FR2836996A1

FR2836996A1 - PRECURSEURS DE TRACEURS IMMUNOLOGIQUES NON-PEPTIDIQUES COMPRENANT UN MOTIF TYROSYL-(X)n-LYSINE-(X)n-TYROSINE, PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS

Info

Publication number: FR2836996A1
Application number: FR0202783A
Authority: FR
Inventors: Anny Cupo; Saint Cecile Le; Jean Pierre Vincent
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2002-03-05
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2003-09-12
Also published as: WO2003075010A2; AU2003227812A8; AU2003227812A1; WO2003075010A3

Abstract

La présente invention concerne un précurseur d'un traceur immunologique caractérisé en ce qu'il comprend un haptène non peptidique couplé à un motif TYR(X) n-LYS ou LYS(X) n-TYR dans lequel X est choisi parmi une liaison simple, un acide aminé, à l'exception de Lysine, Glutamine, Asparagine ou Tyrosine, un groupe succinyle, un groupe hydroxyméthyle -CH (OH)-, un groupe méthylène : -CH2-, un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe oxyéthylène -CH2-O-, ou un groupe méthylamine -CHNH- etn est un nombre entier compris entre 1 et 20, de préférence entre 1 et 10, tout préférentiellement entre 1 et 2.L'invention concerne également des procédés de préparation desdits précurseurs l'utilisation de ces derniers pour la préparation de marqueurs immunologiques utiles dans les dosages immunologiques par compétition.

Description

PRECURSEURS DE TRACEURS IMMUNOLOGIQUES NONPEPTIDIQUES COMPRENANT UN MOTIF TYROSYL- (X) n-LYSINE, OU LYS INE- (X),-TYROSINE, PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS.

La présente invention concerne le domaine de l'immunologie analytique et en particulier la préparation de traceurs utiles pour les dosages immunologiques d'haptènes.

Parmi toutes les méthodes permettant la quantification dans les milieux biologiques comme par exemple le contenu intracellulaire, le sang, le liquide céphalorachidien (LCR), la salive, ou l'urine, des petites molécules, telles que celles utilisées en thérapie antiVIH, ou en cancérologie, les dosages immunologiques, présentent de nombreux avantages en termes de sensibilité, car ils sont adaptés à la mesure de concentrations intracellulaires faibles desdites molécules et aussi en termes de rapidité du fait du temps de préparation des échantillons.

Les dosages d'haptènes, molécules de faible taille, sont effectués au moyen de dosages immunologiques spécifiques, ci-après nommés dosages par compétition" dans lesquels, l'haptène à doser est mis en présence d'un anticorps spécifique, l'anticorps anti-haptène. La liaison entre ces deux molécules, l'haptène et l'anticorps antihaptène, est mesurée en présence d'une troisième molécule, analogue de l'haptène, généralement marquée, appelée traceur .

Ces dosages autorisent leur réalisation avec des échantillons de taille réduite, tant en volume comme en nombre de cellules, ils peuvent être réalisés en mélange complexe et sont bien adaptés au suivi de patients en milieu hospitalier.

Dans le cadre de la présente invention, les termes suivants ont la signification ci-dessous indiquée :
Haptène : Une molécule de petite taille, ayant en général un poids moléculaire inférieur à 5000 daltons susceptible d'avoir des propriétés antigéniques et d'induire une réponse immune seulement lorsqu'elle est couplée à une molécule porteuse de plus grande taille.

Molécule porteuse : Une molécule de poids moléculaire élevé, en général supérieur à 50000 daltons et capable d'induire une réponse immune chez un animal auquel elle est administrée. Lorsqu'il s'agit d'une protéine, la molécule porteuse doit être phylogénétiquement éloignée de l'espèce dans laquelle l'immunisation est réalisée.

Antigène : Une molécule contre laquelle le système immunitaire est capable de réagir. On désigne par antigène également une molécule qui réagit avec un anticorps spécifique de ladite molécule.

Immunogène : un antigène, en particulier lorsque celui-ci est obtenu par couplage d'un haptène et d'une molécule porteuse afin de permettre au premier d'induire une réponse immune et en particulier une réponse humorale avec production d'anticorps ayant une affinité pour ledit haptène.

Traceuse : molécule dérivée d'un analogue d'un haptène comportant un marqueur.

Précurseur d'un traceur : molécule dérivée d'un analogue d'un haptène susceptible de réagir avec un marqueur pour obtenir ledit traceur.

Marqueur : Une molécule ou une particule ayant des propriétés physico-chimiques, telle que l'émission ou l'absorption d'énergie lumineuse, radioactive ou autre, permettant sa détection, par tout moyen.

A titre d'exemple de marqueurs, on peut citer : des enzymes, des isotopes radioactifs, des fluorochromes.

Des dosages immunologiques des molécules de faible taille qui ont une importance toute particulière en matière de santé publique, sont par exemple les dosages des analogues nucléosidiques et non-nucléosidiques, souvent utilisés lors des traitements anti-viraux tels que ceux utilisés pour l'inhibition de la protéase ou de la transcriptase inverse du VIH ou dans des nombreux traitements anti-cancéreux, tels que le methotrexate ou la vincristine ou lorsqu'il s'agit de détecter des traces de molécules lors des dépistages des drogues telles que les narcotiques, ou lors de la détection d'hormones nonpeptidiques, ou encore des neuromédiateurs.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par : - nucléoside naturel : une molécule constituée par l'association d'une base purique (adénine ou guanine) ou pyrimidique (cytosine, uracile et thymine) avec un résidu pentose (béta-D-ribofuranose ou béta-Ddeoxyribofuranose).

