JPWO2017094733A1 - 分子標的医薬に結合するdnaアプタマー及びそれを用いる分子標的医薬の検出方法 - Google Patents
分子標的医薬に結合するdnaアプタマー及びそれを用いる分子標的医薬の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2017094733A1 JPWO2017094733A1 JP2017554119A JP2017554119A JPWO2017094733A1 JP WO2017094733 A1 JPWO2017094733 A1 JP WO2017094733A1 JP 2017554119 A JP2017554119 A JP 2017554119A JP 2017554119 A JP2017554119 A JP 2017554119A JP WO2017094733 A1 JPWO2017094733 A1 JP WO2017094733A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna aptamer
- molecular target
- target drug
- dna
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y25/00—Nanomagnetism, e.g. magnetoimpedance, anisotropic magnetoresistance, giant magnetoresistance or tunneling magnetoresistance
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3517—Marker; Tag
Abstract
分子標的医薬に対して特異的に結合し得るDNAアプタマー、該DNAアプタマーを含む組成物及び当該DNAアプタマーを用いる分子標的医薬の検出方法を提供することを課題とする。分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマー、当該DNAアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用組成物、分子標的医薬の検出用キット、当該DNAアプタマーを用いることを特徴とする、分子標的医薬の検出方法。
Description
本発明は、分子標的医薬に対して特異的に結合し得るDNAアプタマー、該DNAアプタマーを含む組成物及び当該DNAアプタマーを用いる分子標的医薬の検出方法を提供することを課題とする。
がんは疾患による死因として依然として高い比率を占めており、がんの治療に対し多くの分子標的薬が開発されている。これら治療に用いられる抗がん剤の使用効果については、診断時の抗がん剤血中濃度を測定することで高めることができる。このように薬剤の血中滞留状態を知ることは医学、生物学を含む学際領域の最も重要な課題である。
タンパク質は特定の立体構造を有し、その構造が特異性を発現している。特に抗体タンパク質のFab部の立体構造は生体内で特定抗原の検出には必須の構造であり、抗体反応の一翼を担うものである。近年これら抗体タンパク質の特異的認識能に着目した分子標的薬の開発が急速に進み、がん患者の5年生存率を飛躍的に向上させている。例えば、抗体分子標的薬の1つであるベバシズマブ(bevacizumab)は、アバスチンの商品名で販売されており、血管新生を阻害することによりがんの増殖速度を低下させる特徴を有する。がん細胞は一般に正常細胞に比べ細胞増殖を活発に行うため正常細胞より栄養や酸素を必要とし、がん組織周辺に血管をつくる。血管新生には血管内皮細胞増殖因子(VEGF)が必要であるが、ベバシズマブはこの血管内皮細胞増殖因子を阻害する効果がある。このようにベバシズマブはがん細胞周辺の血管新生を阻害し、がん細胞に対する栄養を遮断することでがん細胞の増殖を阻害するものである。よってベバシズマブはがん細胞に対する毒性はなく、他の抗がん剤と併用できるなどのメリットがあり、広くがん治療薬として用いられている。ベバシズマブは、結腸がん・直腸がん・非小細胞肺がん・卵巣がん・乳がんの治療に用いられている(例えば、非特許文献1及び2)。
治療における血中ベバシズマブ濃度の測定には抗体免疫法が用いられるが、操作が非常に煩雑であること、また検査キットが高価であるため頻繁に行うことはできないという欠点を有している。
一本鎖核酸はその塩基配列により様々な立体的構造をとるため、特定の抗原に対して親和性を有する塩基構造を見出すことができる。これら目的とするターゲットに対して特異的に吸着する核酸をアプタマーという。新規のアプタマーの探索には試験管内進化法(IN VITRO SELECTION法)が最も有効な手段として用いられている。特にSELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法は大きく分けて目的核酸分子の選別と選別されたアプタマーの増幅の2ステップがある。(例えば特許文献1)。目的核酸分子の選別と増幅を選択性を高めながら繰り返すことにより、高い親和性を有する核酸断片が得られる。さらに、近年では様々な改良が加えられ、より少ないサイクル回数でアプタマーを回収できる、効率・選択性において優れた手法や、低分子やタンパク質だけでなく細胞や組織(正確には、表面に存在する分子)に結合するアプタマーを得る手法(Cell−SELEX法;例えば、非特許文献3)などが報告されている。この手法は従来のSELEX法に比べ、たんぱく質の解析が不要であること、細胞表面に存在する様々な膜たんぱく質のアプタマーを同時に選別できること、さらに、目的細胞とより特異的に結合するアプタマーを選抜できると言った特徴がある。これらアプタマーは従来診断、治療に用いられてきた抗体の特性でもあるターゲットに対する高親和性や特異性は言うまでも無く、化学的に短時間で合成することが可能であり、さらにその分子修飾に関しても安価に行うことができ、作用機序が単純で、免疫原性もほとんどないという、抗体にはない利点がある。
細胞以外でも例えば抗体タンパク質に対し親和性を有する核酸配列を見出すこともProtein A beads(Thermosicentific 社製) 磁性粒子を用いることで容易に行うことができる。見出された抗体に親和性を有するアプタマーを診断、検査に用いる場合はその末端に蛍光色素を導入し、蛍光顕微鏡での検出が多く用いられる(例えば非特許文献2)。
がん内科的治療においては、抗がん剤の併用が効果的である場合がある。ここで、分子標的薬以外の2剤併用治療はそれまでの治療に比べ優れた成績を上げていたが、どの組み合わせも同等な成績であり、治療成績は頭打ちとなったのに対して、分子標的薬等の抗体医薬は画期的な成績を挙げた。日本における分子標的薬の第一号はイレッサ(ゲフェチニブ)で劇的な治療成績を挙げた症例があるにも関わらず、統計的な効果は示されなかったが、非喫煙者、腺がん患者に対しては比較的効果が高いとされてきた。2009年にアリタムが認可され、シスプラチンと併用することで扁平上皮がんを除く非小細胞肺がんで生存期が伸びることが示された。続いて認可されたベバシズマブは血管新生阻害剤と呼ばれ、血管内皮増殖因子を補足することにより血管新生が抑制されがん細胞への栄養供給を抑制し、がんの増殖を抑えることができる。ベバシズマブはがん自体に対する毒性はないため、他の抗がん剤と併用されるが、たとえば、カルボプラチン、パクリタキセルとの併用で14.2か月全生存期間が延長した。
このように抗体医薬は現在最もよくがん治療に用いられる分子標的薬である。また、がん以外にも関節リウマチ、クローン病、ぜんそくなどの疾患の治療に適した抗体医薬も開発されている。そして、これらの抗体医薬は、低分子医薬と同様に過剰投与による副作用の問題が生じうるが、抗体医薬は低分子医薬に比較すると血中濃度の測定が困難である。そのため、現在、更に治療効果を上げるため、分子標的薬の血中濃度の簡易な測定技術が求められている。
Yaxin Jiang, Xiahong Fang, and Chunli Bai.,Anal chem.., 76(17): 5230-3235, 2004.
