CN115047183A - 检测试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外试剂制备领域，尤其涉及检测试剂及其制备方法和应用。本发明提供了检测试剂，包括：磁分离试剂、酶反应物、底物溶液、校准品和质控品；所述磁分离试剂包括含有标记抗MICA/B抗体的磁性微球；所述酶反应物包括含有碱性磷酸酶标记的抗MICA/B抗体；所述底物溶液包括酶促化学发光反应底物溶液；所述校准品和/或质控品包括MICA/B蛋白溶液。本发明提供的试剂盒能够有效地实现sMIC的定量测定，其灵敏度高，操作简便，检测速度快，为临床上检测MIC蛋白的水平提供了一种可行的方法。

Description

检测试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及体外试剂制备领域，尤其涉及检测试剂及其制备方法和应用。
背景技术
NKG2D是一种同源二聚体II型跨膜C类凝集素受体，其在所有的NK细胞、大部分CD8αβT细胞、NKT细胞和γδT细胞表达，以及少部分具有调节活性的CD4αβT细胞中表达，是肿瘤细胞识别中最重要的激活受体之一。NKG2D受体和配体的相互作用可以激活免疫细胞介导的杀伤作用。NKG2D配体在健康的人体组织里通常不表达或低水平表达，但在被感染细胞和癌细胞的细胞膜表面高水平表达。
在人类中，NKG2D配体包括MICA和MICB(I类MHC链相关蛋白A和B)，它们都被MHC的基因编码，基因序列有84％相同。MICA和MICB都具有高度多态性，目前已发现MICA的蛋白变异体192种，在中国，80％以上的人群的基因型为MICA*002、008、009、010、012；而MICB的蛋白变异体42种，在世界各国人群分布的同源性比MICA高，其中MICB*005是频率最高的，其次是MICB*002、MICB*014、MICB*008。
MICA和MICB可通过金属蛋白酶水解从肿瘤细胞表面脱落，形成游离的MICA和MICB蛋白，或者以外泌体的形式释放。研究发现，sMICA可通过促进NKG2D受体的内吞以及随后的降解来下调T细胞表面NKG2D受体的表达，进而严重损害了肿瘤抗原特异性效应T细胞的反应能力。sMICA抑制NKG2D途径的激活，从而保护肿瘤细胞免受NK细胞介导的细胞毒性作用。Dhar等发现肿瘤细胞释放的sMIC能使NK细胞释放促肿瘤生成的细胞因子，这些因子可降低NK细胞的毒性和多种潜在功能。与健康人相比，B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者血清中sMICA和sMICB的水平都明显增加(sMICA:859±68vs 305±39；sMICB:182±17vs 55±10，单位：pg/mL)。与sMICA>990pg/ml的病人相比，sMICA<990pg/ml的CLL患者的无治疗生存期(TFS)明显增加(P＝0.014)，同样地，sMICB的临界值是200pg/ml(P＝0.0001)。IV期和/或局部淋巴结转移的口腔鳞细胞癌OSCC患者比正常人具有更高的可溶性sMICA血清水平(95％的置信区间(CI)，0.65-2.45，P＝0.021和95％的CI，0.62-4.42，p＝0.031)。低可溶性MICA水平(50pg/mL)的OSCC患者的总生存率明显高于高可溶性MICA水平(50pg/mL)的OSCC患者(95％CI，0.43–2.75，p＝0.03)。Holdenrieder等发现正常人的sMICA显著低于良性和恶性肿瘤患者,良性又明显低于恶性肿瘤患者，而且恶性肿瘤患者sMICA高低与疾病发展阶段成正相关，而且sMICA与肿瘤转移程度密切相关，但与肿瘤大小，细胞分化程度，淋巴结浸润程度无关。因此，血清中sMICA的表达可作为肿瘤预后和诊断的一项指标。恶性肿瘤病人的sMICA的中位数为161pg/mL(n＝296)，健康人中位数<30pg/mL(n＝62)，良性肿瘤病人的sMICA的中位数为84pg/mL(n＝154)。同时，该作者还发现恶性肿瘤病人的sMICB的中位数为216pg/mL(n＝296)，健康人中位数51pg/mL(n＝62)，良性肿瘤病人的sMICB的中位数为198pg/mL(n＝154)。恶性肿瘤患者sMICB的升高与疾病发展阶段及肿瘤转移程度密切相关。
目前，检测sMIC的方法以ELISA法为主，ELISA法成本低，开发难度低，但只能做到半定量，而且自动化程度低，大多需要手工操作，目前在临床上应用已逐渐被化学发光法替代，成为免疫检测领域的研发热点。与传统的酶联免疫吸附法相比，化学发光法的灵敏度高，反应时间短，检测范围宽，分析简便快速，可用于定量检测，但目前还没有一种基于化学发光法的sMIC检测试剂盒。另外，虽然近年来越来越多针对sMIC的药物已进入临床试验阶段，但还缺乏一款快速有效的sMIC检测试剂盒指导临床用药。因此开发一款基于化学发光法的sMIC定量检测试剂盒具有明显的创新性和实用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测试剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种sMIC定量检测试剂盒，该试剂盒能够有效地实现sMIC的定量测定，其灵敏度高，操作简便，检测速度快，为临床上检测MIC蛋白的水平提供了一种可行的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测试剂，包括：磁分离试剂、酶反应物、底物溶液、校准品和质控品；