- analogue nucléosidique (AN) : toute molécule composé d'une base modifiée ou non couplée à un ribose ou à un analogue de celui-ci.

Des tels analogues sont par exemple décrits dans le document : (Périgaud, C. et al. Nucleosides and Nucleotides 1992, vol. 11 (2-4), pages 903-945).

Ainsi par rapport à un nucléoside naturel, un analogue peut comporter des modifications du ribose, comme par exemple celles mentionnées page 607 du document précité, telles que la substitution d'un ou plusieurs

atomes, le déplacement de la liaison entre la base et le sucre, des inversions anomériques (béta-alpha), l'addition de fonctions diverses, l'inversion, substitution ou élimination de groupements hydroxyles, la modification de la taille du cycle (pyranose), l'inversion de la configuration (D-L) ou encore la rupture du cycle (acyclonucléosides) ou des modifications de la base hétérocyclique comme par exemple celles indiquées page 908 dudit document, pour les analogues : Fura, FdUrd, Thi-Gua, 6-MP, AraC ou Fludarabine phosphate.

A titre d'exemple de tels analogues de nucléosides, on peut également citer :
Adénosine, S-Adenosyl-L-methionine, 3'-Azido- 3'-deoxythymidine, Carbovir, Cordycepine, Cytidine, Cytosine-b-D-arabinoside, Deoxycytidine, Deoxytubercidine, 2'-Deoxyuridine, Formycine A, Formycine B, Ganciclovir, Guanosine, Inosine, Puromycine, Ribavirine, Sangivamycine, Saquinavir, Thymidine, Tubercidine, Uridine.

D'autres haptènes dont le dosage est particulièrement intéressant son, par exemple, les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse INNTI. Il existe environ 30 familles d'inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse qui vont se fixer au niveau d'une poche hydrophobe de la transcriptase inverse.

Les premiers INNTI ont été une benzodiazépine (TIBO) et la 1- (2-hydroxyéthoxyméthyl) -9- (phénylthio) thymine (HEPT) et à ce jour une trentaine de classes d'INNTI ont été développées.

Parmi les INNTI les plus utilisés on peut citer : les dipyridodiazépinones, comme la Névirapine, les pyridinones, les bis (hétéroaryl) pipérazines, les dérivés

TSAO, les alpha-anilinophénylacétamide (alpha-APA), les quinoxalines, la benzoxaninone DMP266 (Efavirenz).

En ce qui concerne le développement de traceurs adaptés aux tests immunologiques, la visualisation de protéines de liaison, telles que des récepteurs, des anticorps, voire des enzymes, a été à l'origine du développement de nombreux traceurs résultant d'astuces technologiques.

Les techniques de marquage ont favorisé l'émergence de traceurs modifiés dans des régions n'affectant pas leur interaction avec la molécule cible, permettant à ce traceur d'avoir la meilleure affinité vis- à-vis de la protéine de liaison. Ce concept s'est aussi bien appliqué aux interactions ligand-récepteur qu'aux interactions antigène-anticorps.

En ce qui concerne le développement d'un traceur radioactif ou enzymatique permettant la caractérisation d'anticorps anti-haptène et la mise au point des tests immunologiques correspondants, plusieurs stratégies ont été adoptées.

Pour le marquage radioactif, le plus souvent, certains travaux rapportent le couplage à la molécule d'intérêt, d'un des deux acides aminés susceptibles d'être radiomarqués à l'iode, l'histidine et la tyrosine. La tyrosine peut être introduite en utilisant la tyrosine méthyl ester, la tyramine ou le dipeptide Glycyl-Tyrosine.

(Boulenguez P et al. ; J Neurochem 1992 Mar ; 58 (3) : 951-9 Biochemical and pharmacological characterization of

serotonjLrt-O-carjboxymet. hy. ZgrIycyl/'. T-Lodotyros-fnamde, a new radioiodinated probe for 5-HT1B and 5-HTID binding sites. et Garrigues AM. et al. FEBS Lett 1987 Nov

30 ; 224 (2) : 267-71, Haloperidol-succinylglycyl[125I] iodotyrosine, a novel iodinated ligand for dopamine D2 receptors).

L'introduction d'un groupement absorbant dans la gamme de l'ultraviolet (UV), tel que le résidu Tyr, permet de plus de suivre la formation et la purification du traceur par spectrométrie ultraviolette.

D'autre part, pour l'obtention d'un traceur enzymatique, la stratégie la plus fréquemment utilisée a été celle de coupler l'haptène sur les groupements amino d'une enzyme, telle que par exemple la peroxydase, la phosphatase alcaline, l'acétylcholinesterase, etc.

Dans le cas des ligands, le réactif de Bolton Hunter (N-succinimidyl-3 (4-hydroxyphenyl) propionate) a été le plus couramment utilisé pour le radiomarquage à l'iode 125. Le radiomarquage peut-être réalisé soit avant soit après le couplage du réactif à la molécule cible. Sur le même principe, il est aussi, possible de réaliser un marquage au 3H en utilisant le propionate de Nhydroxysuccinimide tritié.

Toutefois, il a été observé lors de la mise au point de certains dosages, comme par exemple le dosage immunologique du Saquinavir, que l'antigène couplé au dipeptide Glycyl-Tyrosine n'était pas un traceur adéquat.

En effet, l'hémisuccinate du Saquinavir couplé au dipeptide Glycyl-Tyrosine possède une affinité médiocre vis-à-vis de l'anticorps si on la compare à celle du Saquinavir modifié par un chaînon succinyle (forme hapténique). L'une des hypothèses qui peut rendre compte de cette observation est que la tyrosine, par interaction hydrophobe et/ou par

encombrement stérique, interfère dans l'interaction antigène-anticorps.

