JPH02495A - モノクローナル抗体、その製法及びそれを用いた測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、ストレプトミセスＱズブチリシン・インヒビ
ターに特異的なモノクローナル抗体、その製法及びそれ
を用いた免疫ａｌｌ＋ｌｌ間関するものである。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］ストレ
プトミセスφズブチリシン・インヒビターは、材量と佐
原により見出だされたストレプトミセス　アルボグリセ
オラス （Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）の培養上清に存在するタ
ンパク質である（アグリカルチュラル・ビオロジカル・
ケミストリー　３６巻、１６０項、１９７２年）。その
作用は、微生物起源のセリン−プロテアーゼであるズブ
チリシンとモル当たり１：１で結合し、そのプロテアー
ゼ活性を強く阻害する°１ｔが知られている。またこれ
は、微生物起源であり、アルカリ性セリンプロテアーゼ
を特異的に阻害するという特徴を持つ新しいタイプのブ
ロチアーゼインヒビターである。ストレプトミセス・ズ
ブチリシン・インヒビターは、アミノ酸１１３個からな
る２つのジスルフィド結合を含む、分子Ｈ１１，５００
のタンパク質である。さらに溶液中では、同一の二つの
サブユニットから成る二量体で分子ｍは、２３，０００
で安定に存在する。

ストレプトミセス属からは、当該ズブチリシン・インヒ
ビターに構造上類似しているが、酵素に対する阻害特異
性の異なるプロテアーゼ・インヒビターが見出だされて
おり、プラスミノストレプチン、ＡＰＩ（アルカリプロ
テアーゼ・インヒビター　ＳＡＣ（ストレプトミセス・
アンチコアギュラント）アルカリプロテアーゼなどを列
挙できる。ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビ
ター及び関連の微生物起源のプロテアーゼ・インヒビタ
ーについては、ケイ、ヒロミ（Ｋ。

Ｈｉｒｏｍｉ）ら編ニブロチイン・ブロテイナーゼ・イ
ンヒビター、ザ　ケイス　オブ　ストレプトミセス・ズ
ブチリシン・インヒビター、エルセピア社（アムステル
ダム・オランダ）１９８５年に詳細に記述されている。

従来、ストレプトミセス拳ズブチリシン・インヒビター
に対し特異的なモノクローナル抗体は報告されていない
。

またストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターの
測定方法は、既知量のズブチリシンをズブチリシン・イ
ンヒビターを含有する試料に加え、残存するズブチリシ
ンのプロテアーゼ活性を測定して失われたプロテアーゼ
活性から試料中に存在するズブチリシン９インヒビター
を定量することが通常行われている。ズブチリシンの酵
素活性はカゼインやｐ−ニトロフェニルアセテート、Ｎ
−アセチルチロシンエチルエステルなどを用いて測定さ
れる。このとき用いられるズブチリシン濃度は、Ｉ　Ｘ
　１０−２〜３　Ｘ　１０−２ｍｇ／ｍ　Ｉ　　（０，
３〜１．１　ｌｚＭ）であり、したがって測定できるス
トレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターの濃度域
も同オーダーである。すなわちこの濃度以下のストレプ
トミセス・ズブチリシン幸インヒビターを測定する場合
には濃縮操作が必要である。さらには、ズブチリシンは
、ｐＨ７〜１０のアルカリ性ｐＨ域で活性を示すため、
測定に供せられる試料液のｐＨは、このアルカリ性域に
設定される必要がある。

本発明はストレプトミセス・ズブチリシン９インヒビタ
ーに特異的なモノクローナル抗体を使用することにより
上記課題を解決し、免疫学的にストレプトミセス・ズブ
チリシンやインヒビターを高感度にかつ簡便に測定する
方法を提供することを１］的とするものである。

［課題を解決するための手段および作用］本発明者らは
、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターに特
異的なモノクローナル抗体を曳数個作製し、これを用い
て免疫測定法の検討を行った。その結果本発明に関わる
モノクローナル抗体は、ストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビター測定用試薬として極めて有用であるこ
とを見出だし、本発明に到達した。

すなイっち本発明は、ストレプトミセス・ズブチリシン
・インヒビターに対して特異的に結合しつるモノクロー
ナル抗体、変性ストレプトミセス・ズブチリシン・イン
ヒビターを抗原として作製したモノクローナル抗体、変
性ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを抗
原として動物を免疫することを特徴とするモノクローナ
ル抗体の製法、およびこれらのモノクローナル抗体を用
いることを特徴とする試料中のストレプトミセス・ズブ
チリシン・インヒビターの測定方法である。