所述磁分离试剂包括含有标记抗MICA/B抗体的磁性微球；
所述酶反应物包括含有碱性磷酸酶标记的抗MICA/B抗体；
所述底物溶液包括酶促化学发光反应底物溶液；
所述校准品和/或质控品包括MICA/B蛋白溶液。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂检测的目的蛋白包括：MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*012、MICA*019、MICA*045、MICB*002、MICB*005、MICB*008或MICB*014中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述校准品的浓度为39～5000pg/mL。
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述校准品的浓度为5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.12pg/mL、39.06pg/mL。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述质控品的浓度为(50～100)pg/mL和(3000～5000)pg/mL。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述酶促化学发光反应底物溶液包括商品化的发光底物、(金刚烷)-1，2-二氧乙烷或其衍生物的缓冲溶液(AMPPD)。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂还包括样本稀释液、缓冲液或清洗液中的一种或多种。
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述样本稀释液包括：氯化钠、Tris、BSA或Proclin300中的一种或多种；所述样本稀释液的pH值为7.0～8.0，温度为2～8℃。
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述缓冲液包括：Tris、氯化钠、牛血清白蛋白和叠氮化钠中的一种或多种；所述缓冲液的pH值为7.0～8.0，温度为2～8℃。
具体的，在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述清洗液包括：Tris、氯化钠、Tween 20或Proclin 300中的一种或多种；所述清洗液的pH值为7.0～8.0，温度为2～8℃。
本发明还提供了上述检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：取磁珠磁性分离，活化后，与抗MICA/B抗体混合，获得所述磁分离试剂；
S2：取碱性磷酸酶和所述抗MICA/B抗体分别活化后，混合，纯化，获得所述酶反应物；
S3：取所述MICA/B蛋白，稀释后，获得所述质控品或所述校准品。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述磁珠与所述抗MICA/B抗体的质量比为1：(10～20)。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述活化的时间为20～60min，温度为25～30℃。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述混合的温度为2～8℃，时间为12～24h。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述磁性分离采用的溶液包括：MES水溶液；所述MES水溶液的pH值为4.5～5.5，保存温度为2～8℃。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述磁性分离的次数不少于2次。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述活化采用的溶液包括10～50mg/mL EDC溶液和10～50mg/mL NHS，温度为20～30℃，时间为30min。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述混合的时间不少于1h，采用的溶液包括含有0.1～1.0％BSA的MES溶液。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述磁性微球在磁分离保存液中保存，所述磁分离保存液包括Tris、氯化钠、BSA和叠氮化钠，所述磁分离保存液的pH为7～8，保存温度为2～8℃。