DE2724486C2 - Heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium und Mittel zu dessen Durchführung - Google Patents

Description

Antikörper zu einer Agglutination der roten Blutkörperchen. Freies pharmakologisches Material wird, wenn es vorhanden ist, an den Antikörper gebunden. Da der Antikörper verbraucht ist, wird die Hämagglutinalion verhindert, und die roten Blutkörperchen bilden eine Perle am oberen Ende der kegelförmigen Vertiefung. Die Empfindlichkeit der Hämagglutinationshemmung kann in einem weiten Bereich eingestellt werden, da die 5 Hemmung der Agglutination abhängt von der vorhandenen Menge an Antikörper. Obwohl angenommen wird, j$ daß dieses Verfahren zuverlässige Ergebnisse ergibt, besitzt es den Nachteil, daß die Analyse bis zur Vervollstan-

K digung verhältnismäßig lange Zeit erfordert und die Interpretation der Ergebnisse weitgehend subjektiv ist.

% Bei der Enzym-vervielfachten immunologischen Bestimmung wird das pharmakologische Material mit einem

*■·' aktiven Enzym (z. B. Lysozym) markiert, das imstande ist, die Zellwand von Bakterien aufzubrechen. Moleküle

10 des pharmakologischen Materials, die an die Oberfläche von Lysozym gebunden sind, stören die enzymatische ti Aktivität nicht. Wenn die Antikörper an diese markierten Materialien gebunden werden, wird das Substrat Ftc-

risch daran gehindert, die aktiven Stellen des Enzyms zu erreichen, nicht-markiertes Material verdräng! das enzym-markierte Material, was wiederum zu einer Erhöhung der Enzymaktivität führt. Durch Messung der optischen Dichten zu Beginn und nach Abschluß der Analyse kann man die Menge an nicht-markiertem pharmako-15 logischen Material in der Probe ungefähr abschätzen. Durch Verlängerung der Zeit, in der das Enzym einwirken \: kann, kann die Empfindiichkeit der Bestimmung erhöht werden. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt in der ver-

, hältnismäßig geringen Empfindlichkeit, den verhältnismäßig hohen Reagenskosten und der Instabilität der

ν enzymztischen Reagentien.

,; Obwohl jedes der obenerwähnten spezifischen Bindungsverfahren auf bestimmten Gebieten für die Bestim-

I 20 mung kleiner Mengen von pharmakologischen Materialien Vorteile besitzt, geht aus der obigen Zusammenfas-I sung der bekannten Verfahren hervor, daß weiterhin Bedarf besteht an einem einfacheren deu.tigen Verfahren.

1 Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfind „ng, ein bequemes, spezifisches Bindungsverfahren zus Bestimmung

S kleiner Mengen unbekannter Substanzen sowie dafür geeignete Reagentien zu entwickeln, wobei das Verfahren

sehr empfindlich und sehr spezifisch sein soll und keine radioaktiven Materialien erfordern.

..3 25 Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 dadurch gelöst, daß % man als Markierungssubstanz ein Metallatom oder -atome verwendet.

I Wie unten ausführlicher diskutie, ι wird, kann das Reaktionssystem die Form irgendeines der bekannten ObIi-

H chen heterogenen Verfahren annehmen, wie sie zur Zeit angewandt werden für radioimmunologische Beslim-

I mungen und heterogene enzymimmunologische Bestimmungen.

■ 30 Das spezifische Bindungsreagens bzw. Prüfmittel kann unterschiedliche Formen besitzen. Im allgemeinen umfassen solche Prüfmittel drei Grundbestandteile und zwar:

% 1. den nachzuweisenden Liganden,

2. einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und
;.' 35 3. einen markierten Bestandteil, der üblicherweise eine markierte Form

\i a) des Liganden,

R b) eines spezifisch bindenden Analogen des Liganden oder

;*' c) des spezifischen Bindungspartners ist.

Die Bestandteile der Bindungsreaktion werden gleichzeitig oder nacheinander zusammengegeben und innerhalb einer angemessenen Inkubationsz3»t oder -zeiten wird der markierte Bestandteil an seine entsprechenden konkurrierenden Bindungspartner gebunden, so daß das Ausmaß der Bindung, d. h. das Verhältnis der Menge : von markiertem Bestandteil, der an einen Bindungspartner gebunden ist, zu dem nicht-gebundenen e.ne Funk-

45 tion ist der Menge des vorhandenen Liganden. Im folgenden sind einige unterschiedliche Bindangsreafetionsschemata angegeben, die zur Durchführung des heterogenen Bindungsverfahrens angewandt werden können, in den folgenden Diagrammen werden die folgenden Symbole und Abkürzungen verwendet:

■; ⁵⁰ Symbol Definition

L nachzuweisender Ligand

! (T) Lißand oder spezifisch bindendes Analoges dazu

'-;.'· ⁵⁵ B Bindungspartner für den Liganden

'{■ * Markierungssubstanz, d. h. Reagens

,! ins. unlösliche Phase

e, > Inkubationszeit und anschließende Trennung

fe ⁶⁰ (lim) limitiert, in einer Menge vorhanden, die geringer ist als diejenige, die von den gesamten

jjfl bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der angewandten Inkubationszeil

$\ gebunden werden kann, d. h. der Bestandteil, um den die anderen Bestandteile in Konkurrenz

jl·' treten, um mit ihm Bindungen einzugehen

Ej (exe) Überschuß; in einer Menge vorhanden, die größer ist als diejenige, die imstande ist, von den

fj ^ό gesamt-verfügbaren bindenden Stellen unter den Reaktionsbedingungen während der

P angewandten Inkubationszeit gebunden zu werden

Heterogene Bindungsroaklioncn

I. Konkurrenzbindungsreaktionen

u) L + (E)* + B (lim) ► + unlöslichmachendes Mittel fur B oder (E)* (Biochem. J. 88,: 137 (1963)

und US-PS 38 39 153)

b) L + (E)* + «ns. B (lim) ►

(US-PS 35 05 OR 35 55 143, 36 46 346 und 36 54 090)

c) L + B* + ins. (E) (lim) >

(US-PS 365409D)

d) L + ins. (E) + B* (lim) >

(US-PS 3O0 752)

2. Aufeinanderfolgende Sättigungsverfahren

a) L + B (exe) » + (E)* (exe) + unlöslichmachendes Mittel für B oder (E)*

b) L + ins. B (exe) > + (E)* (exe)

(J Immunol. 209, 129 (1972£und US-PS Nr. 37 20 760)

c) L t B" (exe) > + ins. (LJ (exe)

(Nature 219, 186(1968)

3. »Sandwichverfahren

L + ins. B (exe) > + B* (exe)

(US-PS 37 20 760)

~~ 4. Fcstphasen-Verdünnungsverfahren

jj L + (E)* + ins. (unspezifisch) * + B (lim) >

(US-PS 36 59 104)

Für eine nähere Diskussion der bei üblichen heterogenen Bestimmungssystemen wichtigen Parameter, wie eine detailliertere Beschreibung der Bestimmungsanordnungen und alternative Trennverfahren, wird verwiesen auf Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Ed. Odell und Daughaday (J. B. Lippincott Co., Philadelphia 1972).

Andere manipulative Schemata, umfassend andere Reihenfolgen des Zusammengebens und andere Bindungsreaktionsanordnungen, können angewandt werden, um heterogene spezifische Bindungsbestimmungen durchzuführen.

Für eine nähere Beschreibung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und Prüfmittels wird im folgenden ein System beschrieben, bei dem ein Hapten bestimmt wird, indem man ein Bindemittel für ein derartiges Hapten und eine mit einem Metallatom markierte Form des Haptens (»Metailhapten«) zur Verfugung stellt, so daß Bindungsstellen an diesem Bindemittel durch das Metailhapten besetzt sind, wodurch die spezifische Bindungsreaktion eintreten kann bei Zugabe zu einer Probe, in der dieses Hapten vermutet wird, Abtrennung des nicht-gebundenen Metallhaptens und Bestimmung der Konzentration des darin enthaltenen Metallatoms auf übliche Weise, z. B. durch Atomspektrometrie. Die folgenden Absätze beziehen sich auf dieses Verfahren, das beispielhaft angegeben ist.

Die Bindungsstellen können entweder zu 95 bis 100% besetzt sein, wobei nur eine kleine Menge der besetzten Bindungsslellen im Gleichgewichtszustand ersetzt wird, oder sie können teilweise besetzt sein, wobei das markierte und das nicht-markierte Hapten, sowohl um die Bindungsstellen, die vorher durch das markierte Hapten besetzt waren, als auch um die größere Anzahl von freien Bindungsstellen konkurrieren.

In diesem Falle findet der Ersatz bzw. die Verdrängung bei einer geringeren Konzentration des Gemisches statt, und das kann spezielle Trennungsverfahren erforderlich machen.

In einem Medium, das nur Metailhapten und Bindemittel enthält, sind die Bindungsstellen im Gleichgewicht durch das Metailhapten besetzt. Nach Zugabe einer kleinen Menge Hapten zu dem Medium konkurrieren das Hapten und das Metailhapten um die verfügbaren Bindungsstellen. Bei der Bestimmung des Metallgehalts in der abgetrennten Lösung vor der Zugabe des Haptens und nach der Zugabe des Flaptens kann die relative Konzentration des Metalls im Gleichgewichtszustand gemessen werden. Bei Anwendung bekannter Haptenmengen kann die Wirkung beim Gleichgewicht leicht aus Messungen des Metallgehalts des Systems, Bindemittel-Metallhapten oder des freien Metailhapten oder beider Komponenten bestimmt werden. Daher ist es bei dem Verfahren erforderlich, zunächst den Metallgehalt in geeichten Standardlösungen, enthaltend Metallhapten, zu bestimmen und dann die abgetrennte Lösung, enthaltend das Hapten, zu untersuchen. Wenn einmal das Metall in den Standards bestimmt worden ist, kann das Verfahren automatisiert werden, um eine spezifische und genaue Analyse bei einer großen Anzahl von Proben zu ermöglichen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt, was auch bevorzugt ist. Für bestimmte Systeme ist eine Inkubation bei 36°C erforderlich, so daß derTemperaturbereich allgemein zwischen 0 und 50⁰C liegt. Der Fachmann weiß, wie die geeignete Temperatur in Übereinstimmung mit dem jeweiligen spezifischen System, an dem die Bestimmung durchgeführt werden soll, zu wählen ist, wobei Faktoren, wie die Stabilität des Metallhaptens, das f.rfordernis einer Inkubation usw., berücksichtigt werden müssen.

Die Abtrennung der flüssigen Phase von der festen kann nach irgendeinem bekannten Verfahren, wie Filtration, Zenlrifugation usw., durchgeführt werden. Diese Stufe ist auch bei radioimmunologischen Bestimmungen erforderlich, und die verschiedenen dort angewandten Mittel können auch erfolgreich für das erfindungsgemäße

Verfahren angewandt werden.

Das Verfahren kann sehr bequem durchgeführt werden und überwindet die verschiedenen Nachteile des radioimmunologischen Bestimmungsverfahrens. Gleichzeitig ist das Verfahren sehr spezifisch und empfindlich, und man kann im wesentlichen die gleiche Genauigkeit wie bei radioimmunologischen Bestimmungen erreichen.

Einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die leichte Analyse einer Verbindung durch Bestimmung der Metallkomponente. Es sind verschiedene einfache Verfahren zur Metallbestimmung bekannt, wie EmH-sions-, Absorptions- und Fluoreszens-Spektrometrie, verschiedene elektrochemische Verfahren und Neutronenaktivierung. Insbesondere wird üblicherweise die Bestimmung der Atomabsorption von Metallen angewandt, die jetzt als sehr empfindliches und genaues Verfahren bekannt ist. Eine Tatsache, die die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens bestätigt, sogar zur Bestimmung sehr geringer Mengen unbekannter Verbindungen Tür einen weiten Anwendungsbereich. Die Empfindlichkeit der Atomabsorptionsspektrometrie wurde kürzlich in einer Zusammenfassung diskutiert (Atomic Absorption Newsletter 11, 37; 1972). Die Einführung von fiammlosen Verfahren (z. B. Graphitkammer, durch die der elektrische Strom läuft,Trocknen und Atomisieren der Probe bei Temperaturen bis zu 370O⁰C), hat die Empfindlichkeit um Größenordnungen erhöht. Daher können besonders zuverlässige Ergebnisse erzielt werden, selbst bei sehr kleinen Anteilen an der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Substanz. Zum Beispiel liegt bei der Bestimmung von Co die Nachweisgrenze mit einem üblichen Atomabsorptionsgerät bei 0,01 μΕ/ιηΙ, während mit einer Graphitkammer die Nachweisgrenze 0,00004 _:xg/m! beträgt. In der folgenden Tabeüe sind Nachweisgrenzen bei der AtQmahsnrntinn für einige Elemente angegeben, die mit der Graphitkammer bestimmt wurden.

Tabelle 1	Nachweis	Element	Nachweis
Klement	grenze		grenze
	0,00001	Wismut	0,0001
Mangan	0,0000025	Cadmium	0,000001
Silber	0,00008	Kobalt	0,00004
Silicium	0,00003	Eisen	0,00003
Aluminium	0,0000006	Nickel	0,0001
Zink	0,00008	Antimon	0,0002
Gold	0,00006	Thallium	0,00014
Blei

Diese Tabelle zeigt nur einen Teil der Elemente und ist hier nur angegeben, um die sehr niedrigen Nachweisgrenzen zu zeigen, die mit einem derartigen Atomabsorptionsgerät erzielt werden können. Damit kann die hohe Nachweisempfindlichkeit durch Atomabsorptionsspektrophotometer dieses Verfahren in den Bereich der Empfindlichkeitsgrenzen der radioimmunologischen Bestimmungsverfahren bringen, ohne daß die Nachteile auftreten, die mit der Anwendung radioaktiv-markierter Komponenten verbunden sind. Obwohl im Zusammenhang der vorliegenden Beschreibung die Bestimmung des Metalls mit Hilfe von Atomabsorptions- oder Emissionsmessungen angegeben ist, ist es selbstverständlich, daß irgendein anderes bekanntes Verfahren zur Metallbestimmung mit dem gleichen Erfolg angewandt werden kann. So erwähnt z. B. ein vor kurzem erschienener Bericht über die Anwendung der Mikrowellen-Erregungs-Emissions-Spektrometrie (Kawaguchi und Valee, Anal. Chemistry, 47, 1029-1034,1975) die Bestimmung von Metallen in Metallenzymen im Bereich von 10 " bis 10"^l3g Metall absolut genommen. Es kann angenommen werden, daß Fortschritte bei der anodischen »Abstreifw-Voltametrie ein anderes, einfaches und billiges Verfahren für Konzentrationsmessungen von Metall in den Systemen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auftreten, ergeben könnte. Die Bestimmung des Metallgehalts durch Atomabsorptions- oder Emissionsspektrophotometrie ist zur Zeit üblich und kann leicht selbst in kleinen Labors durchgeführt werden. Man kann auch die Möglichkeit in Betracht ziehen, ein elektrochemisches Abscheidungsverfahren auf einem Metalldraht anzuwenden, wie z. B. einem Tantaldraht, und die Menge des Materials zu bestimmen durch Einführung einer Probe in das Atomspektrophotometer.

Die jüngste Entwicklung von Mehrkanal-Atomabsorptions-Spektrometern (Analytica Chim. Acta, 87, 301 [1976]), die imstande sind bis zu neun Elementen gleichzeitig zu analysieren, erweitert die möglichen Anwendungen der Metallhaptene durch die Entwicklung von Multitestsystemen.

Obwohl alle immunochemisch-aktiven Substanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, ist es besonders geeignet zur Bestimmung von Substanzen in sehr kleinen Mengen, da eine sehr hohe Empfindlichkeit erreicht werden kann.

Die Durchführung einer Bestimmung erfordert das Hapten, das Metallhapten und das Bindemittel neben einem Gerät für die Metallbestimmung, wie einem Atomabsorptionsspektrophotometer. Das Metallhapten und das Bindemittel (bindende Substanz) sind entweder in fester Form oder in Lösung verfügbar. Wenn sie in fester Form vorliegen, kann irgendein geeignetes Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch

Vitamine, wie Carothin, Riboflavin, Thiamin, Niacin, Ascorbinsäure, Tocopherol, Phytyl-l,4-naphthochi-

non usw.;

Aminosäuren und Polypeptide;

Zucker, einschließlich Saccharide und Polysaccharide;

Tranquilizer, wie Meprobamat, Valium, Oxazepam, Phenotiazine usw.

Neben den obenangegebenen Haptenen können andere vermischte Verbindungen, wie Kokain, Prostaglandin, Antibiotika, wie Penizillin, Chloromycetin, Actinomycetin und Nukleinsäuren und Nukleotide; lnsekticide, Fungicide, Bakterieide und Nematocide, wie Malathion, Carbamate usw. ebenfalls mit Hilfe des erfindungsgemiißen Verfahrens bestimmt werden. Ganz allgemein können Antigene, Haptene und ihre Antikörper, Hormone, Vitamine, pharmakologische Materialien, wie Arzneimittel und Drogen, Metaboliten und ihre Rezeptoren und bindende Materialien mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden.