Yen-An Shieh, Shu-Jyuan Yang, Ming-Feng Wei and Ming-JiumShieh., ACS NANO., Vol.4, No.3, 1433-1442, 2010.
Guo,et al.,Int.J.Mol.Sci.,9(4):668,2008
以上のような背景の下に、本発明は、分子標的医薬の血中濃度を測定する目的で、分子標的医薬と特異的に結合する新規DNAアプタマーを提供することを課題とするものである。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、SELEX法を用いることによって分子標的医薬に対して特異的な結合能を有するヌクレオチド配列を特定し、当該特定の配列を有するDNAが分子標的医薬に対する特異的アプタマーとして機能し得ることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、一つの態様において、
(1)分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマー。
(2)分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマーのヌクレオチド配列において、1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有することを特徴とするDNAアプタマー。
(3)分子標的医薬に対して特異的に結合するDNAアプタマーであって、
5’−P1−X−P2−3’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Xは、分子標的医薬に対して特異的に結合するヌクレオチド配列、又は当該配列から選択されるヌクレオチド配列において1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列であり、
P1及びP2は、PCR増幅のために導入された第1及び第2プライマー認識配列である上記(1)または(2)に記載のDNAアプタマー。
(4) P1は、配列番号2で示される第1プライマー認識配列であり、及びP2は、配列番号3で示される第2プライマー認識配列である、上記(3)に記載のDNAアプタマー。
(5)糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換から成る群より選択される、少なくとも1つの化学修飾を含む、上記(1)〜(4)のいずれか1に記載のDNAアプタマー;
(6)5’末端又は3’末端に蛍光標識を有する、上記(1)〜(5)のいずれか1に記載のDNAアプタマー;
(7)前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン(GFP)、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750、ローダミン、6−カルボキシテトラメチルローダミン、TAMRA(登録商標)、フィコエリスリン(PE)、フィコシアニン(PC)、PC5、PC7、Cy色素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TexasRed、アロフィコシアニン(APC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA)、Marina Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、 Pacific Blue、 SPRD、 テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、R110、mC1B、CellTracker色素、CFSE、JC−1、PKH、DCFH−DA、DHR、FDA、Calcein AM、ニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、acridine(Acd)、dansyl(Dns)、7−ジメチルアミノクマリン−4−アセティックアシッド(DMACA)、5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホニックアシッド(EDANS)、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン9から選ばれる一種以上を含む発光波長421nmから712nmの有機系蛍光分子である 上記(6)に記載のDNAアプタマー;
(8)前記蛍光標識が量子ドットである上記(6)に記載のDNAアプタマー;
(9)5’末端又は3’末端を蛍光標識された上記(1)〜(8)のいずれか1に記載のDNAアプタマーが金属ナノ粒子表面に吸着されているDNAアプタマー;及び
(10)前記金属ナノ粒子に用いられる金属が金、銀、銅、鉄または珪素である上記(9)記載のDNAアプタマー。
(11)分子標的医薬がベバシズマブであり、分子標的医薬に特異的に結合する配列が配列番号1で表される上記(1)〜(10)のいずれか1に記載のアプタマー。
(1)分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマー。
(2)分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマーのヌクレオチド配列において、1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有することを特徴とするDNAアプタマー。
(3)分子標的医薬に対して特異的に結合するDNAアプタマーであって、
5’−P1−X−P2−3’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Xは、分子標的医薬に対して特異的に結合するヌクレオチド配列、又は当該配列から選択されるヌクレオチド配列において1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列であり、
P1及びP2は、PCR増幅のために導入された第1及び第2プライマー認識配列である上記(1)または(2)に記載のDNAアプタマー。
(4) P1は、配列番号2で示される第1プライマー認識配列であり、及びP2は、配列番号3で示される第2プライマー認識配列である、上記(3)に記載のDNAアプタマー。
(5)糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換から成る群より選択される、少なくとも1つの化学修飾を含む、上記(1)〜(4)のいずれか1に記載のDNAアプタマー;
(6)5’末端又は3’末端に蛍光標識を有する、上記(1)〜(5)のいずれか1に記載のDNAアプタマー;
(7)前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン(GFP)、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750、ローダミン、6−カルボキシテトラメチルローダミン、TAMRA(登録商標)、フィコエリスリン(PE)、フィコシアニン(PC)、PC5、PC7、Cy色素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TexasRed、アロフィコシアニン(APC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA)、Marina Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、 Pacific Blue、 SPRD、 テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、R110、mC1B、CellTracker色素、CFSE、JC−1、PKH、DCFH−DA、DHR、FDA、Calcein AM、ニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、acridine(Acd)、dansyl(Dns)、7−ジメチルアミノクマリン−4−アセティックアシッド(DMACA)、5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホニックアシッド(EDANS)、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン9から選ばれる一種以上を含む発光波長421nmから712nmの有機系蛍光分子である 上記(6)に記載のDNAアプタマー;
(8)前記蛍光標識が量子ドットである上記(6)に記載のDNAアプタマー;