本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合法（Ｇ、ケー
ラーとＣ，ミルスタイン、ネイチャー２５６巻、４９５
頁、１９７５年）により製造できる。さらに詳細には、
本発明のモノクローナル抗体はつぎの（１）　−（４）
の工［７、すなわち、（１）抗体産生細胞調製工程 （２）融合、スクリーニング、クローニング工程（３）
ハイブリドーマ培養工程 （４）必要に応じて行われる精製工程 を実施することにより得られる。以下、各工程について
詳細に説明する。

（１）抗体産生細胞調製工程 抗ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター抗体
はストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを抗
原とし、この抗原をＢ　ａ　］　ｂ　／　ｃマウスに十
分免疫した肺臓より採取できる。免疫ｋ　／’ｌ＝、例
えば、ス！・レブトミセス・ズブチリシン・インヒビタ
ーの使用量、投与部位等の条件は従来の抗血清を得る場
合の条件が適用できる。最終免疫から２−５日後に十分
免疫したマウスのＩＩＩ　Ｉ！ａから抗体産生細胞を採
取する。

（２）融合、スクリーニング、クローニング工程融合は
融合促進剤の存在下、上記マウス抗体産生細胞ならびに
公知のマウス骨髄＋１ｆｉ細胞（ミエローマ細胞）を公
知の方法にてｉ■１　合することにより行うことができ
る。

一般にマウスミエローマ細胞は、ハイブリドーマ選択培
地で成育できず、かつ、それ自身が抗体を産生じないも
のが好ましい。このようなマウスミエローマ細胞として
は、例えば市販されているマウス・ミエローマ細胞Ｘ６
３・Ａｇ８，６５３あるいはこれと同様のものが挙げら
れる。

両細胞の比は、通常、ミエローマ細胞１に対して抗体産
生細胞１−２０の比率で行う。細胞融合促進剤としては
、例えばポリエチレングリコールが用いられ、好ましく
は分子量は１０００−７５００のものがよく用いられる
。

融合細胞、すなわちハイブリドーマの培養は、例えば、
融合促進剤を洗浄除去しハイブリドーマ選択用培地に懸
濁したハイブリドーマの１００−２００μｌずつを９６
ウエル・プレートに播き、約３７℃において５％炭酸ガ
ス−空気中で行う事ができる。

に１的とするハイブリドーマのスクリーニングは培ｉ９
液中の抗体価をＡＦ１定することにより行う。すなわち
、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを結
合させ、さらにウシ血清アルブミンにてブロッキングし
たアッセイ・プレートの各ウェルにハイブリドーマの十
分成育した培地の上清を加え十分インキュベートし、プ
レート内で抗原抗体反応させた後、上２１７を除去洗浄
する。さらに、これにペルオキシダーゼで標識した抗マ
ウス抗体を作用させ洗浄後、基質となる過酸化水素を含
む２．２−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン硫
酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）水溶液を加え呈色
させる。

スクリーニングしたハイブリドーマについて限界希釈法
にてクローニングし、目的の単一のハイブリドーマを調
製できる。

（３）ハイブリドーマ培養工程 前工程で得たクローン化ハイブリドーマを１ｎｖｉｔｒ
ｏまたはｉｎ　　ｖｉｖｏで培養すれば１」的のモノク
ローナル抗体が生産できる。

ｉｎ　　ｖｉｔｒｏでの培養は、例えば９６ウエル・プ
レート中で数個のハイブリドーマの培養から始め、徐々
にスケール・アップすることにより行うことができる。

また、ｉｎ　　ｖｉｖｏでの培養は、例えば、融合細胞
の増殖を容易にさせるためのブリスタン（２，６，１０
，１４−テトラメチルペンタデカン：アルドリッチ社製
）処理をしたマウスにハイブリドーマを腹腔内に接種す
ることにより実施でき、７−１５日後にはモノクローナ
ル抗体を含む腹水が蓄積される。

（４）精製工程 必要に応じて行われる精製工程は、前工程で得られたモ
ノクローナル抗体を通常の物理化学的手法、例えば塩析
、遠心分離、ｉ！折、イオン交換クロマトグラフィー等
の手段を組み合わせることにより行われる。

