２の捕捉体を含む第３試薬をさらに備えてもよい。第１の捕捉体及び第２の捕捉体の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同じである。
本実施形態の試薬キットは、各試薬を収容した容器が箱に梱包されて、ユーザーに提供されてもよい。箱には、添付文書を同梱してもよい。添付文書には、各試薬の組成、タグ付加ステロールの構造、各試薬の使用方法、各試薬の保管方法などが記載されてもよい。本実施形態の試薬キットの一例を、図２Ｂに示す。図２Ｂを参照して、２１は、本実施形態の試薬キットを示し、２２は、タグ付加ステロールを含む第１試薬を収容した第１容器を示し、２３は、第１の捕捉体を含む第２試薬を収容した第２容器を示し、２４は、梱包箱を示し、２５は、添付文書を示す。
本実施形態の試薬キットは、上記の第１試薬及び第２試薬に加えて、第２の捕捉体を含む第３試薬を備えてもよい。図２Ｃを参照して、３１は、本実施形態の試薬キットを示し、３２は、タグ付加ステロールを含む第１試薬を収容した第１容器を示し、３３は、第１の捕捉体を含む第２試薬を収容した第２容器を示し、３４は、第２の捕捉体を含む第３試薬を収容した第３容器を示し、３５は、梱包箱を示し、３６は、添付文書を示す。
試薬中のタグ付加ステロール、第１の捕捉体及び第２の捕捉体はそれぞれ、固体(例えば、粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば、溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。タグ付加ステロールを液体の形態で試薬に含む場合、溶媒としては、例えば上記の水性媒体が挙げられる。必要に応じて、水性媒体にカゼイン、BSAなどの安定化剤を添加してもよい。
第３試薬において、第２の捕捉体は、あらかじめ固相に固定化されていてもよい。この場合、第３試薬は、固相に固定化された第２の捕捉体を含む。固相の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同じである。固相が粒子である場合、図２Ｃにおいて、３４は、粒子に固定化された第２の捕捉体を含む試薬を収容した容器を示す。固相がマイクロプレートであり、第３試薬が、第２の捕捉体が固定化されたマイクロプレートである場合の本実施形態の試薬キットの一例を、図２Ｄに示す。図２Ｄを参照して、４１は、本実施形態の試薬キットを示し、４２は、タグ付加ステロールを含む第１試薬を収容した第１容器を示し、４３は、第１の捕捉体を含む第２試薬を収容した第２容器を示し、４４は、第２の捕捉体が固定化されたマイクロプレートを示し、４５は、梱包箱を示し、４６は、添付文書を示す。図２Ｄにおいて、マイクロプレートは96ウェルプレートである。
本実施形態の試薬キットは、キャリブレータをさらに備えてもよい。キャリブレータは、例えば、リポタンパク質を含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、濃度既知のリポタンパク質を含む緩衝液とを備える。本実施形態の試薬キットは、洗浄液をさらに備えてもよい。洗浄液とこれに含まれる水性媒体及び界面活性剤の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同じである。
本発明のさらなる実施形態は、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬キットの製造のための、タグ付加ステロール、前記タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体、及び前記リポタンパク質に特異的に結合する第２の捕捉体の使用であって、前記タグ付加ステロールにおいて、前記タグがステロール骨格のC3位に付加されている、前記使用に関する。タグ付加ステロール、第１の捕捉体及び第２の捕捉体の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同じである。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１： タグ付加ステロールの調製
タグ付加ステロールとして、ビオチン-PEGn-コレステロール、ビオチン-(CH2)n-コレステロール及びビオチン-PEG7(エーテル)-コレステロールを調製した。これらのビオチン付加コレステロールにおけるビオチン基は、いずれもD-ビオチンのビオチン基であった。それぞれの構造式を以下に示す。
タグ付加ステロールとして、ビオチン-PEGn-コレステロール、ビオチン-(CH2)n-コレステロール及びビオチン-PEG7(エーテル)-コレステロールを調製した。これらのビオチン付加コレステロールにおけるビオチン基は、いずれもD-ビオチンのビオチン基であった。それぞれの構造式を以下に示す。
(１) ビオチン-PEGn-コレステロールの調製
ビオチン-PEGn-コレステロールの合成スキームを以下に示す。
ビオチン-PEGn-コレステロールの合成スキームを以下に示す。
第１ステップを参照して、コレステロール(3 mmol)(東京化成工業株式会社(以下、TCI社ともいう))と、ブロモ酢酸エチル(6 mmol)と、水素化ナトリウム(9 mmol)とを、DMF(15 mL)に溶解し、室温、アルゴン雰囲気下で18時間撹拌した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー法で精製した。第２ステップを参照して、THF2.5mL及び水0.5mLの混合液に、第一ステップで得た化合物(0.11 mmol)を溶解した。続いて、すり潰した水酸化カリウム(0.22 mmol)を添加し、室温、アルゴン雰囲気下で１時間撹拌した。出発物質(コレステロール)の溶液、第１ステップで得られた反応液、及び第２ステップで得られた反応液をそれぞれシリカゲルプレートにスポットし、展開溶媒(ヘキサン：酢酸エチル = 10：1)で展開した。出発物質のRf値は０であり、第１ステップの生成物のRf値は0.3であり、第２ステップの生成物のRf値は０であった。
第３ステップを参照して、第２ステップで得られた化合物(0.03 mmol)、Biotin-PEGn-Amine(0.03 mmol、nは1、2、3、7、11又は23)(BroadPharm社)、HATU(0.05 mmol)、トリエチルアミン(TEA)(8.3μL)をDMF(1 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下で室温にて18時間撹拌した。第２ステップで得られた反応液、第３ステップで得られた反応液、及びそれらの混合液をそれぞれシリカゲルプレートにスポットし、展開溶媒(ジクロロメタン：メタノール = 10：1)で展開した。第３ステップの生成物(Biotin-PEGn-コレステロール)のRf値は0.1～0.2であった。HPLC分取法により、タグ付加コレステロールとして、ビオチン-PEGn-コレステロールを回収した。以下、所定のビオチン-PEGn-コレステロールについて言及する場合、PEG鎖の長さ(nの数)に応じて「PEG1」、「PEG2」、「PEG3」、「PEG7」、「PEG11」又は「PEG23」と呼ぶ。