(9)5’末端又は3’末端を蛍光標識された上記(1)〜(8)のいずれか1に記載のDNAアプタマーが金属ナノ粒子表面に吸着されているDNAアプタマー;及び
(10)前記金属ナノ粒子に用いられる金属が金、銀、銅、鉄または珪素である上記(9)記載のDNAアプタマー。
(11)分子標的医薬がベバシズマブであり、分子標的医薬に特異的に結合する配列が配列番号1で表される上記(1)〜(10)のいずれか1に記載のアプタマー。
別の態様において、本発明は、上記DNAアプタマーによる分子標的医薬の検出に関し、詳細には、
(12)上記(1)〜(11)のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用組成物;
(13)上記(1)〜(11)のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用キット;
(14)上記(1)〜(11)のいずれか1に記載のDNAアプタマーを用いることを特徴とする、分子標的医薬の検出方法;
(15)前記DNAアプタマーを分子標的医薬投与患者の、血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とDNAアプタマーとの結合による応答を観測することによって分子標的医薬の存在を検出する工程を含む、上記(14)に記載の検出方法;
(16)前記応答が、蛍光応答である、上記(15)に記載の検出方法;及び
(17)前記応答が、ラマン散乱応答である上記(15)記載の検出方法
に関する。
(12)上記(1)〜(11)のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用組成物;
(13)上記(1)〜(11)のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用キット;
(14)上記(1)〜(11)のいずれか1に記載のDNAアプタマーを用いることを特徴とする、分子標的医薬の検出方法;
(15)前記DNAアプタマーを分子標的医薬投与患者の、血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とDNAアプタマーとの結合による応答を観測することによって分子標的医薬の存在を検出する工程を含む、上記(14)に記載の検出方法;
(16)前記応答が、蛍光応答である、上記(15)に記載の検出方法;及び
(17)前記応答が、ラマン散乱応答である上記(15)記載の検出方法
に関する。
本発明によれば、分子標的医薬に対して特異的に結合する新規DNAアプタマーを用いることによって、かかる分子標的医薬の効率的な検出が可能となる。特に、蛍光標識等の検出部位を付与したDNAアプタマーを含むキット等に応用することで、生体から採取した血液中の分子標的医薬を測定対象とする簡便かつハイスループットな検出又はイメージングを行うことができる。また、さらに前記の蛍光標識を施したDNAアプタマーを金属ナノ粒子に固着させた分散液を含むキット等に応用することで、生体から採取した血中の分子標的医薬を測定対象とする簡便かつハイスループットな検出又はイメージングを行うことができる。そのような血中の分子標的医薬の検出によって、がんの治療効果を改善することが可能となる。
さらに、本発明のDNAアプタマーにおけるコンセンサス配列は、わずか30塩基程度の比較的短い領域であることから、製造のための手間やコストを抑制すること、及び種々の用途に応じて所望の化学修飾や更なる機能の付加を行うことが容易であるという利点も有する。
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
本明細書において、分子標的医薬とは、がん、自己免疫疾患、臓器移植などの治療に用いられる薬剤のうち、疾患に特有な分子や、過剰に発現している分子、たとえば、がんの細胞分裂に必要な分子等を特定の標的として攻撃し、その機能を抑えることにより、当該疾患の治療や拒絶反応の抑制等の効果を奏する薬剤を意味する本発明の対象となる分子標的医薬としては、例えば、マウスモノクローナルIgG1抗体、抗ヒトTNF-α抗体、マウス・ヒトキメラ抗体、ヒト化抗ヒトIgEモノクローナル抗体、抗IL-5モノクローナル抗体、抗RSウイルス抗体、抗血管内皮細胞増殖因子(VEGF)抗体、PEG化 抗ヒトTNF-α抗体、ヒト化抗CD20受容体抗体、抗CCケモカイン受容体4ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化抗CD5抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗CD22抗体、抗CD20抗体、ヒト型抗上皮成長因子受容体(EGFR)モノクローナル抗体、CTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4、CD152)ヒト化抗体、抗VEGFR2 IgG1抗体等の、抗がん剤や自己免疫疾患治療薬として用いられる抗体医薬が挙げられる。以下、分子標的医薬がベバシズマブ(商品名:アバスチン)である場合について説明する。
1.DNAアプタマー
本願において「DNAアプタマー」とは、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖オリゴDNAを意味し、本発明に係るDNAアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合する機能を有する一本鎖オリゴDNAである。典型的な態様において、本発明に係るDNAアプタマーは、以下に示す配列番号1で表されるヌクレオチド配列を有する。なお、ヌクレオチド配列は、5’末端から3’末端方向に左から右に記載する。
<配列番号1>
CCGTGTGGTGGGGGTTGGGGGTTGTCGTTCGCCG
本願において「DNAアプタマー」とは、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖オリゴDNAを意味し、本発明に係るDNAアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合する機能を有する一本鎖オリゴDNAである。典型的な態様において、本発明に係るDNAアプタマーは、以下に示す配列番号1で表されるヌクレオチド配列を有する。なお、ヌクレオチド配列は、5’末端から3’末端方向に左から右に記載する。
<配列番号1>
CCGTGTGGTGGGGGTTGGGGGTTGTCGTTCGCCG
本発明に係るDNAアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合するという機能を有する限り、上記配列番号1で示される配列における1もしくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、又は付加された配列であってもよい。好ましくは、当該置換、欠失、又は付加されるヌクレオチドは、1〜3個であり、より好ましくは1又は2個であり、さらに好ましくは1個である。また、かかるヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が存在する場合、本発明に係るDNAアプタマーの配列は、上記配列番号1で示される配列と90%以上、好ましくは93%以上、さらに好ましくは96%以上の相同性である配列(以下、「相同体」という場合がある。)であることができる。ここで、本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、典型的には配列解析プログラムによって(例えば、Karlin及びAltschul,1990,PNAS 87:2264−2268;Karlin及びAltschul,1993,PNAS 90:5873−5877)または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオチドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。
1もしくは複数のヌクレオチドが置換される場合、当該置換はユニバーサル塩基によってなされることができる。用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。すなわち、該用語は、一般的に、標準DNA/RNAの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう(例えば、Loakesら,1997,J.Mol.Bio.270:426−435)。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、C−フェニル、C−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド(carbozamide)、ならびにニトロアゾール誘導体(3−ニトロピロール、4−ニトロインドール、5−ニトロインドール、及び6−ニトロインドールなど)が挙げられる(Loakes,2001,Nucleic Acids Res.29:2437)。
