ES2226408T3

ES2226408T3 - Metodos para cuantificacion fraccionada de colesterol en lipoproteinas y reactivos de cuantificacion.

Info

Publication number: ES2226408T3
Application number: ES99933203T
Authority: ES
Inventors: Hiroyuki Sugiuchi
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co Ltd
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: CA2344055C; CN1200113C; AU4932099A; KR100607896B1; JP4428863B2; CN1544650A; KR20010075176A; WO2000017388A1; EP1114870B1; ATE278805T1; CN1318107A; EP1114870A1; EP1114870A4; CA2344055A1; US6794157B1; DE69920937D1; DE69920937T2

Abstract

Un método para determinar cuantitativamente el colesterol LDL en una muestra biológica, que comprende llevar a cabo la reacción del colesterol en presencia de: (a) una muestra biológica, (b) colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa o colesterol deshidrogenasa (referidas aquí en lo sucesivo de manera colectiva como CH-enzimas), y (c) un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno que permiten a las CH- enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL, y determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno o de coenzima reducida formados en la reacción para determinar cuantitativamente la concentración de colesterol LDL.

Description

Métodos para cuantificación fraccionada de colesterol en lipoproteínas y reactivos de cuantificación.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un método para la determinación cuantitativa de colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LDL) (referido de ahora en adelante en la presente memoria como colesterol LDL), que es importante en el campo del diagnóstico clínico, y a un reactivo para utilizarse en el método. La presente invención también se refiere a un método para la determinación fraccionada continua de colesterol en lipoproteínas de alta densidad (HDL) (referido de ahora en adelante en la presente memoria como colesterol HDL) y de colesterol LDL, que también son importantes en el campo del diagnóstico clínico, y a un kit de reactivos para utilizarse en este método. La presente invención se refiere además a un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL, colesterol LDL y colesterol total [el término se utiliza para indicar el colesterol total en HDL, LDL, lipoproteínas de muy baja densidad (referidas de ahora en adelante en la presente memoria como VLDL) y quilomicrón (referido de ahora en adelante en la presente memoria como QM)], que son importantes en el campo del diagnóstico clínico, así como a un kit de reactivos para utilizarse en este método.

Antecedentes de la invención

Generalmente, se denomina a HDL colesterol bueno porque HDL actúa eliminando el colesterol acumulado en las paredes arteriales y transportando el colesterol al hígado. Por otra parte, LDL se denomina generalmente colesterol malo debido a su acción de transportar el colesterol a los tejidos periféricos incluyendo las paredes arteriales. En el campo de las investigaciones clínicas, los niveles de colesterol HDL, colesterol LDL y colesterol total son unos índices útiles para la valoración total de enfermedades relacionadas con lípidos como arterioesclerosis, etc.

Estos niveles de colesterol se determinan de forma separada utilizando reactivos específicos exclusivamente para cada tipo de colesterol de manera que se diseña un autoanalizador para las determinaciones individuales de estos niveles de colesterol. Se ha querido mejorar más la especificidad de un reactivo para cada colesterol. Además, no se conoce un método automatizado sencillo para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL, colesterol LDL, colesterol total, etc. en el mismo sistema de detección.

Descripción de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la determinación cuantitativa de colesterol LDL y un reactivo de determinación para utilizarse en dicho método.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol LDL en la misma muestra y un kit de reactivos para utilizarse en ese método.

Más específicamente, la presente invención se refiere a (1) a (27), más abajo.

(1) Un método para determinar cuantitativamente colesterol LDL en una muestra biológica, que comprende

llevar a cabo la reacción del colesterol en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa o colesterol deshidrogenasa (referidas de ahora en adelante en la presente memoria de manera colectiva como CH-enzimas), y

c): un reactivo que permite a las CH-enzimas de b) actuar sólo sobre el colesterol LDL, y

determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno o de coenzima reducida formados en la reacción para determinar cuantitativamente la concentración de colesterol LDL.

(2) El método de acuerdo con (1), donde el reactivo que permite a las CH- enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL es un reactivo que contiene al menos un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno.

(3) El método de acuerdo con (2), donde el derivado de polioxietileno es un alquiléter de polioxietileno o un alquilariléter de polioxietileno.

(4) El método de acuerdo con (2) ó (3), donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo representado por la fórmula general (I):

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

\newpage

(donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, representan cada uno un número entero de 1 a 200).

(5) Un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol LDL en una muestra biológica, que comprende

someter el colesterol a la primera reacción en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): CH-enzimas, y

c): un reactivo que permite a las CH-enzimas de b) actuar sólo sobre el colesterol HDL, y

determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno o de coenzima reducida formados en la primera reacción para determinar cuantitativamente la concentración de colesterol HDL,

entonces añadir

d): un reactivo que permite a las CH-enzimas de b) actuar sólo sobre el colesterol LDL,

someter el colesterol a una segunda reacción, y

determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno o de coenzima reducida formados en la segunda reacción para determinar cuantitativamente la concentración de colesterol LDL.

(6) Un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol LDL en una muestra biológica, que comprende

someter el colesterol a la primera reacción en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): CH-enzimas, y

entonces añadir

d): CH-enzimas, y

e): un reactivo que permite a las CH-enzimas de d) actuar sólo sobre el colesterol LDL,

someter el colesterol a una segunda reacción, y

(7) El método de acuerdo con (5) ó (6), donde el reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL es un reactivo que contiene al menos un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno.

(8) El método de acuerdo con (7), donde el derivado de polioxietileno es un alquiléter de polioxietileno o un alquilariléter de polioxietileno.

(9) El método de acuerdo con (7) u (8), donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo, representado por la fórmula general (I):

(I)HO -(C_{2}H_{4}O) _{a} - (C_{3}H_{6}O) _{b} - (C_{2}H_{4}O) _{c}-H

(10) Un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol total en una muestra biológica, que comprende

someter el colesterol a la primera reacción en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): CH-enzimas, y

entonces añadir

d): un reactivo que permite a las CH-enzimas de b) actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas,

someter el colesterol a la segunda reacción, y

determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno o de coenzima reducida formados en la segunda reacción para determinar cuantitativamente la concentración de colesterol total.

(11) Un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol total en una muestra biológica, que comprende

someter el colesterol a la primera reacción en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): CH-enzimas, y

entonces añadir

d): CH-enzimas, y

e): un reactivo que permite a las CH-enzimas de d) actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas,

someter el colesterol a la segunda reacción, y

determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno o de coenzima reducida formados en la segunda reacción para determinar cuantitativamente el colesterol total.

(12) El método de acuerdo con una cualquiera de (5) a (11), donde el reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol en HDL es un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL.

(13) El método de acuerdo con (12), donde el reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL contiene además un tensioactivo no iónico que no disuelve las lipoproteínas agregadas.

(14) El método de acuerdo con (12) ó (13), donde el reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL es un reactivo que comprende heparina o una sal de ésta, ácido fosfotúngstico o una sal de éste, sulfato de dextrano o una sal de éste, polietilenglicol, ciclodextrina sulfatada o una sal de ésta, oligosacárido sulfatado o una sal de éste, o una mezcla de éstos y una sal de un metal divalente.

(15) El método de acuerdo con (6) ó (11), donde las CH-enzimas utilizadas en la primera reacción del colesterol son enzimas modificadas químicamente y las CH- enzimas utilizadas en la segunda reacción del colesterol son enzimas que no están modificadas químicamente.

(16) El método de acuerdo con una cualquiera de (10) a (15), donde el reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas es un reactivo que contiene un tensioactivo que solubiliza lipopro-
teínas.

(17) Un reactivo para determinar el colesterol LDL que comprende CH- enzimas y un reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre colesterol LDL.

(18) El reactivo para determinar colesterol LDL de acuerdo con (17), donde el reactivo que permite a las
CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL es un reactivo que contiene al menos un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno.

