JP6041399B2 - げっ歯類由来IgG抗体に結合性を有する核酸分子、結合剤、検出試薬および検出キット - Google Patents
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Description
前記本発明の核酸分子は、前述の通り、げっ歯類由来IgG抗体に対し特異的結合性を有し、解離定数が、1μM以下であることを特徴とする。前記解離定数は、好ましくは200nM以下、より好ましくは100nM以下、さらに好ましくは、10nM以下である。本発明において、げっ歯類とは、哺乳網ネズミ目(げっ歯目)のことをいう。げっ歯類としては、例えば、マウス、ラット等があげられる。本発明の核酸分子は、マウス由来IgGに前記解離定数で特異的に結合する核酸分子が好ましい。同様に、本発明の核酸分子は、ラット由来IgGに前記解離定数で特異的に結合する核酸分子が好ましい。
前記N1のヌクレオチド残基数n1は、特に制限されないが、例えば、0〜40残基の範囲であり、好ましくは、1〜25残基の範囲であり、より好ましくは、4〜10残基の範囲である。
前記N2のヌクレオチド残基数n2は、特に制限されないが、例えば、1〜40残基の範囲であり、好ましくは、2〜20残基の範囲であり、より好ましくは、2〜8残基の範囲である。
前記N3のヌクレオチド残基数n3は、特に制限されないが、例えば、1〜50残基の範囲であり、好ましくは、1〜30残基の範囲であり、より好ましくは、1〜15残基の範囲である。
前記N4のヌクレオチド残基数n4は、特に制限されないが、例えば、1〜40残基の範囲であり、好ましくは、1〜20残基の範囲であり、より好ましくは、1〜10残基の範囲である。
前記N5のヌクレオチド残基数n5は、特に制限されないが、例えば、1〜50残基の範囲であり、好ましくは、1〜30残基の範囲であり、より好ましくは、1〜15残基の範囲である。
前記N6のヌクレオチド残基数n6は、特に制限されないが、例えば、1〜40残基の範囲であり、好ましくは、1〜20残基の範囲であり、より好ましくは、1〜10残基の範囲である。
前記N7のヌクレオチド残基数n7は、特に制限されないが、例えば、1〜50残基の範囲であり、好ましくは、1〜30残基の範囲であり、より好ましくは、1〜10残基の範囲である。
前記N8のヌクレオチド残基数n8は、特に制限されないが、例えば、1〜40残基の範囲であり、好ましくは、2〜20残基の範囲であり、より好ましくは、2〜8残基の範囲である。
以上のヌクレオチド残基数n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7およびn8は、特に制限されないが、以下の等式および不等式を満たすことが好ましい。
n2=n8、n4=n6、(n3+n7)>n5
前記式(I)において、LNAヌクレオチドモノマーの数は、特に制限されないが、例えば、1〜150残基の範囲であり、好ましくは、1〜100残基の範囲であり、より好ましくは、1〜10残基の範囲である。
また、前記式(I)に含まれるLNAの長さは、特に制限されないが、例えば、1〜10残基の範囲であり、好ましくは2残基である。前記式(I)において、DNAを構成するデオキシリボヌクレオチドモノマーの数は、特に制限されないが、例えば、1〜150残基の範囲であり、好ましくは、1〜100残基の範囲であり、より好ましくは、1〜30残基の範囲である。また、前記(I)に含まれるDNAの長さは、特に制限されないが、例えば、1〜30残基の範囲であり、好ましくは、3〜10残基の範囲であり、より好ましくは、4残基の範囲である。
配列番号1
dAdAdAdAdA-CGCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCG-dT
配列番号2
dAdAdAdAdA-GCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGC-dT
配列番号3
dAdAdAdAdA-dGdCGCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCdGdC
配列番号4
dAdAdAdAdA-dGdCdGdCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAdGdCdGdC
配列番号5
dAdAdAdAdA-GCGCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCGC
配列番号6
dAdAdAdAdA-dGdCdGdCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAdGdCdGdC
配列番号7
dAdAdAdAdA-CGCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCG-dT
本発明の核酸分子は、SELEX法に従って、またこの方法に準じた方法で、RNAプールと標的物質とを反応させて得られるRNAプール−標的物質複合体を回収した後、この複合体から、この複合体の形成に関与したRNAプールのみを回収して、製造することが可能である。
本発明の核酸分子は、上記の通りに得ることが出来るが、その塩基配列に基づいた二次構造予測の手法を用いた結果を参照して、得た核酸分子の一部を改変されたものであってもよい。この二次構造予測としては、核酸分子の二次構造の候補を探索し、この探索された二次構造候補のうち、エネルギー的に安定な二次構造を予測する方法であれば、特に制約はない。例えば、核酸分子の塩基配列を、ワトソン・クリック型等の塩基対を構成するステム領域と、このステム領域以外の塩基で構成されるループ構造等の一本鎖領域とに分割して得た二次構造候補のエネルギー関数を最小化することに基づく二次構造予測であってもよい。