Une des principales exigences de ces tests immunologiques est en effet celle de présenter une bonne sensibilité vis-à-vis de la molécule qui doit être mesurée.

La sensibilité du test est définie comme la quantité minimale détectable de façon fiable, généralement obtenue à partir de 15 à 20 % d'inhibition du test.

L'IC 50 est définie par la concentration d'antigène non marqué capable d'inhiber 50 % de la liaison antigène-anticorps. Dans les conditions du test immunologique, en utilisant une dilution d'anticorps donnant 50 % de liaison dans un test en compétition et en défaut de réactif, tant d'anticorps comme d'antigène marqué, l'IC 50 est un bon reflet de l'affinité. L'affinité est déterminée par la méthode de Scatchard.

Cette caractéristique des dosages immunologiques dépend de plusieurs facteurs, tels que l'affinité des anticorps mis en jeu, obtenus par immunisation d'un animal avec un immunogène, obtenu par couplage dudit haptène à une molécule porteuse.

Mais dans le cas particulier des dosages immunologiques par compétition utilisés pour les dosages de petites molécules, la sensibilité du test immunologique est aussi dépendante de la qualité de la compétition entre l'anticorps, la molécule à doser et le traceur qui mime ladite molécule à doser.

Autrement dit, la sensibilité du dosage immunologique par compétition dépend de la capacité du traceur à déplacer la molécule à mesurer, l'haptène, lorsque celle-ci a déjà été reconnue par l'anticorps dirigé contre elle, et s'y trouve liée.

Pour que ledit traceur puisse effectuer un tel déplacement, il doit présenter la structure la plus proche possible de celle de l'haptène.

Il faut cependant tenir compte que la structure de l'haptène a souvent été modifiée du fait même de son couplage à la molécule porteuse, pour obtenir l'immunogène.

De ce fait, la structure de l'haptène mis en présence du système immunitaire pour la production d'anticorps spécifiques est quelque peu différente de celle de l'haptène libre et par conséquent les anticorps induits présentent souvent une meilleure affinité pour la structure de l'haptène légèrement modifié que pour la structure de la forme libre non-modifiée.

La demanderesse a maintenant conçu des traceurs immunologiques qui se rapprochent d'avantage de la structure de l'haptène modifié par son couplage à la molécule porteuse que de la structure de l'haptène libre et qui permettent le développement des dosages immunologiques par compétition ayant une sensibilité accrue.

Le but étant d'obtenir un traceur dont la structure se rapproche de celle de la forme immunogénique de l'haptène ayant servi à la production des anticorps anti-haptène et vis-à-vis duquel le traceur doit entrer en compétition. Cette caractéristique est essentielle en termes de sensibilité du test immunologique permettant de doser l'haptène.

La présente invention concerne donc un précurseur d'un traceur immunologique comprenant un haptène non peptidique couplé à un motif TYR- (X) n-LYS ou LYS- (X) nTYR dans lequel X soit choisi parmi une liaison simple, un acide aminé, à l'exception de Lysine, Glutamine, Asparagine

ou Tyrosine, un groupe succinyle, un groupe hydroxyméthyle -CH (OH)-, un groupe méthylène-CH-, un groupe oxyéthylène - CH2-O- ou un groupe méthylamine-CHNH-et n est un nombre entier compris entre 1 et 20, de préférence entre 1 et 10, tout préférentiellement entre 1 et 2.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré, l'haptène non peptidique est couplé à un motif TYR-LYS ou LYS-TYR.

L'introduction dans l'haptène du motif Tyrosyl- (X) n-Lysine, permet à la fois de réaliser un marquage radioactif aisé et de mimer le lien peptidique entre l'haptène et la protéine porteuse. Le groupement fonctionnel du résidu de Tyrosine, le groupe phénol, est en effet utilisé pour réaliser un radiomarquage à l'iode 125 et le résidu de Lysine mime le lien établi entre l'haptène et la protéine porteuse par l'intermédiaire du groupement fonctionnel amine primaire de sa chaîne latérale.

L'utilisation d'un traceur réunissant ces deux caractéristiques essentielles permet la mise en oeuvre de tests radioimmunologiques de haute sensibilité et par conséquent permet la quantification des épitopes reconnus par l'anticorps même lorsque ces derniers sont faiblement représentés dans un milieu biologique.

Le couplage est orienté en faisant réagir le groupement E amino de la lysine du motif Tyrosyl- (X) n- Lysine sur un résidu acide carboxylique de l'haptène modifié.

Selon des modes de mise en oeuvre préférés, les précurseur de traceurs immunologiques de l'invention

comprennent des haptènes non-peptidiques choisis parmi : des analogues nucléosides, des inhibiteurs nonnucléosidiques, des composés anticancéreux, des drogues, des hormones non-peptidiques, des neuromédiateurs.

Lors que l'haptène est un nucléoside, il peut être choisi parmi : Adénosine, S-Adenosyl-L-methionine, 3'Azido-3'-deoxythymidine, Carbovir, Cordycepine, Cytidine, Cytosine-b-D-arabinoside, Deoxycytidine, Deoxytubercidine, 2'-Deoxyuridine, Formycine A, Formycine B, Ganciclovir, Guanosine, Inosine, Puromycine, Ribavirine, Sangivamycine, Thymidine, Tubercidine, Uridine, Abacavir, 3-fluor-2', 3'dideoxythymidine (FLT), Fura, FdUrd, Thi-Gua, 6-MP, AraC ou Fludarabine phosphate.