(２) ビオチン-(CH2)n-コレステロールの調製
上記(１)の第３ステップにおいて、Biotin-PEGn-Amineに代えて、N-(2-アミノエチル)ビオチンアミド(0.03 mmol)(Cat No. A3131：TCI社)又はビオチン-C5-アミン(0.03 mmol)(Cat No. A3155：TCI社)を用いたこと以外は上記(１)と同様にして、ビオチン-(CH2)n-コレステロールを調製した。以下、所定のビオチン-(CH2)n-コレステロールについて言及する場合、２つのアミド基の窒素原子間の炭素数(nの数)に応じて「C2-Amide」又は「C5-Amide」と呼ぶ。
上記(１)の第３ステップにおいて、Biotin-PEGn-Amineに代えて、N-(2-アミノエチル)ビオチンアミド(0.03 mmol)(Cat No. A3131：TCI社)又はビオチン-C5-アミン(0.03 mmol)(Cat No. A3155：TCI社)を用いたこと以外は上記(１)と同様にして、ビオチン-(CH2)n-コレステロールを調製した。以下、所定のビオチン-(CH2)n-コレステロールについて言及する場合、２つのアミド基の窒素原子間の炭素数(nの数)に応じて「C2-Amide」又は「C5-Amide」と呼ぶ。
(３) ビオチン-PEG7(エーテル)-コレステロールの調製
ビオチン-PEG7(エーテル)-コレステロールの合成スキームを以下に示す。
ビオチン-PEG7(エーテル)-コレステロールの合成スキームを以下に示す。
コレステロール(1.94 mmol)(TCI社)をピリジン(6 mL)に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却した。塩化トシル(3.87 mmol)をピリジン(1.2 mL)に溶解した。第１ステップを参照して、コレステロール溶液に塩化トシル溶液を添加して、室温で一晩撹拌した。第１ステップで得られた反応液をロータリーエバポレータにより濃縮し、得られた固形物を1.2 mLのクロロホルムに溶解して回収した。ここに、メタノール(15 mL)を添加して、コレステ-5-エン-3β-トシレートの沈殿物を得た。沈殿物をろ過により取得し、メタノール(15 mL)及びアセトニトリル(6 mL)で洗浄し、真空乾燥した。第２ステップを参照して、第１ステップで得られたコレステ-5-エン-3β-トシレート(0.02 mmol)とBiotin-PEG7-alchol(BroadPharm社)とを、0.2 mLの1, 4-ジオキサンに溶解し、110℃で18時間、加熱還流した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー法により、タグ付加コレステロールとして、ビオチン-PEG7(エーテル)-コレステロール(以下、「PEG7(エーテル)」とも呼ぶ)を回収した。上記の合成スキームに示すように、PEG7(エーテル)は、Biotin-PEG7-alcholによる求核反応によりトシル基が脱離して、ステロール骨格の3位の酸素原子にタグが付加されるので、3位の酸素原子の立体配置が反転すると考えられる。
実施例２： リポタンパク質中のステロールの測定(１)
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、C5-Amide、PEG3、PEG7、PEG11及びPEG23を用いた。各ビオチン付加コレステロールを、種々の濃度でリポタンパク質を含む試料に混合した後、リポタンパク質中のビオチン付加コレステロールを測定して、定量性を検討した。また、活性の異なる２種のリポタンパク質を同様に測定して、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られるかを検討した。測定は、研究用全自動高感度免疫測定装置HI-1000(シスメックス株式会社)により行った。
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、C5-Amide、PEG3、PEG7、PEG11及びPEG23を用いた。各ビオチン付加コレステロールを、種々の濃度でリポタンパク質を含む試料に混合した後、リポタンパク質中のビオチン付加コレステロールを測定して、定量性を検討した。また、活性の異なる２種のリポタンパク質を同様に測定して、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られるかを検討した。測定は、研究用全自動高感度免疫測定装置HI-1000(シスメックス株式会社)により行った。
(１) 試料の調製
(1.1) リポタンパク質濃度の異なる試料の調製
健常者のプール血清に等量の22％のポリエチレングリコール4000(ナカライテスク株式会社)を混合し、室温にて20分間静置した。その後、混合液を860 xgで15分間、室温にて遠心分離した。得られた上清をHDL画分として回収した。得られたHDL画分をPBSで段階的に希釈して、HDL濃度の異なる５種の試料を調製した。以下、これらの試料を、HDL濃度の低い方から「C1」、「C2」、「C3」、「C4」及び「C5」と呼ぶ。HDL画分を含まないキャリブレータ「C0」として、PBSを用いた。
(1.1) リポタンパク質濃度の異なる試料の調製
健常者のプール血清に等量の22％のポリエチレングリコール4000(ナカライテスク株式会社)を混合し、室温にて20分間静置した。その後、混合液を860 xgで15分間、室温にて遠心分離した。得られた上清をHDL画分として回収した。得られたHDL画分をPBSで段階的に希釈して、HDL濃度の異なる５種の試料を調製した。以下、これらの試料を、HDL濃度の低い方から「C1」、「C2」、「C3」、「C4」及び「C5」と呼ぶ。HDL画分を含まないキャリブレータ「C0」として、PBSを用いた。
(1.2) コレステロール取り込み能の異なるHDLを含む試料の調製
HDLのコレステロール取り込み能が異なることが既知の２種類のプール血清をそれぞれ、上記(1.1)と同様に処理して、HDL画分を回収した。各HDL画分をPBSで同じ倍率で希釈した。以下、取り込み能が高いHDLを含む血清由来のHDL希釈画分を「試料Ｈ」と呼び、取り込み能が低いHDLを含む血清由来のHDL希釈画分を「試料Ｌ」と呼ぶ。なお、上記のプール血清中のHDLのコレステロール取り込み能は、米国特許出願公開第2017/0315112号明細書に記載の方法により決定した。
HDLのコレステロール取り込み能が異なることが既知の２種類のプール血清をそれぞれ、上記(1.1)と同様に処理して、HDL画分を回収した。各HDL画分をPBSで同じ倍率で希釈した。以下、取り込み能が高いHDLを含む血清由来のHDL希釈画分を「試料Ｈ」と呼び、取り込み能が低いHDLを含む血清由来のHDL希釈画分を「試料Ｌ」と呼ぶ。なお、上記のプール血清中のHDLのコレステロール取り込み能は、米国特許出願公開第2017/0315112号明細書に記載の方法により決定した。