Das Bindemittel bzw. die bindende Substanz ist im allgemeinen ein hochmolekulares Material, das Stellen besitzt, die feine Strukturen erkennen lassen. Die interessantesten Makromoleküle sind Proteine und Nukleinsäuren, die sich in Zellmembranen, Blut und anderen biologischen Flüssigkeiten finden. Diese Verbindungen umfassen Enzyme, Antikörper, Ribonukleinsäure und Deoxyribonukleinsäure. Die günstigste Gruppe von Proteinen zur Anwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Antikörper. Antikörper werden gebildet durch Einführung einer immunogenen Substanz in den Blutstrom eines Lebewesens. Das Ergebnis der Einführung der immunogenen Substanz für ein Antigen, ist die Bildung von Antikörpern, die so wirken, daß sie das Antigen überziehen und entgiften oder aus der Lösung ausfällen. Das Protein bildet einen Überzug, der so geometrisch angeordnet ist, daß das Antigen in die räumliche Anordnung des Proteins paßt. Das zu bestimmende Material ist auf irgendeine übliche geeignete Weise an das Protein gebunden und das modifizierte Protein in den Blutsirom eingeführt. Die Antikörper, die sich bilden, umfassen Gruppen von Antikörpern, die so geformt sind, daß sie mit dem an das Protein gebundenen Hapten übereinstimmen.

Bevorzugte Bindemittel sind Verbindungen auf der Basis von Protein, die leicht verfügbar sind. Besonders geeignet sind unlösliche Bindemittel, die das gesamte erfindungsgemäße Verfahren erleichtern. In diesem Falle bestimmt die in dem System vorhandene Haptenmenge die Menge an Metallhapten, das an den Stellen des Bindemittels gebunden wird. Lösliche Bindemittel (Antikörper) werden durch die Bindung an einen unlöslichen Träger, wie Cellulose-Glasperlen, synthetische Polymere usw. unlöslich gemacht.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch Fälle, in denen das Hapten unlöslich gemacht worden ist und eine gewisse Löslichkeit des Bindemittels vorhanden ist, was zu einem Metall-Bindemittel-Derivat führt. In diesem Falle ermöglicht die Verteilung des Metall-Bindemittels zwischen dem unlöslich gemachten Hapten und der Lösung die Messung des nicht-markierten Bindemittels.

Eine andere Abwandlung sind Fälle, bei denen ein Teil des Haptens zusammen mit dem Bindemittel, wie im vorigen Falle, löslich ist und dadurch das System Hapten, Metall-Bindemittel und einen Teil ungelöstes Hapten umfaßt. Die Verteilung des Metall-Bindemittels zwischen der flüssigen und festen Phase ermöglicht die genaue Bestimmung des Haptens in Lösung. Es ist auch möglich, daß die Antikörper an verschiedene Träger gebunden sein können, wie Polyacrylamide, Copolymere aus Vinylacetate und Acrylsäure, Polyvinylester, modifizierte Cellulose usw. Der Vorteil der Anwendung eines derartigen Trägers besteht darin, daß auf diese Weise der Antikörper leicht von der Lösung abgetrennt und die klare Lösung leicht analysiert werden kann. Eine Beschreibung und verschiedene Beispiele für die Kupplung von Metallhaptenen an Protein sind z. B. in Methods of Immunology and Immunochemistry, Band 1 (Chase and Williams, Academic Press, 1967) angegeben. Die Verfahren sind dort beschrieben für die Herstellung von Konjugaten für die immunisation. Sie können jedoch auch angewandt werden zur Herstellung von Kupplungsprodukten aus Metallhaptenen und Proteinen.

Ein grundlegendes Erfordernis für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Metallhaptene. Aufgrund der wichtigen Rolle, die diese Komponente für das erfindungsgemäße Verfahren spielt, wird im folgenden eine etwas ausführlichere Erklärung der Metall-Hapten-Struktur und metallorganischen Derivate und der Prinzipien ihrer allgemeinen Herstellung angegeben. Um eine bessere Definition für ein Metallhapten zu geben, wird auf zwei aligemeine Gruppen von Verbindungen verwiesen, die Metallatome in ihrer Struktur einbauen können. Hierbei kommen metallorganische Verbindungen in Frage, bei denen eine direkte Bindung besteht zwischen Kohlenstoffatomen der organischen Gruppe und Metallatomen oder die allgemeine Gruppe von Koordinationskomplexen mit einem Metall. Die letzteren können (neben den obenerwähnten metallorganischen Verbindungen) auch die sehr große Vielzahl von Verbindungen umfassen, bei denen eine chemische Verbindung zwischen dem Metallatom und einem anderen Atom, nicht notwendigerweise einem Kohlenstoffatom, auftritt, das in der organischen Gruppe vorhanden ist.

Die organische Gruppe kann praktisch irgendeine Verbindung sein, vorausgesetzt, daß sie eine geeignete funktionell Gruppe enthält, mit der eine Bindung zu dem Metallatom eintreten kann. Um die Anwendbarkeit und die Möglichkeiten dieses Verfahrens weiter zu erläutern, scheint es günsti{j zwei allgemeine Versuche zur „ Herstellung von Metallhaptenen anzugeben. Ein Verfahren besteht darin, daß man ein Metallatom oder-atome

™ direkt in das zu untersuchende Hapten einführt. Dabei entsteht ein Metallhapten, das anschließend, wie später

beschrieben, für die Bestimmung angewandt wird.

Das zweite Verfahren besteht in der Herstellung eines metallhaltigen Reagenses, das auch eine funktionell Gruppe einführt, mit der es an das zu bestimmende Hapten gebunden werden kann. In anderen Worten: Es können spezifische Haptene vorliegen, in die spezifische Metallatome nach üblichen Verfahren eingeführt werden, ' I oder man kann ein allgemeines Reagens oder Reagentien herstellen, wieder mit einer Vielzahl von Metallato-

men, und diese können dann an das betreffende Hapten gebunden werden.

Wenn beispielsweise das Hapten eine Carboxylgruppe in der Struktur enthält, kann man ein Metallreagens herstellen, bei dem einer der Liganden, die an das Metallatom gebunden sind, eine weitere funktioneile Amino- oder Hydroxylgruppe enthält, die dann mit einer Carboxylgruppe des Haptens unter Bildung einer Amidbindung oder einer Esterbindung gebunden werden kann, und auf diese Weise kann das metallhaltige Reagens als Markierung für das Hapten dienen. Es geht daraus deutlich hervor, daß irgendeine reaktionsfähige funktioneiie Gruppe entweder in dem Hapten oder in dem metallhaltigen Reagens angewandt werden kann, und die spezielle {|| Auswahl hängt vollständig von den Strukturen und chemischen Eigenschaften der betreffenden Haptene üb.

Weitere spezielle Beispiele zur Illustration dieser Auswahl werden im Rahmen der Beschreibung angegeben.

(Jm die vielseitige Anwendbarkeit des erfindungsgsmäßen Verfahrens weiter zu zeigen, werden im folgenden einige Beispiele angegeben, wie ein Metallhapten hergestellt werden kann, mit Hilfe der verschiedenen Vurbindungsgnippen und verschiedene Verfahren zur Einführung von Metallen in die gewünschten llaptenc. Zunächst wird auf metallorganische Verbindungen eingegangen, entsprechend der oben angegebenen Definition, nämlich Verbindungen, bei denen eine direkte KohlenstoiT-Metall-Bindung vorhanden ist. Es ist allgemein bekannt, daß man diese metallorganischen Verbindungen in drei Hauptgruppen nach der Art der enemischen Verbindung einteilen kann, die zwischen dem Kohlenstoffatom und dem Metallatom eintritt.

1. Die sogenannten ionischen Bindungen, z. B. die Verbindungen wie Butylnatrium oder ein Grignardrcagens, bei denen die Kohlenstoff-Metall-Bindung weitgehend ionisch ist

2. Die Derivate mit kovalenten σ-Bindungen, z. B. Derivate von Quecksilber, wie Diarylquecksilber oder Dialkylquecksilber oder Alkylquecksilberchlorid oder Tetraäthylblei, bei denen die Kohlenstoff-Metall-Bindung überwiegend kovalent ist.

3. Die Gruppe von Verbindungen, bei denen eine sogenannte n--Bindung vorhanden ist, bei der ein Metallatom aus der Gruppe der Übergangsmetalle, wie z. B. Eisen, Kobalt oder Nickel, mit den ^-Elektronen einer ungesättigten organischen Verbindung reagieren oder in Wechselwirkung treten kann. Neben dein Übergang von .τ-Elektronen der organischen Gruppe in leere Orbitale des Metallatoms tritt eine sogenannte »Rückgabe« ein, wobei Elektronen aus besetzten Orbitalen der Metallatome mit leeren Orbitalen der organischen Gruppe in Wechselwirkung treten, wodurch eine zusätzliche Bindung entsteht, die die in der Chemie bekannte ^--Symmetrie besitzt. Diese Gruppe von Verbindungen ist einem weiten Bereich von Reaktionen zugänglich.

Von diesen drei Gruppen sind die interessantesten diejenigen, bei denen eine direkte kovalente Bindung oder eine ,τ-Bindung vorliegt. Die ionischen Metall-Kohienstoff-Bimiungen sind weniger interessant, da in einem dissoziierenden Medium die ionische Metall-Kohlenstoff-Bindung dissoziieren kann und es nicht möglich ist, das Metallatom, an das der Ligand gebunden ist, in der gewünschten Stellung zu halten. Eine kovalente Bindung, wie z. B. eine Quecksilber-Kohlünstoff-Bindung, kann als geeignetes Beispiel angesehen werden. Als Beispiel kann in Steroid, wie Östradiol oder Östriol angeführt werden, das einen aromatischen Ring enthält. Dieses kann leicht durch Umsetzung des Steroids mit Quecksilberacetat merkuriert werden, um ein (oder mehrere) Wasserstoffatom(e) in dem Arylring durch eine Gruppe (oder Gruppen) zu ersetzen, die Quecksilberatome enthalten

_ und dadurch eine Verbindung zu erhalten, in der das Quecksilberatom durch eine stabile Kohlenstoff-Quecksilber-Bindung eingebaut ist. Diese Verbindung kann anschließend als Metallhapten für die gewünschte spezifische Bindungsbestimmung angewandt werden.

Ein anderes Beispiel zeigt die Verwendung einer Verbindung mit ^--artiger Bindung, wobei eine organische Gruppe, wie eine Allylchlorid- oder Allylalkoholgruppe vorliegt. Durch Umsetzung eines derartigen Allylchlorids mit Metallatomen, wie Palladium oder Nickel oder Platin kann eine /r-Allyl-nickel- oder n-AUyl-palladäum oder /r-Allyl-platin-Verbindung entstehen, wobei eine verhältnismäßig feste chemische Bindung zwischen dem Metallatom und dem Elektronensystem der Allylgruppe der organischen Gruppe eintritt. Eine derartige Verbindung kann wiederum angewandt werden als Metallhapten für die spezifische Bindungsbestimmung. Andererseits kann eine geeignet substituierte organische Gruppe mit Verbindungen umgesetzt werden, wie Ferrocen, bei denen das Eisenatom fest an zwei Cyclopentadienylringe gebunden ist. Die organische Gruppe kann mit irgendeinem derartigen sogenannten »Sandwich«-Komplex oder Metallocen umgesetzt werden, bei dem.^ndere Atome als Eisenatome angewandt werden, wie Kobalt oder Nickel oder Mangan, mit geeigneten Ligandevi unter Durchführung einer typischen organischen Reaktion, z. B. einer Friedel-Crafts-Reaktion, an dem Ferrocen und dadurch Einbau des Ferrocens: In anderen Worten: Einführung eines Eisenatoms in das Hapten, das bestimmt werden soll.

Eine andere Möglichkeit besteht z. 3. darin, ein Ferrocen oder Kobaltocen oder eine ähnliche Struktur anzuwenden, bei der eine Substituentengruppe oder funktioneile Gruppe vorhanden ist, die mit einer organischen funktionellen Gruppe des Haptens reagieren kann. Wenn z. B. ein Aminoferrocen angewandt und mit einem Carbonsäurederivat des Haptens umgesetzt wird, kann eine Amidbindung gebildet und dadurch die Ferrocengruppe und damit das Eisenatom in das zu bestimmende Hapten eingebaut werden.

Bei der Anwendung der obenerwähnten Beispiele auf das Steroid Östrogen, z. B. Östradiol, kann man diese Substanz mit Chromhexacarbonyl umsetzen, um einen Arenchrom-tricarbonylartigen Komplex zu erhalten, durch den ein Chromatom in das zu bestimmende Hapten eingeführt werden kann.

Näher auf die weiteren Einzelheiten und Prinzipien der Herstellung der Metallhaptene einzugehen, würde den Rahmen dieser Beschreibung sprengen. Es gibt eine umfangreiche Literatur mit einer großen Anzahl bekannter metallorganischer Derivate, und es ist daher möglich, irgendeine gewünschte Verbindung auf eine gewünschte Weise herzustellen. Der Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, die entsprechenden Metallhaptene zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auszuwählen.

Eine allgemeine Formel für die metallorganischen Derivate, die zur Herstellung der Metallhaptene angewandt werden können, ist M„, L,',L;, L^Lj L, Lt, wobei L die Liganden darstellt, die die chemische Bindung zu dem Metallatom (M) eingehen. Diese Bindung kann entweder durch Kohlenstoff-Metall-Wechselwirkung oder durch eine Wechselwirkung des Melallatoms mit einem anderen Atom (oder Atomen) als Kohlenstoff gebildet werden. Im ersten {'alle wird die Verbindung im allgemeinen als melallorganische Verbindung bezeichnet, während im letzteren Falle die Verbindung als Metallkoordinationskomplex bezeichnet wird. Die Liganden L¹ bis L'' können alle gleich oder verschieden oder Gemische aus gleichen und unterschiedlichen sein. Die Indizes η bis v geben die Anzahl von Atomen oder Liganden pro Formeleinheit an, wobei m irgendeine ganze Zahl von 1 bis K)

und vorzugsweise 1 bis 4 sein kann. Es ist naturlich auch möglich, daß das Metall M für zwei oder mehrere Elemente stehen kann, und das ist der Fall, wenn m mindestens zwei ist. Die Indizes η bis s können irgendeinen Zahlenwert von 0 bis 12 besitzen, vorausgesetzt, daß die Summe der Indizes (« + o +p +<? + r + s) der Koordinationszahl des Metallatoms (M) entspricht, wenn m gleich 1 ist. Wenn m größer ist als 1, ist es erforderlich, die Summe (π+o-rn+q+r + s) für jedes Metallatom M getrennt zu berechnen, so daß diese Summe in jedem Falle der Koordinationszahl des betreffenden Metallatoms M entspricht.

Das Metall kann irgendein metallisches Element oder eine Kombination von metallischen Elementen sein und vorzugsweise ein Übergangsmetail der Gruppen IB, HB, HIB, IVB, VB, VIB, VIIB und VIII des Periodensystems. Besonders günstig sind die sogenannten Edelmetalle der Gruppe VIII, wie Ru, Rh, Pd, Ir und Pt. Zum Beispiel besitzt das Platin eine besondere Stellung in der Chemie der organischen Metallkomplexe aufgrund der Vielzahl von Verbindungen, die dieses Element bilden kann. Aufgrund der Tatsache, daß Pt in mehreren Oxidationsstufen von 0 bis +4 vorliegen kann, ist die Anzahl von Platin-organischen Verbindungen sehr hoch, so daß jeder gewünschte Komplex ins Auge gefaßt und praktisch angewandt werden kann. Andere Elemente, die nrstallartige Eigenschaften besitzen, wie As, B, Sb, Se, Si, Sn, Te, Ge sowie die Lanthaniden, können ebenfalls zur Herstellung von Metallhaptenen angewandt werden.

Zu den wichtigsten organischen Gruppen, die in den Koordinationskomplexen vorliegen, gehören u. a. die folgenden: Pyridin, Äthylen-diamin, Diäthylendiamin, Dimethyl-glyoxim, Dipyridyl, Phenantrolin, Acetylacetonat, Äthylen-diamintetraessigsäure usw.

Diese Gruppen sind über eine funktionelle Gruppe R, die nicht an der Koordination des Metalls beteiligt ist, sondern nur zur Bildung einer chemischen Bindung mit dem Hapten dient, verbunden. Die Auswahl des entsprechenden Metallhaptens. das als Komponente in dem erfindungsgemäßen System angewandt wird, hängt von einigen Eigenschaften, wie der erforderlicher spezifischen Aktivität und der Einfachheit der Metallbestimmung ab.

Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Analyseneinheit angewandt werden, bestehend aus:

(a) einer vorgegebenen Menge eines Metallhaptens, das entsprechend dem zu bestimmenden Hapten ausgewählt ist;

(b,) einer bestimmten Menge des in dem System anzuwendenden Bindemittels bzw. der bindenden Substanz oder

(b_:) einer bekannten Menge eines Antikörpers in unlöslicher Form.

Soweit erforderlich kann die Analyseneinheit auch den Puffer und die notwendigen Hilfsmittel zur Herstellung von Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Probe für eine quantitative Bestimmung enthalten, wie Reagensgläser, Pipetten und Kolben mit Verdünnungsflüssigkeiten.

Eine der wichtigsten Eigenschaften des erilnuungsgemäSen Verfahrens ist die praktisch unbegrenzte Anwendbarkeit durch die Möglichkeit, die Metall-markierten Haptene für die jeweils gewünschte spezifische Bindungsbestimmung genau geeignet herzustellen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Die in den Beispielen angewandten Abkürzungen und Symbole sind im folgenden angegeben:

Atomabsorptionsspektroskopie Ovalbumin Rinderserum-albumin Dimethylformamid Die Ferrocenylgruppe CsH Dicyclohexylcarbodiimid Phospnat-Puffer-Salzlösung N-Hydroxysuccinimid:

OH

Tetrahydrofuran Infrarot Kernmagnetische Resonanz Dünnschichtchromatographie Acetylacetonat-Ligand

o-

CHj-C-CH = C-CH₃

CHj

CH,

Cr(acac)₃ = Tris-acetylacetonatechromium CH₃ -O

Cr

Cym

(acac), Cr(acac)-NH₂ Die Cymantrenylgruppe [CO]₃MnC₅H₄— Monoamino-tris-acetylacetonat-chromium

CH₃

O-

NH₂

CII₃

E₁ = Östron

HO

OH

HO

= Östriol

-OH

HO

E₁(OX)—COOH = Östron-oxim-O-carboxymethyi

N-O-CH₂CO₂H

HO

10

E₂(HS)—COOH = Östradiol-lT^-hemisuccinat

O C 0(C H₂J₂C O₂H

HO

COOH

E₃(HS)₂

Östriol-16ff,17j8-bis-hemisucc;nat

COOH

E₁-NH₂

(E₁)-NOH

Pg- OH

OCO(CHJ₂COOH

-OCO(CHJ₂COOH

HO

l,3,5-Östratrien-3-ol-17-amino NH₂

HO

NOH

1 lar-Hydroxyprogesteron CH₃ C = O

HO-

II

Pg(HS)-COOH

= 11 ß-Hydroxyprogesteron-hemisuccinat

CH₃
C = O

HO₂C-(CHj)₂-C-O- ^

= _d^b-Tetrahydrocannabinol

H₃C

H,C

C₅H₁₁

— COOH = 7-Ncr l-carboxy-^-tetrahydrocannabinol
CO₂H

OH

H₃C

H₁C

C₅H₁,

Beispiel 1
Mit Eisen markiertes Rinderserum-Albumin

a) 0,14 ml (1,0 mMol) Triäthylamin und 0,13 ml (1,0 mMol) IsGbutylchlorformiat wurden unter Rühren zu einer gekühlten Lösung (-15⁰C) von Ferrocenylcarbonsäure, Fc - COOH (235 mg, 1,0 mMoi) in 3 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) gegeben. Nach 20 min langem Rühren bei - 15°C und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur wurde das Resktionsgemisch unter Rühren zu einer gekühlten (0⁰C) Lösung von 400 mg (0,006 mMol) BSA in 60 ml Wasser enthaltend 2,6 g Natriumcarbonat getropft. Nach vollständiger Zugabe wurde 22 h bei 4⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min mit 16 000 UpM bei 0⁰C zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gegen Boratpuffer, pH 8,5 (3x2 I), dialysiert und dann gegen destilliertes Wasser (4x2 I). Beim Lyophj'isieren des Dialysats erhielt man 380 mg BSA - (COFc)_n Konjugat. Die Anzahl der Ferrocenylgruppen Fc pro Mol BSA wurde bestimmt durch klassische UV-Diffe~ential Analyse und es zeigte sich, daß sie ungefähr /7 = 11 war.

Um die gleiche Bestimmung durch Atomabsorption durchzuführen, wurde zunächst eine Eichkurve gebildet durch Lösen einer bekannten Menge FcCOOH in einer Lösung von 0,1 NaOH (Vorratslösung) und anschließende Herstellung geeigneter Verdünnungen in dem erwarteten Meßbereich. Eine abgewogene Menge BSA (COFcJn-Konjugat wurde dann in einem abgemessenen Volumen 0,ln NaOH-Lösung gelöst und dit Lösung durch Atomabsorption bei einer Wellenlänge von 250,6 nm, Spalt 3, plus 53/32,5, (autozero) an BSA gemessen. Die Interpolation der bei dieser Messung erhaltenen ASS-Signale in die Eichkurve ergab η - 16 Ferrocenylgruppen pro Mol BSA in dem wie oben hergestellten BSA-iCOFc^-Konjugat. Diese Bestimmung kann als genauer angesehen werden als die UV-Differential Analyse, da bei dem AAS der Eisengehalt in dem Molekül direkt gemessen wird.

b) Eine Lösung von 15 mg (0,03 mMol) Diferrocenylcarboniumfluorborat, (Fc)₂CH⁺BF₄, in 2 ml Methanol wurde zu einer gekühlten (0⁰C) Lösung von 80 mg (0,0012 mMol) BSA in 10 ml Wasser, enthaltend 0,6 g Natriumbicarbonat gegeben. Obwohl sich die Farbe schnell von dunkelblau nach gelb änderte, wurde das Gemisch weitere 15 h bei 0⁰C gerührt. Die Lösung wurde dann bei O⁰C mit 1.6 000 UpM 30 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gegen Boratpuffer, pH 8,5 (3 x 0,5 1), und dann gegen Wasser (5 x 0,5 I) dialysiert. Beim LyophilisVren des Dialysats erhielt man 67 mg BSA - [CH(Fc)₂]„-Konjugat. Dieses Konjugat zeigte eine gut definierte Bande bei der Elektrophorese, die sich von derjenigen des nicht konjugierten BSA-Ausgangsmaterials unterschied.

Alomubsorptionsmsssungen nach dem oben unter a) beschriebenen Verfahren zeigten η = 11 in dem BAS - [C'>I(Fc)₂]_l>-Konjugat entsprechend 22 Fcrrocenylgruppen pro Mol BSA.

Beispiel 2

Anwendung von cisenmarkiertem BSA zur Bestimmung der Antikörperkonzentration

durch Atomabsorption

Die quantitative Ausfällung der Kombination Antikörper-Antigen, die üblicherweise als Präzipitinreaktion bezeichnet wird, ist ein verbreitet angewandtes immunologisches Verfahren zur Bestimmung der Antikörper-Kon/enlration. Die folgende Beschreibung einer Reihe von Präzipitinreaktionen zeigt die Anwendung von metallmarkierlen Antigenen für die quantitative Bestimmung der Antikörperkonzentration.

Kaninchen-Antiserum gegen Rinderserum-Albumin (Anti-BSA) (0,5 ml einer 1:16 Verdünnung) wurde mit der Antigenlösung (0,5 ml eines Bereichs von Lösungen von 1 mg/mlbis4x 10 ' mg/ml) vermischt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Probe wurde dann auf einem Mischer vermischt und 24 h bei 4⁰C inkubiert. Nach 30 min iangem Zentrifugieren bei 0⁰C mit 4000 UpM wurde die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und die Niederschlage zweimal mit Borat-Salz-Puffer, pH 8,5, gewaschen. Die Niederschläge bzw. Präcipitate wurden dann getrocknet und jeweils in 1,U ml einer Losung von Ο,ϊπ NaOH gelöst.

Das oben angegebene Verfahren wurde mit jedem der folgenden Antigene durchgeführt.

(I) BSA;

(II) BSA - (CO-Fc)₁₆;

(III) BSA - ICH(Fc)₂],,.

Jede der oben angegebenen Lösungen wurde nach zwei Verfahren gemessen:

a) mit einem IJV-Spektrophofometer zur Bestimmung der Absoi^iion bei 287 nm und dadurch Berechnung der ausgefällten Proteinmenge durch Interpolation in eine Eichkurve, die hergestellt worden war und mit einer Lösung von BSA in 0,1η NaOH;

b) unter Verwendung des AAS-Gerätes mit der Graphitkammer:

Injektion von 20 ml Probe bei Programm 7, 7", = 30 s, T₂ = 60 s, T_} = 30 s.

Empfindlichkeit des Schreibers 1, Einstellung des Schreibers 0,5 A, 5 mV Papiergeschwindigkeit 600/h.

Die Eichkurve wurde hergestellt mit Lösungen von Fc - COOH in 0,ln NaOH unter den gleichen Arbeiisbedingungen des Geräts.

Beispiel 3
Mit Quecksilber markiertes Östradiol-hemisuccinat-hapten

ai Eine Tetrahydrofuranlösung von Östradiol-hemisuccinat, E₂(HS) - COOH (300 mg, 0,775 mMol), p-Aminophenylquecksilberchlorid (277 mg, 0,775 mMol) und DCC, (Dicyclohexyldiimid) (160 mg, 0,80 mMol) wurde 36 h bei Raumtemperatur gerührt.

Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung des gelblichen Niederschlags filtriert und das Filtrat zurTrockne eingedampft. Man erhielt 618 mg eines festen Rückstandes.

Nach Reinigung von 150 mg des obigen Rückstands durch Säulenchromatographie überSilicagel und Eluieren mit Chloroform/Äthylacetat (3:1) erhielt man das quecksilbermarkierte Amid, Ei(HS) - CONH - C₆H₄ - HgCI, in reiner Form mit den folgenden Daten:

NMR(d_s-THF) <5(ppm) 7,3-7,9 (4H, aromatisches AA'BB'System), 6,5-7,2 (3H, aromatisch), 2,7 (4il, — CH₂-CH₂-), 0,95 (3H, anguläres CH₃).

b) Ein alternatives Verfahren für die Synthese des Amids E₂(HS) - CONH - C₆H₄ - HgCl war das folgende: 200 mg (0.55 mMol) Östradiol-hemisuccinat in 2 ml trockenem Dimethylformamid wurden mit 0,1 ml Triäthyiamin und 0,16 ml Isobutylchlorformiat bei -12°C vermischt und 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Nach weiterem 1 stündigem Rühren bei 0⁰C wurde das Reaktionsgemisch auf einmal zu einer Lösung von p-Aminophenylquecksilberchlorid in trockenem DMF (2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 48 h bei Raumtemperatur gerührt und dann auf Eis gegossen. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhielt 275 mg. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie wie unter a) beschrieben gereinigt.

13 F

Beispiel 3a

Anwendung des quecksilbermarkierten Östradiol-hemisuccinats E₂(HS) - CONH - Q₁H₄ - HgCI
zur Bestimmung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung mit Hilfe von AAS

Stufe I - Eichkurve

L· wurde eine Vorratslösung von E₂(HS) - CONH - C₆H₄ - HgCl hergestellt durch Lösen von ungefähr 5 mg des Metallhaptens in DMF (5 ml).

Die Arbeitslösung (enthaltend 15% DMF) wurde jeden Tag frisch zubereitet durch Herstellung der entsprechenden Verdünnungen der Vorratslösung mit 0,1 m Phosphat-Puffer-Salzlösung (PBS), pH 7,3. Diese Arbeitslösung wurde angewandt zur Bildung einer Eichkurve für ein Atomabsorptions-Spektrophotomer mit einer Graphitkammer und einem Deuteriumhintergrund-Korrektor unter den folgenden experimentellen Bedingungen: Programm 3: Trocknungszeit (100⁰C) 60 s; Verkohlungszeit keine; Atomisierungszeit (2100⁰C) 20 s; Ansprechen des Schreibers 1; Spalt 4; Lampenstrom 12 mA; Trägergas Argon; Injektionsvolumen 30 (J.

Die Daten für einen typischen Eichversuch sind:

Vorratslösung: 5,3 mg E₂(HS) - CONH - C₆H₄ - HgCi in 5 ml DMF; Arbeitslösung: 0,2 ml Vorratslösung + 0,55 ml DMF + PBS auf 5 ml.

Das ergibt eine 6,22 x 10"⁵ m Lösung enthaltend 12,47 μζ Hg pro ml.

Eine weitere 1 :7 Verdünnung ergibt die Arbeitslösung mit einer Konzentration von 1,55 [xg Hg pro ml. Anteile dieser Lösung wurden in zunehmenden Volumina zu einer 15%igen DMF-PBS-Lösung gegeben wie in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle 3A-1

An-	Arbeits	15%	Mol	Hg	Peaka)
SDtZ-	lösung	DMF/PBS	konzen	Konzen	Höhe
Nr.	(Ί)	(il>	tration	tration	(mm)
			(m x ItT7)	(^g/ml)

1 5

2 15

3 20

4 30

115

105

100

90

3,23 9,70

12,9

19,4

0,064 0,192 0,256 0,384

^u) Mittelwert aus doppelten Messungen (Standard-Abweichung <± 5%).

Wenn man die mittlere Peak-Höhe (mm) gegen die Konzentration ^g Hg/ml) aufträgt, erhält man eine lineare Kurve entsprechend der Gleichung Y = 456,7 χ + 29,69 mit einem Korrelationskoeffizienten γ = 0,9991.

Die Eichkurve wurde zu Beginn jedes Arbeitstages gebildet, um die Geräteinstellungen und die Stabilität der Arbeitslösungen zu überprüfen.

Stufe II - Herstellung von Antisera und y-Globulinen

Das Hapten E₂(HS) - COOH wurde nach dem gemischten Anhydridverfahren mit Hilfe von Isobutylchlorformiat in DMF an BSA gekuppelt. Der Grad der Konjugation wurde bestimmt durch UV Differentialanalyse. Kaninchen wurden immunisiert durch mehrfache subkutane Injektion entlang von Flanke, Nacken und Rumpf mit einer Emulsion von vollständigen Freund's Adjuvants und dem E₂(HS) - COOH — BS A-Konjugat. Vor der Immunisierung wurde Blut entnommen (für normales Serum) und in wöchentlichen Intervallen nach der Immunisierung. Zusätzliche Injektionen wurden in sechswöchigen Intervallen verabreicht. Die Sera von den Blutentnahmen zwischen den einzelnen Zusatzinjektionen wurden zusammengegeben. Immunoglobuline wurden aus den zusammengegebenen Antisera und normalen Sera, hergestellt durch Precipitation in AmmonJLmsulfat und anschließende Dialyse gegen 0,01m PBS, pH 7,3. Die y-Globulinlösungen wurden in 1 ml Anteile in kleine Glasgefäße gegeben und bei -20⁰C aufbewahrt und die einzelnen Anteile je nach Bedarf vor der Anwendung aufgetaut.

Stufe III - Herstellung von auf einer Matrix enthaltenen Anti-E₂(HS) - COOH - Antikörpern

1,0 g mit Cyanobromid aktivierte Sepharose wurde 15 min mit 200 ml einer Lösung von 10~³ m HCl (pH 3) gequollen und gewaschen. Dieses Gel wurde dann in einem Reagenzglas mit Anti-E₂(HS) - COO'-i-Antiserum (hergestellt aus 6 ml Antiserum in einer 0,1m Lösung von Phosphatpuffer, pH 7,3, dialysiertgegen3 x 1 leiner Lösung von 0,1m NaHCO₃ und 0,5m NaCi, pH 8,2) vermischt und 2 h leicht gestürzt. Das Ge! wurde dann nacheinander gewaschen und zentrifugiert mit einer Lösung von 0,1m Acetatpufier, dann mit einer Lösung von 0,1m Boratpuffer (jeweils Im NaCl) bis keine UV-Absorption bei 280 nm mehr beobachtet wurde. Die feste Phase wurde dann emeut in 10 ml Im Äthanolaminiösung, pH 8, suspendiert und 2 h über das Ende gestürzt,

um restliche aktive Gruppen zu desaktivieren. Dieses Verfahren wurde über einige Waschzyklen wiederholt und schließlich der Feststoff erneut in 6 ml einer O₁Im Phosphatpufferlösung, pH 7,3, suspendiert. Die Menge an gebundenem Protein wurde berechnet durch Substraktion der Menge an nicht gebundenem Protein, das bei den Waschvorgiingcn entfernt worden war (gemessen bei 280 nm) von der in der ursprünglichen Lösung vorhandenen Menge.