本発明においては、以上の方法により、ストレプトミセ
ス・ズブチリシン・インヒビターを認識する複数種のモ
ノクローナル抗体を得た。これらは当該ストレプトミセ
ス・ズブチリシン中インヒビターの互いに異なる部位を
認識する抗体であった。これらのモノクローナル抗体の
あるものは、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒ
ビターに結合するとき、ズブチリシンと競合した。ある
種のモノクローナル抗体は、ストレプトミセス・ズブチ
リシン・インヒビターと強く結合する（鈷合定数約１０
　　　Ｍ）が、ストレプトミセス・ズブチリシン・イン
ヒビターとズブチリシンとの複合体（結合定数約１０１
０−１ｌとは結合できず、これらのモノクローナル抗体
は、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター上
の抗原決定部位のうち、ズブチリシンと競合する部位に
結合することが示唆された。

また本発明者らは、変性ストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビターを抗原に用いてストレプトミセス−ズ
ブチリシン・インヒビターに特異的なモノクローナル抗
体を高頻度に複数個作製した。

変性ストレプトミセス・ズブチリシン−インヒビターと
は、例えば、天然のストレプトミセス・ズブチリシン・
インヒビターを ■酵素例えばペプシンなどで分解したちの■遺伝子操作
で天然ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
の＋Ｍ造を一部変化させたもの ■ペプチド合成により構造を一部変化させたちの■加熱
したもの 等があげられる。

この様な変性ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒ
ビターを抗原として使用して動物を免疫し、前述した（
１）−（４）工程と同様に行うことにより変性ストレプ
トミセス・ズブチリシン・インヒビターに対するモノク
ローナル抗体を得ることができる。このとき、前述の工
程（２）のスクリーニングにおいて、変性ストレプトミ
セス・ズブチリシンφインヒビターばかりでなく、天然
ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターにも交
差反応を示すものを選択すれば、天然ストレプトミセス
・ズブチリシン・インヒビター認識モノクローナル抗体
が得られる。

以上のようにして得られたストレプトミセス・ズブチリ
シン・インヒビターに対して特異的に結合し得るモノク
ローナル抗体を用いて、公知の免疫測定法、例えば競合
法、サンドイツチ法などが可能となった。

例えばサンドイツチ法による免疫測定法では、抗体を固
相に固定化する場合は、その方法は公知の方法を採用で
き、固相としては例えば、ポリスチレン、ポリエチレン
、ポリ塩化ビニル、ラテックス、アガロース、セルロー
ス、メタアクリレ−１・、ガラスなどを用いたマイクロ
タイタープレートや粒子が好ましく用いられる。また、
標識で結合された抗体における標識化の方法、その検出
方法は同等限定されるものではなく、公知の方法により
標識化及び測定することができる。標識剤としては、酵
素を用いる方法では、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、またはアルカリ・ホスファターゼなどの
酵素が、放射性物質を用いる方法では、１２５Ｉ、３Ｈ
等が、蛍光物質を用いる方法では、フルオレスカミン、
フルオレ、ソセイン・イソチオシアネートなどが通常使
用されるが、そのほかのものであっても良い。標識剤が
酵素である場合には、その活性をＡｉ１定するために基
質が用いられる。例えば、パーオキシダーゼの基質とし
ては、２，２゛−アジノジー［３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸］−２アンモニウム塩（以下ＡＢＴＳと
する）−Ｈ２Ｏ２，５−アミノサリチル酸−Ｈ２Ｏ２，
０−フェニレンジアミン−Ｈ２Ｏ２等が、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼの基質としては、Ｏ−ニトロフェニルβ−
Ｄ−ガラクトピラノシド等が、アルカリ・ホスファター
ゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニル−ホスフェ−１
・などが用いられる。７１Ｉ１１定のためには、これら
の試薬以外にも溶解剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の
試薬が使用される。

通常サンドイツチ法による免疫測定法は、測定させるべ
き物質（抗原）を認識する第１のモノクローナル抗体と
第１のモノクローナル抗体とは異なる抗原決定部位を認
識する第２のモノクローナル抗体を用い、第１のモノク
ローナル抗体が同相に固定化されており、第２のモノク
ローナル抗体が標識化されていることを特徴とする。し
かしながら、ストレプトミセスΦズブチリシン・インヒ
ビターは均等な２個のサブユニットからなる安定なタン
パク質であるため、サンドイツチ法による免疫測定法に
おいて、同をロ化モノクローナル抗体と標識化モノクロ
ーナル抗体とが、ストレプトミセス・ズブチリシン・イ
ンヒビター上の異なる抗原決定部位を認識することは格
別要求されない。