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述抗MICA/B抗体的活化中采用的溶液包括：20mg/mL的2-亚氨基硫烷溶液。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述碱性磷酸酶的活化中采用的溶液包括：Sulfo-SMCC溶液，活化时间为30min。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述纯化后还包括稀释的步骤，所述稀释采用的溶液包括Tris、氯化钠、BSA和叠氮化钠，pH值为7～8。
本发明还提供了上述检测试剂和/或上述制备方法获得的检测试剂在制备sMIC检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了试剂盒，包括上述检测试剂和/或上述制备方法获得的检测试剂以及可接受的助剂或载体。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，包括：取样品与所述试剂盒混合，检测。
本发明提供了检测试剂，包括：磁分离试剂、酶反应物、底物溶液、校准品和质控品；所述磁分离试剂包括含有标记抗MICA/B抗体的磁性微球；所述酶反应物包括含有碱性磷酸酶标记的抗MICA/B抗体；所述底物溶液包括酶促化学发光反应底物溶液；所述校准品和/或质控品包括MICA/B蛋白溶液。
本发明提供了一种sMIC定量检测试剂盒，该试剂盒能够有效地实现sMIC的定量测定，其灵敏度高，操作简便，检测速度快，为临床上检测MIC蛋白的水平提供了一种可行的方法。
具体实施方式
本发明公开了检测试剂及其制备方法和应用、
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种sMIC定量检测试剂盒，其主要包括磁分离试剂、酶反应物、底物溶液、校准品、质控品，另外包括还包括稀释液、缓冲液、清洗液。所述磁分离试剂为含有标记抗MICA/B抗体的磁性微球，所述酶反应物为含有碱性磷酸酶标记的抗MICA/B抗体，所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液，所述校准品及质控品为含有重组MICA/B蛋白的溶液。
其中：
①试剂盒的浓度线性检测范围为39～5000pg/mL，检测准确度偏差不超过10％；
②校准品具有8个浓度差，浓度范围是39～5000pg/mL，浓度优选5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.12pg/mL、39.06pg/mL；
③质控品为2个浓度，取值范围是(50～100)pg/mL和(3000～5000)pg/mL；
④样本稀释液、缓冲液和清洗液可以在试剂盒内包括，也可使用时单独配制。
⑤此试剂盒可以特异性检测人体内MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*012、MICA*019、MICA*045、MICB*002、MICB*005、MICB*008、MICB*014抗原，检测准确度偏差不超过10％；
⑥所述的发光底物可以采用商品化的发光底物，也可以使用(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物的缓冲溶液(AMPPD)。
本发明提供了一种sMIC定量检测试剂盒的制备方法，包括：
①磁分离试剂的制备
a、MES溶液的制备：配制MES的纯化水溶液，将pH值调节至4.5～5.5，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
b、磁分离保存液的制备：称取Tris、氯化钠、BSA，及叠氮化钠，加纯化水充分溶解定容，将pH值调节至7.0-8.0，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
c、取磁珠，磁性分离除去上清；
d、用MES溶液洗涤磁珠，磁性分离，重复洗涤不少于2次；
e、加入10～50mg/mL EDC溶液和10～50mg/mL NHS溶液，置于摇床上，在20～30℃活化30min；
f、磁性分离除去上清，以质量比1:10～1:20加入抗MICA/B抗体，置于摇床上，在25～30℃反应1h以上；磁性分离，加入含0.1～1.0％BSA的MES溶液，置于摇床上，在20～30℃反应1h以上；
g、磁性分离去除上清，用PBS或Tris洗涤3次以上，用磁分离保存液重悬至1.0～2.0mg/mL，保存于2～8℃。
②酶反应物的制备
a、酶反应物缓冲液的制备：称取Tris、氯化钠、BSA，及叠氮化钠，加纯化水充分溶解定容，将pH值调节至7.0～8.0，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