(２) 試薬の調製
(2.1) R1試薬(タグ付加ステロールを含む試薬)
R1試薬として、各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、いずれも0.5μMであった。
(2.1) R1試薬(タグ付加ステロールを含む試薬)
R1試薬として、各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、いずれも0.5μMであった。
(2.2) R2試薬(第２の捕捉体が固定化された固相を含む試薬)
R2試薬として、抗ApoAI抗体が固定化された磁性粒子を調製した。具体的には次のようにして調製した。磁性粒子に対しWSC(株式会社同仁化学研究所)及びNHS(キシダ化学株式会社)を添加し、続いて抗ApoA1抗体を添加することで、磁性粒子表面のカルボキシ基に抗ApoA1抗体を結合させた。これにより、R2試薬として、抗ApoAI抗体が固定化された磁性粒子を含む懸濁液を得た。
R2試薬として、抗ApoAI抗体が固定化された磁性粒子を調製した。具体的には次のようにして調製した。磁性粒子に対しWSC(株式会社同仁化学研究所)及びNHS(キシダ化学株式会社)を添加し、続いて抗ApoA1抗体を添加することで、磁性粒子表面のカルボキシ基に抗ApoA1抗体を結合させた。これにより、R2試薬として、抗ApoAI抗体が固定化された磁性粒子を含む懸濁液を得た。
(2.3) R3試薬(第１の捕捉体を含む試薬)
R3試薬として、アルカリホスファターゼ(ALP)標識ストレプトアビジン溶液(Promega社)を含む緩衝液を用いた。
R3試薬として、アルカリホスファターゼ(ALP)標識ストレプトアビジン溶液(Promega社)を含む緩衝液を用いた。
(2.4) R4試薬(測定用緩衝液)及びR5試薬(基質溶液)
R4試薬及びR5試薬として、測定用緩衝液とALPの化学発光基質溶液とを含むHISCL(登録商標)発光基質セット(シスメックス株式会社)を用いた。
R4試薬及びR5試薬として、測定用緩衝液とALPの化学発光基質溶液とを含むHISCL(登録商標)発光基質セット(シスメックス株式会社)を用いた。
(2.5) 洗浄液
洗浄液として、界面活性剤のKolliphor(登録商標)P188(Sigma Aldrich社)を緩衝液に溶解して、0.1%(w/v) Kolliphor P188を含む緩衝液を調製した。
洗浄液として、界面活性剤のKolliphor(登録商標)P188(Sigma Aldrich社)を緩衝液に溶解して、0.1%(w/v) Kolliphor P188を含む緩衝液を調製した。
(３) 測定
(3.1) HDLとタグ付加ステロールとの接触
R1～R5の各試薬をHI-1000(シスメックス株式会社)にセットした。サンプルとして、キャリブレータC0～C5、試料Ｈ及び試料Ｌを用いた。R1試薬(90μL)に各サンプル(30μL)を添加して混合し、42℃にて３分間静置した。これによりHDLとビオチン付加コレステロールとを接触させ、HDLとビオチン付加コレステロールとを結合させた。
(3.1) HDLとタグ付加ステロールとの接触
R1～R5の各試薬をHI-1000(シスメックス株式会社)にセットした。サンプルとして、キャリブレータC0～C5、試料Ｈ及び試料Ｌを用いた。R1試薬(90μL)に各サンプル(30μL)を添加して混合し、42℃にて３分間静置した。これによりHDLとビオチン付加コレステロールとを接触させ、HDLとビオチン付加コレステロールとを結合させた。
(3.2) 磁性粒子上でのHDLと抗ApoA1抗体との複合体の形成
R1試薬とサンプルとの混合液(120μL)を含むキュベットにR2試薬(30μL)を添加して、42℃で２分間静置した。これにより、HDLと抗ApoA1抗体とを反応させた。その後、混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除去し、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子を集磁して上清を除去した後、ビオチン付加コレステロールを結合したHDLと抗ApoA1抗体との複合体が固定された磁性粒子にR3試薬(100μL)を添加して、42℃で３分間静置した。これにより、HDLに結合したビオチン付加コレステロールとALP標識ストレプトアビジンとを接触させた。混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除去し、洗浄液を添加して、磁性粒子を洗浄した。
R1試薬とサンプルとの混合液(120μL)を含むキュベットにR2試薬(30μL)を添加して、42℃で２分間静置した。これにより、HDLと抗ApoA1抗体とを反応させた。その後、混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除去し、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄した。磁性粒子を集磁して上清を除去した後、ビオチン付加コレステロールを結合したHDLと抗ApoA1抗体との複合体が固定された磁性粒子にR3試薬(100μL)を添加して、42℃で３分間静置した。これにより、HDLに結合したビオチン付加コレステロールとALP標識ストレプトアビジンとを接触させた。混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除去し、洗浄液を添加して、磁性粒子を洗浄した。
(3.3) HDL中のタグ付加ステロールの測定
洗浄した磁性粒子を集磁して上清を除去した。磁性粒子を含むキュベットにR4試薬(50μL)及びR5試薬(100μL)を添加し、37℃で５分間反応させた。反応後、化学発光強度(Count)を測定した。
洗浄した磁性粒子を集磁して上清を除去した。磁性粒子を含むキュベットにR4試薬(50μL)及びR5試薬(100μL)を添加し、37℃で５分間反応させた。反応後、化学発光強度(Count)を測定した。
(４) 結果
キャリブレータの測定結果を図３Ａ～図３Ｅに示す。試料Ｈ及び試料Ｌの測定結果を図４Ａ～図４Ｅに示す。図３Ａ～図３Ｅを参照して、いずれのタグ付加ステロールを用いた場合も、HDLを含まないCOの測定値に比べて、C1～C5の測定値の方が高かった。これにより、HDLに結合したタグ付加ステロール由来のシグナルを検出できたことが示された。よって、いずれのタグ付加ステロールを用いても、HDL中のタグ付加ステロールを測定できることが示された。また、キャリブレータ中のHDL濃度が高いほど、測定値が高くなることが示された。C1～C5は同一のプール血清から調製されているので、HDL濃度が高いキャリブレータでは、HDL中により多くのタグ付加ステロールが含まれると考えられる。したがって、HDL中のタグ付加ステロールの定量的な測定が可能であることが示唆された。