認識する抗原決定部位の異なる２種類のモノクローナル
抗体を用いるときには、サンドイツチ法における２　Ｍ
ｉ類の抗原抗体反応を同時に進行させることができ、不
要な物質の洗浄除去操作は、１回のみでよい１段階サン
ドイツチ法をおこなうことができる。しかし、認識する
抗原決定部位が共通なモノクローナル抗体を固相化抗体
と標識化抗体の両方に用いるときには以下に述べる２段
階サンドイツチ法を行うほうが好ましい。すなわち、最
初に固）１１化モノクロ一ナル抗体とストレブ！・ミセ
ス・ズブチリシン・インヒビターとの抗原抗体反応１を
行わせた後、不要な物質を洗浄除去しする。

ついで標識化モノクローナル抗体を加え、抗原抗体反応
１により固定化されたストレプトミセス・ズブチリシン
・インヒビターとの抗原抗体反応２を行わせ、不要な物
質をｉｆｇ度洗浄除去し、標識を検出する。

［発明の効果］ 本発明により、ストレプトミセス・ズブチリシン・イン
ヒビターに対して特異的に結合し得るモノクローナル抗
体かえられた。これらのうちあるものは、ストレプトミ
セスφズブチリシン・インヒビター上の抗原決定部位に
結合することが示唆された。

また、変性ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビ
ターを抗原として動物を免疫し、モノクローナル抗体を
調製し、その中から天然ストレプトミセス・ズブチリシ
ン・インヒビターにも交差反応するものを選択すれば、
天然ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター認
識モノクローナル抗体を得ることができる。ストレプト
ミセス・ズブチリシン・インヒビターは、構造のゆらぎ
が少ないため、モノクローナル抗体が得られにくいが、
この方法により、ストレプトミセス・ズブチリシン・イ
ンヒビターの抗原免疫性が高まり、天然ストレプトミセ
ス・ズブチリシン・インヒビターを用いたときと比較し
て、数多くのモノクローナル抗体が得られるようになっ
た。

さらに本発明のモノクローナル抗体を用い、本発明の方
法で試料中のストレプトミセス・ズブチリシン・インヒ
ビターは特に１〜３２０ｎｇ／ｍｌという低濃度の範囲
でも高感度にＤ定可能であった。また本方法は、ストレ
プトミセス・ズブチリシン・インヒビタτに特異的な測
定方法であり、ズブチリシンの活性阻害を用いる従来法
に比べて、題めて簡便であり、短詩１ｆｊＪで多数の検
体の測定が可能となった。

［実施例］ 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。た
だし、本発明はこれに限定されるものではない。

（実施例１） （１）抗ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビタ
ー・モノクローナル抗体の調製 抗ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター・モ
ノクローナル抗体の調製は、Ｇ、ケーラーとＣ，ミルス
タインの方法に苧じて以下に示すような方法で行った。

イ）免疫 ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを１　
、　０〜２　、　０　ｍｇ　／　ｍｌでリン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）に溶解し、等量のフロイントのコンプリー
ドアシュパンＩ−（ＦＣＡ）と混合乳化し、６週齢のＢ
　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀）の腹腔にストレプト
ミセスΦズブチリシン・インヒビターで１００μｇを含
む混合物を投与した。４週間後にストレプトミセス・ズ
ブチリシン・インヒビター１００μｇをフロイントのイ
ンコンプリートアジュバントと混合して腹腔に追加免疫
した。最終免疫は、細胞懸合の３日前に予め血中抗体価
が陽性になることを確認したマウス（血清を５００倍以
上に希釈してもストレプトミセス・ズブチリシン・イン
ヒビターを固ト１１とする酵素免疫測定で陽性）につい
てストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター１０
０μｇを含むＰＢＳを尾静脈に投与した。

口）細胞の調製 最終免疫の３０後にマウスの１１１！臓を摘出し、細胞
を１５％５％ラン血清を含むＤＭＥＭ（以下、１５ＦＣ
３−ＤＭＥＭとする）で肺臓から貫流しナイロンメツシ
ュで濾過したのちＤＭＥＭで３回洗浄し、約２Ｘ１０　
’　ｃｅ　Ｉ　Ｉ　ｓ／ｍｌでＤＭＥＭに懸濁した。融
合パートナ−であるマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）
としては、Ｓ　Ｐ　２１０を用いた。これをチめ、８−
アザグアニン３０μｇ／ｍ１を添加した１５ＦＣ３−Ｄ
ＭＥＭで細胞融合の約１週間前まで培ｊｔシ、その後１
５ＦＣ３−Ｄ　Ｍ　Ｅ〜１て培養したλ・Ｉ数増殖明の
ものをＤＭＥＭで３回洗浄し、約５ｘ　１０８ｃ　ｅ　
Ｉ　ｌ　ｓ／ｍｌでＤＭＥＭに懸濁した。