(19) El reactivo de acuerdo con (18), donde el derivado de polioxietileno es un alquilariléter de polioxietileno.

(20) El reactivo de acuerdo con (18) o (19), donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo representado por la fórmula general (I):

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

(21) Un kit de reactivos para la determinación fraccionada de colesterol HDL y colesterol LDL que comprende un primer reactivo y un segundo reactivo, comprendiendo el mencionado primer reactivo un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de la lipoproteína HDL y un reactivo que contiene CH-enzimas, y comprendiendo el mencionado segundo reactivo un reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL.

(22) El kit de reactivos de acuerdo con (21), donde el reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL es un reactivo que contiene un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno.

(23) El kit de reactivos de acuerdo con (21), donde el derivado de polioxietileno es un alquilariléter de polioxietileno.

(24) El kit de reactivos de acuerdo con (21) ó (22), donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo representado por la fórmula general (I):

\vskip1.000000\baselineskip

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

(25) Un kit de reactivos para la determinación fraccionada de colesterol HDL y de colesterol total que comprende un primer reactivo y un segundo reactivo, comprendiendo el mencionado primer reactivo un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de la lipoproteína HDL y un reactivo que contiene CH-enzimas, y comprendiendo el mencionado segundo reactivo un reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipopro-
teínas.

(26) El kit de reactivos de acuerdo con (25), donde el reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas contiene además un tensioactivo que solubiliza a las lipoproteínas.

(27) El kit de reactivos de acuerdo con una cualquiera de (21) a (26), donde el reactivo para agregar lipoproteínas distintas de la lipoproteína HDL es un reactivo que comprende heparina o una sal de ésta, ácido fosfotúngstico o una sal de éste, sulfato de dextrano o una sal de éste, polietilenglicol, ciclodextrina sulfatada o una sal de ésta, oligosacárido sulfatado o una sal de éste, o una mezcla de éstos y una sal de un metal divalente.

A partir de ahora la presente invención se describirá con mayor detalle.

Como se ha descrito más arriba, la presente invención se refiere a un método para la determinación cuantitativa de colesterol LDL que comprende añadir a una muestra biológica que contiene diferentes tipos de lipoproteínas, un reactivo específico que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL (de ahora en adelante referido como A en la presente memoria) y a un reactivo para utilizarse en dicho método.

Como se ha descrito más arriba, la presente invención también se refiere a un método para la determinación fraccionada de colesterol HDL y de colesterol LDL que comprende añadir a una muestra biológica que contiene diferentes tipos de lipoproteínas un reactivo específico que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol HDL (de ahora en adelante referido como B en la presente memoria) para determinar cuantitativamente el colesterol HDL y añadir después el reactivo A para determinar cuantitativamente el colesterol LDL así como a un kit de reactivos para utilizarse en este método.

Como se ha descrito más arriba, la presente invención se refiere además a un método para la determinación fraccionada de colesterol HDL y de colesterol total que comprende añadir a una muestra biológica que contiene diferentes tipos de lipoproteínas el reactivo B para determinar cuantitativamente el colesterol HDL y añadir después a la mezcla de reacción un reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas (de ahora en adelante referido en la presente memoria como reactivo C) para determinar cuantitativamente el colesterol total así como a un kit de reactivos para utilizarse en este método.

Una muestra biológica a la que se va a aplicar la presente invención no está limitada especialmente. Más específicamente, pueden utilizarse como muestras sangre en sí misma o fracciones sanguíneas como plasma o suero,
etc.

Las reacciones para determinar cuantitativamente el colesterol en la presente invención, se llevan a cabo generalmente en un medio acuoso, preferiblemente en una disolución tamponada.

Los tampones útiles en la disolución tamponada, incluyen tris (hidroximetil) aminometano, tampón fosfato, tampón borato y tampón Good. Ejemplo de tampón Good son ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2- inoetanosulfónico (BES), ácido 3-[N,N-bis(2-hidroxietil)amino]-2-hidroxipropanosulfónico (DIPSO), ácido N-(2-hidroxietil)piperacina-N'-2-etanosulfónico (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (de ahora en adelante referido como MES en la presente memoria), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (de ahora en adelante referido como MOPS en la presente memoria), ácido 3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO), piperacina-N-N'-bis(2-ácido etanosulfónico) (de ahora en adelante referido como PIPES en la presente memoria), piperacina-N-N'-bis(2-hidroxipropano-3-ácido sulfónico) (POPSO), etc.

El pH de la disolución tamponada es 5 a 10, preferiblemente 6 a 9. La concentración del tampón que se utiliza es 5 a 500 mM, preferiblemente 20 a 200 mM.

El reactivo A, que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL, es un reactivo que no permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en HDL, VLDL y QM. El reactivo A también permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL incluso en presencia de un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL, que se describirá más adelante.

El reactivo A es típicamente un reactivo que contiene al menos un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno.

El derivado de polioxietileno adecuado es por ejemplo un alquilariléter de polioxietileno, un alquiléter de polioxietileno, etc., que presente un resto alquilo de al menos 8 átomos de carbono, por ejemplo, octilo, nonilo, etc. y que tenga un resto arilo como fenilo, etc.

Los ejemplos específicos de derivado de polioxietileno incluyen los compuestos disponibles comercialmente Nonion HS-210, Nonion HS-215, Nonion NS-208.5 y Nonion HS-208 (todos producidos por NOF Corporation) y Emulgen L-40, Emulgen 911 y Emulgen 810 (todos producidos por Kao Corporation). El equilibrio hidrófilo-lipófilo (de ahora en adelante referido como HLB en la presente memoria) del derivado de polioxietileno es preferiblemente 9 a 20.

Los copolímeros polioxietileno-polioxipropileno pueden ser copolímeros al azar o copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno. Un ejemplo del copolímero es un compuesto representado por la fórmula general (I):

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

Los ejemplos de los compuestos representados por la fórmula general (I) incluyen compuestos disponibles comercialmente como Pluronic L-121, Pluronic L-122, Pluronic L-101, Pluronic P-103 y Pluronic F-108 (todos producidos por Asahi Denka Kogyo K.K.). El peso molecular del resto propilenglicol en los compuestos de fórmula general (I) es preferiblemente de al menos 2.050, más preferiblemente 2.750 o más, más preferiblemente 3.250 o más. El HLB de los copolímeros polioxietileno-polioxipropileno es preferiblemente 1 a 6.

La concentración respectiva utilizada de los derivados de polioxietileno y de los copolímeros polioxietileno-polioxipropileno no está limitada específicamente pero es preferiblemente 0,001 a 10%, más preferiblemente 0,01 a 5%, más preferiblemente 0,05 a 1%.

Los ejemplos del reactivo B, que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol HDL, son reactivos para agregar lipoproteínas distintas de HDL y anticuerpos frente a lipoproteínas distintas de HDL.

Los reactivos para agregar lipoproteínas distintas de HDL son generalmente aquellos que contienen agentes para agregar estas lipoproteínas y/o sales de metales divalentes. Los ejemplos del agente agregante incluyen heparina o una sal de ésta, ácido fosfotúngstico o una sal de éste, sulfato de dextrano o una sal de éste, polietilenglicol, ciclodextrina sulfatada o una sal de ésta, oligosacárido sulfatado o una sal de éste, y mezclas de éstos. Los ejemplos de ciclodextrina incluyen \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina y \gamma-ciclodextrina. Los ejemplos de oligosacárido incluyen maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa y maltoheptaosa. Los ejemplos de sales incluyen sales de sodio, potasio, litio, amonio y magnesio. Los ejemplos de sal de metal divalente incluyen sales de magnesio, calcio, manganeso y níquel.