Stufe IV - Titration der auf Sepharose enthaltenen Anti-Ej(HS) - COOH-Antikörper

Zunehmende Mengen von E₂(HS) - CONH - C₆H₄ - HgCl-Lösung wurden zu einem konstanten Volumen (30 [Al) der aufSepharose enthaltenen AnU-E₂(HS) - COOH-Antikörper (hergestellt entsprechend Stufe III) in Polyäthylenflaschen gegeben und das Gesamtvolumen mit 15% DMF/PBS Puffer auf 120 -Δ gebracht. Nach 90 min langer Inkubation bei Raumtemperatur in einem mechanischen Schüttler wurden die Flaschen 10 min mit 300 UpM zentrifugiert. Gleiche Anteile (30 μΐ) wurden dann von der überstehenden Flüssigkeit mit einer Eppendorf-Spritze entnommen und in die Graphitkammer eines AA-Spektrometers eingespritzt. Die Konzentralion des gefundenen Quecksilbers ist ein Maß für den freien Anteil an E₂(HS) - CONH - C₆H₄HgCI, das nicht an Antikörper gebunden ist, die auf der Sepharose immobilisiert sind und der gebundene Anteil kann durch Differenzbildung erhalten werden.

Die Ergebnisse eines derartigen Versuchs sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Nr.	Zugesetztes	Mol-Konz.	Gesamt-	Peak-Höhe	Kon/, an	Gebun
	Volumen des	d. Hg.	konz. Hg")	d. über	freiem Hg	den
	Hg-markierten	markierten	(;ig/ml)	stehenden	(um/ml)	1%)
	Ilaptens")	Haptens		Flüssig
	(''D	(m x 10"7)		keit)
				(mm)
1	5	3,23	0,064	12	0,012	81,2
2	10	6,46	0,128	23	0,041	67,9
3	15	9,7	0,192	40	0,085	55,7
4	20	12,9	0,256	60	0,119	53,5
5	25	16,2	0,320	73	0,171	46,5
6	30	19,4	0,384	86	0,204	46,8
a)	Es wurde immer ein konstantes Volumen von 30 al Antikörper-Sepharose-Suspension ange
	wandt.
h)
Gesamtes Endvolumen: 120 -^L

^c) Lineare Steigung der Eichkurve: y = 384,3 χ + 7,4 (χ = ig Hg/ml) (regression equation).

Beispiel 4
Hg-markiertes Östron-oxim-O-carboxymethyl-hapten

Östron-oxim-O-carboxymethyl, E₁(OX) - COOH, (200 mg, 0,583 mMoD.p-Aminophenylquecksilberchlorid (191 mg), DDC (121 mg, 0,587 mMol) in 6 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemische wurde zur Entfernung des Niederschlags filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei man 345 mg eines festen Rückstands erhielt. Beim Chromatographieren über Kieselsäure und Eluieren mit Chloroform/Methanol (99 : 1) erhielt man 100 mg reines Amid: E₁(OX) - CONH - C₆H₄HgCl mit folgenden Werten:

NMR-Spektrum (d₈-THF), δ (ppm) 7,4-7,8 (4H, aromatisch, AA'BB'-System), 6,5-7,3 (3H, aromatisch), 4,6 (2H, — OCH₂-), 0,9 (3H, angeläres CH₃).

Das gleiche Amid E₁(OX) - CONH - C₆H₄HgCl wurde hergestellt nach dem gemischten Anhydridverfahren mit Hilfe von Isobutyl-chlorformiat wie in Beispiel 3b beschrieben.

Beispiel 5

Mit Quecksilber markierte Östradiol-haptene Dieses Beispiel umfaßt die folgenden Stufen:

Stufe ί

Hine Lösung von 1,0 g (3,67 mMol) Östradiol und 1,1 g (3,45 mMol) Quecksilberacetat in 20 ml Methanol wurde 2.5 h unter Rückfluß erhitzt und dann 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von weiteren

QuScksilberacetat Π,Ι g, 3,45 mMol) wurde das Reaktionsgemisch 2 hunter Rückfluß erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Trennung der festen und flüssigen Phasen a) bzw. b) filtriert. Jede Phase wurde folgendermaßen getrennt aufgearbeitet:

a) Die feste Phase wurde in 10 ml eines Gemisches aus Methanol/Chloioform/Methylenchlorid (1:1:1) gelöst mit einer Lösung von 400 mg Lithiumchlorid in 3 ml Methanol vermischt und 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum (Wasserpumpe) abgedampft und tier Rückstand in 25 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser (3 x 50 ml) zur Entfernung anorganischer Chloride extrahiert, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel entfernt, wobei man 0,6 g eines festen Produktes erhielt. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte das Vorhandensein drei neuer Verbindungen,

Chlorquecksilberöstradiolderivate neben einer kleinen Menge nicht umgesetztem Östradiol
b) Die flüssige Phase wurde mit400 mg Lithiumchlorid vermischt und bei Raumtemperatur20 h gerührt. Ein anorganischer weißer Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das organist_he Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Man erhielt einen Feststoff, bei dem sich bei der Dünnschichtchromatographie zeigte, daß er die gleiche Zusammensetzung besaß wie das nach a) erhaltene Produkt.

Stufe II

Die Ab'rennung der Chlorquecksilberöstradiolderivate wurde erreicht durch Acylierung der Hydroxylfunktionen, Chromatographie über Kieselsäure, um die reinen Komponenten zu erhalten und Hydrolyse der Acetate, um die reinen Chlorquecksilberöstradiolderivate zu erhalten. Ein typisches Verfahren war: das unter a) oder b) in Stufe I erhaltene Gemisch (0,6 g) wurde in 3 ml Essigsäureanhydrid und 15 ml trockenem Pyridin 2 h unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch unter magnetischem Rühren zu 200 ml eiskaltem Wasser getropft. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 0,59 g eines glasartigen Rückstandes. Beim Chromatographieren über Kieselsäure, Eluieren mit Benzol und dann mit Benzol/Chloroform erhielt man zunächst Östradiolacetat (88 mg), dann 2-Chlorquecksilberöstradioldiacetat (190 mg), später 4-Chlorquecksilberöstradioldiacetat und schließlich 2,4-(Bis-chlorquecksilberöstradioldiacetat). Die Jrei Chlorquecksilberdiacetatderivate konnten durch ihr typisches NMR-Spektrum identifiziert werden, insbesondere durch die Benzylringprotonen zur Bestimmung der Stellung und des Grades der Substitution.

Stufe III

Die Hydrolyse jedes der abgetrennten Chlorquecksilberdiacetate ergab das entsprechende Chlorquecksilberöstradiol, nämlich 2-Chlorquecksilberöstradiol, 4-Chlorquecksilberöstradiol und 2,4-(Bis-chIorquecksilbcr)-östradiol.
Ein typischer Hydrolyseversuch war:

Eine Lösung von 65 mg 4-ChlorquecksiIberöstradioldiacetat in 5 Gew.-% Kalnimhydroxid in Methanol (20 ml) und Lithiumchlorid (12 mg) wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen des Methanols im Vakuum (Wasserpumpe) wurde der Rückstand mit 50 ml Wasser vermischt, etwas Lithiumchlorid zugegeben und das Gemisch mit Chloroform (2 x 25 ml) und dann mit Äthylacetat (3 x 20 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Man erhielt: 48 mg 4-Olorquecksilberöstradiol.

Analyse:

berechnet für C₁₈H₁₃O₁HgCl: C 42.60; H 4,57%;
gefunden: C 42,60; H 4,85%.

NMR-Spektrum (d₈-THF): <5 (ppm) 6,7-7,3 (2H aromatisch, AB-System),

0,9 (3H, Singulett, anguläres CH₃).

Stufe IV

Ein weiterer Nachweis der Struktur der Chlorquecksilberderivate wurde erhalten durch Umwandlung in die jeweiligen Jodöstradiolderivate:

Das unter a) erhaltene Chlorquecksilberöstradiolgemisch (0,6 g) wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und unter Rühren bei Raumtemperatur 0,3 g Jod zugegeben. Nach 20 h langem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des rcten Niederschlags filtriert und das Chloroformextrakt mit einer wäßrigen Kaliumjodidlösung extrahiert, bis das freie Jod entfernt war. Die Chloroformphase wurde dann über MgSO₄ getrocknet und eingedampft, wobei man 454 mg eines festen Rückstands erhielt. Dieser wurde über eine Silicagelsäule chromatographiert, mit Tetrachlorkohlenstoff und Tetrachlorkohlenstoff-Diäthyläther-Gemischen eluiert. Die folgenden Verbindungen wurden in der Reihenfolge des Eiuierens in reiner Form erhalten:

(I) 2,4-Dijodöstradiol (42 mg), NMR (CCl₄) δ (ppm) 7,7 (IH, aromatisch), 0,9 (3H, angular CU_x);
(II) 2-Jodöstradioi (31 mg), NMR (CCi₄) δ (ppm) 7,5 (IH, aromatisch), 6,5 (IH, aromatisch),
0,9 (3H, angular CH,);

(III) 4-Jodöstradio! (60 mg), NMR (CCl₄^ <J(ppm) 6,6-7,3 (2H, aromatisch, AM-System), 0,8 (3H, angular CH₃).

Der Rest des eluierten Materials aus der Säule bestand aus Gemischen der obigen drei Verbindungen.

Beispiel 5A Mit Quecksilber markierte Östriol-haptene

Das in Beispiel 5 für Östradiol beschriebene Verfahren wurde auch auf Östriol angewandt und zwar folgendermaßen:

0,635 g (2 mMol) Quecksilberacetat wurden zu einer Lösung von 0,575 g (2 mMol) Östriol in 20 ml Methanol, gegeben. Das Gemisch wurde 4 h unter Rückfluß erhitzt und dann 12 h bei Raumtemperatur gerührt Bei Zugabe von 20 ml CHCI₃ und 20 ml CH₂Cl₂ zu dem Reaktionsgemisch entstand eine klare Lösung, die dann mit is 0,2 g LiCI in 3 ml Methanol behandelt wurde. Nach 12 h langem Rühren bei Raumtemperatur wurde das organische Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand (1,26 g) mit Wasser (3 x 25 ml) gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Waschiösungen wurden mit Äthylacetat (3 x_25 ml) extrahiert, um etwaige gelöste Ostriolderivate zu entfernen. Der nach Eindampfen der vereinigten Athylacetatauszüge erhaltene Rückstand wurde mit dem festen Rückstand zusammengegeben, der wie oben erhalten worden war, und das Gemisch wurde wie in den Stufen II und III des Beispiels 5 behandelt, um die Chlorquecksilberöstriolderivate zu trennen. Wenn andererseits die Jodöstrolderivate erwünscht sind, wird der wie oben erhaltene feste Rückstand in THF gelöst und mit einer Lösung von 0,5 g Jod in 50 ml CHCI₃ titriert, bis die Jodfarbe in dem Reaktionsgemisch stabil bleibt Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand, der ein Gemisch aus 2-Jodöstriol, 4-Jodöstriol und 2,4-Dijodöstriol war, über eine Silicagelsäule Chromatographien, wobei man reines 2,4-DijodöstrioI 2s (0,1 g) und ein Gemisch von 2-Jod- und 4-Jodöstriol (0,32 g) erhielt Die beiden Monojodöstrolderivate konnten gegebenenfalls durch wiederholte Chromatographie getrennt werden. Das NMR-Spektrum der drei Verbindungen war im Bereich der aromatischen Protonen identisch mit dem für die Östradi&lderivate nach Beispie? 5 erhaltenen.

Die beiden in Beispiel 5 und 5A angegebenen Verfahren stellen einen sehr einfachen Weg dar zur Herstellung von reinen radioaktiven Jodderivaten von Östradiol und Östriol.

Beispiel 6

35 Mit Eisen markiertes ösiradioi-hemisuccinat-hapien E₂(HS) - CONH - CH₂Fc

Stufe I - Synthese von Östradiol-17j8-succinat-N-succinimid-ester

O

V E₂(HS)-COOn'

_

DCC (58 mg, 0,28 mMol) wurde zu einer eiskalten Lösung von Östradiol-n^-hemisuccinat, E₂(HS) - COOH,(93 mg,0,25 mMol)undN-Hydroxysuccinamid,NHS(30 mg,0,25 mMol)in4 ml trockenem, frisch destilliertem Tetrahydrofuran gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 0⁰C und dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt Nach Abfiltrieren des ausgefallenen DicyclohexylharnstofTs wurde das THF-Filtrat so zur Trockne eingedampft, wobei man 120 mg eines weißen Feststoffs erhielt. Durch IR- und NMR-Spektroskopie zeigte es sich, daß es der erwartete aktive Ester

V₁

E₂(HS)-COON

war. Dieser wurde ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe angewandt.

Stufen

Eine Lösung von 120 rag des aktiven Esters

O
E₂(HS)-COON j

(ungefähr 0,25 mMol) und 55 mg (0,25 mMol) Ferrocenyhnethylamin Fc - CH₂NH₂ in 4 ml trocknem, frisch destilliertem THF wurde 20 h bei Raumtemperatur magnetisch gerührt. Das Gemisch wurde zur Entfernung von ausgefallenen Substanzen filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei ein weißer Feststoff entstand. Dieser wurde in 10 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 2 x 10 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde Ober MgSO₄ getrocknet und eingedampft, wobei man 160 mg eines festen Rückstands erhielt. Dieser wurde durch Säulenchromatographie über 7 g 10%iges desaktiviertes basisches Aluminiumoxid Chromatographien. Beim Eluieren mit Benzol-Chloroform (4:1) erhielt man 55 mg (40%) einer reinen Verbindung, Fp. 140-143⁰C. Durch IR- und NMR- und hoch aufgelöstes Massenspektrum zeigte es sich, daß es das Amid E₂(HS) - CONH - CH₂ - Fc war.

IR(CHCl₃)V(CnT¹):
NMR (CDa,) δ (ppm):

1720 (vs): 1660 (vs): 1170 (s): 1100 (s): 1000 (m).

7,3-6,8 (aromatisch 3H): 4,3 (Ferrocenyl 9H) 0,8 (angular Methyl 3H).

Molekularion (hoch aufgelöstes Massenspektrum, m/e) 569,2238 analysiert für Cj₃H₃₉O₄NFc. Beispiel 6A

Anwendung von eisenmarkierten Östradiol-hemisuccinat, E₂(HS) - CONH - CH₂Fc zur Bestimmung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung durch AAS

Stufe I - Eichkurven

Es wurde ähnlich wie in Beispiel 3A Stufe I beschrieben, gearbeitet. Das markierte Hapten E_:(HS) -CONH -CH₂Fc wurde zur Herstellung einer Vorratslösung, enthaltend 1 mg/ml, in DMF gelöst. Es wurden Verdünnungen mit Pufferlösungen hergestellt (0,05 m Natriumeitratpuffer, pH 7,3 oder0,01 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3), um die Arbeits-Standard-Lösungen, enthaltend 15% DMF, zu erhalten. Die Eichkurven wurden folgendermaßen hergestellt:

a) nach dem Verfahren der Standardzugabe: 90 ul der Vorratslösung wurden auf ein Volumen von 10 ml verdünnt und dann 30 al Anteile in das AAS eingespritzt, um den Arbeitsbereich von 50 bis 300 ng Fe/ml zu erhalten;

b) durch übliche Verdünnungsverfahren, wobei 30, 60, 90 und 120 μΙ einer entsprechend konzentrierten Lösung mit Pufferlösung auf ein Gesamtvolumen von 120 μΐ gebracht wurden. Jede Standard-Konzentration wurde doppelt hergestellt und jede AA-Messung doppelt oder dreifach durchgeführt und Deuterium-Hintergrundkorrektor. Die Versuchsbedingungen waren: Programm 7; Trocknungszeit (100⁰C) 40 s; Verkohlungszeit (1100⁰C) 90 s; Atomisierungszeit (2400⁰C) 10 s; Spalte 3, Lampenstrom 20 mA; Trägergas Argon; Ansprechen des Schreibers 1; 0,25 A, 20 mV; Papiergeschwindigkeit 2 cm/min. D^:e folgenden Daten wurden für das Verfahren der Standardzugabe für zwei typische Eichversuche erhalten, einer mit Lösungen, die in dreifach destilliertem Wasser mit 15% DMF(Tabelle 6Λ-1) erhalten worden waren und der zweite mit Verdünnungen in 0,01m PBS mit 15% DMF (Tabelle 6A-?).

Tabelle 6A-1	Molare	Fe-	Höhe des Peaks")	Mittelwert
Nr.	Konz. an	Konzen-	(mm)	aus 2 Ver
	Fc-markier-	Iralion		suchen A
	tem Hapten	(ng/ml)		und B
	(mx ItT7)			(mm)
	0b)	0	17,6 ±1,5	16,8
IA	0	0	16,0 ±0	39,5
IB	1,98	11,0	39,7 ± 2,5	60,0
2A	1,98	11,0	39,3 ±1,1
2B	3,95	22,1	61,0 ±2,6
3 A	3,95	22,1	59,0 ±1,7
3B

Fortsetzung

Nr. Molare	Fe-	Höhe des Peaks3)	Mittelwert
Konz. an	Konzen-	(mm)	aus 2 Ver
Fc-markier-	tration		suchen A
tem Hapten	(ng/ml)		und B
(m x l<r7)			(mm)

4A 5,93

4B 5,93

5A 7,90

5B 7,90

33,2 332

44,2

80,5 ±2,1

81,3 ±3,0

101,0 ±1,4

100,3 ±2,5

.... 80,9. 100,6

^a) Mittel aus drei-Messungen +S.D. (Standard-Abweichung).