b、MICA/B抗体活化：将抗MICA/B抗体溶于PBS溶液中，与20mg/mL的2-亚氨基硫烷溶液在25～30℃静置20min～1h，加入0.1M甘氨酸溶液，20～30℃静置5min，用凝胶柱除去2-亚氨基硫烷，收集活化后的抗MICA/B抗体，保存于2～8℃备用；
c、碱性磷酸酶活化：将碱性磷酸酶用PBS溶液溶解，加入Sulfo-SMCC溶液，在25～30℃静置30min，用凝胶柱除盐，收集活化后的碱性磷酸酶，保存于2～8℃备用；
d、将活化后的抗MICA/B抗体与碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置12～24h，用Superdex 200凝胶纯化柱纯化，获得抗MICA/B抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，再用酶反应物缓冲液稀释至0.5～2.0μg/mL，得到酶反应物。
③校准品和质控品的制备
a、样本稀释液的制备：称取氯化钠、Tris和BSA，量取Proclin 300，用纯化水混匀、定容，将pH值调至7.0～8.0之间，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
b、取纯度≥95％的重组MICA/B蛋白，用样本稀释液配制成8个具有浓度差的校准品，浓度范围是39～5000pg/mL；
c、取纯度≥95％的重组MICA/B蛋白，用样本稀释液配制成两个浓度的质控品，取值范围是(50～100)pg/mL和(3000～5000)pg/mL。
④清洗液的制备
称取适量的Tris和氯化钠，量取Tween 20和Proclin 300，加纯化水充分溶解，将pH值调节至7.0～8.0，用纯化水定容，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
⑤反应缓冲液的制备
称取适量的Tris、氯化钠和牛血清白蛋白、叠氮化钠，加纯化水充分溶解，加入阻断剂，混匀，将pH值调至7.0～8.0之间，用纯化水定容，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
将上述配制好的磁分离试剂、酶反应物、MICA/B校准品、MICA/B质控品、样本稀释液、清洗液和反应缓冲液联合发光底物独立地置于包装容器内，得到sMIC定量检测试剂盒。
本发明提供了一种sMIC定量检测试剂盒的使用方法，包括：
①将MICA/B校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到不同校准浓度下的发光值，得到发光值—浓度值拟合曲线；
②将MICA/B质控品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到不同质控品浓度的发光值，与步骤①得到的拟合曲线拟合得到质控品对应的浓度值，在所得浓度值与原浓度值在规定偏差范围内时，进行待测样本测试；
③将待测样本放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到对应发光值，结合拟合曲线得到所对应样本的浓度。
其中，上述3个步骤对应的全自动化学发光免疫分析仪测试步骤包括：
④将冷藏环境中贮存的试剂盒在25～30℃平衡至少15min；
⑤取若干支试管，加入待测产品，然后往试管加入10～20μL反应缓冲液，轻轻振荡混匀，37±0.5℃温育5min；
⑥往每支试管加入15～40μL酶反应物和10～40μL磁分离试剂，轻轻振荡混匀，37±0.5℃温育10min，进行磁分离，去上清；
⑦往每支试管中加入300μL清洗液，振荡混匀30s，进行磁分离，去上清；重复3次；
⑧每管加入200μL化学发光底物溶液，振荡混匀，检测发光强度。
本发明重组MIC蛋白的制备、抗MICA/B抗体的制备及筛选、试剂盒的制备及验证例中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1校准品、质控品用可溶性重组MIC蛋白的制备
(1)以pcDNA3为表达载体，分别将C端带His×6标签的编码MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*012、MICA*019、MICA*045、MICB*002、MICB*005、MICB*008、MICB*014胞外区的cDNA序列(序列来源于http://hla.alleles.org)连接到载体上(委托广州艾基生物技术有限公司合成)；
(2)获得含质粒的转化菌后，用LB液体培养基发酵，用QIAGEN EndoFreePlasmidKit处理菌液并提取质粒；
(3)取处于对数生长期的且存活率≥90％的293F细胞，用无血清培养基将细胞稀释至4×106细胞/mL，置锥形培养瓶中备用；
(4)以生理盐水为介质，以120μL/mL加入Polyjet(SignaGen)配制成A液，以40μg/mL加入质粒DNA配制成B液，在20～30℃静置5min，将A、B液等比例混合后静置10min，再将转染复合物以1:20加入到配制好的293F细胞悬液中，置二氧化碳振荡培养箱中以130rpm进行悬浮培养72小时；