Los ejemplos preferibles del agente agregante utilizado incluyen 0,02 a 10 mM de heparina con un peso molecular de 5.000 a 20.000 o sales de ésta, 0,1 a 10 mM de ácido fosfotúngstico con un peso molecular de 4.000 a 8.000 o sales de éste, 0,01 a 5 mM de sulfato de dextrano con un peso molecular de 10.000 a 500.000 o sus sales, 0,1 a 20 mM de sulfato de dextrano con un peso molecular de 1.000 a 10.000 o sus sales, 0,3 a 100 mM de polietilenglicol (PEG) con un peso molecular de 4.000 a 25.000, 0,1 a 50 mM de ciclodextrina sulfatada con un peso molecular de 1.000 a 3.000 o sus sales, 0,1 a 50 mM de oligosacárido sulfatado con un peso molecular de 400 a 3.000 o sus sales, y mezclas de éstos. Los ejemplos más preferidos son 0,03 a 1 mM de heparina con un peso molecular de 14.000 a 16.000 o sus sales, 0,1 a 3 mM de ácido fosfotúngstico con un peso molecular de 5.000 a 7.000 o sus sales, 0,01 a 5 mM de sulfato de dextrano con un peso molecular de 150.000 a 250.00 o sus sales, 0,1 a 10 mM de sulfato de dextrano con un peso molecular de 1.000 a 5.000 o sus sales, 1,0 a 50 mM de PEG con un peso molecular de 5.000 a 22.000, 0,1 a 10 mM de ciclodextrina sulfatada con un peso molecular de 1.000 a 2.000 o sus sales, 0,1 a 10 mM de oligosacárido sulfatado con un peso molecular de 400 a 2.000 o sus sales, y mezclas de éstos.

Los ejemplos preferidos de la sal de metal divalente incluyen las sales de magnesio, calcio, manganeso, níquel y cobalto, cuya concentración es 0,1 a 50 mM. Preferiblemente, se utiliza la sal de magnesio a una concentración de 0,1 a 50 mM.

Se prefiere que los agentes para agregar lipoproteínas distintas de HDL contengan además un tensioactivo no iónico que no disuelva las lipoproteínas agregadas.

Los ejemplos de tensioactivo no iónico que no disuelve las lipoproteínas agregadas incluyen un alquiléter de polioxietileno, un alquilariléter de polioxietileno, un copolímero polioxietileno-polioxipropileno, sales de un ácido sulfúrico de un alquiléter de polioxietileno y un alquilbenceno sulfonato. De entre estos tensioactivos, los éteres de polioxietileno [Emulgen 220 (Kao Corporation), etc.] son particularmente deseados como el alquiléter de polioxietileno; Emulgen B66 disponible comercialmente, etc. como el alquilariléter de polioxietileno; Pluronic F88 disponible comercialmente (Asahi Denka Kogyo K. K.) como el condensado polioxietileno-polioxipropileno, Emal 20C disponible comercialmente (Kao Corporation) como el sulfato sódico del alquiléter de polioxietileno, y sodio dodecilbencenosulfonato como la sal del ácido alquil bencenosulfónico.

El tensioactivo no iónico que no disuelve las lipoproteínas agregadas puede utilizarse en combinación, siempre que el tensioactivo no permita a las CH- enzimas actuar sobre el colesterol LDL. Sin embargo, es preferible utilizar el tensioactivo no iónico sólo. La concentración del tensioactivo no iónico no está limitada especialmente pero es preferiblemente 0,01 a 10%, más preferiblemente 0,1 a 5%.

Los ejemplos de anticuerpos frente a lipoproteínas distintas de HDL incluyen un anticuerpo antiapo-lipoproteína B, un anticuerpo antiapo-lipoproteína C, un anticuerpo antiapo-lipoproteína E y un anticuerpo anti-\beta-lipoproteína. Estos anticuerpos pueden utilizarse solos o en combinación. Los anticuerpos pueden ser bien monoclonales o policlonales. Además, los anticuerpos pueden estar degradados o modificados química o enzimáticamente.

Como reactivo C, que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas, existen, por ejemplo, tensioactivos que disuelven todas las lipoproteínas.

Como tensioactivos mencionados más arriba, se utilizan tensioactivos no iónicos que disuelven HDL, LDL, VLDL y QM. Los ejemplos específicos de estos tensioactivos son tensioactivos no iónicos disponibles comercialmente como Triton X-100, éteres alquilo polioxietileno como Emulgen 106, Emulgen 108, Emulgen 709, etc. Estos tensioactivos pueden utilizarse solos o en combinación. La concentración de los tensioactivos no está limitada especialmente pero es preferiblemente 0,01 a 10%, más preferiblemente 0,1 a 5%.

Como enzimas que tienen las actividades de colesterol-esterasa, colesterol-oxidasa y colesterol deshidrogenasa que pueden utilizarse en la presente invención, existen, por ejemplo, colesterol-esterasa y lipoproteína lipasa derivadas de microorganismos o de animales que tienen la capacidad de hidrolizar éster de colesterol, colesterol- oxidasa derivada de microorganismos que tiene la capacidad de oxidar colesterol para producir peróxido de hidrógeno, y colesterol deshidrogenasa derivada de microorganismos o de animales.

Estas enzimas pueden utilizarse dependiendo de su especificidad por el sustrato. En el caso de la determinación cuantitativa de colesterol HDL, se prefiere utilizar una enzima específica del colesterol y para la determinación cuantitativa de colesterol LDL, se utiliza preferiblemente una enzima específica de éste. Con el fin de mejorar la especificidad y estabilidad de estas enzimas, también pueden utilizarse enzimas que están modificadas químicamente con un grupo que tiene polietilenglicol como componente principal, un resto de oligosacárido soluble en agua, o un grupo sulfopropilo. Aún más, también pueden utilizarse enzimas obtenidas por ingeniería genética.

Los ejemplos del reactivo para modificar las enzimas (modificador químico) incluyen compuestos donde el polietilenglicol y un grupo capaz de unirse a un grupo amino están conectados, por ejemplo, Sun Bright VFM4101 (NOF Corporation) donde el polietilenglicol y un grupo capaz de unirse a un grupo amino como un grupo N- hidroxisuccinimido están conectados, Sun Bright series AKM, series ADM y series ACM [todos fabricados por NOF Corporation, Chemical Engineering Monographs (Kagaku Kogaku Ronbunshu), 20 (3), 459 (1994)] que son compuestos que tienen la estructura de polialquilenglicol y la estructura de ácido anhídrido, compuestos donde un copolímero polietilenglicol-polipropilenglicol y un grupo capaz de unirse a un grupo amino están conectados, copolímeros éter de polietilenglicol monometacrilmonometilo y anhídrido maleico, etc. Aún más, también pueden utilizarse poliuretano P4000 activado (Boehringer Mannheim, Directions for Enzyme Modification Set) que es un modificador químico de poliuretano, Dextran T40, que es un modificador químico de dextrano, y TCT activado (Boehringer Mannheim, Directions for Enzyme Modification Set), 1,3- propanosultona, etc. Mediante la utilización de estos modificadores químicos, las enzimas pueden modificarse con un grupo que tiene polietilenglicol como componente principal, un grupo que tiene polipropilenglicol como componente principal, un grupo que tiene un copolímero de propilenglicol y polietilenglicol, un grupo que contiene un sacárido en su estructura, un grupo sulfopropilo, un grupo poliuretano, etc.

En Yuji Inada, "Tanpakushitu-no-Hybrid (Hybrid of Proteins)" publicado por Kyoritsu Publishing Co. (1987), etc., se describe un método para la reacción de una enzima con el modificador químico mencionado más arriba. Típicamente, cuando se utiliza, por ejemplo, Sun Bright, la enzima se disuelve en una disolución tamponada como tampón HEPES de pH 8 o más alto, después, por ejemplo, se añade una cantidad 0,01-500 veces molar de Sun Bright a la disolución de 0ºC a 50ºC, seguido de agitación durante 5 a 60 minutos. La mezcla de reacción resultante se utiliza como está, o si es necesario, después de eliminar los compuestos de bajo peso molecular mediante un ultrafiltro.