また、本発明に係るDNAアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合するという機能を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態におけるDNAアプタマーの長さは、上限としては、例えば200塩基以下、好ましくは150塩基以下、より好ましくは100塩基以下である。全塩基の数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。下限としては、上記配列番号1における塩基数以上、すなわち34塩基以上である。DNAアプタマーは1本鎖(ssDNA)であることが好ましいが、ヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に2本鎖構造を形成する場合であっても、そのDNAアプタマーの長さは1本鎖の長さとして計算するものとする。
好ましい実施態様において、本発明に係るDNAアプタマーは、上記配列番号1で示される配列、及びその5’及び3’末端側にそれぞれプライマー認識配列よりなるヌクレオチド配列であることができる。すなわち、この場合、当該DNAアプタマーは、
5’−P1−X−P2−3’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Xは、配列番号1で示されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。P1及びP2は、PCR増幅のために導入された第1及び第2プライマー認識配列である。好ましくは、P1は、GCC TGT TGT GAG CCT CCT(配列番号2)であり、及びP2は、CGC TTA TTC TTG TCT CCC(配列番号3)である。
5’−P1−X−P2−3’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Xは、配列番号1で示されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。P1及びP2は、PCR増幅のために導入された第1及び第2プライマー認識配列である。好ましくは、P1は、GCC TGT TGT GAG CCT CCT(配列番号2)であり、及びP2は、CGC TTA TTC TTG TCT CCC(配列番号3)である。
本発明に係るDNAアプタマーは、生体内における安定性の増大のために、化学修飾されていてもよい。そのような化学修飾の非限定的な例としては、糖鎖部分での化学的置換(例えば、2’−0メチル化)、リン酸エステル部分での化学的置換(例えば、ホスホロチオエート化、アミノ基、低級アルキルアミン基またはアセチル基等の化学修飾)、及び塩基部分での化学的置換が挙げられる。同様に、5’又は3’末端に付加的な塩基を有することもできる。該付加的塩基の長さは通常5塩基以下である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとアプタマーの安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug−3’、uu−3’、tg−3’、tt−3’、ggg−3’、guuu−3’、gttt−3’、ttttt−3’、uuuuu−3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明に係るDNAアプタマーは、後述のベバシズマブの検出方法又は当該検出用キットにおいて用いるために、例えば5’末端又は3’末端に連結した検出標識を有することができる。かかる検出標識としては、蛍光標識が好ましいが、ラマン散乱標識、酵素標識、さらに赤外線標識を用いてもよい。
蛍光標識は、当該技術分野において慣用されている蛍光標識剤を用いることができるが、例えば、グリーンフルオレセントプロテイン(GFP)、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750、ローダミン、6−カルボキシテトラメチルローダミン、TAMRA(登録商標)、フィコエリスリン(PE)、フィコシアニン(PC)、PC5、PC7、Cy色素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TexasRed、アロフィコシアニン(APC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA)、Marina Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、 Pacific Blue、 SPRD、 テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、R110、mC1B、CellTracker色素、CFSE、JC−1、PKH、DCFH−DA、DHR、FDA、Calcein AM、ニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、acridine(Acd)、dansyl(Dns)、7−ジメチルアミノクマリン−4−アセティックアシッド(DMACA)、5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホニックアシッド(EDANS)、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン9から選ばれる一種以上が挙げられる。
好ましくは、例えば6−カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA(商標))、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル(FAM)、シアニン系蛍光色素(Cy3、Cy3.5,Cy5,Cy5.5)など市販のオリゴヌクレオチド固相合成サービスで導入できる蛍光団が挙げられる。
好ましくは、例えば6−カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA(商標))、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル(FAM)、シアニン系蛍光色素(Cy3、Cy3.5,Cy5,Cy5.5)など市販のオリゴヌクレオチド固相合成サービスで導入できる蛍光団が挙げられる。
さらに、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー(消光物質)がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。酵素標識の例としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。また、発光基質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等)などを標識剤として用いてもよい。
ラマン散乱標識に関しては、前記の蛍光標識されたアプタマーの例えば5’末端又は3’末端に金属表面と結合能を有する置換基として特に限定するものではないが、チオール(SH)基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基及びカルボキシル基から選ばれる基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることにより当該アプタマー吸着金属粒子から発せられる増強ラマン散乱光を検出することで細胞認識を行うものである。この場合、特に限定するものではないが、金属ナノ粒子として、金、銀、鉄、量子ドットなどを用いることができる。
2.DNAアプタマーの選別
本発明のDNAアプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment:SELEX法)が用いられる。当該SELEX法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド(アプタマー)の選別と、PCRによる指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより,ターゲット物質に親和性を有する核酸分子(一本鎖DNA、RNA)を得るというものである。また、その改良手法として、例えばGuo,et al.,Int.J.Mol.Sci.,9(4):668,2008に記載されているようなSELEX法を応用することが好ましい。即ち、タンパク質を固定化した磁性粒子を調整し、核酸ライブラリーと混合させ、磁性粒子上のタンパク質に親和性を有する核酸のみを抽出し、PCR増幅をおこなうSELEX法である。