ハ）細胞融合及び抗体産生ハイブリドーマの選択＋１’
ｌ！細胞３Ｘ１０８とミエローマを約５：１の割合で混
合し、遠心（８００ｒｐｍ、５分）して沈澱させた。こ
れにポリエチレングリコール（分子２４０００）　４５
９６、ジメチルスルホキシド５％を含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ
　１　ｍｌを加えて混合し、３７℃で１分保った後、遠
心（１０００ｒｐｍ、５分）し上清を除き、約２０ｍ１
のＤＭＥＭをゆっくり加え撹拌した。１５ＦＣ５−ＤＭ
ＥＭで３回洗浄した後、ヒボキサンチン０．１ｍＭ、ア
ミノプテリン０．４μＭ１チミジン１６μＭを含む１５
ＦＣ８−ＤＭＥＭ　（ＨＡＴ培Ｊｌｊｌ　）にＩＪ！！
！臓細胞で２　Ｘ　１０６ｃ　ｅ　１１　ｓ　／　ｍｌ
に懸濁し１００μｌずつ９６ウエルカルチヤープレート
にまき、５％ＣＯっ、３７℃のインキュベーターで培ｉ
ｔ　Ｌだ。

ｆｆ　＋１　ＨＡ　Ｔ培地を１００μｌずつ添加し、そ
の後バイブドーマのコロニーが出現するまで約１０日間
２〜３日ごとに１（ＡＴ培地を交換した。続いてＨＡＴ
培地、１５ＦＣ３−ＤＭＥＭで培養を続けた。ハイブリ
ドーマのコロニーが各ウェルに出現した時点で、抗スト
レプトミセス・ズブチリシン・インヒビター抗体の検出
を行い、陽性であったウェルの細胞について限界希釈法
によりクローニングをおこなった。こうして抗ストレプ
トミセス・ズブチリシン・インヒビター・モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマを得た。

二）モノクローナル抗体の生産 クローニングされたモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマは、１５ＦＣ３−ＤＭＥＭで増殖させた後、−ｒめ
２週間前に０．５ｍｌのブリスタンを１１１７腔に投与
したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に、１匹あたり５Ｘ１０
６ｃｅ　ｌ　Ｉｓで移植した。１０１後にたまった腹水
を回収し、これよりモノクローナル抗体を精製した。

ホ）モノクローナル抗体の精製 腹水を１１００００Ｘ、２０分遠心して沈澱物及び浮遊
物を取り除いたのち４５％飽和濃度になるまで飽ｔｏ硫
安溶液を加え、４℃で１夜静置した。

遠心して沈澱を集めＰＢＳに溶解し、さらに硫安沈澱を
２回繰り返した後、沈澱を２０ｍＭ　　Ｔｒｉ　Ｓ　−
ＨＣｌｍ１７Ｍ　（４０ｍＭＮ　ａ　ＣＩ含Ｈ）ｐＨ８
，０に溶解し、同緩衝液に対して４℃にて透析した。遠
心して析出物を除き上清を陰イオン交換クロマトグラフ
ィーで精製した。陰イオン交換クロマトグラフィーはＴ
　Ｓ　Ｋ　−Ｇ　Ｅ　Ｌ　　Ｄ　Ｅ　ＡＥ−５ＰＷ（東
ソーｐ′Ａ：式会社製、商品名）を用いる高速液体クロ
マトグラフィーで行い、２０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ
５１４衝ｉｆｌ、ｐＨ８，０においてＮａＣ１４０ｍＭ
から５００ｍＭまで直線的に濃度勾配をかけることによ
り、モノクローナル抗体を溶出させた。こうして精製さ
れたモノクローナル抗体は、電気泳動、ゲルクロマトグ
ラフィーでモノクローナル抗体であることを確認した。

またストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを
固相とする酵素免疫測定、及びイムノブロブディング法
でストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターに対
するモノクローナル抗体であることを確認した。

（２）不溶化抗体の調製 未処理９６ウエルーマイクロタイタープレート（タンク
・イムノプレー１・、インターメッド社製）に各ウェル
に０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ９，６）に溶
解した１　ｕ　ｇ　／　ｍｌのマウスの抗ストレプトミ
セス拳ズブチリシン・インヒビター・モノクローナル抗
体（名称Ａとする）の溶液２５０μｌを加えて、４℃で
一夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液を除去
し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有
０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０゜以下ＰＢＳとす
る）に０．０４％ツイーン（Ｔｗｅ　ｅ　ｎ）−２０を
含有させた溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ溶液と略す）で３回洗
浄した後、１％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）を含有
するＰＢＳ−Ｔ溶液３００μ」を加えて、４℃でブロッ
キング処理し、そのまま４℃にて保存した。