キャリブレータの測定結果を図３Ａ～図３Ｅに示す。試料Ｈ及び試料Ｌの測定結果を図４Ａ～図４Ｅに示す。図３Ａ～図３Ｅを参照して、いずれのタグ付加ステロールを用いた場合も、HDLを含まないCOの測定値に比べて、C1～C5の測定値の方が高かった。これにより、HDLに結合したタグ付加ステロール由来のシグナルを検出できたことが示された。よって、いずれのタグ付加ステロールを用いても、HDL中のタグ付加ステロールを測定できることが示された。また、キャリブレータ中のHDL濃度が高いほど、測定値が高くなることが示された。C1～C5は同一のプール血清から調製されているので、HDL濃度が高いキャリブレータでは、HDL中により多くのタグ付加ステロールが含まれると考えられる。したがって、HDL中のタグ付加ステロールの定量的な測定が可能であることが示唆された。
図３Ａ～図３Ｅの結果を比較すると、リンカーが長いタグ付加ステロールを用いた方が、検出されるシグナル強度が大きいことが分かった。また、図３Ａより、リンカー中のスペーサー部分がPEGではなく、炭化水素鎖であっても、HDL中のタグ付加ステロールを測定できることが示された。
図４Ａ～図４Ｅを参照して、いずれのタグ付加ステロールを用いた場合も、試料Ｌの測定値に比べて、試料Ｈの測定値の方が高かった。試料Ｌ及び試料Ｈは、ほぼ同じ濃度のHDL画分を含むと考えられるので、試料Ｌと試料Ｈとの間の測定値の差は、HDLのコレステロール取り込み能の差に相当することが示唆された。したがって、HDL中のタグ付加ステロール測定により、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られることが示唆された。
実施例３： リポタンパク質中のステロールの測定(２)
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、C2-Amide、PEG3、PEG7、PEG11及びPEG23を用いた。PEG7、PEG11及びPEG23については、実施例２とは異なる濃度で用いた。各ビオチン付加コレステロールと、実施例２で調製した試料Ｌ及び試料Ｈとを用いて、リポタンパク質の活性を反映した結果が得られるかを検討した。測定は、実施例２と同様にして行った。
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、C2-Amide、PEG3、PEG7、PEG11及びPEG23を用いた。PEG7、PEG11及びPEG23については、実施例２とは異なる濃度で用いた。各ビオチン付加コレステロールと、実施例２で調製した試料Ｌ及び試料Ｈとを用いて、リポタンパク質の活性を反映した結果が得られるかを検討した。測定は、実施例２と同様にして行った。
(１) 試薬、試料及び測定
R1試薬として、各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、C2-Amideが6.2μMであり、PEG3が0.5μMであり、PEG7が0.2μMであり、PEG11が0.1μMであり、PEG23が0.05μMであった。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。試料として、実施例２で調製した試料Ｌ及び試料Ｈを用いた。上記のR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
R1試薬として、各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、C2-Amideが6.2μMであり、PEG3が0.5μMであり、PEG7が0.2μMであり、PEG11が0.1μMであり、PEG23が0.05μMであった。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。試料として、実施例２で調製した試料Ｌ及び試料Ｈを用いた。上記のR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
(２) 結果
測定結果を図５Ａ～図５Ｅに示す。図５Ａ～図５Ｅより、C2-Amideを用いた場合も、他のビオチン付加コレステロールを用いた場合と同様に、試料Ｌの測定値よりも試料Ｈの測定値の方が高かった。よって、リンカー中のスペーサー部分が、鎖長の短い炭化水素鎖であっても、HDL中のタグ付加ステロールの測定が可能であって、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られることが示唆された。図５Ｃ～図５Ｅを参照して、R1試薬中のPEG7、PEG11及びPEG23の濃度を下げることにより、化学発光強度(count)は低下したが、結果は実施例２と同様であった。
測定結果を図５Ａ～図５Ｅに示す。図５Ａ～図５Ｅより、C2-Amideを用いた場合も、他のビオチン付加コレステロールを用いた場合と同様に、試料Ｌの測定値よりも試料Ｈの測定値の方が高かった。よって、リンカー中のスペーサー部分が、鎖長の短い炭化水素鎖であっても、HDL中のタグ付加ステロールの測定が可能であって、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られることが示唆された。図５Ｃ～図５Ｅを参照して、R1試薬中のPEG7、PEG11及びPEG23の濃度を下げることにより、化学発光強度(count)は低下したが、結果は実施例２と同様であった。
実施例４： リポタンパク質中のステロールの測定(３)
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、PEG1及びPEG2を用いた。各ビオチン付加コレステロールと、実施例２で調製したキャリブレータ、試料Ｌ及び試料Ｈとを用いて、リポタンパク質中のビオチン付加コレステロールを測定した。測定は、実施例２と同様にして行った。
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、PEG1及びPEG2を用いた。各ビオチン付加コレステロールと、実施例２で調製したキャリブレータ、試料Ｌ及び試料Ｈとを用いて、リポタンパク質中のビオチン付加コレステロールを測定した。測定は、実施例２と同様にして行った。
(１) 試薬、試料及び測定
R1試薬として、各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、いずれも0.5μMであった。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。試料として、実施例２で調製したキャリブレータC0～C5、試料Ｌ及び試料Ｈを用いた。上記のR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