本発明のDNAアプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment:SELEX法)が用いられる。当該SELEX法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド(アプタマー)の選別と、PCRによる指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより,ターゲット物質に親和性を有する核酸分子(一本鎖DNA、RNA)を得るというものである。また、その改良手法として、例えばGuo,et al.,Int.J.Mol.Sci.,9(4):668,2008に記載されているようなSELEX法を応用することが好ましい。即ち、タンパク質を固定化した磁性粒子を調整し、核酸ライブラリーと混合させ、磁性粒子上のタンパク質に親和性を有する核酸のみを抽出し、PCR増幅をおこなうSELEX法である。
上述のとおり、「インビトロセレクション法」は、ランダムなヌクレオチド配列を含む核酸分子のプール(いわゆる、DNAプール)からターゲットとする分子や細胞に対して親和性を持つアプタマー分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。この方法によれば、当該選択されたアプタマー分子のみをPCR法等で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つアプタマー分子を濃縮することができる。
具体的には、まず、20〜300塩基、好ましくは30〜150、より好ましくは30〜100塩基程度のランダムなヌクレオチド配列(塩基配列)領域を含む1本鎖核酸分子、例えば、オリゴDNAを調製する。オリゴDNAは、PCR(Polymerase Chain Reaction)増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを用いることが好ましい。プライマー認識配列部分は、PCR増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するようにしてもよい。用いるプライマー認識配列部分の長さは、特に限定されるものではないが、約20〜50、好ましくは20〜30塩基程度である。また、PCR増幅後の1本鎖DNAを電気泳動などで分離可能とするために、5’側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。
次に、上記で得られたランダムなヌクレオチド配列を有する核酸分子(ライブラリープール)と、ターゲットタンパク質を固定した磁性粒子とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドに静置し、核酸分子−ターゲットタンパク質複合体と遊離核酸分子とを分離する。分離溶液の上澄み部分を除去し、得られた核酸分子−ターゲットタンパク質複合体を用いてPCR反応を行うことでタンパク質結合性核酸配列の増幅を行う。この後、ターゲットタンパク質と複合体を形成している核酸分子を当該技術分野において周知の手法に従って一本鎖化する。そのような手法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した核酸二重鎖のうちターゲットタンパク質結合能を有するssDNAを分離することができ、さらにDNAポリメラーゼなどのPCR反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。その後、回収されたssDNAをライブラリープールとして用いて同様の操作を行う。
上述の核酸分子とターゲットタンパク質との混合、ターゲットタンパク質と結合した核酸分子の分離、PCR増幅、増幅された核酸分子を再びターゲットタンパク質との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンドを行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にターゲット細胞と結合する核酸分子を選別することができる。得られた核酸分子は、当該技術分野において周知の手法によりその配列解析を行うことができる。
3.ベバシズマブの検出用組成物、検出方法、及びキット
上述のように、本発明に係るDNAアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合する機能を有することから、当該ベバシズマブの血中濃度検出において好適に用いることができる。
上述のように、本発明に係るDNAアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合する機能を有することから、当該ベバシズマブの血中濃度検出において好適に用いることができる。
具体的には、本発明のDNAアプタマーを含む検出用組成物を血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させ、その後、当該試料とDNAアプタマーとの結合による応答(シグナルの有無)を観測することによってベバシズマブの存在を検出する。「生体から採取された試料」は、動物、好ましくはヒトから採取したものであって、最小侵襲で確保可能な試料または分泌体液、in vitro細胞培養液成分試料等であれば、その形態は特に限定されない。また、ベバシズマブの存在を検出するための「応答」は、蛍光応答もしくはラマン散乱応答であることが好ましく、そのため上記で述べたとおり、蛍光応答においてはDNAアプタマーの5’末端又は3’末端にTAMRA(商標)、FITC等の蛍光標識剤を連結させることが好ましい。またラマン散乱応答においてはDNAアプタマーの5’末端又は3’末端にCy3.5(商標)、TAMRA(商標)、FITC等の蛍光標識剤を連結させ、さらに前記のチオール(SH)基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基及びカルボキシル基から選ばれる基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることが好ましい。
また、本発明のベバシズマブの検出用組成物は、その簡便性や携帯性を高めるためDNAアプタマーを含むキットとして提供することもできる。当該キットにおいてDNAアプタマーは、通常、適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該DNAアプタマーが固相担体上に固定されたDNAアレイの態様で提供されることができる。例えば、DNAアプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、固相担体の表面にストレプトアビジンを固定化させて、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によってDNAアプタマーを固相担体表面に固定化することができる。当該キットには、必要に応じて他の試薬等を適宜含んでいても良く、例えば、添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
本発明の測定対象となる分子標的医薬が、上記に挙げたものであって、ベバシズマブ以外である場合も、上記と同様に、本発明を実施することができる。
本発明の医薬組成物は、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等)に対して投与することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例1:アプタマーの選別
SELEX法を用いて、ランダムな配列を有するDNAプールから肺がん分子標的薬であるベバシズマブに特異的に結合するアプタマーの選別を行った。当該SELEX法における各工程は以下のとおりである。
1) DNAプールの調製(DNAアプタマー候補群の溶液調製)
2) ターゲット物質−ベバシズマブ固定磁性粒子の調製及び混合
3) ターゲット結合性DNAと非結合性DNAの分離
4) ターゲット結合性DNAの複製(ターゲット物質と結合したDNAアプタマーを増幅する工程)
5) ターゲット結合性DNAの精製(増幅したDNAアプタマーを1本鎖DNAに精製する工程)