^b) Blindprobe: dreifach destilliertes Wasser mit 157. DMF.

Beim Auftragen der mittleren Peak-Höhe.der doppelten Versuche (mm) gegen die Konzentration (ng FeAnI) erhielt man eine Gleichung mit linearer Steigung Y = 1,889 χ + 17,80 und einem Korelationskoeffizienten r = 0,9997. .

Tabelle 6A-2

Nr. Molare	Fe-	Höhe des Peaks")	Mittelwert
Konz. an	Konzen-	(mm)	aus 2 Ver
Fc-markier-	tration		suchen A
tem Hapten	(ng/ml)		und B
(m x 10~7)			(mm)

IA IB

2A 23

3A
3B

4A 4B

5A 5B

0^b) 0

1,98

3,9·. 3,95

5,93 5,93

7,90 7,90

0 0

11,0 11,0

22,1 22,1 33,2 33,2

44,2 44,2

41,0 ±1,7
41,0 ±1,0
65,0 ±2,0
65,5 ±2,1

78,7 ±1,5
81,5 ±2,1

102,0 ±3,0
97,5 ±4,9

113,5 ±4,9
125,5 ±3,5

41,0 65,3 80,1 99,8 119,5

") Mittel aus drei Messungen ±S. D. (Standard-Abweichung). ^b) Blindprobe: 0,1m PBS mit 15% DMF.

Beim Auftragen der mittleren Peak-Höhe der doppelten Versuche (mm) gegen die Konzentration (ng Fe/ml) erhielt man eine Gleichung mit linearer Steigung Y = 1,731 χ + 42,88 und einem Korelationskoeffizienten r = 0,9977.

Stufe II - Titrierung von aus Sepharose enthaltenem Anti-Ej(HS) - COOH

Um die Bestimmung durchzuführen, wurden verschiedene Faktoren untersucht mit Hilfe von Antisera, die wie in Beispiel 3 A, Stufe 2 erhalten worden waren und der mit Sepharose immobilisierten Antikörper, die entsprechend Beispiel 3A, Stufe 3, erhalten worden waren.

Zur Bestimmung der unspezifischen Absorption durch die Sepharose wurde ein Sepharose-Präparat hergestellt entsprechend dem Verfahren des Beispiels 3A, Stufe IH, mit der Ausnahme, daß y-Globuline von normalem Kaninchenserum (NRS) anstelle der Anti-E₂(HS) - COOH-Antikörper verwendet wurden.

Ein konstantes Volumen (60 μΐ) der Suspension der an Sepharose gebundenen Antikörper (oder NRS-y-Globuline) wurde mit Hilfe eines Vortex-Mischers mit entsprechenden Volumina bekannter Konzentration E₂(HS) - CONHCHjFc vermischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle 10 min wiederholt mit dem Vortex-Mischer gemischt wurde. Das Gemisch wurde dann 1 min mit 3000 UpM zentrifugiert. Anteile (30 ;xl) der überstehenden Flüssigkeit wurden mit einer Eppendorf-Pipette entnommen und in die Graphitkammer eines AA-Gerätes eingespritzt.

Die Ergebnisse einschließlich der Eich-Standards mit und ohne Sepharose-Suspensionen sind in Tabelle 6A-3 zusammengefaßt. In dieser Tabelle sind die Peak-Höhen angegeben nach entsprechender Substraktion der Blindsignale, so daß die Eichkurve durch den Ursprung geht.

	Molare Konz.	27 24 486	NRS-y-	Anti-	Peak-
Tabelle 6A-3	des Fe-mar-		Globuline	E2(IIS)-CO2II-	I lohe
Nr.	Lii-ili-it	Fe-Kon-	(.,Ii	)'-(ilob<iiini;	(111 lit)
	Ihiptcns	zentration		M)
	(mx IO"7)	(M)1VmI)
	—		-	—	0
	17,9		-	-	32
Blindprobe	17,9	-	60	-	33
1	35,8	100	-	-	60
2	35,8	100	60	-	58
3	53,7	200	-	-	87
4	9,16	200	-	60	9,5
5	18,3	300	-	60	52,5
6	27,5	51	-	60	16,0
7	36,6	102	-	60	??.,5
8	45,8	154	-	60	35,0
9	59,1	205	-	60	46,5
iO	256
11	307

Durch Auftragen der oben angegebenen Daten auf eine Kurve ist es möglich, die molare Konzentration der Antikörperstellen (5,01 x IO"⁶ m) auf der Sepharose und die BSidungskonstante (K_ar = 3,44 x IO"⁵ m"') des markierten Haptens zu berechnen.

Stufe III - Hemmungs- und Kreuzreaktions-Versuche mit E₂(HS) - CONH - CH₂ - Fc

Ein festgelegtes Volumen (30 -xl) einer Lösung von mit Eisen markiertem Östradiol-hemisuccinat E_:(HS) - CONH - CH₂Fc mit einer geeigneten Konzentration (ausgewählt entsprechend den in Stufe II erhaltenen Ergebnissen) wurde mit einem konstanten Volumen (30 μ.1) von Lösungen verschiedener Konzentrationen an nicht markiertem Hapten, Östradiol-hemisuccinat (oder Östron-17-(O-carboxymethyl)oxim, E|(Ox) — COOH), vermischt. Dieses Gemisch wurde zu einem konstanten Volumen (60 μΐ) der an Sepharose gebundenen Antikörper gegeben, 1 min mit dem Mischer gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Mischen wurde in Zeitabständen von iO min wiederholt. Das Bestimmungsgemisch wurde dann i min mit 3000 UpM zentrifugiert. Anteile (30 al) wurden mit einer Eppendorf-Pipette entnommen und in das Graphilrohr des AΑ-Gerätes eingespritzt. Die folgenden Vergleiche wurden nach dem gleichen Verfahren bestimmt, um die Spezifität festzustellen:

a) eine Suspension von an Sepharose gebundenen Antikörpern ohne Zugabe des metallmarkierten Haptens;

b) Gemische von metallmarkierten und nicht-markierten Haptenen ohne Zugabe der an Sepharose gebundenen Antikörper;

c) Gemische von metallmarkierten und nicht-markierten Haptenen unter Zugabe von Sepharosi gebundenen y-Globulinen von normalem Kaninchenserum.

Die mit den beiden Haptenen erhaltenen Hemmwerte sind in Tabelle 6A-4 angegeben. Tabelle 6A-4

Hemmung von

E₂(HS) - CONH - CH₂Fc (27,5 x ID"⁷ m)

[E1(HS) - COOH]	Hem	[E1(OX) - COOH]	Hem
(M~x IO"7)	mung	(M x ΙΟ"7)	mung
3,6	8,5	3,75	0,5
7,2	17,5	7,5	3,0
15,0	21,5	15,0	6,5
36,0	43,5	37,5	9,5
72,0	48,0	75,0	25,5
150,0	56,0	150,0	50,5
300,0	63,5

Beispiel 7 Eiscnmurkiertes Östriol-his-hcmisuccinut-ruiplcn

CONH-CH₂Fc 5

E₃(HS)

CONH-CH₂Fc

IO Stufe I

Nach dem in Beispiel 6, Stufe I beschriebenen Verfahren unter Verwendung vonÖstriol-loi^nji-bishemisuccinat (496 mg, 1 mMol), N-Hydroxysuccinimid (230 mg, 2 mMol) und DCC (450 mg, 2,2 mMol) erhielt man den aktiven Bis-ester, is

IN >

coon y 20

E₃(HS)₂ nT O

COON ^x "

550 mg (81%), Fp. 90-95⁰C. 30

Stufe II

Der oben erhaltene aktive Bis-ester (130 mg, 0,19 mMol) und Ferrocenylmcthylamin (81 mg, 0,38 mMol) wurden nach dem in Beispiel 6, Stufe H, angegebenen Verfahren umgesetzt. Nach Reinigung durch Säulenchro- 35 matographie und anschließende präparative Dünnschichtchromatographie erhielt man 60 mg (—30%) des Bisamids

CONHCH₂Fc

E₃(HS)₂

CONHCH₂Fc

IR(CHCI₃); v(cnT'): 1730 (vs): 1615 (vs): 1500 (s): 1170(s): lllO(m): 1000 (m).

NMR(CDCI₃) ν (ppm): 7,3-6,7 (aromatisch 3H); 4,26 (Bis-ferrocenyl, 18H); 0,8 (anguläres Methyl, 3H).

Beispiel 8 50

Eisenmarkiertes l,3,5-Östratrien-3-ol-17-amin-Hapten E, - NHCO - CHjCH₂CO - Fc Stufe I - Synthese von 4-Keto-4-ferrocenyl-butanoat-N-succinimidester

4-Keto-4-ferrocenyl-buttersäure (hergestellt durch Friedel-Crafts-Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid auf 5|

Ferrocen) (286 mg), (1 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (115 mg, 1 mMol) wurden entsprechend dem in Bei- |

spiel 6, Stufe I, beschriebenen Verfahren umgesetzt. Man erhielt 300 mg (78%) des aktiven Esters gj

C₅H₅FCC₅H₄-CO-CHj-CH₂-COO-N

21

IR(CHCl₁)V(Cm"¹): 1815; 1790; 1745; 1715; 1660; 1180; 1070.

NMR(CDCI.,) δ (ppm): 4,88 (C₅H₄,2H); 4,50 (C₅H₄,2H); 4,25 (C₅H₅,5H); 3,08 (— C H₂-C11₃--, 411); 2,87 (Succinimid-Ring, 4H).

Diese Verbindung kann als Reagens für die Metallmarkierung von Haptenen dienen, die funktionell Aminogruppen besitzen wie in Stufe III unten angegeben.

Stufe II - Synthese von l,3,5-Östratrien-3ol-17-amino E, - NH₂

ίο Kobalt-chlorid-hexahydrat, CoCI₂ ■ 6 H₂O (670 mg, 2,8 mMol) wurde zu einer Lösung von Östronoxim (390 mg, 1,37 mMol) in 80 ml Methanol gegeben und die Lösung bei Raumtemperatur gerührt bis sie homogen war. Dann wurden 580 mg Natriumborhydrid innerhalb von 20 min zugegeben. Während dieser Zugabe wurde die Lösung schwarz und es trat eine heftige Wasserstoffentwicklung ein. Nach weiterem 1 stündigem Rühren bei Raumtemperatur änderte das Gemisch seine Farbe nach gelblich-braun. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum

abgedampft und der entstehende Rückstand mit einigen Anteilen von warmem Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Auszüge wurden im Vakuum eingedampft, wobei man 359 mg des Amins E| - NH₂ als weiße kristalline Substanz erhielt, Fp. 190-193⁰C. Oberhalb von 193°C wurde das Material wieder kristallin und schmolz dann unter Zersetzung bei 235 bis 238°C.

:» NMR(CD₃OD), δ (ppm): 7,25-6,6 (3H, aromatisch); 0,7 (3H, anguläres CH₁).

Stufe Hl - Synthese von E₁ - NHCO - CH₂CH₂COFc

Eine Lösung von E| - N H₂ (entsprechend Stufe II hergestellt), (50 mg, 0,18 mMol)in3 ml frisch destilliertem Dioxan wurde zu einer magnetisch gerührten Lösung des in Stufe I erhaltenen aktiven Esters (50 mg, 0,13 mMol) in 3 ml Dioxan gegeben. Es wurde weitere 30 min bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Auszüge wurden mit Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Man erhielt 86 mg eines bräunlichen Rückstands. Dieser wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt. Man erhielt 31 mg (45%) Amid E, - NH - CO - CH₂ - CH₂ - COFc, Fp. 228-230⁰C.

IR(CHCI-J₁V(Cm"¹): 1660 (s): U90(m): 1100 (m); 1005 (m).

NMR(CDCI-J δ (ppm): 7,0-6,6 (3H, aromatisch); 4,7-4,2 (9H, Ferrocenyl); 0,7 (3H, angular CIl₁)-

Beispiel 9

Chrommarkiertes Östradiol-hemisuccinat-Hapten E₂(HS) - CONH - (acac)Cr(acac),

Eine Lösung von Monoamino-tris-acetylacetonatchrom (acac), - Cr(acac) - NHi (hergestellt nach Collman und Yamada, J. Org. Chem., 28, 3017 (1963), (400 mg, 1,1 mMol), Östradiol-hemisuccinat, E₂(HS) - COOII (350 mg, 0,95 mMol), DCC (210 mg, 1,05 mMol) in Methylenchlorid (30 ml) wurde 18 h bei Raumtemperatur magnetisch gerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Harnstoffes wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde erneut in einer kleinen Menge Benzol gelöst und die nach Zugabe von Petroläther ausfallende kleine Menge Harnstoff abfiltriert. Nach Entfernung der Lösungsmittel wurde der Rückstand einige Male mit Aceton extrahiert. Die vereinigten Acetonauszüge wurden eingedampft. Man erhielt 376 mg (58%) des hohen Amids, das durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt wurde. Man erhielt 100 mg (15%) des gewünschten reinen Amids E₂(HS) - CONH - (acac)Cr(acac)₂.

I. R-(CHCI₂) ν (cm"¹): 1740 (s): 1670 (s): 1580 (vs): 1520 (vs): 1370 (vs): 1280 (m): 1020 (m): 920 (m).

Beispiel 10
Kupfer- und palladiummarkiertes Östradiol-hemisuccinat-Hapten

NH,- \

E₂(HS)-CO — NH—(CH₂)₄—CH

CO₂-J₂

M(M = Cu_-Pd)

Eine Lösung des NHS-aktiven Esters von Östradiol-hemisuccinat, der entsprechend Beispiel 6, Stufe I, hcrgestellt worden war, (300 mg,O,63 mMol)in8 mITHFwurdezu8 ml gesättigterwäßrigerNaHCO,-Lösung, enthaltend 223 mg(0,63 mMol) Bis-Iysinat-Kupfergegeben (hergestellt nach Brubakcrund Busch, Inorg.Chcm.,5, 2110 (1966). Es entstand ein zweiphasiges flüssiges System, wobei die blaue wäßrige Lösung die untere Schicht bildete.

22

Nach 2 h langem magnetischen Rühren des Reaktionsgemisches ging die blaue Farbe in die obere Phase (ΊΊI F) über. Das Gemisch wurde in einen Scheidetrichter gegeben und die blaue THF-Schicht gesammelt und zur Trockne eingedampft. Der blaß-blaue Rückstand wurde mit Äthylacetat extrahiert, um nicht umgesetztes Slcroid zu entfernen. Der verbleibende Feststoff erwies sich beider Dünnschichtchromatographie als eine reine Substanz und das IR-Spektrum stimmte mit dem erwarteten Produkt überein, bei dem die endständige NH₂-Gruppe der Lysingruppe mit dem aktiven Ester reagiert hatte unter Bildung der Peptid-Bindung von

NH₂-\

E₂(HS)- CO — NH- (CH₂)₄— CH

Cu ίο

CO₂-J₂
Nach ähnlichen Verfahren war es möglich das entsprechende Palladium-Analoge herzustellen.

Beispiel 11

Küualtmarkiertes Gsirauioi-Hapien

Stufe I

Das N-Carbobenzoxyderivat von Aspartinsäure wurde nach dem Verfahren von Le Quense and Young, J. Chcm., Soc, 1954 (1951) in das Anhydrid umgewandelt.

Stufe II

Das nach der oben angegebenen Stufe I erhaltene Anhydrid (0,76 g) und 0,83 g Östradiol wurden 4 h in 10 ml Pyridin unter Rückfluß erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand einige Male mit CIICI, extrahiert, um nicht umgesetztes Östradiol zu entfernen. Der verbleibende Feststoff wurde in einer sehr kleinen Menge DMF gelöst und erneut mit Aceton ausgefällt. Man erhielt 1,0 g eines Feststoffes, der durch das NMR- und IR-Spektrum identifiziert wurde als

O COOH

Il /

0-C-CH₂-CH O

\ Il

NH-C-OCH₂C₆H₅

Stufe III

Durch Hydrogenolyse der in Stufe II erhaltenen Verbindung mit einem Palladiumkatalysator wurde die Carbobenzoxygruppe entfernt und man erhielt die mit Östradiol substituierte Aspartinsäure

COOH
0-CO-CH₂-CH

NH,

Stufe IV

Dieses Aminosäurederivat kann mit geeigneten Metallderivaten umgesetzt werden, um Aminosäurekompiexe zu erhalten.

Zum Beispie! führt die Umsetzung von Carbonato-bis-äiiiyien-diarninkobaltchlorid (CO Cn₂CO₃)Ci mit der oben angegebenen Aminosäure zu einem Ersatz der CO₃-Gruppen und Bildung des Komplexes

23

R-CH \

CO₂ \

Coen₂

NH₂

Cl₂

Ähnliche Verfahren wurden mit anderen geeigneten Aminosäuren wie Cystein- oder Glutaminsäure durchgerührt.