(5)以2000rpm离心10min收集表达上清，并用0.45μm滤膜进行过滤；
(6)以PBS为缓冲体系，用镍离子亲和层析法纯化表达上清中的蛋白，用含500mM咪唑的PBS溶液洗脱得到蛋白，再通过透析除去蛋白溶液中的咪唑，浓缩，得到可溶性的重组MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*012、MICA*019、MICA*045、MICB*002、MICB*005、MICB*008、MICB*014蛋白。
实施例2 MIC定量检测试剂盒及其制备方法
①磁分离试剂的制备
(1)MES溶液的制备：称取4.875g MES，加纯化水充分溶解，将pH值调节至4.5，用纯化水定容至1L，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(2)磁分离保存液的制备：称取2.42g Tris、5.0g氯化钠、1g牛血清白蛋白，0.1g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，混匀，将pH值调至7.0，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(3)取100mg羧基磁珠，磁性分离除去上清；
(4)用20mL MES溶液洗涤磁珠，磁性分离，重复洗涤2次；
(5)加入用MES缓冲液新鲜配制的5mL的10mg/mL EDC溶液和5mL的10mg/mL NHS溶液，置于摇床上，在25～30℃活化30min；
(6)磁性分离除去上清，以质量比1:20加入抗MICA/B抗体(BAMOM AB，克隆号：BAMO1)，置于摇床上，在25～30℃反应1h。磁性分离，加入20mL含1.0％BSA的MES溶液，置于摇床上，在25～30℃反应1h；
(7)磁性分离去除上清，用20mL含0.1％Tween 20的PBS洗涤4次，并用磁分离保存液重悬至1.0mg/mL，保存于2～8℃。
②酶反应物的制备
(8)酶反应物缓冲液的制备：称取2.42g Tris、5.0g氯化钠和1g牛血清白蛋白，0.1g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，混匀，将pH值调至7.0，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(9)将1mg抗MICA/B抗体(CN 112574311 B，克隆号：9C9)溶于含2mM EDTA的0.01MPBS(pH 7.2)中，与2μL的20mg/mL的2-亚氨基硫烷溶液混匀，在25～30℃静置20min，加入10μL的0.1M甘氨酸溶液，20～30℃静置5min，用凝胶柱除去2-亚氨基硫烷，收集活化后的抗MICA/B抗体，保存于2～8℃备用；
(10)将1mg碱性磷酸酶用1mL的0.01M PBS溶解，加入40μL的5mg/mL Sulfo-SMCC溶液，在25～30℃静置30min，用凝胶柱除去Sulfo-SMCC，收集活化后的碱性磷酸酶，保存于2～8℃备用；
(11)将步骤(9)获得的活化后的抗MICA/B抗体与步骤(10)获得的碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置12h，用Superdex 200凝胶纯化柱纯化，获得抗MICA/B抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，再用步骤(8)获得的酶反应物缓冲液稀释至0.5μg/mL，得到酶反应物。
③校准品和质控品的制备
(12)样本稀释液的制备：称取5.0g氯化钠、8g Tris和30g牛血清白蛋白，加800mL纯化水充分溶解，量取0.3mL Proclin 300，混匀，将pH值调至7.0，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(13)取纯度≥95％的实施例1获得的重组MICA*002蛋白，用样本稀释液配制成5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.12pg/mL、39.06pg/mL；
(14)取纯度≥95％的实施例1获得的重组MICA*002蛋白，用样本稀释液配制成两个浓度的质控品，取值范围是50pg/mL和4000pg/mL。
④清洗液的制备
称取12.12g Tris和5g氯化钠，量取0.5g Tween 20和0.3mL Proclin 300，加纯化水充分溶解，将pH值调节至7.0，用纯化水定容，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
⑤反应缓冲液的制备
称取2.42g Tris、5.0g氯化钠和1g牛血清白蛋白，0.1g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，加入22.5mg TRU block，混匀，将pH值调至7.0，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