6) ターゲット結合性核酸のクローンニング(得られたDNAアプタマーの配列解析の前処理)
7) これら1)〜6)の工程を6ラウンド実行
8) ターゲット結合性核酸の配列解析(シーケンサーによるDNAアプタマーのヌクレオチド配列の解析)
より詳細な実験手順は、以下のとおりである。
DNAプールは、以下の配列を有する全長が70塩基でランダム配列部分(N)が34塩基のオリゴDNAを用いた。
DNA pool:Random34(つくばオリゴ社製)
・配列: 5’-GCC TGT TGT GAG CCT CCT(N34)CGC T TA TTC TTG TCT CCC−3’
・長さ: 70塩基(ランダム配列は中央の34塩基)
・分子量: 21391.3 g/mol
・モル吸光係数: 630475 L/mol・cm
ランダム配列の両側は、後のPCRにおいてプライマーによって認識され、増幅を可能にするための配列である。
磁性粒子表面へのベバシズマブの固定化は、アバスチンに添付してある説明書に従って行った。磁性粒子はThermo Scientific社製Protein A Magnetic Beads (product 88845)を用いた。
SELEX法を用いて、ランダムな配列を有するDNAプールから肺がん分子標的薬であるベバシズマブに特異的に結合するアプタマーの選別を行った。当該SELEX法における各工程は以下のとおりである。
1) DNAプールの調製(DNAアプタマー候補群の溶液調製)
2) ターゲット物質−ベバシズマブ固定磁性粒子の調製及び混合
3) ターゲット結合性DNAと非結合性DNAの分離
4) ターゲット結合性DNAの複製(ターゲット物質と結合したDNAアプタマーを増幅する工程)
5) ターゲット結合性DNAの精製(増幅したDNAアプタマーを1本鎖DNAに精製する工程)
6) ターゲット結合性核酸のクローンニング(得られたDNAアプタマーの配列解析の前処理)
7) これら1)〜6)の工程を6ラウンド実行
8) ターゲット結合性核酸の配列解析(シーケンサーによるDNAアプタマーのヌクレオチド配列の解析)
より詳細な実験手順は、以下のとおりである。
DNAプールは、以下の配列を有する全長が70塩基でランダム配列部分(N)が34塩基のオリゴDNAを用いた。
DNA pool:Random34(つくばオリゴ社製)
・配列: 5’-GCC TGT TGT GAG CCT CCT(N34)CGC T TA TTC TTG TCT CCC−3’
・長さ: 70塩基(ランダム配列は中央の34塩基)
・分子量: 21391.3 g/mol
・モル吸光係数: 630475 L/mol・cm
ランダム配列の両側は、後のPCRにおいてプライマーによって認識され、増幅を可能にするための配列である。
磁性粒子表面へのベバシズマブの固定化は、アバスチンに添付してある説明書に従って行った。磁性粒子はThermo Scientific社製Protein A Magnetic Beads (product 88845)を用いた。
磁性粒子を用いたSELEXの実施例
ベバシズマブ固定磁性粒子を17μLとり、リン酸バッファー(pH7.4、Ca,Mgフリー、2mM EDTA、0.1%HAS)で洗浄、これに、10μMに調整したDNAライブラリーを20μL添加する。室温で30分静置したのち磁気スタンドを用いて磁性粒子を回収し、リン酸バッファー(2mM EDTA、0.1%BSA)で洗浄、最終的に20μL TEバッファーで置換し、95℃ヒートブロックに10分間静置し、磁性粒子上のベバシズマブに吸着したDNAを脱離させる。回収したDNAライブラリーをPCRにより増幅したのち、目的とするDNA配列を回収する。
精製したDNAにストレプトアビジンを加えて磁性粒子に吸着させ、磁石により磁性粒子を回収したのち上澄みを除去、その後アルカリバッファー変性により上澄み中に磁性粒子と結合していない1本鎖DNAを回収した(図1)。その後アルカリバッファーをPBSバッファーに置換することで、磁性粒子と結合した目的物である1本鎖DNAを回収した。これを1ラウンドとし、この操作を6回行った。
6ラウンド後、ビオチン非修飾の18塩基プライマーを用いてPCR増幅を行い、PCR産物をシークエンサー解析した。
ベバシズマブ固定磁性粒子を17μLとり、リン酸バッファー(pH7.4、Ca,Mgフリー、2mM EDTA、0.1%HAS)で洗浄、これに、10μMに調整したDNAライブラリーを20μL添加する。室温で30分静置したのち磁気スタンドを用いて磁性粒子を回収し、リン酸バッファー(2mM EDTA、0.1%BSA)で洗浄、最終的に20μL TEバッファーで置換し、95℃ヒートブロックに10分間静置し、磁性粒子上のベバシズマブに吸着したDNAを脱離させる。回収したDNAライブラリーをPCRにより増幅したのち、目的とするDNA配列を回収する。
精製したDNAにストレプトアビジンを加えて磁性粒子に吸着させ、磁石により磁性粒子を回収したのち上澄みを除去、その後アルカリバッファー変性により上澄み中に磁性粒子と結合していない1本鎖DNAを回収した(図1)。その後アルカリバッファーをPBSバッファーに置換することで、磁性粒子と結合した目的物である1本鎖DNAを回収した。これを1ラウンドとし、この操作を6回行った。
6ラウンド後、ビオチン非修飾の18塩基プライマーを用いてPCR増幅を行い、PCR産物をシークエンサー解析した。
実施例2:蛍光標識DNAアプタマーによるベバシズマブの染色
ProteinA Magnetic Beadsに固定したベバシズマブを1.5 mL遠心チューブに入れ、これにシークエンサー解析により見出されたベバシズマブに対して親和性のあるヌクレオチド配列からなるDNAアプタマーの5‘末端をCy3.5(商標)で修飾し、このDNAを超純水により100μMに調製したアプタマー溶液を20μLとり、1mLリン酸バッファー液を有する1.5mL遠心チューブに分散させながら添加した。これを37℃1時間インキュベーターに静置した。その後、PBSで細胞を3回洗浄した後、さらにPBSを2mL添加した状態でオリンパス製の倒立型蛍光顕微鏡IX71により観察した。配列番号1を有するDNAアプタマーによる結果を、それぞれ図2及び3に示す。これらの蛍光標識DNAアプタマーが磁性粒子上のベバシズマブに特異的に結合し、それによってベバシズマブに対する良好な蛍光イメージング画像が得られることが明らかとなった。
ProteinA Magnetic Beadsに固定したベバシズマブを1.5 mL遠心チューブに入れ、これにシークエンサー解析により見出されたベバシズマブに対して親和性のあるヌクレオチド配列からなるDNAアプタマーの5‘末端をCy3.5(商標)で修飾し、このDNAを超純水により100μMに調製したアプタマー溶液を20μLとり、1mLリン酸バッファー液を有する1.5mL遠心チューブに分散させながら添加した。これを37℃1時間インキュベーターに静置した。その後、PBSで細胞を3回洗浄した後、さらにPBSを2mL添加した状態でオリンパス製の倒立型蛍光顕微鏡IX71により観察した。配列番号1を有するDNAアプタマーによる結果を、それぞれ図2及び3に示す。これらの蛍光標識DNAアプタマーが磁性粒子上のベバシズマブに特異的に結合し、それによってベバシズマブに対する良好な蛍光イメージング画像が得られることが明らかとなった。
実施例3 ベバシズマブに対する結合定数の測定
ベバシズマブ(100 mg/4 mL)溶液200 μLを水晶振動子マイクロバランス(AFFINIXQ8 株式会社アルバック社製)用センサーチップ装着カップに添加した。その後37℃で2時間静置し、その後、ベバシズマブ溶液をピペットを用いて慎重に除去し、さらにリン酸バッファー(Gibco DPBS )200μLで3回洗浄し、最後に200μLのリン酸バッファー液をカップに入れて、装置に装着した。センサーカップが装着されたら、これに攪拌機を設置し、撹拌を行いながらセンサースイッチをオンした。水晶振動子上の圧力変動が収まったところで、センサーカップ1から4にそれぞれアプタマー濃度が1.48 μM、1.98 μM、2.32 μM、2.91 μMになるようにアプタマーを添加し吸着曲線が安定するまで測定を行った。
ベバシズマブ(100 mg/4 mL)溶液200 μLを水晶振動子マイクロバランス(AFFINIXQ8 株式会社アルバック社製)用センサーチップ装着カップに添加した。その後37℃で2時間静置し、その後、ベバシズマブ溶液をピペットを用いて慎重に除去し、さらにリン酸バッファー(Gibco DPBS )200μLで3回洗浄し、最後に200μLのリン酸バッファー液をカップに入れて、装置に装着した。センサーカップが装着されたら、これに攪拌機を設置し、撹拌を行いながらセンサースイッチをオンした。水晶振動子上の圧力変動が収まったところで、センサーカップ1から4にそれぞれアプタマー濃度が1.48 μM、1.98 μM、2.32 μM、2.91 μMになるようにアプタマーを添加し吸着曲線が安定するまで測定を行った。