De acuerdo con la presente invención, la colesterol-esterasa, colesterol-oxidasa y colesterol deshidrogenasa se utilizan preferiblemente en la mezcla de reacción a una concentración de 0,01 a 200 U/ml, más preferiblemente 0,1-100 U/ml.

En la presente invención, las CH-enzimas utilizadas para determinar cuantitativamente el colesterol HDL pueden utilizarse como tales para la determinación cuantitativa del colesterol LDL o del colesterol distinto de HDL o colesterol total.

Alternativamente, para la determinación cuantitativa de colesterol LDL o de colesterol distinto de HDL o colesterol total, pueden añadirse al sistema CH- enzimas que tengan la misma o diferentes especificidades.

Preferiblemente, se utilizan CH-enzimas modificadas químicamente para la determinación cuantitativa de colesterol HDL y para la determinación de colesterol en LDL, colesterol en lipoproteínas distintas de HDL, y de colesterol total, se utilizan CH-enzimas sin ninguna modificación química.

En la reacción del colesterol de acuerdo con la presente invención, puede utilizarse un tensioactivo o ácido cólico que se utiliza convencionalmente para activar las CH-enzimas siempre que no afecte la especificidad de la reacción. Aún más, también pueden utilizarse diferentes sales para solubilizar proteínas como globulina.

Como tensioactivo para activar las CH-enzimas, se utilizan tensioactivos aniónicos, por ejemplo, a una concentración de 0 a 5%. Los ejemplos de ácidos cólicos son ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido taurocólico y ácido quenodesoxicólico. El ácido cólico se utiliza a una concentración de 0 a 5%. Los ejemplos del tensioactivo aniónico incluyen un alquilsulfonato como 1-pentasulfonato, 1-hexasulfonato, 1-heptasulfonato y 1-octasulfonato. Estos tensioactivos se utilizan a una concentración de 0 a 5%.

Los ejemplos de las sales incluyen cloruro sódico, sulfato sódico, cloruro potásico, sulfato potásico, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de magnesio, cloruro de litio, sulfato de litio, cloruro de amonio, sulfato de amonio, nitrato de magnesio y nitrato de calcio. Estas sales se utilizan a una concentración de 0 a 100 mM.

Cuando la reacción del colesterol se lleva a cabo con colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa, se forma peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno formado puede determinarse cuantitativamente, utilizando, por ejemplo,
4-aminoantipirina y un fenol, 4-aminoantipirina y el reactivo de Trinder, o un cromógeno altamente sensible en presencia de peroxidasa.

Los ejemplos de fenoles son fenol, 4-clorofenol, m-cresol y ácido 3- hidroxi-2,4,6-triyodobenzoico (HTIB).

Los ejemplos de reactivos de Trinder (Catálogo General de Dojin Kagaku Kenkyusho, 19ª ed., 1994) son anilinas como N-sulfopropilanilina, N-etil-N-(2- hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina (TOOS), N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopro-
pil)- 3,5-dimetilanilina (MAOS), N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (DAOS), N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina (TOPS), N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (HDAOS), N,N-dimetil-m-toluidina, N,N-disulfopropil-3,5-dimetoxianilina, N-etil- N-sulfopropil-m-anisidina, N-etil-N-sulfopropilanilina, N-etil-N-sulfopro-
pil- 3,5-dimetoxianilina, N-sulfopropil-3,5-dimetoxianilina, N-etil-N-sulfopropil- 3,5-dimetilanilina, N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-anisidina, N-etil-N-(2-hidroxi-3- sulfopropil)anilina y N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina, N-etil-N-(3- metilfenil)-N'-succiniletilendiamina (EMSE), y N-etil-N-(3-metilfenil)-N'- acetiletilendiamina.

Como cromógeno altamente sensible, están 10-(N-metilcarbamoil)-3,7-bis (dimetilamino)fenotiadina (MCDP) descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Examinada Publicada No. 33479/85, bis[3-bis(4-clorofenil)metil-4-dimetilaminofenil]amina (BCMA) descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Examinada Publicada No. 27839/92, los compuestos descritos en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada No. 296/87, etc.

El cromógeno se utiliza preferiblemente a una concentración de 0,01 a 10 mg/ml.

Cuando la reacción del colesterol se lleva a cabo con colesterol-esterasa y colesterol deshidrogenasa en presencia de una enzima oxidada, NAD (P), como sustrato, se forma una coenzima reducida, NAD (P) H. El NAD (P) H formado puede determinarse cuantitativamente midiendo la absorbancia de una mezcla de reacción de 300 a 500 nm, preferiblemente de 330 a 400 nm, particularmente preferido aproximadamente a 340 nm. La determinación de NAD (P) H puede también realizarse formando un pigmento de formazán mediante la adición de diaforasa y de una sal de tetrazolio y midiendo después el pigmento de formazán por colorimetría.

La reacción para la determinación cuantitativa de colesterol LDL se lleva a cabo de 10 a 50ºC, preferiblemente de 30 a 40ºC, habitualmente a 37ºC, durante 1 a 30 minutos, preferiblemente durante 2 a 10 minutos.

En la determinación fraccionada, la reacción para determinar cuantitativamente el colesterol HDL (de ahora en adelante referida en la presente memoria como la primera reacción) se lleva a cabo de 10 a 50ºC, preferiblemente de 30 a 40ºC, habitualmente a 37ºC, durante 1 a 30 minutos, preferiblemente durante 2 a 10 minutos; las reacciones para determinar cuantitativamente el colesterol LDL o el colesterol total (de ahora en adelante referidas en la presente memoria como la segunda reacción) se llevan a cabo de 10 a 50ºC, preferiblemente de 30 a 40ºC, habitualmente a 37ºC, durante 1 a 30 minutos, preferiblemente durante 2 a 10 minutos. El comienzo de la segunda reacción puede realizarse en cualquier paso, por ejemplo, después de que la primera reacción haya terminado o durante la primera reacción, siempre que se complete la determinación cuantitativa de HDL. La segunda reacción se inicia por la adición del reactivo A que permite a las CH-enzimas actuar de manera específica sobre el colesterol LDL o por la adición del reactivo C que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas y, si es necesario, las CH-enzimas. El peróxido de hidrógeno o la coenzima reducida [NAD (P) H] formados en la segunda reacción se determina cuantitativamente utilizando los mismos reactivos utilizados en la primera reacción como tales, o, si es necesario y se desea, se pueden volver a añadir los reactivos al sistema.

En la presente invención en la que el colesterol HDL y el colesterol LDL se determinan de manera fraccionada llevando a cabo, en primer lugar, la reacción del colesterol HDL seguida de la reacción del colesterol LDL, la reacción del colesterol LDL se inicia por adición del reactivo A, como se ha descrito más arriba. En este caso, cuando la primera reacción del colesterol HDL se realiza añadiendo el tensioactivo no iónico que no disuelve las lipoproteínas agregadas distintas de HDL, es decir, añadiendo bien el derivado de polioxietileno o el copolímero polioxietileno-polioxipropileno, la segunda reacción del colesterol LDL puede iniciarse también añadiendo un tensioactivo para formar el reactivo A en combinación con el tensioactivo utilizado en la reacción del colesterol HDL.

La concentración de colesterol en cada lipoproteína se calcula mediante la ecuación siguiente basada en una diferencia en absorbancia (\Delta OD) antes y después de cada reacción utilizando una muestra de ensayo y en una diferencia en absorbancia (\Delta ODest) utilizando una muestra con una concentración conocida de colesterol en diferentes lipoproteínas.