实施例3 MIC定量检测试剂盒及其制备方法
①磁分离试剂的制备
(1)MES溶液的制备：称取9.75gMES，加纯化水充分溶解，将pH值调节至5.0，用纯化水定容至1L，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(2)磁分离保存液的制备：称取12.12g Tris、7.5g氯化钠、5g牛血清白蛋白，0.5g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，混匀，将pH值调至7.5，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(3)取100mg羧基磁珠，磁性分离除去上清；
(4)用20mL MES溶液洗涤磁珠，磁性分离，重复洗涤3次；
(5)加入用MES缓冲液新鲜配制的5mL的25mg/mL EDC溶液和5mL的25mg/mL NHS溶液，置于摇床上，在20～30℃活化30min；
(6)磁性分离除去上清，以质量比1:15加入抗MICA/B抗体(BAMOM AB，克隆号：BAMO1)，置于摇床上，在25～30℃反应1h。磁性分离，加入20mL含0.5％BSA的MES溶液，置于摇床上，在20～30℃反应1h；
(7)磁性分离去除上清，用20mL含0.1％表面活性剂Tween 20的PBS洗涤3次，并用磁分离保存液重悬至1.5mg/mL，保存于2～8℃。
②酶反应物的制备
(8)酶反应物缓冲液的制备：称取12.12g Tris、7.5g氯化钠和10g牛血清白蛋白，0.5g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，混匀，将pH值调至7.5，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(9)将1mg抗MICA/B抗体(CN 112574311 B，克隆号：9C9)溶于含3mM EDTA的0.01MPBS(pH 7.2-8.0)中，与3μL的20mg/mL的2-亚氨基硫烷溶液混匀，在25～30℃静置40min，加入10μL的0.1M甘氨酸溶液，20～30℃静置5min，用凝胶柱除去2-亚氨基硫烷，收集活化后的抗MICA/B抗体，保存于2～8℃备用；
(10)将1.5mg碱性磷酸酶用1mL的0.01MPBS溶解，加入60μL的5mg/mL Sulfo-SMCC溶液，在25～30℃静置30min，用凝胶柱除去Sulfo-SMCC，收集活化后的碱性磷酸酶，保存于2～8℃备用；
(11)将步骤(9)活化后的抗MICA/B抗体与步骤(10)获得的碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置20h，用Superdex 200凝胶纯化柱纯化，获得抗MICA/B抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，再用步骤(8)获得的酶反应物缓冲液稀释至1.0μg/mL，得到酶反应物。
③校准品和质控品的制备
(12)样本稀释液的制备：称取7.5g氯化钠、12g Tris和40g牛血清白蛋白，加800mL纯化水充分溶解，量取1.0mL Proclin 300，混匀，将pH值调至7.5之间，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
(13)取纯度≥95％的实施例1获得的重组MICA*008蛋白，用样本稀释液配制成5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.12pg/mL、39.06pg/mL；
(14)取纯度≥95％的实施例1获得的重组MICA*008蛋白，用样本稀释液配制成两个浓度的质控品，取值范围是70pg/mL和3000pg/mL。
④清洗液的制备
称取12.12g Tris和7.5g氯化钠，量取0.75g Tween 20和1.0mL Proclin300，加纯化水充分溶解，将pH值调节至7.5，用纯化水定容，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
⑤反应缓冲液的制备
称取12.12g Tris、7.5g氯化钠和10g牛血清白蛋白，0.5g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，加入1.60g MAB33(Roche)，混匀，将pH值调至7.5之间，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
实施例4 MIC定量检测试剂盒及其制备方法
①磁分离试剂的制备