（３）西洋ワサビ・バーオキンダーゼ（以下ＨＲＰと略
す）標識抗体の調製 ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に溶解
したＨＲＰ溶液（５ｍｇ　／　ｍｌ　）に１％１−フル
オロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶ｉｆ＆
０．１ｍｌを加え、室温にて１時間反応させた。

次に、０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０ｍｌを加
えて、３０分間反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリ
ウムを０．１６Ｍエチレングリコール１、Ｏｍｌを加え
て除去した後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，５）で透析した。

次にマウスの抗ストレプトミセス・ズブチリシン・イン
ヒビター・モノクローナル抗体（名称Ｂとする。（１）
で用いたモノクローナル抗体とは異る部位を認識するも
の。）５ｍｇを加え、５．５時間反応させた。水素化ホ
ウ素ナトリウム５　ｍｇを加え、４℃で一夜放置した。

上記のようにして得られた生成物はＴＳＫ−ゲルＧ−３
０００ＳＷ　（東ソー株式会社製、商品名）を用いる高
速液体クロマトグラフィーにて精製し、ＨＲＰ標識抗体
を得た。

（４）酵素免疫測定による試料中のストレプトミセス・
ズブチリシン・インヒビターの定量本実施例中の（２）
で述べた方法で作製したモノクローナル抗体を固定化し
たマイクロタイタープレートを室温にもどし、ＰＢＳ−
Ｔ溶液で３回洗浄した後、精製したストレプトミセス・
ズブチリシン・インヒビター１．０〜３２０口ｇ　／　
ｍｌを含何する正常人血清を４阜物質として各ウェルに
２０μｌずつ加えた。次いで、（３）で作製したＨＲＰ
標識抗体４　、　２　ｍｇ　／　ｍｌを１．５％正常ウ
サギ血清、０．００７５９６ミオグロビン、０．００７
５９１；精製白糖、０．０６％卵白アルブミンを含むＰ
ＢＳ−Ｔ？８液（以下、抗原抗体反応用ＰＢＳ−Ｔ溶液
と記す）で１０００倍に希釈し、各ウェルに３００μｌ
ずつ添加し、室温で３時間インキュベートした後、溶液
を除去してから、ＰＢＳ−Ｔ溶１ｆＭで３回洗浄した。

さらに、１．２％ＡＢＴＳ及び０−　０１９ｏ　Ｈ２０
２を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）か
らなる基質溶液を各ウェルに２００μｍ添加し、室温で
３０分間反応させたあと、１Ｍクエン酸溶液を１００μ
ｌ加えて反応を停止した。各ウェルについて、波長４１
５ｎｍ、！ＩＪ象波長４’）２ｏｍの吸収強度を自動マ
イクロタイタープレート・リーダー（東ソー株式会社製
、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定し、４弗物質の濃度及
び吸収強度をプロットして表１のごとき結果をｊ！Ｉで
、検量線を作成した。

表１ （実施例２） 丈１ｉ！ｉ例１の（１）、　　（２）と同様にして抗ス
トレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター・モノク
ローナル抗体（Ａ）を用いて不溶化抗体を作製した。

実施例１の（３）において用いられたモノクローナル抗
体（Ｂ）のかわりに、（２）で用いたモノクローナル抗
体（Ａ）を用いて、実施例１（２）と同様にＨＲＰ　標
識抗体を調製した。前述のように調製したモノクローナ
ル抗体（Ａ）を固定化したマイクロタイタープレートを
室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、精
製したストレプトミセス・ズブチリシン中インヒビター
１．０〜３２０ｎｇ／ｍｌをＤＨする正常人血清を標準
物質として、各ウェルに２０μｍずつ加えた。次いで、
抗原抗体反応用ＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに
加え、室温で３時間インキュベートしたのち、溶液を除
去後、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。次いで、各ウェ
ルにＨＲＰ標識モノクローナル抗体（Ａ　）　４　、　
２　ｍｇ　／　ｍｌを抗原抗体反応用ＰＢＳ−Ｔ溶液で
１０００倍に希釈した溶液を３００μｌずつ添加し、室
温で３時間インキュベートしたのち、溶液を除去してか
ら、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。実施例１の（４）
における場合とまったく同様に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２を
基質として、反応液の吸収強度を波長４１５ｎｍ（対象
波長４９２　ｎ　ｍ）にて測定し、表２の如き結果を得
て、検量線を作製した。