Beispiel 12

Synthese von Eisen-markiertem Cannabinoid-Metallhapten
Stufe I - Herstellung eines aktiven Esterderivats von 1-Carboxy-/1⁶-THC

I-Carboxy-J⁽'-THC(74 mg, 0,22 mMol) und N-Hydroxy-succinimid (30 mg, 0,22 mMol) in trockenem, frisch destilliertem THF (5 ml) wurden 3 Stunden unter Rühren und Kühlen mit einer Lösung von 50 mg (0,24 ml) DCC in 3 ml THF vermischt. Nach 15 Stunden langem Stehen bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgcrnisch zur Entfernung des ausgefallener. Dicyclchexylharr.stoffs filtriert und das Filtrat ohne weitere Reinigung für die näcnste Stufe verwendet.

Stufe II - Umsetzung des aktiven Esters von l-Carboxy-2l⁶-THC mit Aminomethylferrocen

Aminomethylferrocen, C₅H₅FeC₅H₄CHjNH₂, (47 ir.g, 0,22 mMol) wurde zu einer THF-Lösung des aktiven Esters von l-Carboxy-<d^h-THC, der entsprechend Stufe I erhalten worden war, gegeben. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur und dann 3 Stunden bei 60⁰C gerührt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der feste Rückstand in 10 ml Diäthyläther gelöst und zweimal mit 10 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Phase über MgSO₄ und Abdampfen des Lösungsmittels verblieben 158 g eines rohen Gemisches. Trennung durch präparative Dünnschichtchromatographie und Eluieren mit Chloroform-Äthylaectat (1 : 1) ergab 45 mg (45%) des reinen, gelben, kristallinen Amids, Fp. 73-76°,
GHjFeC₅H₄CHj-NH - CO - (Λ''-THC).

I. R. (CHCI-Jr(Cm"¹): 1720 (v); 1660 (m); 1625 (vs); 1580 (m) 1180-1280 (brs) 1105 (m); 1000 (m);

910(vs).
NMR(CDCl-J ö (ppm): 6,86 (vinylisches H); 6,27 (aromatisches 2H); 4,20 (Ferrocenyl 9H);

3,4 (br, - CH, -- N).

Beispiel 13
Synthese von Mangan-markiertem Barbiturat-Metallhapten

Et Et

Et Et

HN

13-1

NNa

SO₂Cl

HN N-SO₂

OC CO CO

13-3

Eine Lösung von 0,144 g (0,7 mMol) Natriumbarbital, 13-1, und 0,214 g (0,7 mMol) Cymantrenylsulfonylchlorid, 13-2 in 40 ml Methanol wurde 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt und 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand mit dreimal 10 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten CHC1₃-Auszüge wurden eingedampft und der Rückstand über eine präparative Dünnschichtchromatographieplatte (Aluminiumoxid) gereinigt. Bei Eluieren mit Chloroform-Methanol (9:1) erhielt man das gewünschte Produkt, 13-3, als obersten Streifen (R_r = 0,9) (60 mg).

IR(CHCI₃) ν (cm '): 2050 (vs); 1950 (vs) (typisches Metallcarbonyle 1740 (vs);

1690 (vs) (Barbituratcarbonyl)
NMR(CDCl₃) δ (ppm): 4,9 und 5,6 (Cyclopentadienyl 4H); 0,9 (Triplett) (2 CH₃-Gruppen);

2,0 (Quadruplett) (2 CH,-Gruppen).

24

Beispiel 14 Synthese von Chrom-markiertem Barbiiurat-Mctallhapien

Stufe I — Synthese von l-Carboxymethyl-S^-diäthyl-barbitursäure s

und l^-Bisicarboxymethyl^S^-diäthyl-barbitursäure

Eine Lösung von Natrium barb ital (4,63 g, 72,5 mMol) und Methylchloracetat (3,69 g, 40,0 mMoi) in 50 ml Methanol und 10 ml Dimethylsulfoxid wurde 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Methanol wurde im Vakuum abgedampft und die verbleibende Lösung mit 50 ml Wasser verdünnt, wobei sich ein gummiartiges Produkt abschied. Nach Abdekantieren der wäßrigen Schicht wurde der gummiartige Rückstand mit mehreren Anteilen In NaOH verrieben. Nach Zusammengeben der alkalischen Schichten wurde der unlösliche Rückstand (0,92 g) getrocknet und es zeigte sich durch das IR- und NMR-Spektrum, daß es der Dimethylester der disubstituierten l,3-Bis(cartoxymethyl)-5,5-diäthyl-bartitursäure war. (NMR(CDCl₃) δ (ppm) 4,85 (Singulett, - N -CH₂ -); 3,8 (Singulett, - OCH₃); 2,1 (Quartett, - CH, der Äthylgruppen); 0,9 (Triplett, CH₅ der Äthylgruppen).

Die alkalischen Waschflüssigkeiten wurden angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Der nach Abdampfen des CH₂Cl₂ verbleibende Rückstand wurde über eine Silicagelsäule Chromatographien, um den monosubstituierten Ester l-CarboxyrnethyI-5,5-diäthylbarbitursäure zu erhalten. Das NMR-Spektrum war das gleiche wie für den Diester, mit Ausnahme des Integrationsmusters (das mit der Monosubstitution übereinstimmte? und der zusätzlichen Absorption bei δ 10,5 für das - NK-Proton.

Die beiden Verbindungen, der Diester und der Monoester, wurden zu der freien Carbonsäure hydrolysiert, indem man sie 3 bis 4 Stunden in 20%iger HCl-Lösung unter Rückfluß erhitzte und auf übliche Weise aufarbeitete. Das ER- und NMR-Spektrum bestätigten die Strukturen der freien (Carboxymethyl)-Derivate.

25 Stufe Il - Synthese der aktiven Ester mit N-Hydroxysuccinimid und Umsetzung mit (acac),Cr(acac) - NH₂

(A) N-Hydroxysuccinimid (0,46 g, 3,98 mMol) und DCC (1,1 g, 5,4 mMol) wurden zu einer THF-Lösung des Bis-(carboxymethyl)-Derivats, das in Stufe I durch Hydrolyse von 0,61 g (1,8 mMol) des Diesters erhalten worden war, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt zur Entfernung von ausgefallenem Harnstoffderivat nitriert und das Lösungsmittel von dem Filtrat abgedampft Der rohe Rückstand (—0,25 mMol) wurde in Methylenchlorid gelöst, und nach Zugabe von (acach Cr(acac)NH₂ (0,14 g, 0^8 mMol) wurde das Reaktionsgemisch 36 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Der bei der Reaktion entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und der nach Abdampfen des Lösungsmittels von dem Ritrat erhaltene Rückstand durch Chromatographie über eine Silicagelsäule gereinigt Man erhielt 30 mg des reinen Produktes, 14-1, (einzelner Punkt bei Dünnschichtchromatographie und IR(CHCl₃) y (cm¹) 1740, 169Q, 1580, 1450, 1380.

(acac),Cr(acac)—NHCO — CH₂-N Ν—CH₂CO-NH-(acac)Cr(acac)₂ 14-1

O

(B) Das oben unter (A) beschriebene Verfahren wurde mit dem Mono-carboxymethylderivat (0,13 g, &

0,5 mMol) wiederholt, mit der Ausnahme, daß die endgültige chromatographische Reinigung mit Hilfe einer ||

FlorisilsäuleO,15-0,25 mm(60-100 mesh) durchgeführt wurde. Man erhielt 50 mg reines Produkt 14-2(einzel- i

ncr Punkt im Dünnschichtchromatogramm und IR(CHCIj), ν (cm"¹) 1740, 1640, 1580, 1520, 1380;) 50 £

Si CH, I

1 a

\ ^5ä ·*

HN N — CH₂CONH-« ^Ctfacacfc ί

■o ;

⁰ CH, Si

14-2 ^:

Beispiel 15 Synthese von Platin-markiertem Östronhapten

AO

15-1

[(C₆H₅)jP],Pt

15-2

A.O

PiC₆H₅),

15-3

Eine Lösung von Tetrakis-(triphenylphosphin)-platin, 15-2, (0,25 g, 0,2 mMol) und 16-Brom-östronacetat, 15-1 (0,1 g, 0,26 mMol) in 8 ml Benzol wurde 2 Stunden unter Stickstoffatmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde dann mit einem Stickstoffatom entfernt, der Rückstand mit mehreren Anteilen (6 x 20 ml) heiBem Petroäther gewaschen, um freies Triphenylpnosphin zu entfernen. Der Rückstand wurde dann in Methanol gelöst, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal aus MethylenchloridJHexan umkristallisiert. Man erhielt 70 mg (32%) farblose Kristalle, die unter Zersetzung bei 265-267°C schmolzen und im Dünnschichtchromatogramm einen einzigen Punkt zeigten (Rf- 0,57, Silicagel, 2% MeOH in CHCI,).

IR(KBr-Tablette), v(cm"'), 690 (vs), 740 (vs), 1000 (m), 1090 (vs), 1165 (m), 1190 (m), 1210 (s), 1435 (vs), 1485 (vs), 1745 (vs), 1765 (s), 2910 (s), 3050 (s).

NMR(CDjCl_:), δ (ppm): 7,3 breit, (C₆Hs)₃P und steroid-aromatische Protonen); 2,25 (Singulett, CH₃CO), 1,15 (Singulett, anguläres CH₃) und breite Resonanz zwischen 3,0 und 0,5 aliphatische Steroidprotonen.

Beispiel 16

Synthese von Mangan-markiertem Östron-Hapten O

16-1

OC CO CO

16-2

OC CO CO

AO

16-3

Eine Lösung von I6-Bfom-Östronacetat, 16-1 (55 mg, 0,014 mMol) und Natriumeymantrenylsulfinat, 16-2, (55 mg, 0.019 mMol) in DMF (1 ml) wurde 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen und Zugabe von 5 ml Wasser wurde das Reaktionsgemisch mit 3 x 10 ml Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde durch präparativc Dünnschichtchromatographie gereinigt. Man erhielt 23 mg der Östron-sulfon-Verbindung 16-3, Fp. 170-175°. IR(CHCl,), (cm"¹) 3020 (w), 2940 (m), 2020 (w), 2020 (vs), 1970 (vs) (terminale Metallcarbonyle), 1755 (s). 1675 (m). NMR(CDCl₃), δ (ppm) 7,4 und 6,8 (aromatischer Ring 3H); 5,5 und 4,9 (Cyclopentadienyl-protonen, 4H); 2,8-0,6 komplexe Resonanz der aliphatischen Steroidprotonen. Das Massenspektrum mit hoher AuI-

lösung zeigte als Haupt-Peak das molekulare Ion mit einem Verlust von drei Metallcarbonylen. Berechnet für C₂₅H₂₇O₅MnS(M-S CO), 494,5; gebunden 494,0960.

Beispiel 17 Synthese von Platin-markiertem Östriolhapten

OCH₃ OCH₃

CH₃O CH₂Cl

17-2 20

Stufe I - Synthese von Chlormethyl-trimethoxyöstriol

Eine Lösung von Trimethoxy-östriol, 17-1 (0,1 g, 0,29 mMol) und 3 Tropfen Methyl-chlormet^-yläther in 1 ml Eisessig wurde 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Temperatur wurde dann auf 60⁰C erhöht und in Intervallen von 3 Stunden 2mal Anteile von 3 Tropfen zugegeben. Das gekühlte Reaktionsgemisch wurde mit 40 ml Wasser verdünnt und der weiße Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Exsikkator über P₂O₅ getrocknet. Beim Reinigen durch präparative Dünnschichtchromatographie (Silicagel, 2% Methanol in Chloroform) ergab ein Produkt (40 mg, 38%), das durch NMR-Spektroskopie als Gemisch der beiden Isomeren, 2-Chlormethyl- und 4-Chlormethyl-trimethoxyöstriol, 17-2, identifiziert wurde.

Stufe II - Umsetzung von 17-2 mit Tetrakis(triphenylphosphin)-platin

Eine Lösung des in Stufe I erhaltenen chlormethylierten Gemisches (40 mg, 0,1 mMol) und [(Q,H₅),P].,Pt (85 mg, 0,068 mMol) in Benzol (7 ml) wurde 3 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluß erhitzt. Beim Aufarbeiten nach dem in Beispiel 15 angegebenen Verfahren erhielt man eine Verbindung, die durch zweimalige aufeinanderfolgende präparative Dünnschichtchromatographie (Silicagel, 2% Methanol in Chloroform) gereinigt wurde. Man erhielt 40 mg (67%) der Platinverbindung 17-3, Fp. 135-140⁰C.

•sA^"" :

j(Cm-'), HOO(s), 1120 (vs), 1170 (vs), 1315 (m), 1385 (m), 1440 (vs), 1490(m), 1600(s),verschiedene schwache Banden zwischen 1680-1990, 2880 (s) und 2940 (s). NMR(CDCIj) δ (ppm), 7,45 (breites Multiplen (C₆H₅)₃P Protonen und aromatische Steroid-Protonen), 3,80 (breites SinguIett),3,50 (Singulett) und 3,35 (Singulett) für3 Methoxy-CHj-Gruppen; 3,0-1,0 (aliphatische Steroidprotonen); 0,90 (Singulett) und 0,75 (Singulett). Die angulären Methylgruppen der beiden Isomeren, 17-3.

Beispiel 18

Synthese von Gold-markiertem Östradiol-hemisuccinat-Hapten
O

ίο

20 25

40 45 50 ⁵⁵ 60 65

KO

Il

OC(CH₂)ICO—NH

I I

N ' N + (C₆Hs)₃PAuOCCH₃

HN-N

18-1

18-2

OCOiCH^CONH

! Ql- Ao-

N-N

HO

18-3

Stufe I

Der entsprechend Beispiel 6, Stufe I, aus E₂(HS) - COOH (0,186 g, 0,5 mMol), NHS (0,075 g, 0,65 mMol) und DCC (0,146 g, 0,71 mMol) erhaltene aktive Ester von Östradiolhemisuccinat wurde umgesetzt mit 5rAminotetrazol (0,1 g, 1,0 mMol) in 5 ml DMF. Nach 15 Stunden langem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch ein 2phasiges Äthylacetat-Wasser-System (50 ml: 10 ml) extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde abgetrennt, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol umkristallisiert, wobei ein weißes Produkt zurückblicb (0,06 g, 22%), Fp. - !95⁰C. Das !R- und NMR-Spektrum zeigte, daß es dasTetrazoI-sübstituierte Amid 18-1 war.

IR(KBr), V(Cm"¹): 1730 (sh), 1710 (s), 1630 (s), 1580 (m).

NMR(CDjOD), δ (ppm) war im wesentlichen identisch mit demjenigen der Verbindung E₂(HS) - COOII,

auiier der Abwesenheit der COOH-Resonanz.

Stufe II

Eine Lösung von Triphenylphosphin-goldacetat, 18-2 (0,06 g, 0,11 mMol) in 5 ml Methanol wurde mit einer Lösung von 18-1 (entsprechend Stufe I hergestellt) (0,052 g, 0,12 mMol) in 5 ml Methanol vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und nach Entfernung des Methanols wurde der Rückstand mit 3 x 10 ml Tetrahydrofuran extrahiert. Die vereinigten THF-Auszüge wurden filtriert und Diäthyläther zugegeben bis sich ein Feststoff abschied. Dieser wurde abfiltriert und aus THF-Diäthyläther umkristallisiert. Man erhielt das Goldderivat 18-3 in Form weißer Kristalle (0,035 g, 35%). Das NMR-Spektrum (DMSO-d,,) zeigte die Triphenylphosphinresonanz mit Mittelpunkt bei δ 7,7; die aromatische Protonen der Steroidgruppe bei δ 7,0 und 6,55; die

O O

Il Il

—C —CH₂-CH₂-C-Protonen

mit Mittelpunkt bei δ 2,7; die anguläre Methylgruppe bei δ 0,68 und die breite Resonanz der aliphatischen Protonen der Steroidgruppe zwischen δ 3,0-0,9.

Beispiel 19

Synthese von Mangan-markiertem l,3,5-Östratrien-3-ol-17-amino-Haptenen

NH₂

Cym-COON

19-2

HO

19-4

!9-1

Cym- C -(C Hj)₂-

19-3

NH -CO-(CH,)₂- C

OC CO CO

19-5

Cym = (CO)₃MnC₅H₄

Stufe I - Synthese des Cymantrenoyl-N-succinimid-Esters 19-2

Eine Lösung von Cymantrenylcarbonsäure, Cym - COOH, (0,25 g) und N-Hydroxysuccinimid (0,12 g) in THF wurde mit 0.23 g DCC 2 Stunden bei 0°C unter Stickstoff behandett. Es wurde weitere 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, zur Entfernung des ausgefallenen Harnstoffs filtriert und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde durch das IR- und NMR-Spektrum identifiziert als der aktive Ester 19-2. Dieser wurde für die nächste Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.