Lorsque l'haptène est un composé anticancéreux, il peut être choisi parmi toutes les classes d'anticancéreux, tels les antimétabolites, les alcaloïdes les cancérostatiques.

Parmi les produits anticancéreux antimétaboliques, on peut citer : des analogues des bases puriques : 6-mercaptopurine, cladribine, fludarabine.

- des analogues des bases pyrimidiques : 5-fluoro-uracile, cytarabine, gemcitabine.

Parmi les narcotiques, on peut citer les psychotropes comme la cocaïne, la morphine, l'héroïne et leurs dérivés apparentés ou encore les tranquilisants.

L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un précurseur d'un traceur immunologique tels que ceux ci-dessus définis comprenant le couplage entre un

dérivé carboxylique de l'haptène et le groupement E-amine de la Lysine du motif Tyrosyl- (X) n-Lysine.

Parfois, les haptènes possèdent naturellement un groupe acide carboxylique, parfois il y est introduit chimiquement, selon des procédés connus de l'homme du métier, pour permettre leur couplage à une protéine porteuse, comme par exemple l'hémocyanine de Patelle ou KLH. Dans de tels cas, le couplage est effectué par formation d'une liaison peptidique entre la fonction acide carboxylique de l'haptène et les fonctions amines libres des chaînes latérales des résidus Lysines de la protéine porteuse.

La grande majorité des haptènes ne possèdent pas de groupement susceptible d'être engagé dans la formation d'une liaison peptidique avec les résidus amines libres d'une protéine porteuse de type KLH.

Par conséquent, la première étape de la mise en oeuvre des traceurs de l'invention consiste à modifier ledit haptène de façon à introduire une fonction acide carboxylique libre, lorsque celle-ci n'est pas présente naturellement, suivie du couplage du dérivé carboxylique dudit haptène avec le motif Tyrosyl- (X) n-Lysine.

Ainsi, plus particulièrement le couplage est effectué par activation de l'acide carboxylique de l'haptène ou de l'haptène modifié en présence de chloroformiate d'éthyle suivie de la réaction dudit dérivé activé avec le groupement s-amine de la Lysine du motif Tyrosyl- (X) n-Lysine ou encore au moyen d'une carbodiimide en présence de N-hydroxysuccinimide.

La première étape du couplage entre le dérivé carboxylique de l'haptène et le motif Tyrosyl- (X) n-Lysine est effectué par activation de la fonction acide carboxylique de l'haptène modifié par le chloroformiate d'éthyle, particulièrement adapté à l'obtention de précurseurs de traceurs utiles pour la détection des inhibiteurs de la protéase du VIH et d'autres antiviraux, tant nucléosidiques que non nucléosidiques, soit par couplage au moyen d'un carbodiimide en présence de Nhydroxysuccinimide, particulièrement adapté à l'obtention de précurseurs de traceurs utiles pour la détection d'analogues nucléosidiques, pour obtenir un intermédiaire réactionnel.

Cet intermédiaire réactionnel réagit avec le groupement amine libre E de la Lysine lorsque l'on effectue le couplage en milieu tampon à pH compris entre 8 et 10, de préférence à un pH compris entre 8,5 et 9, de façon à favoriser la réactivité du groupement E amino.

L'invention concerne également un traceur immunologique comportant le précurseur ci-dessus défini ou obtenu par l'un des procédés ci-dessous mentionnés couplé à un marqueur.

Selon un premier mode de réalisation, le traceur de l'invention comporte un marqueur couplé sur le groupement fonctionnel de la Tyrosine.

Selon un deuxième mode de réalisation, le traceur de l'invention comporte un marqueur sur le groupement fonctionnel de la Lysine.

Selon une mise en oeuvre préférée, les traceurs immunologiques de l'invention comportent des marqueurs

choisis parmi une enzyme, un chromophore, une particule magnétique, une particule colorée, un fluorochrome, la protéine verte de fluorescence (GFP), la fluorescéine, la rhodamine, le red texas, une particule métallique, la biotine, un complexe avidine-biotine, un complexe streptavidine-biotine, couplés sur le groupement a amino libre de la lysine du motif Lys- (X) n-Tyr.

Selon un mode de réalisation particulier, le traceur immunologique de l'invention comporte un radioélément sur le résidu tyrosine et de préférence ledit

radioélément est choisi parmi les atomes radioactifs : 125I, 3H.

Des traceurs particulièrement préférés sont les traceurs immunologiques radioactifs : Saquinavir K-Y 125I, ddA-HS-K-YI, NFV-Ac-ssAla-K-YI et les traceurs immunologiques enzymatiques : Saquinavir K-Y peroxydase, ddA-HS-K-Y peroxydase, NFV-Ac-ssAla-K-Y peroxydase.

L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un traceur immunologique comprenant une étape de couplage d'un marqueur sur le résidu tyrosine ou sur le résidu lysine d'un précurseur défini ci-dessus ou obtenu par un procédé ci-dessus mentionné.

Selon un mode de réalisation particulier dudit procédé, le motif TYR- (X) n-LYS ou LYS- (X) n-TYR est préalablement marqué avant son couplage à l'haptène non peptidique.

En particulier, le marquage préalable du motif TYR- (X) n-LYS est effectué soit au moyen d'un marqueur radioactif sur le résidu tyrosine soit au moyen d'un marqueur enzymatique sur le résidu lysine.

Dans tous les cas, le suivi de la réaction est effectué par chromatographie liquide haute pression. Les produits de couplage sont caractérisés par spectrométrie de masse (MALDI-TOF).

Pour la préparation de traceurs radioactifs, après purification par chromatographie, chaque dérivé obtenu est radiomarqué à l'iode 125. Le radiomarquage est effectué en présence d'iodure de sodium radioactif et d'un oxydant dans un tampon phosphate à pH 7,5.