表２ （実施例３） ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビターを３２
μｇ／ｍｌ　（２，８μＭ）となるように、２０　ｍ　
Ｍピロリン酸緩衝液（ｐＨ８，５）に溶解させた（以下
溶液１とする）。実施例１（１）で作製したマウスの抗
ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター・モノ
クローナル抗体（ＩｇＧ１タイプ；名称Ｃとする。モノ
クローナル抗体Ａ、Ｂとは異なる部位を認識するもの）
を［溶ｉｔＹ　Ｉ　Ｊの中へ（ａ）０、（ｂ）０．０６
、（ｃ）０．１２、（ｄ）０．１８、（ｅ）０．２４、
（ｆ’）０．３０、（ｇ）０．３６、（ｈ）０．４２、
（ｉ）０．４ｇ、及び（ｊ）０．６０ｍｇ／ｍｌの各濃
度となるように加え、２５℃にて１０分間インキュベー
トした（各溶液を溶液１ａ〜１ｊとする）。

ズブチリシンＢＰＮ−（長瀬産業■製）を４６μｇ　／
　ｍｌとなるように、２０ｍＭビロリン酸緩衝液（ｐＨ
８，５）に溶解させた（以下溶液２とする）。

ｐ−二トロフェニル・アセテート（半井化学■製）を２
．８ｍＭになるように、１０％イソプロピル・アルコー
ルを含有する水に溶解させた（以下溶液３とする）。

先に調製した「溶液１ａ〜１ｊＪの各の０．５ｍｌと溶
ｉＬＭ　３の０．５ｍｌを分光器用のガラス・セルの中
で混へし、続いて、「溶液２」を１．０ｍｌ加え、すば
やく混合し、波長４０５ｎｍでの吸光度の増加を、２５
℃にて、磁気分光光度計（ユニオン技研製５Ｍ−４０１
）を用いて、経時的に測定し１分間あたりの４０５　ｎ
　ｍでの吸光度の変化量から反応を刀速度Ｖをもとめた
。このときの反応溶液をそれぞれ４１〜４ｊとする。ま
た「溶液１ａ−１ｊＪのかイ）りに、２０ｍＭピロリン
酸緩衝液を用いることにより、本条件下でのズブチリシ
ンの固有の反応初速度Ｖ　　をさらに、「溶液１ａ−１
ｊＪ及び溶液［ｎｔ ２のかわりに、同緩衝液を用いることにより、非酵素的
な加水分解反応初速度Ｖ　　　を求めた。

ｓｐａ口【 結果を表３に示す。

表３ ズブチリシンＢＰＮ−ストレプトミセス・ズブチリシン
・インヒビター　ｐ−二トロフェニル・アセテートの初
期濃度が各 ［ズブチリシンｒ３ＰＮ’ｌ　ｏ　−２、３Ｘ　１０　
　ｍｇ／　ｍｌ［ストレプトミセスφズブチリシン・イ
ンヒビター］　ロー８．０Ｍｇ　／　ｍｌ ［ｐ−ニトロフェニル・アセテート］　ｏ　−０、７ｆ
ｆ１Ｍの条件下で即ち、反応溶−液４ａの条件下でスト
レプトミセス・ズブチリシン・インヒビターはズブチリ
シンＢＰＮ−を完全に阻害した。これに対して４ｂ、　
４ｃ・・・とモノクローナル抗体（Ｃ）の濃度の増加と
ともに阻害度は低下し、反応液４ｊの条件下、即ち、モ
ノクローナル抗体（Ｃ）濃度１２．ＯＸ１０　″１１１
ｇ　／　ｍｌのとき、阻害は認められなかった。

以上の結果は、当該モノクローナル抗体は、ストレプト
ミセス・ズブチリシン・インヒビターにおけるズブチリ
シンＢＰＮ−に対する阻害反応部位にχ、Ｊ　して反応
する抗体であることを強く示している。

（実施例４） （抗原と抗体産生細胞の調製） 抗原であるストレプトミセス−ズブチリシン・インヒビ
ターをリン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣｌ含
有０，０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢＳと
省略する）で０　、　５１１１ｇ　／　ｍｌの濃度に調
製し、それに最終濃度で１００ｍＭになるように２−メ
ルカプトエタノールを添加した。