Stufe II - Umsetzung von 19-2 mit l,3,5-Östratrien-3-ol-17-amin E, - NH₂

Der oben in Stufe I erhaltene aktive Ester wurde umgesetzt mit einer Lösung von E, - NH_:(0,27 g, 1,0 mMol) in IO ml THF unter Stickstoff. Nach 15stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand mit einem 2-Phasen-System von Äthyiacetat und Wasser extrahiert. Die Äthylacetaischicht wurde abgetrennt, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingedampft. Beim Reinigen durch preparative Dünnschichtchromatographie erhielt man 0,26 g (53%) der reinen Verbindung, Fp. 120-12I⁰C. Das IR- und NMR-Spektrum sowie das Massenspektrum zeigten, daß es das Cymantrenylderivat 19-4 war. Das IR-Spektrum zeigte die typischen Metallcarbonylabsorptionen bei 2050 und 1920 cm' unddie Amidbanden bei 1680 und 1540 cm"¹. Das NMR-Spektrum (CDCl₃) δ (ppm) zeigte die aromatischen Östroge..· protonen bei 7,16 und 6,60, die Protonen des Cyclopentadienylringes bei 5,33 und 4,75, die anguläre CHj-Gruppe bei 0,7 und die aliphatischen Steroidresonanzen zwischen 3,0-0,9. Das Massenspektrum mit hoher Auflösung zeigte das Molekularion bei m/e 501,1327 (berechnet 501,4) und den Haupt-Peak (M-3 CO) bei m/e 417,1783.

Stufe III - Synthese des +-Oxo^-cymantrenyl-butanoat-N-succinimidesters, 19-3

Der aktive N-Succinimidester 19-3 wurde nach dem oben in Stufe I beschriebenen Verfahren hergestellt aus 4-Oxo-4-cymantrenylbuttersäure (0,29 g, 0,7 mMol), N-Hydroxysuccinimid (0,08 g, 0,7 mMol) und DCC (0,18 g, 0,77 mMo!) in THF.

Stufe rv - Umsetzung von 19-3 mit l,3,5-Östradien-3-ol-17-amin E, - NH₂

Der oben in Stufe III erhaltene aktive Ester wurde nach dem in Stufe II beschriebenen Verfahren umgesetzt mit E₁ - NH₂. Das in 33%iger Ausbeute erhaltene Endprodukt 19-5 zeigte im IR-Spektrum (CHCI₃) die Metallcarbonylbanden bei 2015 und 1950 cm"¹ und die Amidbanden bei 1670 und 1500 cm"¹. NMR-Spektrum(CDCI-,) δ (ppm): 7,2 und 6,6 (aromatische Protonen); 5,5 und 4,9 (Cyclopentadienyl-Protonen);

ο ο

Il Il

2,8(— C —(C Η₃)₂~ C-Protonen) 5 0,66 (anguläres CII,) 2,5-0,9 (aliphatische Steroidprotonen).

Beispiel 20
Synthese von Kobalt-markiertem l,3,5-Östratrien-3-ol-17-amino-Hapten

O NH₂

Co⁺ PF₆-

HO

20-1 20-2 20-3

Stufe I - Synthese von Kobalticenium-carboxylat-N-succinimidester, 20-2

Eine Lösung von DCC (0,206 g, 1,0 mMol) in 10 ml frisch destilliertem Acetonitril wurde bei 0⁰C zu einer Lösung von Cobalticeniumcarbonsäure-hexafluorphosphat (0,378 g, I₁OmMoI) und N-Hydroxysuccinimid (0,115 g, 1,0 mMol) in 15 ml Acetonitril gegeben. Nach 2 Stunden langem Rühren bei 0⁰C ließ man die Lösung a; ;f Raumtemperatur kommen, und es wurde weitere 24 Stunden gerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Harnstoffs wurde das Lösungsmittel abgedampft. Man erhielt 0,47 g des aktiven Esters, 20-2 IR(KBr) ν (cm '): 3100, 2895,2810,1820, 1790 (s), 1750 (s), 1470, 1425,1410,1380,1270 (s), 1200 (s), 1100 (s), 1010,900,830 (s). NMR-( Aceton-d₆) zeigt die Absorption des ungesättigten Cyclopentadienyls bei δ 6,2 (Singulett) und der substituierten Cyclopentadienylprotonen bei 6,3 δ (Triplett) und 6,65 δ (Triplett).

Stufe II - Umsetzung von 20-2 mit E, - NH₂

Eine Lösung des aktiven Esters 20-2 (0,47 g), die entsprechend Stufe I hergestellt worden war, und E, - NI I₂ (0,273 g) in 15 ml Acetonitril wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abfiltrieren wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand (0,693 g) in möglichst wenig Aceton gelöst. Die Acetonlösung wurde 2 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt und zur Entfernung ausgefallener Verunreinigungen filtriert. Das Acetonfiltrat wurde mit Wasser verdünnt und der gelbe Niederschlag abfiltriert, mit einigen Anteilen Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 0,46 g des Kobalticenium-östrogenderivats 20-3.

IR(KBr), (cm"¹): 3250, 3100, 2920 (s), 2850, 1775, 1700 (s), 1625 (s), 1500, 1420, 1390, 1270,

1250(s), l?.20(s), 1160, 1100, 840 (s).

NMR(Aceton-d_ft) (ppm): 5,95 (Singulett, unsubstituierter C₅H₅-Ring); 7,2-6,15 (aromatische Steroidprotonen und die beiden Tripletts des substituierten Cyclopentadienylringes);
0,9 (anguläres CH₃), 2,8-1,0 (aliphatische Steroidprotonen).

Beispiel 21

Immunologisches Bestimmungsverfahren mit Hilfe einer Sephadex-Säure

und einem Kobalt-markierten Metallhapten

Eines der üblicherweise zur Trennung der »gebundenen« und »freien« Haptene bei dem Antikörper-Antigen-Gleichgewichts-System angewandten Standardverfahren ist die Gelfiltration mit Adsorbentien vom Sephadex-Typ. Die folgende Beschreibung der Ergebnisse zeigt, wie ein derartiges Verfahren mit Metallhaptenreagenticn angewandt werden kann und als Grundlage dienen kann zur Optimierung einer Metallimmunologischen-Bestimmung, bei der eine derartige Trennung erforderlich ist

Stufe I - Herstellung der Säulen und Reagentien

(A) Kleine Säulen mit Sephadex G-10 wurden in Kolben von 3 mi Kunststoffspritzen hergestellt, die am Boden poröse Polyäthylenscheiben enthielten. Das Sephadex G-10 konnte über Nacht in Wasser quellen. Nach Entfernung der feinen Anteile durch wiederholte Suspension in entionisiertem Wasser wurde das überste-

30

hcnde Wasser so vollständig wie möglich entfernt und das Sephadexgel dreimal in 0,01m Phosphatpuffer, pll 7,5, suspendiert. Das Sephadsx konnte sich 2 Stunden absetzen, dei überstehende Puffer wurde entlernt und ein gleiches Volumen frischer Puffer zugegeben, um eine 50%ige Suspension zu erhalten. Während die Suspension heftig gerührt wurde, wurden 2 ml der Aufschlämmung in jeden Spritzenkolben pipettiert. Nachdem überschüssiger Puffer abgezogen worden war, (1 ml) wurde die Austrittsöffnung der Spritze mit einer Kappe verschlossen und die Säulen, enthaltend 1 ml Sephadex-G-10-Gel, waren für die Verwendung fertig.

(Ii) Eine Vorralilösung (93,35 μg Co/ml) des mit Kobaltmarkierten Östrogen-Haptens 20-3, das entsprechend Beispiel 20 hergestellt worden war, wurde in 40% DMF - dreifach destilliertem Wasser, zu dem 0,2% (Vol.) superreiner Saltetersäure zugegeben worden waren, zubereitet. Verdünnte Standards (im Bereich von 0 bis 0,4 (ig Co/ml) wurden in Duplikaten in 15% DMF/0,01m Phosphatpuffer hergestellt und jede AA-Messung doppelt durchgerührt, um die Eichkurven zu erhalten.

(C) Das angewandte Anti-Östradiol-hemisuccinat-Antiserum R-27, Pool VII, besaß eine Konzentration von 4,2 x 10"^sm Antikörper-Bindungsstellen. Zum Vergleich wurde normales Kaninchenserum, R-49, bei den Versuchen angewandt. is

Stufe II - Bestimmungsverfahren

^vier Säulen, die· entsprechend Stufe I (A) hergestellt worden waren, wurden mit den Ziffern 1 bis 4 nummeriert und dem Index a oder b, um die Duplikate der gleichen Säulen anzugeben, z. B. la, Ib; 2a, 2b; usw. Die Saulen 1,3 und 4 dienten zum Vergleich und die Säule 2 für die Bestimmung. Die Vorratslösung aus Stufe I (B) wurde verdünnt, um eine Arbeitslösung des Metallhaptens (2,43 ag Co/ml) zu erhalten. Die aufeinanderfolgende Zugabe der Reagentien ist in Tabelle 21-1 zusammengestellt:

Tabelle 21-1

Reihenfolge der Zugabe der Säulen-Nr.

^Reagentien la Ib 2a 2b 3a 3b 4a 4b

(l)Metallhaptenlösung(ml) 0.24 0.24 0.24 0.24 -

Pufferlösung (ml)

(2) Pufferlösung (ml)

(3) Antiserumlösung (ml)

Pufferlösung (ml) 0.2 0.2 - - 0.2 0.2 - -

(4) Pufferlösung (ml)

(1) Ein konstantes Volumen (0,24 ml) der Metallhapten-Arbeitslösung wurde zu den Säulen 1 und 2 gegeben (0,24 ml, entsprechend einem absoluten Wert von 0,58 ug Co) und das gleiche Volumen (0,24 ml) der Pufferlösung wurde zu den Säulen 3 und 4 gegeben. Die Säulen konnten ablaufen, und die aus jeder Säule auslaufende Flüssigkeit wurde in Polyäthylen-Reagensröhrchen gesammelt, und es zeigte sich bei Untersuchung auf Co durch AA, daß kein Kobalt vorhanden war.

(2) In der nächsten Stufe wurde die Auslaßöffhung der Säulen mit einer Kappe verschlossen, 1 ml Puffer zu jeder Säule zugegeben, und nach Vermischen des Gels mit einem Vortex-Mischer konnten die Säulen ablaufen, und die auslaufenden Flüssigkeiten wurden, wie oben, gesammelt und durch AA auf Co untersucht. Die aus den Säulen 1 und 2 ausgelaufenen Flüssigkeiten ergaben im Mittel 0,12 ag Co, und in den ausgetretenen Flüssigkeiten aus den Säulen 3 und 4 fand sich keines.

(3) Zu jeder Säule wurde ein Volumen von 0,2 ml Antiserum zu den Säulen 2 und 4, bzw. Pufferlösung zu den Säulen 1 und 3 gegeben. Die abgezogenen Flüssigkeiten aus allen Säulen zeigten durch AA keinen Kobaltgehalt.

(4) Die Säulen wurden 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zweimal 1 ml Puffer zu jeder Säule zugegeben und die Flüssigkeiten getrennt gesammelt. Bei AA-Untersuchung auf Co zeigten die aus den Säulen ausgetretenen Flüssigkeiten die unspezifische Entfernung weiterer 0,13 ag Co von den nach Stufe (2) in der Säule verbliebenen 0,46 ag Co. Die Flüssigkeit von der Bestimmung aus der Säule 2, der das Antiserum zugesetzt worden war, zeigte einen Gehalt von 0,43 ;xg Co, entsprechend einer 94%igen Rückgewinnung des ursprünglich auf die Säule aufgebrachten Metallhaptens. Die aus den Säulen 3 und 4 austretenden Flüssigkeiten zeigten, wie erwartet, kein Co.

Bei einem weiteren Vergleichsversuch, bei dem die zu der Säule 2 zugesetzte Antikörperlösung ersetzt wurde durch y-GIobuline von normalem Kaninchenserum, betrug die unspezifische Elution von Metallhapten in beiden Säulen 1 und 2 zwischen 0,18 und 0,25 ag Co.

Das oben beschriebene Sephadex-Säulen-Verfahren entsprach dem in der Literatur angegeben (Clin. Chem., 21,1805 (1975)) für ein radioimmunologisches Bestimmungsverfahren von Östriol. Es ist selbstverständlich, daß die in diesem Beispiel 21 angegebenen Arbeitsbedingungen von dem Fachmann optimiert werden können, um die nicht-spezifische Elution von Hapten zu verringern Und die für jedes einzelne zu bestimmende Hapten günstigsten Arbeitsparameter festzulegen.

—	—	—	—	0.24	0.24	0.24	0.24
1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
-	-	0.2	0.2	-	-	0.2	0.2
0.2	0.2	-	-	0.2	0.2	-	-
2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0

ti", Il I

Beispiel 22

Immunologische Bestimmung durch Ammoniumsulfat-Präzipitation mit einem

kobalt-rnarkierten Metall hapten
5

Ein verhältnismäßig einfaches und billiges Verfahren zur Trennung der »gebundenen« und »freien« Haptcnc bei dem Antikörper-Hapten-Gleichgewichtssystem ist die Proteinausfällung durch Zugabe einer konzentrierten Lösung eines Salzes, wie Ammonium- oder Natriumsulfat. Dabei wird die »gebundene« Komponente ausgefällt und die »freie« Komponente bleibt in Lösung, und die Menge des markierten Haptens kann entweder in dem Niederschlag (Präzipitat) oder der überstehenden Flüssigkeit bestimmt werden. Die folgende Beschreibung der Ergebnisse zeigt ein nicht-optimiertes Beispiel Tür eine Anwendung eines derartigen Verfahrens unter Verwendung von Metallhapten-Reagentien. Die Optimierung der Arbeitsbedingungen kann leicht für jedes einzelne Hapten entwickelt werden.

Stufe I - Herstellung der Reagentien

Eine Vorratslösung von Kobalt-markiertem Östrogen 20-3 wurde wie in Beispiel 20, Stufe I, (B) hergestellt n.it einer Konzentration von 93,35 ag Co/ml. Die Arbeitslösung (1,86 μg Co/ml) für Eichstandards wurde hergestellt unter Verwendung von 100 al Vorratslösung, 10 al superreiner Salpetersäure (65%) und mit 0,0 Im Phosphaiiüsung auf ein Volumen von 5 ml gcbiächi. Die AfbciisiöSüng (0,187 μ§ Cü/ffiS) für die Antikörper-! iäptCfi-Reaktionen wurde hergestellt unter Verwendung von 50 μΐ der Vorratslösung, 3,73 ml DMF, 50 μΐ superreincr Salpetersäure (65%) und Ergänzung mit 0,01m Phosphatpuffer auf 25 ml.

Das angewandte Anti-östradiol-hemisuccinat-Antiserum, R-27, Pool VIII, besaß eine Konzentration von 7,84 x 10~⁵m Antikörperstellen. Zum Vergleich wurde normales Kaninchenserum NRS R-49 angewandt.
Die Ausfällösung wurde hergestellt aus 7,6 g Ammoniumsulfat, 12 ml Wasser und 1,5 ml Dimethylformamid.

Stufe Π - Verfahren zur Bestimmung der Arbeitsbedingungen

1. 20 Halbmikro-Polyäthylen-Röhrchen wurden la, Ib, 2a, 2b bis zu 10a, 10b nummeriert, um jeweils Duplikate zu erhalten.

2. Ein festes Volumen (100 u!)derMetallhaptenarbeitslösung(0,187 μg Co/ml) wurde in jedes der Röhrchen 1 bis 9 pipettiert. In die Röhrchen 10 wurden 100 μΐ Phosphatpuffer anstelle des Metallhaptens pipettiert.

3. Anteile von 10,20,30 und 50 al NRS wurden zu den Röhrchen 1,2,3 bzw. 4 gegeben und dienten als Vergleich für die nicht-spezifische Adsorption.

4. Anteile von 10,20,30,40 und 50 al Antiserum wurden in die Röhrchen 5,6,7,8 bzw. 9 gegeben, sowie 50 μΙ Antiserum in Röhrchen 10.

5. Alle Röhrchen wurden mit einem Vortex-Mischer gemischt und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

6. Ein konstantes Volumen (200 al) Ammoniumsulfatlösung wurde in jedes Röhrchen gegeben und mit einem Vortex-Mischer vermischt.

7. Nach 20 Minuten langem Zentrifugieren mit 2000 g bei Raumtemperatur wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen, die Teströhrchen wurden auf Papier umgedreht und konnten 5 Minuten lang ablaufen.