En fonction de la nature des dérivés et de leur sensibilité à l'oxydation, différents oxydants peuvent être utilisés ; à titre d'exemple, on peut mentionner : la chloramine T, le iodogène, la lactopéroxydase et la glucose-oxydase.

Les dérivés radiomarqués sont purifiés par chromatographie liquide haute pression utilisant un support, des solvants et des gradients adaptés à chaque molécule.

L'invention a tout particulièrement pour objet les traceurs immunologiques radiomarqués : ANN-Lys-Tyr-125I, AN-Lys-Tyr-125I.

Encore selon un autre mode de réalisation, l'invention a pour objet un traceur immunologique comportant un marqueur enzymatique sur le résidu lysine et de préférence ledit marqueur enzymatique est choisi parmi le groupe comprenant la peroxydase, la phosphatase alcaline, l'uréase.

L'invention est illustrée ci-dessous au moyen d'exemples, non limitatifs dans lesquels on décrit le procédé de préparation de précurseurs de traceurs avec le motif Tyr- (X) n-Lys, des traceurs immunologiques dérivés de

ceux-ci, ainsi que leur utilisation pour des dosages immunologiques et au moyen des figures en annexe dans lesquelles : - la figure 1 illustre l'analyse comparative de la spécificité d'anticorps anti-saquinavir au moyen d'un dosage immunologique mettant en oeuvre différents traceurs, parmi lequels le traceur SQV-HS-Y-K* de l'invention.

- la figure 2 illustre l'étude comparative, à partir d'un échantillonnage de plasmas, entre les techniques de dosage immunologiques, ELISA et RIA utilisant le traceur SQV-HS-K-Y* et chromatographiques pour le Saquinavir et montre une bonne corrélation entre la technique de référence (HPLC) et le dosage RIA mis en oeuvre avec le traceur SQV-HS-K-Y*.

PARTIE EXPERIMENTALE. EXEMPLES
1-Protocole de couplage du dipeptide.

Le couplage du dipeptide sur la fonction acide carboxylique de l'haptène modifié peut s'effectuer soit sur la fonction a amino terminale du dipeptide soit sur le groupement E amino de la lysine. Le couplage monodirectionnel sur l'une ou l'autre de ces deux fonctions amines peut être favorisé en utilisant des conditions de pH et de rapport de concentrations particulières. Il faut ensuite isoler le produit de couplage par purification par chromatographie liquide haute pression (CLHP). Le choix des conditions expérimentales, c'est-à-dire l'orientation du couplage, est dicté par la nécessité d'obtenir la meilleure adéquation entre la structure de la forme immunogénique et celle du traceur de façon à obtenir la meilleure affinité pour le test immunologique.

A) Protocole utilisé pour les antiprotéases modifiées :

Pour les antiprotéases modifiées contenant une fonction acide carboxylique libre, les conditions de couplage au dipeptide Tyrosyl-Lysine ont été les suivantes :
Le couplage s'effectue en deux étapes : a) la fonction acide carboxylique sur l'haptène (1 équivalent) est préalablement activée par le chloroformiate d'éthyle (2,2 équivalents) dans le diméthyformamide en présence de triéthylamine (2,5 équivalents), pendant 10 minutes à froid (bain eau et glace). b) le dipeptide Tyrosyl-Lysine (1,5 équivalents), préalablement solubilisé dans un tampon borate phosphate 50 mM, à pH 8-9, est ajoutée au milieu réactionnel.

Le mélange est ensuite placé sous agitation à 4 C. Le suivi du couplage est effectué par chromatographie liquide haute pression.

La réaction est arrêtée par dilution dans l'eau et congélation, lorsque la quantité du produit de couplage désiré n'évolue plus et/ou lorsque des produits secondaires de la réaction apparaissent.

B) Protocole utilisé pour les analogues nucléosidiques modifiées :
La liaison glycosidique des analogues nucléosidiques est sensible en milieu acide. De ce fait l'utilisation du chloroformiate d'éthyle qui libère de l'acide chlorhydrique lors de l'activation de la fonction acide carboxylique est écartée et l'activation est effectuée avec le dicyclohéxylcarbodiimide (DCC) en présence de N-hydroxysuccinimide.

Le couplage s'effectue en deux étapes :

a) Après modification de l'hydroxyle en 5'des analogues nucléosidiques du ribose par un chaînon hémisuccinate, la fonction acide carboxylique libre (1 équivalent) est activée en présence de DCC (3,6 équivalents) et de N-hydroxysuccinimide (3,6 équivalents) dans le diméthylformamide durant 3 heures à température ambiante. b) le dipeptide Tyrosyl-Lysine (1,5 équivalents) est préalablement solubilisé dans un tampon borate phosphate 50 mM, à pH 8,9 et ajoutée ensuite au milieu réactionnel.

Le mélange est agité à température ambiante. Le suivi du couplage est effectué par chromatographie liquide haute pression sur une colonne C18 phase inverse. Le

gradient d'élution est indiqué sur la table 5 ci-dessous, Table 5

<tb>
<tb> Temps <SEP> (Min) <SEP> H20 <SEP> (0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> TFA) <SEP> CH3CN <SEP> (0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> TFA)
<tb> 0 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb> 5 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb> 45 <SEP> 40 <SEP> 60
<tb>
et la réaction est arrêtée comme décrit précédemment.

2-Protocoles de radiomarquage à l'iode 125.

Les conditions d'iodation (nature de l'oxydant et conditions de purification par CLHP) ont été mises au point en fonction de la sensibilité à l'oxydation et à la dégradation de chaque molécule.