その後３７℃で６０分間温水中にて反応させ変性ストレ
プトミセス・ズブチリシン・インヒビターとした。この
抗原を５０Ｍｇ／匹になるようにフロイント・コンプリ
ート・アジュバント（ギブコ社製）と１：１になるよう
に懸濁し、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（♀）９匹の腹
腔内に投与した。

さらに初回免疫から数えて１か月後に５０μｆ／匹にな
るようフロイント・インコンプリート・アジュバント（
ギブコ社製）と１：１になるように懸濁し、追加免疫し
た。２週間後に最終免疫として５０Ｍｇ／匹になるよう
に変性ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
をＰＢＳで調製しマウス腹腔内に注射した。最終免疫か
ら３日後、これらのマウスの肺臓から抗体産生細胞を採
取した。

（融合、スクリーニング、クローニング）これらのマウ
ス肺臓細胞を２．５×１０８個とマウス・ミエローマ（
ＳＰ２１０−Ａｇ１４．ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）細胞
を２．５×１０７個をケーラーとミルシュタインの方法
（ネイチャ２５６巻、４９５．１９７５年）にて融合し
た。融合後、２．０ＸＩＯ’牌臓細胞膵臓ｌになるよう
にＩＸ］、０−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０−’アミ
ノプテリン、１．６Ｘ１０−’チミジンを含むＤＭＥＭ
（ダルベツコ・モディファイド・イーグルズ・メディウ
ム）に懸濁し、９６ウエル・プレートに２．０ＸＩＯ’
細胞／ウエルとなるように播いた。ハイブリドーマが十
分成育してきｔ二ところで、ＥＬＩＳＡ　（エンザイム
・リンクド・イムノソルベント・アッセイ）によるスク
リーニングを行った。スクリーニングには変性ストレプ
トミセス・ズブチリシン・インヒビターを２０ｎｇ／ウ
ェルとなるように結合した９６つエル・マイクロタイタ
ー・プレート（ヌンクインターメッド社製イムノプレー
ト２）を用い、２次抗体にペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＭ抗体（タゴト１製）を用いて抗変性ストレプト
ミセス・ズブチリシン・インヒビター抗体を拾った。こ
のとき、９６ウエル・プレート２２枚から抗変性ストレ
プトミセス・ズブチリシン・インヒビター抗体陽性ハイ
ブイドーマ５株が得られた。これらのハイブリドーマを
３回の限界希釈法にてクローニングしセル・ラインとし
た。これら５つの抗体は、天然ストレプトミセス・ズブ
チリシン・インヒビターと交差反応することが同様の方
法で認められ、それぞれ抗体イ５５ロ、ハ二、ホとした
。これらの結果をを表４〜表８に示す。

（モノクローナル抗体の製造および精製）前項でｉすた
それぞれのハイブリドーマ５，０Ｘ１００個を、予めブ
リスタン処理した７週令のオスのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスの腹腔内に各々１００μｌ／匹になるよう投与
した。１０日口から１４１１１１にかけてＬｉ的とする
モノクローナル抗体を含むマウス腹水を各２０ｍ１／匹
前後得た。採取したそれぞれの腹水は、４０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心分離を行い上澄を得、採取した上澄を
５０％硫安アンモニウム沈殿分画法にしたがって粗精製
した後、ＴＳＫ−ＧＥＬ　　ＤＥＡＥ−５ｒ’Ｗ（東ソ
ー（株）社製、商品名）を用いたイオン交換クロマトグ
ラフィー　ＴＳＫ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷ　（東ソー（
株）社製、商品名）を用いたゲル濾過をおこない精製し
た。

精製したモノクローナル抗体の純度はメルカプトエタノ
ール還元下での１２％５ＤＳ−ポリアクノルアミド電気
泳動を行い各々について確認した。

このとき、検出されたバンドは、１本の軽鎖と１本の重
鎮の２本のバンドのみであった。

これらのモノクローナル抗体のストレプトミセス・ズブ
チリシン・インヒビターに対する特異性は、イムノプロ
ティング法にて確認した。

表４　抗体イ 表５ 抗体口 表７ 抗体ニ 表６ 抗体ハ 表８ 抗体ホ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター
   に対して特異的に結合しうるモノクローナル抗体。
2. （２）変性ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビ
   ターを抗原として作製した請求項（１）に記載の抗体。
3. （３）変性ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビ
   ターを抗原として、動物を免疫することを特徴とする請
   求項（２）に記載の抗体の製法。
4. （４）請求項（１）または（２）に記載の抗体を用いる
   ことを特徴とする試料中のストレプトミセス・ズブチリ
   シン・インヒビターの測定方法。