図4と図5にそれぞれ、ベバシズマブ固定化表面に対するアプタマー分子の吸着特性と速度解析法により算出された解離定数を示す。
本アプタマーのベバシズマブに対する解離定数はおよそ9.1×10−6 Mであり、強くベバシズマブに結合していることがわかる。
本アプタマーのベバシズマブに対する解離定数はおよそ9.1×10−6 Mであり、強くベバシズマブに結合していることがわかる。
本願発明のアプタマーは、分子標的医薬の血中濃度の測定等に極めて有用であり、医療分野での応用が期待される。
Claims (17)
- 分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマー。
- 分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマーのヌクレオチド配列において、1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有することを特徴とするDNAアプタマー。
- 分子標的医薬に対して特異的に結合するDNAアプタマーであって、
5’−P1−X−P2−3’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Xは、分子標的医薬に対して特異的に結合するヌクレオチド配列、又は当該配列から選択されるヌクレオチド配列において1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列であり、
P1及びP2は、PCR増幅のために導入された第1及び第2プライマー認識配列である
該DNAアプタマー。 - P1は、配列番号2で示される第1プライマー認識配列であり、及び
P2は、配列番号3で示される第2プライマー認識配列である、請求項3に記載のDNAアプタマー。 - 糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換から成る群より選択される、少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項1〜4のいずれか1に記載のDNAアプタマー。
- 5’末端又は3’末端に蛍光標識を有する、請求項1〜5のいずれか1に記載のDNAアプタマー。
- 前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン(GFP)、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750、ローダミン、6−カルボキシテトラメチルローダミン、TAMRA(登録商標)、フィコエリスリン(PE)、フィコシアニン(PC)、PC5、PC7、Cy色素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TexasRed、アロフィコシアニン(APC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA)、Marina Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、 Pacific Blue、 SPRD、 テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、R110、mC1B、CellTracker色素、CFSE、JC−1、PKH、DCFH−DA、DHR、FDA、Calcein AM、ニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、acridine(Acd)、dansyl(Dns)、7−ジメチルアミノクマリン−4−アセティックアシッド(DMACA)、5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホニックアシッド(EDANS)、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン9から選ばれる一種以上である、請求項6に記載のDNAアプタマー。
- 前記蛍光標識が量子ドットである請求項6記載のDNAアプタマー。
- 5’末端又は3’末端を蛍光標識された請求項1〜8のいずれか1に記載のDNAアプタマーが金属ナノ粒子表面に吸着されているDNAアプタマー。
- 前記金属ナノ粒子に用いられる金属が金、銀、銅、鉄または珪素である請求項9記載のDNAアプタマー。
- 分子標的医薬がベバシズマブであり、分子標的医薬に特異的に結合する配列が配列番号1で表される請求項1〜10記載のアプタマー。
- 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用組成物。
- 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用キット。
- 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを用いることを特徴とする、分子標的医薬の検出方法。
- 前記DNAアプタマーを血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とDNAアプタマーとの結合による応答を観測することによって分子標的医薬の存在を検出する工程を含む、請求項14に記載の検出方法。
- 前記応答が、蛍光応答である、請求項15に記載の検出方法。
- 前記応答が、ラマン散乱応答である、請求項15に記載の検出方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015233842 | 2015-11-30 | ||
JP2015233842 | 2015-11-30 | ||
JP2015240517 | 2015-12-09 | ||
JP2015240517 | 2015-12-09 | ||
PCT/JP2016/085440 WO2017094733A1 (ja) | 2015-11-30 | 2016-11-29 | 分子標的医薬に結合するdnaアプタマー及びそれを用いる分子標的医薬の検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017094733A1 true JPWO2017094733A1 (ja) | 2018-09-13 |
Family
ID=58796871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017554119A Pending JPWO2017094733A1 (ja) | 2015-11-30 | 2016-11-29 | 分子標的医薬に結合するdnaアプタマー及びそれを用いる分子標的医薬の検出方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10640772B2 (ja) |
EP (1) | EP3385382A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2017094733A1 (ja) |
TW (1) | TW201732040A (ja) |
WO (1) | WO2017094733A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6793917B2 (ja) * | 2016-08-15 | 2020-12-02 | 国立大学法人東京農工大学 | アプタマー及び抗体検出方法 |
WO2019094968A1 (en) * | 2017-11-13 | 2019-05-16 | Base Pair Biotechnologies, Inc. | Detection of tenofovir |
CN113521295B (zh) * | 2020-04-21 | 2022-07-01 | 湖南大学 | 一种负载核酸适体药物偶联物的dna八面体结构 |
CN114086260A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-02-25 | 上海药明康德新药开发有限公司 | 利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,3,4-噁二唑类化合物的方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69128350T2 (de) | 1990-06-11 | 1998-03-26 | Nexstar Pharmaceuticals Inc | Nukleinsäureliganden |