La concentración de colesterol LDL puede determinarse por la ecuación siguiente:

\Delta OD \div \Delta ODest x (concentración conocida de colesterol LDL)

La concentración de colesterol HDL puede determinarse, por ejemplo, por la ecuación siguiente:

\Delta OD \div \Delta ODest x (concentración conocida de colesterol HDL)

En la determinación fraccionada, cuando los compuestos formados en la primera y segunda reacción son los mismos y son detectados por el mismo método, la concentración de colesterol total puede calcularse de acuerdo con la ecuación siguiente, utilizando la diferencia en absorbancia antes de la primera reacción y después de la segunda reacción:

\Delta OD \div \Delta ODest x (concentración conocida de colesterol total)

El reactivo de la presente invención para determinar cuantitativamente el colesterol LDL comprende CH-enzimas y un reactivo que comprende el derivado de polioxietileno y el copolímero polioxietileno-polioxipropileno. El reactivo anterior para determinar cuantitativamente el colesterol LDL puede contener además, si resulta necesario, los tampones ya mencionados, reactivos para agregar lipoproteínas distintas de HDL, tensioactivos utilizados para determinar cuantitativamente colesterol, ácidos cólicos, diferentes sales, enzimas como peroxidasa, cromógenos como
4-aminoantipirina y reactivos de Trinder o coenzimas oxidadas como NAD (P).

El kit de reactivos de la presente invención para la determinación fraccionada de colesterol HDL y colesterol LDL comprende un primer reactivo y un segundo reactivo. Por ejemplo, el primer reactivo comprende un reactivo que contiene un agente agregante para lipoproteínas distintas de HDL y CH-enzimas y el segundo reactivo comprende un reactivo que contiene el derivado de polioxietileno y el copolímero polioxietileno- polioxipropileno.

El kit de reactivos de la presente invención para la determinación fraccionada de colesterol HDL y de colesterol total comprende un primer reactivo y un segundo reactivo. Por ejemplo, el primer reactivo comprende un reactivo que contiene un agente agregante para lipoproteínas distintas de HDL y CH-enzimas y el segundo reactivo comprende un reactivo que contiene un tensioactivo no iónico que disuelve todas las lipoproteínas (HDL, LDL, VLDL y QM).

El primer y segundo reactivo del kit de reactivos de acuerdo con la presente invención puede contener además, si es necesario y se desea, los tampones ya mencionados, tensioactivos utilizados para la determinación cuantitativa de colesterol, ácidos cólicos, diferentes sales, enzimas como peroxidasa, cromógenos como 4-aminoantipirina y reactivos de Trinder, coenzimas oxidadas como NAD (P).

En el segundo reactivo, la fuente de CH-enzimas puede ser igual o diferente que en el primer reactivo. Se prefiere que la enzima modificada químicamente descrita más arriba se utilice como la CH-enzima en el primer reactivo y que una CH-enzima sin modificar químicamente se utilice como CH-enzima en el segundo reactivo.

Descripción breve de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra la correlación entre la concentración de colesterol HDL obtenida por el método de la presente invención (designado como DB HDL-C en la figura) y la concentración de colesterol HDL obtenida por el método comparativo (método L HDL-C, designado como S HDL-C en la figura).

La Fig. 2 es un gráfico que muestra la correlación entre la concentración de colesterol LDL obtenida por el método de la presente invención (designado como DB LDL-C en la figura) y la concentración de colesterol LDL obtenida por el método comparativo (método L LDL-C, designado como S LDL-C en la figura).

La Fig. 3 es un gráfico que muestra la correlación entre la concentración de colesterol total obtenida por el método de la presente invención (designado como DB-TC en la figura) y la concentración de colesterol total obtenida por el método comparativo (método Determiner L TC II, designado como L TC II en la figura).

La Fig. 4 es un gráfico que muestra la correlación entre la concentración de colesterol HDL obtenida por el método de la presente invención (designado como DB HDL-C en la figura) y la concentración de colesterol HDL obtenida por el método comparativo (método L HDL-C, designado como S HDL-C en la figura).

La Fig. 5 es un gráfico que muestra la correlación entre la concentración de colesterol LDL obtenida por el método de la invención (designado como Método de la invención en la figura) y la concentración de colesterol LDL obtenida por el método comparativo (designado como Método comparativo en la figura) que se calcula de acuerdo con la fórmula de conversión Friewald.

Mejores medios para llevar a cabo la invención Ejemplo 1 Determinación de colesterol HDL y colesterol LDL Primer reactivo (pH = 7)

MES (Nacalai Tesque, Inc.)	20 mM
Ácido dextran sulfónico (Tokyo Kasei)	0,23 mg/ml
Sulfato de magnesio (Kanto Chemical Co., Ltd)	1,5 mg/ml
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,23 mg/ml
4-aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,13 mg/ml
Colesterol-esterasa modificada con polietilenglicol (\text{*}1)	0,25 U/ml
Colesterol-oxidasa modificada con polietilenglicol (\text{*}2)	1,65 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	12,5 U/ml

(*1): Preparada disolviendo 50 g de colesterol-esterasa (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) en 1 L de tampón HEPES 0,1 M (pH 8,5) y añadiendo 330 g de Sun Bright VFM4101 a la disolución a 25ºC, seguido de agitación durante 2 horas.

(*2): Preparada disolviendo 50 g de colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) en 1 L de tampón HEPES 0,1 M (pH 8,0) y añadiendo 10 g de Sun Bright VFM4101 a la disolución a 15ºC, seguido de agitación durante 2 horas.

Segundo reactivo (pH = 7)

MES (Nacalai Tesque, Inc.)	20 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd)	3 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	2 U/ml
Pulronic L-121 (Asahi Denka Kogyo K.K.)	0,7%
Emulgen L-40 (Kao Corporation)	0,5%
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml

Se prepararon muestras de suero de 30 sujetos sanos y se determinó el colesterol HDL y el colesterol LDL en las muestras por los procedimientos siguientes.

El reactivo 1, 2,25 ml, se mezcló con 30 \mul de la muestra. Después de agitar la mezcla, se midió inmediatamente la absorbancia E1 a 585 nm. Después se incubó la mezcla a 37ºC durante 5 minutos, y se midió la absorbancia E2 a la misma longitud de onda. Se añadieron 0,75 ml del Reactivo 2 a la disolución de reacción. Después de agitar la mezcla, se midió inmediatamente la absorbancia E3 a 585 nm y después la mezcla se incubó a 37ºC durante 5 minutos y se midió la absorbancia E4 a la misma longitud de onda. Se trataron sueros que tenían una concentración conocida de colesterol por el mismo procedimiento para medir absorbancias E1est, E2est, E3est y E4est, respectivamente.

La concentración de colesterol HDL se determinó por la ecuación siguiente, utilizando los datos de absorbancia.

(E2 - E1) \div (E2est - E1 est) x (concentración de colesterol HDL conocida)

La concentración de colesterol LDL se determinó igualmente por la ecuación siguiente, utilizando los datos de absorbancia.

(E4 - E3) \div (E4est - E3est) x (concentración de colesterol LDL conocida)

Por motivos de comparación, se determinó en cada muestra de suero la concentración de colesterol HDL y de colesterol LDL utilizando Determiner L HDL- C y Determiner L LDL-C (ambos fabricados por Kyowa Medex Co., Ltd.), que son kits comerciales para la determinación independiente del colesterol, respectivamente. Se calculó el coeficiente de correlación entre los resultados obtenidos con estos kits comerciales y los resultados de acuerdo con el método de la presente invención. El coeficiente de correlación fue de 0,997 para el colesterol HDL y 0,988 para el colesterol LDL.