本発明の核酸分子は、上記の通り、マウス等のげっ歯類由来のIgG抗体に結合性を有することを特徴とするものである。従って、本発明の核酸分子の用途としては、マウス等のげっ歯類由来のIgG抗体への結合性を利用する用途であれば特に制約はなく、SDS−PAGE(SDSポリアクリルアミド電気泳動法)法に準じて行われる泳動対象物の検出用として、ELISA法(酵素免疫測定法;Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)の測定の対象物若しくはこの対象物を含む複合体の検出用として、ノースウエスタン法に準じて行われる泳動対象物の検出用として、又はマウス等のげっ歯類由来のIgG抗体若しくはこの抗体を利用した精製用として用いられてもよい。
本発明の核酸分子の応用例としては、得た核酸分子を含有する試薬、この試薬を有するキット等、マウス等のげっ歯類由来のIgG抗体への結合性を利用したものが挙げられる。例えば、上記の本発明の核酸分子を含有する試薬を用いて、マウス等のげっ歯類由来のIgG抗体への結合を検出する検出キットとしてもよい。このようなキットの測定対象物としては、溶液、懸濁液のような液体系であってもよく、培養細胞や組織切片等、固形物であってもよい。
試料中の検出対象物を抗原とし、前記検出対象物と抗体とを反応させて免疫沈降させる免疫沈降工程と、
前記免疫沈降物を変性させて前記試料の他の成分から分離する分離工程と、
前記分離工程で分離した免疫沈降物の前記抗原に抗体を反応させる第1反応工程と、
前記抗体反応工程の抗体に対し特異的に結合する結合剤を反応させる第2反応工程とを有し、
前記第2反応工程の前記結合剤として、前記本発明の結合剤を用いることを特徴とする。
[実施例2]
(文献)
Yoshihito Yoshida*, Nobuya Sakai*, Hiromi Masuda,
Makio Furuichi, Fumiko Nishikawa, Satoshi Nishikawa,
Hiroshi Mizuno and Iwao Waga:
“Rabbit antibody detection with RNA aptamers”
Analytical Biochemistry, Vol. 375, pp. 217-222, (2008)
[実施例3]
[実施例5]
[比較例1]
Claims (13)
- げっ歯類由来IgG抗体に対し特異的結合性を有し、解離定数が1μM以下である一本鎖の核酸分子であり、下記一般式(I)で表され、
前記核酸分子は、ステム長さ3以上のステム領域を、前記核酸分子の末端に有し、
前記ステム長さ3以上のステム領域において、5’末端側の鎖における3’末端の塩基の一本鎖領域側に隣接する塩基が、アデニン以外の塩基であり、かつ、
前記ステム長さ3以上のステム領域は、グアニン残基およびシトシン残基のみから構成されていることを特徴とする核酸分子。
前記N3、N5およびN7は、それぞれループ構造であり、前記N1は、ループ構造形成可能であり、前記N2およびN8は、相互に水素結合してステム構造を形成し、前記N4およびN6は、相互に水素結合してステム構造を形成しており、
前記式(I)において、
前記一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基の数は、15〜150残基の範囲であり、
前記N1のヌクレオチド残基数n1は、5残基であり、
前記N2のヌクレオチド残基数n2は、3〜40残基の範囲であり、
前記N3のヌクレオチド残基数n3は、10残基であり、
前記N4のヌクレオチド残基数n4は、3〜40残基の範囲であり、
前記N5のヌクレオチド残基数n5は、8残基であり、
前記N6のヌクレオチド残基数n6は、3〜40残基の範囲であり、
前記N7のヌクレオチド残基数n7は、1残基であり、
前記N8のヌクレオチド残基数n8は、3〜40残基の範囲であり、
前記N 1 のヌクレオチド配列は、5’側から3’側に向かってdAdAdAdAdAであり、
前記N 3 のヌクレオチド配列は、5’側から3’側に向かってGAAGAGAAGAであり、
前記N 5 のヌクレオチド配列は、5’側から3’側に向かってGAAGGAGAであり、
前記N 7 のヌクレオチドは、Aである。 - 前記式(I)において、前記ヌクレオチド残基の一部がメチル化ヌクレオチド残基であることを特徴とする請求項1記載の核酸分子。
- RNA分子であることを特徴とする請求項1又は2記載の核酸分子。
- 前記式(I)において、前記ヌクレオチド残基の一部がLNAおよびDNAの少なくとも一方であることを特徴とする請求項3記載の核酸分子。
- 前記式(I)において、5’末端にラベル化合物が結合していることを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ラベル化合物が、ビオチンであることを特徴とする請求項5記載の核酸分子。
- 前記げっ歯類由来IgGが、マウス由来IgGであることを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記マウス由来IgG抗体が、サブタイプ1のIgG抗体、サブタイプ2aのIgG抗体およびサブタイプ3のIgG抗体のうち少なくとも一つであることを特徴とする請求項7記載の核酸分子。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とするげっ歯類由来IgG抗体に対する結合剤。
- 請求項9記載の結合剤を含むことを特徴とするげっ歯類IgG由来抗体の検出試薬。
- 請求項10記載の検出試薬を含むことを特徴とするげっ歯類由来IgG抗体の検出キット。
- 試料中の検出対象物を抗原とし、前記検出対象物と抗体とを反応させて免疫沈降させる免疫沈降工程と、
前記免疫沈降物を変性させて前記試料の他の成分から分離する分離工程と、
前記分離工程で分離した免疫沈降物の前記抗原に抗体を反応させる第1反応工程と、
前記第1反応工程の抗体に対し特異的に結合する結合剤を反応させる第2反応工程とを有し、
前記第2反応工程の前記結合剤として、請求項9記載の結合剤を用いることを特徴とする検出方法。 - 前記分離工程が、SDS−PAGEであり、前記第1反応工程および前記第2反応工程がウエスタンブロット法であることを特徴とする請求項12記載の検出方法。
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