D'une manière générale, 1 équivalent de Tyrosine et 0,5 équivalent de 125INa sont placés dans un tampon Phosphate 250 mM pH 7,5 en présence de l'agent oxydant :

La chloramine T mg par équivalent de Tyrosine.

L'iodogène : 100 g par équivalent de Tyrosine.

La lactoperoxydase : 50 ug en présence d'eau oxygénée, soit rajoutée au milieu (à raison de 3 fois 10 lÀl à 0, 01% en volume), soit produite in situ par l'ajout de glucose oxydase (5 g) et de glucose (0,5 moles) .

La réaction d'iodation, conduite pendant 1 minute, est arrêtée soit par ajout d'un excès de tyrosine (100 équivalents) soit par ajout de métabisulfite de sodium ou MBS (10 g). Le rapport molaire 125r/Tyr est maintenu inférieur à un tout au long de la réaction pour éviter la formation de diiodotyrosines.

Le support de chromatographie et les conditions d'élution (nature de l'éluant et gradient) utilisés pour la purification sont définis pour chacune des molécules.

RESULTATS
Concernant le Saquinavir, l'accrochage du dipeptide Glycyl-Tyrosine à l'hémisuccinate du Saquinavir entraîne une baisse de l'affinité d'un facteur 100 par rapport à l'hémisuccinate du Saquinavir alors que l'haptène modifié (hémisuccinate du Saquinavir) et le dérivé comprenant le dipeptide Tyrosyl-Lysine sont reconnus avec une bonne affinité et de façon équivalente.

Ce résultat indique que, dans le cas de l'anticorps anti-Saquinavir, le choix du dipeptide TyrosylLysine est plus judicieux que le dipeptide Glycyl-Tyrosine.

En tenant compte des résultats obtenus pour les antiprotéases, pour les analogues nucléosidiques et notamment la ddA, le couplage du dipeptide Tyrosyl-Lysine à

au groupe acide carboxylique de l'haptène modifié par succinylation (en 5'sur le ribose) a été réalisé directement.

1. Caractérisation des anticorps.

Les antiprotéases (Saquinavir (SQV) et Nelfinavir (NFV)) et un analogue nucléosidique, la ddA, ont été couplés à la KLH par l'intermédiaire d'un bras intercalant. Les anticorps obtenus chez le lapin ont été caractérisés à l'aide d'un traceur radiomarqué à l'iode sur l'haptène préalablement modifié par le dipeptide tyrosyllysine.

Pour le Saquinavir, les anticorps produits ont été caractérisés de différentes façons : en RIA avec deux traceurs radiomarqués à l'iode 125 et en ELISA avec une forme immobilisée de l'antigène. Dans un premier temps, les anticorps anti-SQV ont été caractérisés en test RIA avec comme traceur l'hémisuccinate du Saquinavir couplé au dipeptide Glycyl-Tyrosine (SQV-HS-G-Y*). L'affinité de ces anticorps vis-à-vis du SQV s'est avérée faible (64 nM). Alors ces anticorps ont été caractérisés en test ELISA avec la forme immobilisée de l'antigène, SQV-HS-BSA sur une phase solide. Les caractéristiques de ces anticorps antiSQV, établies dans un test ELISA, sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous.

TABLEAU 1

<tb>
<tb> Analogues <SEP> IC <SEP> 50 <SEP> finale <SEP> (M)
<tb> Saquinavir <SEP> 2,6. <SEP> 10-9
<tb> SQV-HS <SEP> 3. <SEP> 10-10
<tb> SQV-HS-G-Y <SEP> 1. <SEP> 10
<tb>
ijes acides aminés sont présentes en fonction de la nomenclature internationale.

* représente l'isotope 125 I.

Il est constaté que le dérivé SQV-HS-G-Y est 30 fois moins bien reconnu que l'hémisuccinate du Saquinavir (SQV-HS). Par conséquent, ce dernier a été couplé sur la chaîne latérale de la lysine du dipeptide tyrosyl-lysine afin de mimer le lien établi entre l'haptène et la protéine porteuse. Les anticorps anti-SQV ont été caractérisés en test radioimmunologique avec le SQV-HS-K-Y marqué à l'iode 125. Les caractéristiques des anticorps anti-SQV, établies dans un test RIA avec le traceur SQV-HS-K-Y*, sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous.

TABLEAU 2

<tb>
<tb> Analogues <SEP> IC <SEP> 50 <SEP> finale <SEP> (M)
<tb> Saquinavir <SEP> 1,2. <SEP> 10-8
<tb> SQV-HS <SEP> 4, <SEP> 4. <SEP> 10-10
<tb> SQV-HS-K-Y <SEP> 6. <SEP> 10-
<tb> SQV-HS-G-Y <SEP> 1. <SEP> 10
<tb> IDV <SEP> nI
<tb> NFV <SEP> nI
<tb>
ni : non immunoreacni jusqu a aes conceno. auons o. e lu ivi.

Les caractéristiques des anticorps anti-SQV établies en ELISA et en RIA avec le traceur SQV-HS-K-Y* montrent que le SQV-HS-G-Y est en moyenne 30 fois moins bien reconnu que l'hémisuccinate du Saquinavir. En revanche, le SQV-HS-K-Y est aussi bien reconnu que l'hémisuccinate du Saquinavir.

Afin de généraliser cette approche à d'autres anticorps, nous avons caractérisé les anticorps dirigés contre une autre antiprotéase, le Nelfinavir à la fois avec les traceurs correspondants aux produits de couplage aux dipeptides Glycyl-Tyrosine et Tyrosyl-Lysine. Les résultats obtenus concernant les caractéristiques des anticorps anti-

NFV établies dans un test RIA avec les traceurs NFV-Ac- PAla-G-Y* et NFV-Ac-pAla-K-Y* sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.