La Fig. 1 muestra una correlación entre la concentración (mg/dL) de colesterol HDL de acuerdo con el método de esta invención (designado como DB HDL-C en la Fig. 1) y la concentración (mg/dL) de colesterol HDL obtenida por el método comparativo (método L HDL-C, designado como S HDL-C en la Fig. 1). La Fig. 2 muestra una correlación entre la concentración (mg/dL) de colesterol LDL de acuerdo con el método de esta invención (designado como DB LDL-C en la Fig. 2) y la concentración (mg/dL) de colesterol LDL obtenida por el método comparativo (método L LDL-C, designado como S LDL-C en la Fig. 2).

Ejemplo 2 Determinación de colesterol HDL y colesterol LDL Primer reactivo (pH = 7)

MES (Nacalai Tesque, Ltd.)	20 mM
Ácido fosfotúngstico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	7,5 mg/ml
Sulfato de magnesio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	1,5 mg/ml
TOOS (Dojin Kagaku)	0,5 mg/ml
Emulgen B66 (Kao Corporation)	10 mg/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,5 mg/ml
Colesterol-esterasa (LPBP, Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)	4 U/ml
Colesterol-oxidasa (rCO, Oriental Yeast Co., Ltd.)	2 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	10 U/ml

Segundo reactivo (pH = 7)

MES (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	3 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	2 U/ml
Pluronic L-121 (Asahi Denka Kogyo K.K.)	0,7%
Emulgen L-40 (Kao Corporation)	0,5%
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml

Con el fin de determinar el colesterol HDL y el colesterol LDL, se repitió el mismo procedimiento del Ejemplo 1 utilizando las mismas muestras del Ejemplo 1 excepto en que la longitud de onda medida se cambió a 555 nm. Se calculó el coeficiente de correlación entre los resultados obtenidos con los kits comerciales de Determiner L HDL-C y Determiner L LDL-C y los resultados obtenidos de acuerdo con el método de la presente invención. El coeficiente de correlación fue 0,929 para el colesterol HDL y 0,911 para el colesterol LDL.

Ejemplo 3 Determinación de colesterol HDL y colesterol total Primer reactivo (pH = 7)

MES (Nacalai Tesque, Inc.)	20 mM
Ácido dextran sulfónico (Tokyo Kasei)	0,23 mg/ml
Sulfato de magnesio (Kanto Chemical Co., Ltd.)	1,5 mg/ml
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,23 mg/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,13 mg/ml
Colesterol-esterasa modificada con polietilenglicol (*1)	0,25 U/ml
Colesterol-oxidasa modificada con polietilenglicol (*2)	1,65 U/ml
Peroxidasa	12,5 U/ml

(*1): Preparada por el mismo procedimiento que *1 en el Ejemplo 1

(*2): Preparada por el mismo procedimiento que *2 en el Ejemplo 1

Segundo reactivo (pH = 6,75)

MES (Nacalai Tesque, Inc.)	30 mM
Triton X-100 (Sigma)	1 g/L
Colesterol-esterasa (Toyobo Co., Ltd.)	2,4 U/ml
Colesterol-oxidasa (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.)	6,25 U/ml

Se prepararon muestras de suero de 30 sujetos sanos utilizadas en el Ejemplo 1 y se determinó el colesterol HDL y el colesterol total de las muestras por los procedimientos siguientes.

El Reactivo 1, 2,25 ml, se mezcló con 30 \mul de la muestra. Después de agitar la mezcla, se midió inmediatamente la absorbancia E1 a 585 nm. Después se incubó la mezcla a 37ºC durante 5 minutos, y se midió la absorbancia E2 a la misma longitud de onda. Se añadieron 0,75 ml del Reactivo 2 a la disolución de reacción. Después de agitar la mezcla, se midió inmediatamente la absorbancia E3 a 585 nm y después la mezcla se incubó a 37ºC durante 5 minutos y se midió la absorbancia E4 a la misma longitud de onda. Se trataron separadamente sueros que tenían una concentración conocida de colesterol por el mismo procedimiento para medir absorbancias E1est, E2est, E3est y E4est, respectivamente.

(E2 - E1) \div (E2est - E1 est) x (concentración de colesterol HDL conocida)

También se determinó la concentración de colesterol total por la ecuación siguiente, utilizando los datos de absorbancia.

(E4 - E1) \div (E4est - E1est) x (concentración de colesterol total conocida)

Por motivos de comparación, se determinaron en cada muestra de suero las concentraciones de colesterol HDL y de colesterol total utilizando Determiner L HDL-C y Determiner L TC II (ambos fabricados por Kyowa Medex Co., Ltd.), que son kits comerciales para la determinación independiente del colesterol, respectivamente. Se calculó el coeficiente de correlación entre los resultados obtenidos con los kits comerciales y los resultados de acuerdo con el método de la presente invención. El coeficiente de correlación fue de 0,992 para el colesterol HDL y 0,999 para el colesterol total.

La Fig. 3 muestra una correlación entre la concentración (mg/dL) de colesterol total de acuerdo con el método de esta invención (designado como DB-TC en la Fig. 3) y la concentración (mg/dL) de colesterol total obtenida por el método comparativo (método Determiner L TC II, designado como L TC II en la Fig. 3).

La Fig. 4 muestra una correlación entre la concentración (mg/dL) de colesterol HDL de acuerdo con el método de esta invención (designado como DB HDL-C en la Fig. 4) y la concentración (mg/dL) de colesterol HDL obtenida por el método comparativo (método L HDL-C, designado como S HDL-C en la Fig. 4).

Ejemplo 4 Primer reactivo (pH 7,25)

PIPES (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,3 mg/mL

Segundo reactivo (pH 7,25)

PIPES (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	5 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	1 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	20 U/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,51 mg/mL
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml
Tensioactivo (clase y concentración mostradas en la Tabla 1)

Como muestras, se utilizaron HDL, LDL, VLDL y QM separados de suero sanguíneo humano por el método de la ultracentrifugación. Fukushi Iryo Gijutsu Shinkoukai (Welfare Medical Technology Promotion Organization) proporcionó las respectivas fracciones de lipoproteína. Estas fracciones se prepararon de acuerdo con Adv. Lipid Res., 6 (1968) [Practical methods for plasma lipoprotein analysis por Hatch, F. y Lees, R.]. La concentración de colesterol en cada lipoproteína utilizada en este ensayo se determinó utilizando Determiner L TC II (Kyowa Medex Co., Ltd.). Se vio que la concentración era 73 mg/dL para HDL, 264 mg/dL para LDL, 84 mg/dL para VLDL y 17 mg/dL para QM.

Después de mezclar 4\mul de cada muestra con 300 \mul del primer reactivo, la mezcla se mantuvo a 37ºC durante 5 minutos. En este paso, se midió la absorbancia de la mezcla. Posteriormente, se añadieron a la mezcla 100 \mul del segundo reactivo y se dejó reaccionar. Después de 5 minutos, se midió la absorbancia de la mezcla de reacción. La absorbancia se midió a una longitud de onda principal de 600 nm y a una longitud de onda secundaria de 700 nm, utilizando el autoanalizador Hitachi 7070.

Las diferencias en absorbancia obtenidas antes y después de las reacciones utilizando la fracción LDL, la fracción HDL, la fracción VLDL y la fracción QM se muestran como A_{LDL}, A_{HDL}, A_{VLDL} y A_{QM}, respectivamente.

Los resultados se muestran en la Tabla 1 en términos de A_{HDL}/ A_{LDL}, A_{VLDL}/ A_{LDL} y A_{QM}/ A_{LDL}, respectivamente. Los resultados indican que al hacerse la proporción menor, las condiciones para la determinación cuantitativa son más específicas para LDL.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Como se muestra en la Tabla 1, los resultados revelan que mediante la utilización de los tensioactivos en combinación, la reacción del colesterol es más específica para el colesterol LDL que en el caso de la utilización del tensioactivo solo.