R1試薬として、各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、いずれも0.5μMであった。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。試料として、実施例２で調製したキャリブレータC0～C5、試料Ｌ及び試料Ｈを用いた。上記のR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
(２) 結果
キャリブレータの測定結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す。試料Ｈ及び試料Ｌの測定結果を図７Ａ及び図７Ｂに示す。図６Ａ及び図６Ｂを参照して、PEG1及びPEG2のいずれを用いた場合も、HDLを含まないCOの測定値に比べて、C1～C5の測定値の方が高かった。また、キャリブレータ中のHDL濃度が高いほど、測定値が高くなることが示された。図７Ａ及び図７Ｂを参照して、PEG1及びPEG2のいずれを用いた場合も、試料Ｌの測定値に比べて、試料Ｈの測定値の方が高かった。したがって、リンカー中のスペーサー部分が短いPEG鎖であるタグ付加ステロールを用いても、HDL中のタグ付加ステロールの定量的測定が可能であって、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られることが示唆された。
キャリブレータの測定結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す。試料Ｈ及び試料Ｌの測定結果を図７Ａ及び図７Ｂに示す。図６Ａ及び図６Ｂを参照して、PEG1及びPEG2のいずれを用いた場合も、HDLを含まないCOの測定値に比べて、C1～C5の測定値の方が高かった。また、キャリブレータ中のHDL濃度が高いほど、測定値が高くなることが示された。図７Ａ及び図７Ｂを参照して、PEG1及びPEG2のいずれを用いた場合も、試料Ｌの測定値に比べて、試料Ｈの測定値の方が高かった。したがって、リンカー中のスペーサー部分が短いPEG鎖であるタグ付加ステロールを用いても、HDL中のタグ付加ステロールの定量的測定が可能であって、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られることが示唆された。
実施例５： リポタンパク質中のステロールの測定(４)
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、PEG7(エーテル)を用いた。PEG7(エーテル)と、実施例２で調製したキャリブレータ、試料Ｌ及び試料Ｈとを用いて、リポタンパク質中のビオチン付加コレステロールを測定した。測定は、実施例２と同様にして行った。
実施例１で調製したビオチン付加コレステロールのうち、PEG7(エーテル)を用いた。PEG7(エーテル)と、実施例２で調製したキャリブレータ、試料Ｌ及び試料Ｈとを用いて、リポタンパク質中のビオチン付加コレステロールを測定した。測定は、実施例２と同様にして行った。
(１) 試薬、試料及び測定
R1試薬として、1μM PEG7(エーテル)と、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。試料として、実施例２で調製したキャリブレータC0～C5、試料Ｌ及び試料Ｈを用いた。上記のR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
R1試薬として、1μM PEG7(エーテル)と、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。試料として、実施例２で調製したキャリブレータC0～C5、試料Ｌ及び試料Ｈを用いた。上記のR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
(２) 結果
キャリブレータの測定結果を図８Ａに示す。試料Ｈ及び試料Ｌの測定結果を図８Ｂに示す。図８Ａを参照して、HDLを含まないCOの測定値に比べて、C1～C5の測定値の方が高かった。また、キャリブレータ中のHDL濃度が高いほど、測定値が高くなることが示された。図８Ｂを参照して、試料Ｌの測定値に比べて、試料Ｈの測定値の方が高かった。上記のとおり、PEG7(エーテル)は、他のタグ付加ステロールと異なり、タグが結合しているC3位の酸素原子の立体配置が反転しているが、この点は測定に影響しないことが分かった。よって、ステロール骨格のC3位とリンカーとの連結部分がエーテル結合であるタグ付加ステロールを用いても、HDL中のタグ付加ステロールの定量的測定が可能であって、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られることが示唆された。
キャリブレータの測定結果を図８Ａに示す。試料Ｈ及び試料Ｌの測定結果を図８Ｂに示す。図８Ａを参照して、HDLを含まないCOの測定値に比べて、C1～C5の測定値の方が高かった。また、キャリブレータ中のHDL濃度が高いほど、測定値が高くなることが示された。図８Ｂを参照して、試料Ｌの測定値に比べて、試料Ｈの測定値の方が高かった。上記のとおり、PEG7(エーテル)は、他のタグ付加ステロールと異なり、タグが結合しているC3位の酸素原子の立体配置が反転しているが、この点は測定に影響しないことが分かった。よって、ステロール骨格のC3位とリンカーとの連結部分がエーテル結合であるタグ付加ステロールを用いても、HDL中のタグ付加ステロールの定量的測定が可能であって、リポタンパク質の質的活性を反映した結果が得られることが示唆された。
実施例６： ステロール測定に対するLCATの影響の検討(１)
コレステロールは、そのC3位にあるヒドロキシ基がLCATによりエステル化されて、リポタンパク質の中心部へ取り込まれる。しかし、本実施形態のタグ付加ステロールは当該ヒドロキシ基を有さない。リポタンパク質中のタグ付加ステロールの測定がLCATの影響を受けるか否かを、組み換え型LCATを用いて検討した。
コレステロールは、そのC3位にあるヒドロキシ基がLCATによりエステル化されて、リポタンパク質の中心部へ取り込まれる。しかし、本実施形態のタグ付加ステロールは当該ヒドロキシ基を有さない。リポタンパク質中のタグ付加ステロールの測定がLCATの影響を受けるか否かを、組み換え型LCATを用いて検討した。
(１) 試料の調製
健常者のプール血清に等量の22％のポリエチレングリコール4000（ナカライテスク株式会社）を混合し、室温にて20分間静置した。その後、混合液を860 xgで15分間、室温にて遠心分離した。得られた上清をHDL画分として回収した。得られたHDL画分から一部を取り、ApoAI測定用キットN-アッセイTIA ApoAI-H(ニットーボーメディカル株式会社)を用いてApoAI濃度を測定した。濃度測定の具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。HDL画分に含まれるApoA1に対し、重量比1:10となるよう組み換え型LCAT(Sino Biological社)をHDL画分に混合して、LCAT添加試料を調製した。比較のため、LCATを添加していないHDL画分を、LCAT未添加試料として測定に用いた。