TABLEAU 3

<tb>
<tb> NFV-Ac-ssAla-G-Y* <SEP> NFV-Ac-ssAla-K-Y*
<tb> IC50 <SEP> (M) <SEP> IC50 <SEP> (M)
<tb> NFV <SEP> 510-9 <SEP> 410-"
<tb> NFV-Ac-pAla-COOH <SEP> 2, <SEP> 810'" <SEP> 1, <SEP> 710-9
<tb> NFV-Ac-ssAla-G-Y <SEP> 3,2 <SEP> 10-10 <SEP> 6 <SEP> 10-10
<tb> NFV-Ac-ssAla-K-Y <SEP> 3 <SEP> 10-l'8, <SEP> 3 <SEP> 10-"
<tb> IDV <SEP> nI <SEP> nI
<tb> SQV <SEP> nI <SEP> nI
<tb> nI <SEP> : <SEP> non <SEP> immunoréactifjusqu'à <SEP> des <SEP> concentrations <SEP> de <SEP> 10 <SEP> M.
<tb>

Les caractéristiques des anticorps anti-NFV montrent que pour cet anticorps, les dosages immunologiques utilisant les traceurs NFV-Ac-ssAla-G-Y* et NFV-Ac-pAla-K-Y* sont équivalents en termes de sensibilité et de spécificité. De plus, ces deux molécules sont reconnues de façon identique dans chacun des tests indiquant qu'elles sont équivalentes en termes de reconnaissance par l'anticorps.

Par la suite, nous avons directement utilisé ce dipeptide pour produire un traceur afin de caractériser les anticorps dirigés contre la ddA.

Les caractéristiques de ces anticorps anti-ddA établies dans un test RIA avec le traceur ddA-HS-K-Y* sont présentées dans le tableau 4 ci-dessous.

Tableau 4

<tb>
<tb> Analogues <SEP> IC50 <SEP> (M) <SEP> SEM
<tb> DdA-HS <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 7. <SEP> 10-11 <SEP> (n=5)
<tb> DdA-HS-K-Y <SEP> 1, <SEP> 4. <SEP> 10-10
<tb> ddA <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 4. <SEP> 10-9 <SEP> (n=14)
<tb> ddI <SEP> 1. <SEP> 10-7
<tb> 3TC <SEP> 6, <SEP> 4. <SEP> 10-4
<tb> AZT <SEP> nI
<tb> d4T <SEP> nI
<tb> ddC <SEP> 4. <SEP> 10-5
<tb>

nI : non immunoréactif jusqu'à des concentrations de 10-'M.

Comme pour les anticorps précédents, le ddA-HSK-Y est aussi bien reconnu que l'haptène.

La spécificité des anticorps anti-SQV, anti-NFV et anti-ddA est excellente puisque aucune réactivité croisée n'est observée vis-à-vis des autres antiviraux utilisés en thérapie anti-VIH. La sensibilité des tests et l'absence d'interférence avec des composants des milieux biologiques tels que les protéines plasmatiques, le contenu intracellulaire, ou le milieu de culture dans les tests in vitro, autorise le dosage brut sans purification préalable des échantillons.

2. Applications cliniques.

On peut constater que les résultats des dosages RIA sont comparables à ceux obtenus par HPLC et permettent la quantification du SQV plasmatique.

Les résultats des dosages par ELISA sont très différents de ceux obtenus par HPLC. Le test ELISA étant plus sensible aux interférences protéiques que le dosage RIA, une façon de s'affranchir de ces interférences serait d'extraire le SQV des échantillons biologiques.

Aussi, puisque l'étude de la spécificité des anticorps montre que l'hémisuccinate du Saquinavir est 100 fois mieux reconnu, l'optimisation du test pourrait passer par la succinylation du SQV des échantillons biologiques.

3. Conclusions.

Les travaux expérimentaux réalisés dans le cadre de la présente invention et les résultats des tests immunologiques mentionnés dans l'exemple ci-dessous permettent de conclure que le traceur conçu par la demanderesse, comportant le motif KY permet la réalisation d'un dosage immunologique ayant une bonne sensibilité.

Ces résultats confirment que le traceur immunologique conçu dans le cadre de la présente invention, qui tient compte de la reconnaissance de l'épitope par l'anticorps, présente la meilleure adéquation avec l'immunogène.

En effet, la comparaison des structures de l'isostère du ddATP et de l'hémisuccinate de la ddA montre des analogies confirmées par la modélisation moléculaire.

Cette analogie structurale a été démontrée expérimentalement par le fait que le dérivé ddA-HS-K-IY est parfaitement reconnu par les anticorps anti-isostère du ddATP, de même que le dérivé non radiomarqué.

En effet, dans l'exemple, montré par la demanderesse pour illustrer l'invention, l'haptène est couplé sur les fonctions amines primaires des chaînes latérales des lysines de la protéine porteuse. Par conséquent, en couplant l'haptène sur la chaîne latérale de la lysine du dipeptide tyrosyl-lysine, on mime le lien établi entre l'haptène et la protéine porteuse. Le traceur ainsi obtenu est le plus proche structurellement de la forme immunogénique.

Prise dans leur ensemble, l'étude de la spécificité des différents anticorps que la Demanderesse a caractérisé montre qu'un précurseur d'un traceur utilisant le dipeptide Tyrosyl-Lysine conduit à l'obtention d'un traceur permettant l'obtention d'un test avec une sensibilité suffisante pour détecter et quantifier des molécules faiblement représentées.