Ejemplo 5 Primer reactivo (pH 6,75)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,3 mg/ml

Segundo reactivo (pH 6,75)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	1 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	3 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	20 U/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,51 mg/ml
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml
Tensioactivo (clase y concentración mostradas en la Tabla 2)

El ensayo se llevó a cabo de manera similar al Ejemplo 4, excepto en que se utilizaron los tensioactivos mostrados en la Tabla 2. Se determinaron así, respectivamente, A_{LDL}, A_{HDL}, A_{VLDL} y A_{QM} en base a lo que se calcularon las proporciones A_{HDL}/ A_{LDL}, A_{VLDL}/ A_{LDL} y A_{QM}/ A_{LDL}. La concentración de colesterol en cada una de las lipoproteínas utilizadas en este ensayo se determinó utilizando Determiner L TC II (Kyowa Medex Co., Ltd.) y se vio que era 81 mg/dL para HDL, 263 mg/dL para LDL, 72 mg/dL para VLDL y 14 mg/dL para QM.

Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

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3

Como se muestra en la Tabla 2, los resultados revelan que mediante la utilización de los tensioactivos en combinación, la reacción del colesterol es más específica para el colesterol LDL que en el caso de la utilización del tensioactivo solo.

Ejemplo 6 Primer reactivo (pH 6,75)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	20 mM
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,3 mg/ml

Segundo reactivo (pH 6,75)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	20 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	2 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	3 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	20 U/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,51 mg/ml
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml
Tensioactivo (clase y concentración mostradas en la Tabla 3)

El ensayo se llevó a cabo de manera similar al Ejemplo 4, excepto en que se utilizaron los tensioactivos mostrados en la Tabla 3. Se determinaron así, respectivamente, A_{LDL}, A_{HDL}, A_{VLDL} y A_{QM} en base a lo que se calcularon las proporciones A_{HDL}/ A_{LDL}, A_{VLDL}/ A_{LDL} y A_{QM}/ A_{LDL}. La concentración de colesterol en cada una de las lipoproteínas utilizadas en este ensayo se determinó utilizando Determiner L TC II (fabricado por Kyowa Medex Co., Ltd.) y se vio que era 85 mg/dL para HDL, 252 mg/dL para LDL, 75 mg/dL para VLDL y 19 mg/dL para QM.

Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

4

Como se muestra en la Tabla 3, el colesterol LDL puede determinarse de manera más específica utilizando la combinación de los tensioactivos.

Ejemplo 7 Primer reactivo (pH 7,0)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	10 mM
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,3 mg/ml

Segundo reactivo (pH 7,0)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	1 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	3 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	20 U/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,51 mg/ml
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml
Tensioactivo (clase y concentración mostradas en la Tabla 4)

El ensayo se llevó a cabo de manera similar al Ejemplo 4, excepto en que se utilizaron los tensioactivos mostrados en la Tabla 4. Se determinaron, respectivamente, A_{LDL}, A_{HDL}, A_{VLDL} y A_{QM} en base a lo que se calcularon las proporciones A_{HDL}/ A_{LDL}, A_{VLDL}/ A_{LDL} y A_{QM}/ A_{LDL}. La concentración de colesterol en cada una de las lipoproteínas utilizadas en este ensayo se determinó utilizando Determiner L TC II (Kyowa Medex Co., Ltd.) y se vio que era 79 mg/dL para HDL, 273 mg/dL para LDL, 76 mg/dL para VLDL y 16 mg/dL para QM.

Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

5

Como se muestra en la Tabla 4, el colesterol LDL puede determinarse de manera más específica utilizando la combinación de los tensioactivos.

Ejemplo 8 Primer reactivo (pH 7,0)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	10 mM
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,3 mg/ml
Cloruro de magnesio hexahidrato (Kanto Chemical Co., Ltd.)	7 mg/dL
Sulfato de dextrano sódico (Tokyo Kasei)	0,7 mg/dL

Segundo reactivo (pH 6,75)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	1 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	3 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	20 U/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,51 mg/ml
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml
Tensioactivo (clase y concentración mostradas en la Tabla 5)

El ensayo se llevó a cabo de manera similar al Ejemplo 5, excepto en que se utilizaron los tensioactivos mostrados en la Tabla 4 y en que la absorbancia se midió inmediatamente después de la adición del segundo reactivo y 5 minutos después de la adición del segundo reactivo con el fin de obtener las diferencias en la absorbancia como A_{LDL}, A_{HDL}, A_{VLDL} y A_{QM}, respectivamente. En base a las diferencias, se calcularon las proporciones de A_{HDL}/ A_{LDL}, A_{VLDL}/ A_{LDL} y A_{QM}/ A_{LDL}. La concentración de colesterol en cada una de las lipoproteínas utilizadas en este ensayo se determinó utilizando Determiner L TC II (Kyowa Medex Co., Ltd.) y se vio que era 79 mg/dL para HDL, 273 mg/dL para LDL, 76 mg/dL para VLDL y 16 mg/dL para QM.

Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

6

Como se muestra en la Tabla 5, el colesterol LDL puede determinarse de manera más específica utilizando la combinación de los tensioactivos.

Ejemplo 9 Primer reactivo (pH 7,0)

Segundo reactivo (pH 7,0)

MOPS (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	1 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	0,6 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	20 U/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,51 mg/ml
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml
Tensioactivo (clase y concentración mostradas en la Tabla 6)

El ensayo se llevó a cabo de manera similar al Ejemplo 8, excepto en que se utilizaron los tensioactivos mostrados en la Tabla 6. Se determinaron, respectivamente, A_{LDL}, A_{HDL}, A_{VLDL} y A_{QM} en base a lo que se calcularon las proporciones de A_{HDL}/ A_{LDL}, A_{VLDL}/ A_{LDL} y A_{QM}/ A_{LDL}. La concentración de colesterol en cada una de las lipoproteínas utilizadas en este ensayo se determinó utilizando Determiner L TC II (Kyowa Medex Co., Ltd.) y se vio que era 82 mg/dL para HDL, 270 mg/dL para LDL, 73 mg/dL para VLDL y 14 mg/dL para QM.

Los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

7

Como se muestra en la Tabla 6, el colesterol LDL puede determinarse de manera más específica utilizando la combinación de los tensioactivos.

Ejemplo 10 Primer reactivo (pH 7,25)

PIPES (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
HDAOS (Dojin Kagaku)	0,3 mg/ml

Segundo reactivo (pH 7,25)

PIPES (Nacalai Tesque, Inc.)	50 mM
Colesterol-esterasa (lipoproteína lipasa, Toyobo Co., Ltd.)	2 U/ml
Colesterol-oxidasa (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)	3 U/ml
Peroxidasa (Toyobo Co., Ltd.)	20 U/ml
4-Aminoantipirina (Saikyo Kasei)	0,51 mg/ml
Cloruro de calcio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,1 mg/ml
Emulgen L-40 (Kao Corporation)	0,16%
Pluronic L-121 (Asahi Denka Kogyo K.K.)	0,2%

Como muestras de suero humano, se recogieron 88 muestras de los pacientes y se procedió a la determinación cuantitativa de colesterol LDL en las muestras de acuerdo con los procedimientos siguientes.

Después de mezclar 4\mul de cada muestra con 300 \mul del primer reactivo, la mezcla se mantuvo a 37ºC durante 5 minutos. En este paso, se midió la absorbancia de la mezcla. Posteriormente, se añadieron a la mezcla 100 \mul del segundo reactivo y se dejó reaccionar. Después de 5 minutos, se midió la absorbancia de la mezcla de reacción. Separadamente, se trataron sueros con concentraciones conocidas de colesterol LDL, respectivamente, de la misma forma. Mediante la medición de la absorbancia, se determinó cuantitativamente la concentración de colesterol en cada muestra. La absorbancia se midió a una longitud de onda principal de 600 nm y a una longitud de onda secundaria de 700 nm, utilizando el autoanalizador Hitachi 7070.