健常者のプール血清に等量の22％のポリエチレングリコール4000（ナカライテスク株式会社）を混合し、室温にて20分間静置した。その後、混合液を860 xgで15分間、室温にて遠心分離した。得られた上清をHDL画分として回収した。得られたHDL画分から一部を取り、ApoAI測定用キットN-アッセイTIA ApoAI-H(ニットーボーメディカル株式会社)を用いてApoAI濃度を測定した。濃度測定の具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。HDL画分に含まれるApoA1に対し、重量比1:10となるよう組み換え型LCAT(Sino Biological社)をHDL画分に混合して、LCAT添加試料を調製した。比較のため、LCATを添加していないHDL画分を、LCAT未添加試料として測定に用いた。
(２) 試薬及び測定
R1試薬として、C2-Amide、PEG3、PEG7、PEG11及びPEG23の各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、C2-Amideが6.2μMであり、PEG3が0.5μMであり、PEG7が0.2μMであり、PEG11が0.1μMであり、PEG23が0.05μMであった。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。上記の試料及びR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。また、バックグラウンドの測定のため、PBSを各試料と同様に測定した。
R1試薬として、C2-Amide、PEG3、PEG7、PEG11及びPEG23の各ビオチン付加コレステロールと、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。各R1試薬中のビオチン付加コレステロールの濃度は、C2-Amideが6.2μMであり、PEG3が0.5μMであり、PEG7が0.2μMであり、PEG11が0.1μMであり、PEG23が0.05μMであった。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。上記の試料及びR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。また、バックグラウンドの測定のため、PBSを各試料と同様に測定した。
(３) 結果
測定結果を図９Ａ～図９Ｅに示す。図中、「Net count」は、各試料の測定値からPBSの測定値を差し引いた値を指し、「rLCAT+」は、LCAT添加試料を指し、「rLCAT-」は、LCAT未添加試料を指す。図９Ａ～図９Ｅを参照して、いずれのタグ付加ステロールを用いた場合も、rLCAT-の測定値に比べて、rLCAT+の測定値の方が高かった。これは、組み換え型LCATの添加により、HDLに結合したタグ付加ステロール由来のシグナルが増加したことを示した。組み換え型LCATの存在下では、HDLの表層付近に存在する内因性コレステロールのエステル化及びHDL内部への移動が促進され、当該HDLの表層におけるタグ付加ステロールの結合量が増加したことが考えられる。よって、HDL中のタグ付加ステロールの測定は、間接的にLCATの影響を受けることが示唆された。
測定結果を図９Ａ～図９Ｅに示す。図中、「Net count」は、各試料の測定値からPBSの測定値を差し引いた値を指し、「rLCAT+」は、LCAT添加試料を指し、「rLCAT-」は、LCAT未添加試料を指す。図９Ａ～図９Ｅを参照して、いずれのタグ付加ステロールを用いた場合も、rLCAT-の測定値に比べて、rLCAT+の測定値の方が高かった。これは、組み換え型LCATの添加により、HDLに結合したタグ付加ステロール由来のシグナルが増加したことを示した。組み換え型LCATの存在下では、HDLの表層付近に存在する内因性コレステロールのエステル化及びHDL内部への移動が促進され、当該HDLの表層におけるタグ付加ステロールの結合量が増加したことが考えられる。よって、HDL中のタグ付加ステロールの測定は、間接的にLCATの影響を受けることが示唆された。
実施例７： ステロール測定に対するLCATの影響の検討(２)
リポタンパク質中のタグ付加ステロールの測定がLCATの影響を受けるか否かを、LCAT阻害剤を用いて検討した。
リポタンパク質中のタグ付加ステロールの測定がLCATの影響を受けるか否かを、LCAT阻害剤を用いて検討した。
(１) 試料の調製
健常者のプール血清に、LCAT阻害剤としてN-エチルマレイミド(NEM)を終濃度10 mMとなるように添加し、37℃にて45分間インキュベーションした。その後、当該プール血清をPBSで1600倍に希釈して、NEM添加試料を調製した。比較のため、NEMを添加していない希釈プール血清を、NEM未添加試料として測定に用いた。
健常者のプール血清に、LCAT阻害剤としてN-エチルマレイミド(NEM)を終濃度10 mMとなるように添加し、37℃にて45分間インキュベーションした。その後、当該プール血清をPBSで1600倍に希釈して、NEM添加試料を調製した。比較のため、NEMを添加していない希釈プール血清を、NEM未添加試料として測定に用いた。
(２) 試薬及び測定
R1試薬として、0.5μM PEG3と、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。上記の試料及びR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。測定は、独立して２回行った。
R1試薬として、0.5μM PEG3と、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。上記の試料及びR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。測定は、独立して２回行った。
(３) 結果
測定結果を図１０に示す。図中、「% of control」とは、NEM未添加試料の測定値を100%としたときのNEM添加試料の測定値の割合を示す。図１０を参照して、NEM添加試料の測定値は、NEM未添加試料の測定値よりも低かった。これは、NEMの添加により、HDLと結合したタグ付加ステロール由来のシグナルが低減したことを示した。NEMによって内因性LCATの活性が阻害されたことにより、HDLによる内因性コレステロールのエステル化及びHDL内部への移動が抑制され、当該HDLにおけるタグ付加ステロールの結合量が低下したことが考えられる。実施例６の結果も考慮すると、本実施形態の方法は、LCATの活性を反映したリポタンパク質の質的活性を評価可能であることが示唆された。