US20110076279A1 (en) | 2006-10-20 | 2011-03-31 | Schering Corporation | Fully human anti-vegf antibodies and methods of using |
US8501912B2 (en) * | 2007-12-03 | 2013-08-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Filipil compositions and methods for treating cancer |
DE102008045696A1 (de) | 2008-09-04 | 2010-03-11 | Drk Blutspendedienst West Ggmbh | Granulozyten HNA-3a/b-Antigen |
US8883832B2 (en) * | 2009-07-06 | 2014-11-11 | Aerpio Therapeutics Inc. | Compounds, compositions, and methods for preventing metastasis of cancer cells |
JP5812478B2 (ja) * | 2011-08-12 | 2015-11-11 | 国立大学法人群馬大学 | 抗癌剤結合性核酸アプタマー及びその利用 |
JP2014217311A (ja) * | 2013-05-08 | 2014-11-20 | 日産化学工業株式会社 | がん細胞に結合するdnaアプタマー |
JP2016021883A (ja) * | 2014-07-17 | 2016-02-08 | 日産化学工業株式会社 | ヒト大腸癌細胞Colo205に特異的に結合する核酸 |
US10420820B2 (en) * | 2014-09-29 | 2019-09-24 | Counterpoint Biomedia LLC | Targeting of pharmaceutical agents to pathologic areas using bifunctional fusion polypeptides |
JP6041399B2 (ja) * | 2014-11-12 | 2016-12-07 | Necソリューションイノベータ株式会社 | げっ歯類由来IgG抗体に結合性を有する核酸分子、結合剤、検出試薬および検出キット |
-
2016
- 2016-11-29 EP EP16870670.3A patent/EP3385382A4/en not_active Withdrawn
- 2016-11-29 WO PCT/JP2016/085440 patent/WO2017094733A1/ja active Application Filing
- 2016-11-29 JP JP2017554119A patent/JPWO2017094733A1/ja active Pending
- 2016-11-29 US US15/779,753 patent/US10640772B2/en active Active
- 2016-11-30 TW TW105139490A patent/TW201732040A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10640772B2 (en) | 2020-05-05 |
US20190284560A1 (en) | 2019-09-19 |
WO2017094733A1 (ja) | 2017-06-08 |
EP3385382A1 (en) | 2018-10-10 |
EP3385382A4 (en) | 2019-05-29 |
TW201732040A (zh) | 2017-09-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2666989C2 (ru) | Мультиплексные анализы на основе аптамеров | |
Medley et al. | Aptamer-conjugated nanoparticles for cancer cell detection | |
Fang et al. | Aptamers generated from cell-SELEX for molecular medicine: a chemical biology approach | |
WO2017094733A1 (ja) | 分子標的医薬に結合するdnaアプタマー及びそれを用いる分子標的医薬の検出方法 | |
Zhou et al. | The potential of aptamers for cancer research | |
Tan et al. | Single-walled carbon nanotubes (SWCNTs)-assisted cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment (cell-SELEX) for improving screening efficiency | |
US20160187342A1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to EN2 (Engrailed-2) and Use Thereof | |
WO2019149115A1 (zh) | 核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体或肿瘤检测中的应用 | |
Liu et al. | Plasmonically Enhanced CRISPR/Cas13a‐Based Bioassay for Amplification‐Free Detection of Cancer‐Associated RNA | |
Li et al. | PD-L1 aptamer isolation via Modular-SELEX and its applications in cancer cell detection and tumor tissue section imaging | |
WO2016158851A1 (ja) | 血管内皮増殖因子受容体に結合する核酸アプタマー | |
Jia et al. | CRISPR-powered biosensing platform for quantitative detection of alpha-fetoprotein by a personal glucose meter | |
Lee et al. | Optical coding of fusion genes using multicolor quantum dots for prostate cancer diagnosis | |
JP5528643B2 (ja) | ヒト心筋由来トロポニンiに特異的にかつ速やかに結合できる組み換えタンパク質 | |
JP2023509902A (ja) | 癌治療用免疫抗癌組成物 | |
Feng et al. | Chiral interaction is a decisive factor to replace d-DNA with l-DNA aptamers | |
JP2019523404A (ja) | 全vegf−aのレベルを検出するための方法及び手段 | |
JP2014217311A (ja) | がん細胞に結合するdnaアプタマー | |
JP2015019606A (ja) | 非小細胞肺癌に特異的に結合する核酸 | |
WO2016129531A1 (ja) | 非小細胞肺がん細胞(h1975)に結合するdnaアプタマー | |
JP2015019607A (ja) | マウス大腸癌Colon26に特異的に結合する核酸 | |
JP2016021883A (ja) | ヒト大腸癌細胞Colo205に特異的に結合する核酸 | |
JP6774047B2 (ja) | 複合体、試料中の対象核酸の検出方法及びキット | |
JP6869587B2 (ja) | マイクロrnaプロセシング活性の検出方法及びその応用 | |
JP2010041951A (ja) | 標的分子の検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191107 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201201 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210622 |