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Claims

REVENDICATIONS

1) Un précurseur d'un traceur immunologique caractérisé en ce qu'il comprend un haptène non peptidique couplé à un motif TYR- (X),-LYS ou LYS- (X) n-TYR dans lequel X est choisi parmi une liaison simple, un acide aminé, à l'exception de Lysine, Glutamine, Asparagine ou Tyrosine, un groupe succinyle, un groupe hydroxyméthyle-CH (OH)-, un groupe méthylène :-CH-, un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe oxyéthylène -CH2-O-, ou un groupe méthylamine-CHNH-et n est un nombre entier compris entre 1 et 20, de préférence entre 1 et 10, tout préférentiellement entre 1 et 2.

2) Un précurseur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un haptène non peptidique couplé à un motif TYR-LYS ou LYS-TYR.

3) Un précurseur selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'haptène nonpeptidique est choisi parmi : des analogues nucléosidiques, des inhibiteurs non-nucléosidiques, des composés anticancéreux, des stupéfiants, des hormones nonpeptidiques et des neuromédiateurs.

4) Un précurseur selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'analogue nucléosidique est choisi parmi : Adénosine, S-Adenosyl-L-methionine, 3'-Azido-3'deoxythymidine, Carbovir, Cordycepine, Cytidine, Cytosineb-D-arabinoside, Deoxycytidine, Deoxytubercidine, 2'Deoxyuridine, Formycine A, Formycine B, Ganciclovir, Guanosine, Inosine, Puromycine, Ribavirine, Sangivamycine, Saquinavir, Thymidine, Tubercidine, Uridine, Abacavir, 3-

fluor-2', 3'-dideoxythymidine (FLT), Fura, FdUrd, Thi-Gua, 6-MP, AraC ou le Fludarabine phosphate.

5) Un précurseur selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'inhibiteur non-nucléosidique est choisi parmi : une dipyridodiazépinone, une pyridinone, une bis (hétéroaryl) pipérazine, un dérivé TSAO, une alphaanilinophénylacétamide (alpha-APA), la quinoxaline, la benzoxaninone DMP266 (Efavirenz).

6) Un précurseur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le composé anti-cancéreux est choisi parmi : les alcaloïdes les cancérostatiques et des antimétabolites choisis parmi des analogues de bases puriques ou des analogues de bases pyrimidiques.

7) Un précurseur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le stupéfiant est choisi parmi la cocaïne, la morphine, l'héroïne et leurs dérivés apparentés.

8) Procédé d'obtention d'un précurseur d'un traceur immunologique défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend le couplage entre un dérivé carboxylique de l'haptène et le groupement E-amine de la Lysine du motif Tyrosyl- (X) nLysine.

9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le couplage est effectué par activation de l'acide carboxylique de l'haptène en présence de chloroformiate d'éthyle suivie de la réaction dudit dérivé activé avec le groupement E-amine de la Lysine du motif Tyrosyl- (X) n-Lysine.

10) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le couplage est effectué au moyen d'une carbodiimide en présence de N-hydroxysuccinimide.

11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le couplage est effectué en milieu tampon à un pH compris entre 8 et 10, de préférence à un pH compris entre 8,5 et 9.

12) Un traceur immunologique caractérisé en ce qu'il comprend un précurseur défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou obtenu par un procédé défini à l'une quelconque des revendications 8 à 11, couplé à un marqueur.

13) Un traceur immunologique selon la revendication 12, caractérisé en ce que le marqueur est choisi parmi le groupe comprenant : un atome radioactif, une enzyme, une particule magnétique, une particule colorée, un chromophore, un fluorophore, une particule métallique, la biotine, un complexe avidine-biotine, un complexe streptavidine-biotine.

14) Un traceur immunologique selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que le marqueur est couplé sur le groupement fonctionnel de la Tyrosine

15) Un traceur immunologique selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que le marqueur est couplé sur le groupement fonctionnel de la Lysine.

16) Un traceur immunologique selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte un marqueur radioactif sur le résidu tyrosine.

17) Un traceur immunologique selon la revendication 16, caractérisé en ce que le marqueur

radioactif est choisi parmi les atomes radioactifs : I"', 3 H3.

18) Un traceur immunologique selon la revendication 17 choisi parmi : Saquinavir K-Y I, ddA-HS- K-YI, NFV-Ac-pAla-K-YI.

19) Un traceur immunologique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte un marqueur enzymatique sur le résidu lysine.

20) Un traceur immunologique selon la revendication 19, caractérisé en ce que le marqueur enzymatique est choisi parmi le groupe comprenant la peroxydase, la phosphatase alcaline et l'uréase.

21) Un traceur immunologique choisi parmi : Saquinavir K-Y peroxydase, ddA-HS-K-Y peroxydase, NFV-Ac- pAla-K-Y peroxydase.

22) Procédé d'obtention d'un traceur immunologique caractérisé en ce qu'il comprend une étape de couplage d'un marqueur sur le résidu tyrosine ou sur le résidu lysine d'un précurseur défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7.

23) Procédé d'obtention d'un traceur immunologique caractérisé en ce qu'il comprend une étape de

couplage d'un motif TYR- (X),-LYS ou LYS- (X),-TYR préalablement marqué à un haptène non peptidique.

24) Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le marquage préalable du motif TYR- (X) n-LYS est effectué au moyen d'un marqueur radioactif sur le résidu tyrosine.

25) Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le marquage préalable du motif TYR- (X) n-LYS est effectué au moyen d'un marqueur enzymatique sur le résidu lysine.