測定結果を図１０に示す。図中、「% of control」とは、NEM未添加試料の測定値を100%としたときのNEM添加試料の測定値の割合を示す。図１０を参照して、NEM添加試料の測定値は、NEM未添加試料の測定値よりも低かった。これは、NEMの添加により、HDLと結合したタグ付加ステロール由来のシグナルが低減したことを示した。NEMによって内因性LCATの活性が阻害されたことにより、HDLによる内因性コレステロールのエステル化及びHDL内部への移動が抑制され、当該HDLにおけるタグ付加ステロールの結合量が低下したことが考えられる。実施例６の結果も考慮すると、本実施形態の方法は、LCATの活性を反映したリポタンパク質の質的活性を評価可能であることが示唆された。
実施例８： ステロール測定によるリポタンパク質の質的活性の評価
酸化処理により機能を低下させたリポタンパク質を含む試料を、タグ付加ステロールを用いて測定して、当該リポタンパク質の質的活性を評価できるか否かを検討した。
酸化処理により機能を低下させたリポタンパク質を含む試料を、タグ付加ステロールを用いて測定して、当該リポタンパク質の質的活性を評価できるか否かを検討した。
(１) 試料の調製
健常者血清をPBSで100倍に希釈した。希釈した血清に、ジエチレントリアミン五酢酸(終濃度100μM：東京化成工業株式会社)、過酸化水素(終濃度20、40又は60μM：富士フイルム和光純薬株式会社)、組み換え型ミエロペルオキシダーゼ(終濃度10 nM：R&D Systems社)及び亜硝酸ナトリウム(200μM：富士フイルム和光純薬株式会社)を添加して、37℃にて１時間インキュベーションした。その後、L-メチオニンを終濃度２mMとなるように添加して酸化反応を停止させた。得られた反応液をPBSで15倍に希釈して、酸化処理試料を調製した。比較のため、過酸化水素を添加しなかったこと以外は上記と同様にして調製した試料も測定した。
健常者血清をPBSで100倍に希釈した。希釈した血清に、ジエチレントリアミン五酢酸(終濃度100μM：東京化成工業株式会社)、過酸化水素(終濃度20、40又は60μM：富士フイルム和光純薬株式会社)、組み換え型ミエロペルオキシダーゼ(終濃度10 nM：R&D Systems社)及び亜硝酸ナトリウム(200μM：富士フイルム和光純薬株式会社)を添加して、37℃にて１時間インキュベーションした。その後、L-メチオニンを終濃度２mMとなるように添加して酸化反応を停止させた。得られた反応液をPBSで15倍に希釈して、酸化処理試料を調製した。比較のため、過酸化水素を添加しなかったこと以外は上記と同様にして調製した試料も測定した。
(２) 試薬及び測定
R1試薬として、0.5μM PEG3と、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。上記の試料及びR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
R1試薬として、0.5μM PEG3と、0.3%カゼインナトリウムとを含む緩衝液を調製した。R2～R5の各試薬は、実施例２と同じ試薬を用いた。上記の試料及びR1試薬を用いたこと以外は、実施例２と同様にして測定を行った。
(３) 結果
測定結果を図１１に示す。図中、「% of 0μM」とは、過酸化水素を添加しなかった試料の測定値を100%としたときの各酸化処理試料の測定値の割合を示す。図１１を参照して、酸化処理試料の測定値は、過酸化水素を添加しなかった試料の測定値よりも低かった。また、添加した過酸化水素の濃度が高いほど、測定値が低くなることが示された。酸化処理によってHDLの活性が低下したことにより、HDLによる内因性コレステロールの取り込みが抑制され、その結果、当該HDLにおけるタグ付加ステロールの結合量が低下したことが考えられる。本実施形態の方法はリポタンパク質の質的活性を評価可能であることが示唆された。
測定結果を図１１に示す。図中、「% of 0μM」とは、過酸化水素を添加しなかった試料の測定値を100%としたときの各酸化処理試料の測定値の割合を示す。図１１を参照して、酸化処理試料の測定値は、過酸化水素を添加しなかった試料の測定値よりも低かった。また、添加した過酸化水素の濃度が高いほど、測定値が低くなることが示された。酸化処理によってHDLの活性が低下したことにより、HDLによる内因性コレステロールの取り込みが抑制され、その結果、当該HDLにおけるタグ付加ステロールの結合量が低下したことが考えられる。本実施形態の方法はリポタンパク質の質的活性を評価可能であることが示唆された。
１０： リポタンパク質中のステロールの測定用試薬
１１、２１、３１、４１： リポタンパク質中のステロールの測定用試薬キット
１２： 容器
２２、３２、４２： 第１容器
２３、３３、４３： 第２容器
３４： 第３容器
４４： 第２の捕捉体を固定化したマイクロプレート
１３、２４、３５、４５： 梱包箱
１４、２５、３６、４６： 添付文書
１１、２１、３１、４１： リポタンパク質中のステロールの測定用試薬キット
１２： 容器
２２、３２、４２： 第１容器
２３、３３、４３： 第２容器
３４： 第３容器
４４： 第２の捕捉体を固定化したマイクロプレート
１３、２４、３５、４５： 梱包箱
１４、２５、３６、４６： 添付文書
Claims (21)
- 試料中のリポタンパク質と、タグ付加ステロールと、前記タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体とを接触させることにより、前記タグ付加ステロールを含む前記リポタンパク質及び前記第１の捕捉体を含む複合体を形成する工程と、
前記複合体に含まれる前記標識物質により生じるシグナルを検出する工程と
を含み、
前記タグ付加ステロールにおいて、前記タグがステロール骨格のC3位に付加されている、
リポタンパク質中のステロールを測定する方法。 - 前記タグ付加ステロールが、下記の式(I)：
R1は、置換基を有してもよい炭素数１以上６以下のアルキル基、又は、置換基を有してもよい炭素数２以上６以下のアルケニル基であり、