(1)MES溶液的制备：称取19.52g MES，加纯化水充分溶解，将pH值调节至5.5，用纯化水定容至1L，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(2)磁分离保存液的制备：称取24.24g Tris、10.0g氯化钠、10g牛血清白蛋白，1g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，混匀，将pH值调至8.0之间，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(3)取100mg羧基磁珠，磁性分离除去上清；
(4)用20mL MES溶液洗涤磁珠，磁性分离，重复洗涤2次；
(5)加入用MES缓冲液新鲜配制的5mL的50mg/mL EDC溶液和5mL的50mg/mL NHS溶液，置于摇床上，在20～30℃活化30min；
(6)磁性分离除去上清，以质量比1:10加入抗MICA/B抗体(BAMOM AB，克隆号：BAMO1)，置于摇床上，在25～30℃反应1h。磁性分离，加入20mL含0.1％BSA的MES溶液，置于摇床上，在20～30℃反应1h；
(7)磁性分离去除上清，用20mL含0.1％表面活性剂TritonX 100的50mM Tris洗涤4次，并用磁分离保存液重悬至2.0mg/mL，保存于2～8℃。
②酶反应物的制备
(8)酶反应物缓冲液的制备：称取24.24g Tris、10.0g氯化钠和25g牛血清白蛋白，1g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，混匀，将pH值调至8.0，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(9)将1mg抗MICA/B抗体(CN 112574311 B，克隆号：9C9)溶于含5mM EDTA的0.01MPBS(pH 7.2-8.0)中，与4.2μL的20mg/mL的2-亚氨基硫烷溶液混匀，在25～30℃静置1h，加入10μL的0.1M甘氨酸溶液，20～30℃静置5min，用凝胶柱除去2-亚氨基硫烷，收集活化后的抗MICA/B抗体，保存于2～8℃备用；
(10)将2mg碱性磷酸酶用1mL的0.01M PBS溶解，加入80μL的5mg/mL Sulfo-SMCC溶液，在25～30℃静置30min，用凝胶柱除去Sulfo-SMCC，收集活化后的碱性磷酸酶，保存于8℃备用；
(11)将步骤(9)活化后的抗MICA/B抗体与步骤(10)获得的碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置24h，用Superdex 200凝胶纯化柱纯化，获得抗MICA/B抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，再用酶反应物缓冲液稀释至2.0μg/mL，得到酶反应物。
③校准品和质控品的制备
(12)样本稀释液的制备：称取10.0g氯化钠、15g Tris和50g牛血清白蛋白，加800mL纯化水充分溶解，量取2.0mL Proclin 300，混匀，将pH值调至8.0之间，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃；
(13)取纯度≥95％的实施例1获得的重组MICB*005蛋白，用样本稀释液配制成5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.12pg/mL、39.06pg/mL；
(14)取纯度≥95％的实施例1获得的重组MICB*005蛋白，用样本稀释液配制成两个浓度的质控品，取值范围是100pg/mL和5000pg/mL。
④清洗液的制备
称取24.24g Tris和10g氯化钠，量取1g Tween20和2.0mL Proclin 300，加纯化水充分溶解，将pH值调节至8.0，用纯化水定容，混匀，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
⑤反应缓冲液的制备
称取24.24g Tris、10.0g氯化钠和25g牛血清白蛋白，1g叠氮化钠，加800mL纯化水充分溶解，加入2.40g HBR1(Scantibodies)，混匀，将pH值调至8.0之间，用纯化水定容至1L，过滤除菌，贴标签，保存于2～8℃。
验证例
(1)最低检测限实验
对实施例2～4的试剂盒分别使用20孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为试剂盒的最低检测限，不超过36pg/mL。实施例2～4的试剂盒的最低检测限指标检测结果见表1。
表1实施例2～4的试剂盒最低检测限的测定结果
Figure BDA0003683800690000151
Figure BDA0003683800690000161
(2)线性相关性实验
复孔测定实施例2～4的试剂盒的校准品(A～H)，用线性进行拟合，检测结果见表2。
表2实施例2～4的试剂盒剂量-反应曲线的线性相关性试验结果
Figure BDA0003683800690000162
从表2可以看出，实施例2～4的sMIC定量检测试剂盒测定的MIC浓度-反应曲线线性相关系数(r)均大于0.9900，符合国家标准要求。
(3)准确度试验