Por otra parte, se midió el colesterol total, el colesterol HDL y la grasa neutra utilizando Determiner L TC (Kyowa Medex Co., Ltd.), Determiner L HDL-C (Kyowa Medex Co., Ltd.) y Determiner L TG (Kyowa Medex Co., Ltd.), respectivamente, que son todos kits disponibles comercialmente. Después se determinó la concentración de colesterol LDL de acuerdo con la fórmula de Friedewald siguiente. Se vio que un coeficiente de correlación entre la concentración de colesterol LDL obtenida por el método de la presente invención y la concentración de colesterol LDL calculada de acuerdo con la fórmula de Friedewald era 0,9767.

Fórmula de Friedewald:

(concentración de colesterol LDL) = (concentración de colesterol total) - (concentración de colesterol HDL) - (concentración de grasas neutras)/5

La Fig. 5 muestra la correlación entre la concentración de colesterol LDL obtenida por el método de la invención (designado como Método de la invención en la figura) y la concentración de colesterol LDL obtenida por el método comparativo (designado como Método comparativo en la figura).

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona el método para la determinación cuantitativa de colesterol LDL y el kit de reactivos para ser utilizado en el método. La presente invención también proporciona el método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol LDL o colesterol total en la misma muestra en el mismo sistema, así como un kit de reactivos para ser utilizado en ese método.

Claims

1. Un método para determinar cuantitativamente el colesterol LDL en una muestra biológica, que comprende

llevar a cabo la reacción del colesterol en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa o colesterol deshidrogenasa (referidas aquí en lo sucesivo de manera colectiva como CH-enzimas), y

c): un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno- polioxipropileno que permiten a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL, y

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el derivado de polioxietileno es un alquiléter de polioxietileno o un alquilariléter de polioxietileno.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo representado por la fórmula general (I):

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, representan cada uno un número entero de 1 a 200.

4. Un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol LDL en una muestra biológica, que comprende

someter el colesterol a la primera reacción en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): CH-enzimas, y

c): un reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol HDL, y

entonces añadir

d): un reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL, que es un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno- polioxipropileno,

someter el colesterol a la segunda reacción, y

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde las CH-enzimas se añaden además con el reactivo d) a la mezcla de reacción después de que la primera reacción haya terminado.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, donde el derivado de polioxietileno es un alquiléter de polioxietileno o un alquilariléter de polioxietileno.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo representado por la fórmula general (I):

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

8. Un método para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol total en una muestra biológica, que comprende

someter el colesterol a la primera reacción en presencia de:

a): una muestra biológica,

b): CH-enzimas, y

entonces añadir

d): un reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas,

someter el colesterol a una segunda reacción, y

determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno o coenzima reducida formados en la segunda reacción para determinar cuantitativamente la concentración de colesterol total,

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde las CH-enzimas se añaden además con el reactivo d) a la mezcla de reacción después de que la primera reacción haya terminado.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, donde el reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol HDL es un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde el reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL comprende además un tensioactivo no iónico que no disuelve las lipoproteínas agregadas.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, donde el reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL es un reactivo que comprende una sal de metal divalente y al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en heparina o una sal de ésta, ácido fosfotúngstico o una sal de éste, sulfato de dextrano o una sal de éste, polietilenglicol, ciclodextrina sulfatada o una sal de ésta y oligosacárido sulfatado o una sal de éste.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 5 ó 9, donde las CH-enzimas utilizadas en la primera reacción del colesterol son enzimas modificadas químicamente y las CH-enzimas utilizadas en la segunda reacción del colesterol son enzimas que no están modificadas químicamente.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde el reactivo que permite a las CH-enzimas actuar sobre el colesterol en todas las lipoproteínas es un reactivo que comprende un tensioactivo que disuelve todas las lipoproteínas.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde las CH-enzimas son colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa, y la determinación del peróxido de hidrógeno se lleva a cabo mediante reacción del peróxido de hidrógeno con un cromógeno en presencia de peroxidasa para formar un colorante y determinando la absorbancia de la mezcla de reacción.

16. Un reactivo para determinar el colesterol LDL, que comprende CH- enzimas y un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno que permiten a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL.

17. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 16, donde el derivado de polioxietileno es un alquilariléter de polioxietileno.

18. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo representado por la fórmula general (I):

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

19. El reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde las CH-enzimas son colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa, y el reactivo comprende además peroxidasa y un cromógeno capaz de producir un colorante por reacción con peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa.

20. Un kit de reactivos para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y colesterol LDL, que comprende un primer reactivo que comprende CH-enzimas y un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL que comprende una sal de metal divalente y al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en heparina o una sal de ésta, ácido fosfotúngstico o una sal de éste, sulfato de dextrano o una sal de éste, polietilenglicol, ciclodextrina sulfatada o una sal de ésta y oligosacárido sulfatado o una sal de éste y un segundo reactivo que comprende un derivado de polioxietileno y un copolímero polioxietileno-polioxipropileno que permiten a las CH-enzimas actuar sólo sobre el colesterol LDL.

21. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 20, donde el segundo reactivo comprende además CH-enzimas.

22. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 21, donde las CH-enzimas utilizadas en el primer reactivo son enzimas modificadas químicamente y las CH-enzimas utilizadas en el segundo reactivo son enzimas que no están modificadas químicamente.

23. El kit de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde el derivado de polioxietileno es un alquilariléter de polioxietileno.

24. El kit de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, donde el copolímero polioxietileno-polioxipropileno es un tensioactivo representado por la fórmula general (I):

(I)HO-(C_{2}H_{4}O) _{a}-(C_{3}H_{6}O) _{b}-(C_{2}H_{4}O) _{c}-H

25. El kit de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, donde el primer reactivo comprende además un tensioactivo no iónico que no disuelve las lipoproteínas agregadas.

26. El kit de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, donde las CH-enzimas son colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa, y el primer reactivo comprende además peroxidasa y un cromógeno capaz de producir un colorante por reacción con peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa.

27. Un kit de reactivos para la determinación fraccionada continua de colesterol HDL y de colesterol total, que comprende un primer reactivo que comprende colesterol-esterasa, colesterol-oxidasa, peroxidasa, un cromógeno capaz de producir un colorante por reacción con peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa y un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL que comprende una sal de metal divalente y al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en heparina o una sal de ésta, ácido fosfotúngstico o una sal de éste, sulfato de dextrano o una sal de éste, polietilenglicol, ciclodextrina sulfatada o una sal de ésta y oligosacárido sulfatado o una sal de éste, y un segundo reactivo que comprende un tensioactivo que disuelve todas las lipoproteínas.

28. Un kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 27, donde el segundo reactivo comprende además colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa.

29. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 28, donde la colesterol-esterasa y la colesterol-oxidasa utilizadas en el primer reactivo son colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa modificadas químicamente, y la colesterol-esterasa y la colesterol-oxidasa utilizadas en el segundo reactivo son colesterol-esterasa y colesterol-oxidasa que no están modificadas químicamente.

30. El kit de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, donde el primer reactivo comprende además un tensioactivo no iónico que no disuelve las lipoproteínas agregadas.

31. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 o el kit de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 30, donde el derivado de polioxietileno se selecciona del grupo que consiste en Nonion HS- 210, Nonion HS-215, Nonion NS-208.5, Nonion HS-208, Emulgen L-40, Emulgen 911 y Emulgen 810, y el copolímero polioxietileno-polioxipropileno se selecciona del grupo que consiste en Pluronic L-121, Pluronic L-122X, Pluronic L-101, Pluronic P-103 y Pluronic F-108.