X及びYは、同一又は異なって、-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C=O)-NH-、-(C=O)-NH-R2-、-R2-NH-(C=O)-、-NH-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-、-(C=O)-R2-、-R2-(C=O)-O-、-(C=O)-O-R2-、-R2-O-(C=O)-、-O-(C=O)-R2-、-R2-(C=S)-NH-、-(C=S)-NH-R2-、-R2-NH-(C=S)-、-NH-(C=S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、又は-S-R2-で表され、ここで、R2は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有してもよい炭素数１以上10以下のアルキレン基、置換基を有してもよい炭素数６以上12以下のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有してもよい炭素数３以上８以下のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Lは、-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、又は-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-で表わされ、ここで、R3は、酸素原子、硫黄原子、-NH-、-NH-(C=O)-、-(C=O)-NH-又は結合手であり、
Zは、タグであり、
a及びcは、同一又は異なって、０以上６以下の整数であり、
bは、０又は１であり、
d及びeは、同一又は異なって、０以上12以下の整数であり、
fは、０以上24以下の整数である。)
で表される請求項１に記載の方法。 - 前記式(I)において、aは０又は１であり、b及びcは１であり、Xは-NH-(C=O)-R2-で表され、Yは-R2-(C=O)-NH-で表され、R2は、それぞれ独立して、置換基を有さない炭素数１以上６以下のアルキレン基であり、Lは-[(CH2)2-O]f-(CH2)d-で表わされ、dは１以上６以下の整数であり、fは０以上24以下の整数である請求項２に記載の方法。
- 前記タグが、ビオチン基である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タグ付加ステロールが、タグ付加コレステロールである請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タグ付加ステロールが、下記の式(II)：
又は下記の式(III)：
又は下記の式(IV)：
で表される請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。 - 前記第１の捕捉体が、前記タグに特異的に結合する標識抗体、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンである請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記形成する工程において、前記リポタンパク質に特異的に結合する第２の捕捉体が、前記リポタンパク質と前記タグ付加ステロールと前記第１の捕捉体との接触に用いられる請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記形成する工程において、前記タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と、前記第２の捕捉体とを接触させ、その後、前記タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と前記第２の捕捉体との複合体と、前記第１の捕捉体とを接触させる請求項８に記載の方法。
- 前記形成する工程において、前記タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と前記第２の捕捉体との接触と、前記複合体と前記第１の捕捉体との接触との間に、未反応の遊離成分を除去するB/F分離を行う請求項９に記載の方法。
- 前記第２の捕捉体が固相に固定化されており、前記タグ付加ステロールを含むリポタンパク質と前記第２の捕捉体との複合体が前記固相上に形成される請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第２の捕捉体が、前記リポタンパク質に特異的に結合する抗体である請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リポタンパク質に特異的に結合する抗体が、抗ApoAI抗体である請求項１２に記載の方法。
- 前記形成する工程と前記検出する工程の間に、未反応の遊離成分を除去するB/F分離を行う請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標識物質が酵素であり、前記シグナルが、前記酵素と基質とを接触させることにより生じる化学発光シグナルである請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酵素が、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼである請求項１５に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血清又は血漿である請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リポタンパク質が、高比重リポタンパク質である請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
- タグ付加ステロールを含む試薬であって、前記タグ付加ステロールにおいて、前記タグがステロール骨格のC3位に付加されている、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法に用いられる、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬。
- タグ付加ステロールを含む第１試薬と、前記タグに特異的に結合し且つ標識物質を有する第１の捕捉体を含む第２試薬とを備える試薬キットであって、前記タグ付加ステロールにおいて、前記タグがステロール骨格のC3位に付加されている、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬キット。
- リポタンパク質に特異的に結合する第２の捕捉体を含む第３試薬を備える請求項２０に記載の試薬キット。
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| JP2022043939A JP2023137653A (ja) | 2022-03-18 | 2022-03-18 | リポタンパク質中のステロールを測定する方法、リポタンパク質中のステロールの測定用試薬及び試薬キット |
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2022
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| Publication number | Publication date |
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