取纯度≥95％的实施例1获得的重组MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*012、MICA*019、MICA*045、MICB*002、MICB*005、MICB*008、MICB*014蛋白，按照实施例2～4的方法分别用样本稀释液配制成50pg/mL和3000pg/mL的校准品溶液，并用实施例2～4的sMIC定量检测试剂盒进行检测，每个浓度的校准品检测3次，计算测定结果的平均值，结果如表3所示，测定值与靶值的相对偏差的绝对值不超过10％。
表3实施例2～4的sMIC检测试剂盒准确度试验结果
Figure BDA0003683800690000171
Figure BDA0003683800690000181
(4)精密度试验
①批内精密度：使用实施例2～4的sMIC定量检测试剂盒分别对浓度为50pg/mL和3000pg/mL的校准品进行重复检验，各重复20次，检测结果见表4，可以看出，实施例2～4的sMIC定量检测试剂盒的50pg/mL和3000pg/mL校准品的批内变异系数(CV)不大于5％，符合国家标准不大于10％的要求。
表4试剂盒批内精密度的测定
Figure BDA0003683800690000182
Figure BDA0003683800690000191
②批间精密度：分别使用3个批号的实施例2～4的sMIC定量检测试剂盒检测浓度为50pg/mL和3000pg/mL的校准品进行重复检验，各重复20次，检测结果见表5～7。可以看出，实施例2～4的sMIC定量检测试剂盒测定浓度为50pg/mL和3000pg/mL的校准品的批间变异系数(CV)均不大于5％，符合国家标准不大于15％的要求。
表5实施例2试剂盒批间精密度检测结果
Figure BDA0003683800690000192
Figure BDA0003683800690000201
表6实施例3试剂盒批间精密度检测结果
Figure BDA0003683800690000202
Figure BDA0003683800690000211
表7实施例4试剂盒批间精密度检测结果
Figure BDA0003683800690000212
Figure BDA0003683800690000221
综上所述，本发明的sMIC定量检测试剂盒能检测MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*012、MICA*019、MICA*045、MICB*002、MICB*005、MICB*008、MICB*014蛋白，而且具有良好的分析性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.检测试剂，其特征在于，包括：磁分离试剂、酶反应物、底物溶液、校准品和质控品；
所述磁分离试剂包括含有标记抗MICA/B抗体的磁性微球；
所述酶反应物包括含有碱性磷酸酶标记的抗MICA/B抗体；
所述底物溶液包括酶促化学发光反应底物溶液；
所述校准品和/或质控品包括MICA/B蛋白溶液。
2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂检测的目的蛋白包括：MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*012、MICA*019、MICA*045、MICB*002、MICB*005、MICB*008或MICB*014中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取磁珠磁性分离，活化后，与抗MICA/B抗体混合，获得所述磁分离试剂；
S2：取碱性磷酸酶和所述抗MICA/B抗体分别活化后，混合，纯化，获得所述酶反应物；
S3：取所述MICA/B蛋白，稀释后，获得所述质控品或所述校准品。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S1中所述磁珠与所述抗MICA/B抗体的质量比为1：(10～20)。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，S2中所述活化的时间为20～60min，温度为25～30℃。
6.如权利要求4至5任一项所述的制备方法，其特征在于，S2中所述混合的温度为2～8℃，时间为12～24h。
7.如权利要求1或2所述的检测试剂和/或如权利要求3至6任一项所述制备方法获得的检测试剂在制备sMIC检测试剂盒中的应用。
8.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的检测试剂和/或如权利要求3至6任一项所述的制备方法获得的检测试剂以及可接受的助剂或载体。
9.如权利要求8所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：取样品与所述试剂盒混合，检测。
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