8. Ein konstantes Volumen (100 al) einer Phosphatpufferlösung wurde zu jedem Röhrchen zugegeben, und nach dem Vermischen mit einem Mischer wurden gleiche Anteile (30 μΐ) mit einer Eppendorf-i'ipette abgezogen und in die Graphitkammer des Meßgeräts für die Atomabsorption eingespritzt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Präzipitate aus den Röhrchen 1 bis 4 (NRS-Vergleich) sowie Röhrchen 5 (10 μΐ Antiserum) und Röhrchen 10 (kein Hapten zugesetzt) 6% oder weniger »gebundenes« Kobalt-markiertes Hapten enthielten. Die Röhrchen 6,7,8 und 9 enthielten 50,68,76 bzw. 85% »gebundenes« Kobalt-markiertes Hapten.

so Ein ähnlicher Versuch wurde durchgeführt unter Verwendung eines festen Volumens Antiserum (30 μΐ) und Zugabe unterschiedlicher Volumina (20 bis 100 μΐ) Metallhapten und Ergänzung der Differenz zu einem konstanten Volumen (130 al) mit Phosphatpuffer. Diese beiden Versuchsreihen erfordern die geeignete Auswahl entsprechender Gemische von Antisera und Metallhaptenverdünnungen für eine Konkurrenz-Bindungsbestimmung.

H,C

Beispiel 23 Synthese eines Palladiumreagenses und eines Palladium-markierten Östrogen-Haptens

K^PdCL

^COOH * H₃C MeOH

23-1 23-2 23-3

Stufe I — Synthese eines ff-Aliylpalladium-Sorbinsäure-KompIex-Dirners, 23-2

Zu einer Suspension von Kaliumtetrachlorpalladit, K₂PdCI₄, (2,09,6,12 mMol) in 30 ml Wasser wurden unter Rühren 1,5 g (12,3 mMol) Sorbinsäure 23-1 und anschließend 250 ml Methanol und 20 ml Wasser gegeben. Es wurde eine weitere Stunde gerührt bis alle festen Teilchen in Lösung gegangen waren. Das Reakiionsgemisch wurde auf ungefähr ein Drittel des Volumens auf einem Rotationsverdampfer im Vakuum eingedampft und der gelbe Niederschlag abfiltriert, mit mehreren Anteilen Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet Man erhielt 1,1 g (38%) gelber Kristalle, Fp. 170-173⁰C. Das IR-Spektrum (KBr) zeigte die Carbonylbande bei 1690 cm ',und das NMR-Spektrum (in Deuteropyridin) zeigte Resonanzen zur Stützung der Struktur 23-2 oder von dessen Isomer bei dem die — OCH₃-Gruppe sich in α-Stellung zu der endständigen Methylgruppe befindet: δ (ppm), 1,42 (Dublett, CH₃), 3,46 (Singulett, OCH₃), 3,72-4,65 (Multiplett, terminale AHyl-Protonen), 6,72 (Triplett, zentrales Allyl-Proton).

Stufe II — Synthese eines Tr-Allylpalladium-sorbinsäure-Komplex-Monomers, 23-2

Das in Stufe I erhaltene /r-AUylpalladiumderivat, 23-2 (0,2 j», 0,435 mMol) wurde in 5 ml Methylenchlorid suspendiert und 0,2 ml (2,6 mMol) Pyridin langsam unter Rückfluß zugetropft. Nach Zugabe des Pyridins ging der gesamte Feststoff in Lösung, und die gelbe Lösung v/urde im Vakuum eingedampft. Der feste Rückstand wurde mehrere Male mit leichtem Petroläther zur Entfernung von nicht-umgesetzten Pyridin gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 0,13 g (50%; eines geiben Feststoffes, Fp. 65-70⁰C, lös!ich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform und Methylenchlorid. Das IR-Spektrum (CHCI₃) zeigte die Carbonylbande bei 1720 cm"¹ und das NMR-Spektrum (CDCl₃) die erwarteten Resonanzen für die Struktur 23-3; δ (ppm): 7.55 (Multiplett, Pyridin-Protonen); 6,4 (Triplett, zentrales Allyl-Proton); 3,7-4,1 (Multiplett, terminale Allyl-Protonen); 3,45 (Singulett, OCH₃); 1,4 (Dublett, terminales CH₃).

Ähnliche Monomere können hergestellt werden unter Anwendung anderer Liganden, wie von j5-Diketonaien und Cyclopentadienylen, von denen bekannt ist, daß sie die Chlorbrücken in 7r-Allylpalladium-chloriddimeren ersetzen.

Stufe III - Synthese von aktivem N-Succinimidester, 23-4

O O

OCH₃

23-3+ HO —N I H₃C^^? 1¹^-CH-COO — N | 5"

Pd

N Cl

23-4

Eine Lösung von 40 mg DCC in 2 ml THF wurde unter Rühren zu einer kalten Lösung (0⁰C) des Palladiumkomplexes, 23-3 (60 mg, 0,19 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (22 mg, 0,19 mMol) in 5 ml THF gegeben, Es «ι wurde weitere 2 Stunden bei 0°C gerührt und dann weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur. Der entstandene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und das gelbe Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit Mcthylcnchlorid extrahiert und der gelbe organische Auszug im Vakuum eingedampft. Man erhielt einen gelben Feststoff, der aufgrund des IR-Spektrums (KBr) der Succinimidester 23-4 war (v₍₍₎ 1820, 1780 und 1745 cm '). Diese Verbindung kann als allgemeines Reagens zur Markierung von Haptenen mit Palladium durch Umsetzung mit einer in dem Hapten vorhandenen funktionellen Aminogruppe dienen, wie z. B. 1,3,5-Öslratrien-3-ol-!7-amin, E| - NH₂ oder Amphetamin-(l-pheny!-2-aininopropan).

Beispiel 24

Synthese von Kobalt-markiertem Rinderseramalbumin und dessen Umsetzung mit Anti-BSA-Antikörpem Stufe I - Kobaltmarkiemng von BSA

Eine Lösung von Carboxykobalticenium-N-succinimidester (0,15 g, 0,236 mMol), der entsprechend Beispiel 20, Stufe I hergestellt worden war, in 2 ml Acetonitril wurde zu einer gekühlten Lösung von BSA (0,15 g, 2,36 X 10~⁶ Mol) in 20 ml Wasser gegeben. Nach Zugabe von einigen topfen Triäthylamin zur Einstellung ίο eines alkalischen pH-Wertes von 10 wurde das Reaktionsgemisch 48 Stunden bei 4°C gerührt. Die Lösung wurde dann gegen ein Wasser-Acetonitril-System zweimal dialysiert und dann dreimal gegen destilliertes Wasser. Beim Lyophilisieren des Dialysats erhielt man 117 mg eines gelblichen flockigen Pulvers, das sich als das BSA-Carboxykobalticenium-Konjugat erwies.

Stufe II - Bestimmung von η (Anzahl der Metallhapten-Markierungs-Moleküle) in dem BSA-Konjugat (A) Es wurden die folgenden Ausgangslösungen hergestellt:

1. BSA-Ausgangslösung (10"⁶m): 3,2 mg BSA, gelöst in 50 ml Wasser. 2. Carboxykobalticenium-Vorratslösung (10"³m): 3,2 mg Carboxykobalticenium-PF₆-Salz in 10 ml 40%iger DMF/HjO-Lösung.

3. Kobalt-markiertes BSA-Konjugat-Vorratslösung: 4,2 mg BSA-Konjugat, entsprechend Stufe I, gelöst in 50 ml 16% DMF/H,O-Lösung.

(B) Es wurden zwei Eichkurven hergestellt durch Atomabsorptionsmessungen:

Eichung (1)

Es wurde eine Reihe von Verdünnungen von Carboxykobalticeniumsalz in 15% DMF/H₂O (Gesamtvolumen von 300 ml) im Bereich zwischen 0 bis 0,39 ug Co/ml hergestellt. Die lineare Steigung der Gleichung Y = 71,654 χ + 3,296 besaß einen Korrelationskoeffizienten r = 0,9933.

Eichung (2)

Es wurde die gleiche Reihe von Verdünnungen von Carboxykobalticeniumsalz, wie bei Eichkurve (1) hergestellt, unter Zusatz eines konstanten Volumens (60 ul) der BSA-Vorratslösung auf ein Gesamtvolumen von 300 ul. Die Steigung der linearen Gleichung Y = 72,034 χ + 2,2 besaß einen Korrelationskoeffizienten r = 0,9995. (3) Die Kobalt-markierte BSA-Konjugat-Vorratslösung wurde 1 :10 und 1 :20 verdünnt und unter den gleichen Gerätebedingungen wie für die Eichkurve (2) die Atomabsorption gemessen. Die Höhe der Signale bei 22 bzw. 12 mm wurde in die lineare Gleichung für Y interpoliert und ergab eine Konzentration von 0,275 jxg Co/ml bzw. 0,136 ug Co/ml für die beiden Verdünnungen, entsprechend einer Konzentration von 2,735 ag Co/ml in der ursprünglichen BSA-Konjugat-Vorratslösung entsprechend 46,4 x 10~⁹ Co-Atomen/ml.

Da die Vorratslösung, enthaltend 4,2 mg BSA-Konjugat in 50 ml, 1,3 x 10"' BSA-Mol/ml entsprach, betrug die Anzahl der Kobalticeniumhaptene pro Mol BSA in dem markierten Konj'ugat η = 46,4 x 10 V

1,3 x 10"'»35.

Stufe III - Wechselwirkung von Kobalt-markiertem BSA-Konjugat mit Anti-BSA-Antikörpern

Ein einfaches Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung durch Atomabsorption ist in dem folgenden Beispiel angegeben:

Es wurden zwei Reihen von doppelten Röhrchen folgendermaßen hergestellt:

1) Anti-BSA-Antiserum (100 μΐ) wurde zu jedem von vier Röhrchen 1 bis 4 gegeben. Das gleiche Volumen

(100 ul) 0,01m PhosphatpulTer wurde zu jedem von weiteren 4 Röhrchen 5 bis 8 gegeben. 2) Ein festes Volumen (100 μI) voa vier Verdünnungen von BSA-Kobalt-markiertem-Konjugat, enthaltend 0,23,0,47,0,94 bzw. 1,88 ;ig Co/ml (oderO,8,1,6,3,1 bzw. 6,2 μgBSA-Konjugat/100μl Probe) wurde zu den Röhrchen 1 bis 4 zugegeben und entsprechend zu den Röhrchen 5 bis 8. 3) Die Lösungen wurden mit Hilfe eines Vortex-Mischers vermischt und eine Stunde bei 37°C und dann 48 Stunden bei 4⁰C inkubiert. 4) Die Röhrchen wurden 30 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert.

5) Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Hilfe der Atomabsorption auf Co untersucht.

Die für die Röhrchen 5 bis 8 erhaltenen Werte dienten zum Vergleich bzw. zur Eichung. Die Werte von den Röhrchen 1 bis 4 zeigten dann die Menge an freiem Kobalt-markiertem-BSA in Lösung (durch Differenzbildung

konnte das »gebundene« BSA-Antigen bestimmt werden). Die Atomabsorptionsmessungen wurden in die

Eichkurve interpoliert und ergaben 0,00, 0,06, 0,59 bzw. 1,25 ag Co/ml »freies« Hapten, entsprechend einer Konzentration von 0,0,2, 2,0 bzw. 4,3 ag BSA-Konjugat/100 μΙ Originalprobe in den Röhrchen I, 2, 3 bzw. 4.

Man kann das Verfahren auf verschiedene Weise variieren. Zum Beispiel ist es möglich, die Antikörperproteine mit einer Art von Metal lhapten und das Antigenprotein mit einer anderen Metallmarkierung zu markieren
und dann durch Atomabsorption jedes Metall getrennt zu bestimmen. Der ausgefällte Antikörper-Antigen-Komplcx kann gesammelt und erneut in einem geeigneten Lösungsmittel für die Atomabsorptionsmessung der
beiden verschiedenen Metalle suspendiert werden. Es ist auch möglich, das gleiche Hapten mit zwei oder men- 5 reren unterschiedlichen Metallen zu markieren. Zum Beispiel kann BSA mit einem Gemisch von N-Succinimid
aktivem Ester von Carboxykobalticenium und Carboxycymantren umgesetzt werden oder mit Carboxyferrocen
und Carboxycymantren, um das gemischte Kobalt- und Mangan- bzw. gemischte Eisen- und Mangan-markierte
BSA-Hapten zu erhalten.

35

Claims (14)

Patentansprüche:

1. Heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem P.üssigen | Medium, wobei man |

a) das flüssige Medium mit einem Mittel zusammenbringt, das einen markierten Bestandteil enthält, umfassend ein Konjugat aus einer Markierungssubstanz und einer bindenden Komponente, das mit dem Liganden ein Bindungsreaktionssystem bildet und eine gebundene Phase und eine freie Phase ergibt, wobei die Menge der Markierungssubstanz in der gebundenen Phase eine Funktion ist von der Menge des in dem flüssigen Medium vorhandenen Liganden;

b) die gebundene Phase von der freien Phase trennt und

c) die Menge der Markierungssubstanz bestimmt, die entweder in der gebundenen oder in der freien

Phase vorliegt, |

dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungssubstanz ein Metallatom oder Metallalome verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Metallatoms entwed, . in der gebundenen Phase oder in der freien Phase durch Atomabsorptions- oder -emissionspektrophotomelrie bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe von Antigenen, Haptenen und Antikörpern dazu, Hormonen, Vitaminen, pharmakoiogischen Materialien wie Arzneimittel und Drogen, Metaboliten und ihren Rezeptoren und bindenden Substanzen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Hormon oder ein Antagonist davon, ein Antibiotikum, Tranquilizer, Vitamin, Narkotikum, Cannabinoit, Barbiturat oder Alkaloid isl.

5. Mittel zur Durchführung d^s Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, umfassend

1. den nachzuweisenden Liganden,

2. einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und

3. einen markierten Bestandteil, der eine markierte Form
30

a) des Liganden,

b) eines spezifisch bindenden Analogen des Liganden oder

c) des spezifischen Bindungspartners

ist, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Bestandteil eine mit einem Metallatom markierte Substanz

6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es

1. ein Konjugat des. Metallatoms und des Liganden oder eines spezifisch bindenden Analogen davon, und 2. einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden enthält.

7. Mittel nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Bestandteil den Liganden oder ein spezifisch bindendes Analoges davon umfaßt, in den bzw. das das Metallatom eingeführt worden ist, oder der bzw. das an ein metallorganisches Derivat gebunden ist.

8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das metallorganische Derivat die Formel

μ, Li Li:L,l;l; l:

besitzt, in der M das Metallatom ist, L' bis L" Liganden oder spezifisch bindende Anlöge davor jcdeutcn, die gleich oder verschieden sein können, m eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet und n, o, p, q, r und s ganze

Zahlen von 0 bis 12 sind, vorausgesetzt, daß die Summe rr'cht größer isi als die Koordinationszahl von M„,.

9. Mittel nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das rr.stallorganische Derivat eine melallorganische Verbindung oder eine Metallkoordinationskomplex ist.

10. Mittel nach Anspruch 5 bis 9, dpdurch gekennzeichnet, daß man als Metall ein Übergangsmetall der Gruppen IB, HB, HlB. IVB, VB, VlB, VIIB und VIII des Periodensystems verwendet.

11. Mittel nach Ansr ich 5 bib 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens einen spezifischen Bindungspartner zu dem Liganden und ein daran gebundenes metallmarkiertes Konjugat umfaßt, wobei das Konjugat das Metallatom und den Liganden oder ein spezifisch bindendes Analoges davon umfaßt.

12. Mittel nach Anspruch 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner in unlöslicher Form vorliegt.

13. Mittel nach Anspruch 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es

1. ein lösliches Konjugat des Metailatoms und eines spezifischen Bindungspartner des Liganden, und

2. eine unlösliche Form des Liganden oder eines spezifisch bindenden Analogen davon

enthält.

14. Mittel nach Anspruch 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es

1. ein lösliches Konjugat des Metallatoms und eines spezifisch bindenden Partners des Liganden, und

2. eine unlösliche Form eines spezifischen Bindungspartners des Liganden

enthält.

Die Erfindung betrifft ein heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Hiermit wird eine genaue, wirksame und spezifische Analyse für kleine Mengen chemischer Verbindungen beim Menschen, bei Tieren und Pflanzen sowie ein Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungsanalysen ermöglicht.

Es besteht laufend Bedarf an schnellen und genauen quanti.ativen Bestimmungen von chemischen Substanzen, die in sehr geringen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Speichel oder Urin, vorhanden sind. Diese pharmakologischen Materialien können entweder von natürlich vorkommenden physiologisch aktiven Verbindungen stammen oder von eingenommenen Arzneimitteln und/oder deren Metaboliten. Diese Arzneimittel gehören entweder zur Gruppe der Verbindungen, die medizinisch für therapeutische Zwecke verabreicht werden, oder es Vonnen Drogen sein, die mißbräuchlich eingenommen worden sind, wie Narkotika oder andere giftige Substanzen. Von größter Wichtigkeit ist die Bestimmung von bestimmten Verbindungen, für diagnostische Zwecke, die ein Anzeichen sein können für eine ordnungsgemäße Funktion oder für einen im Körper ablaufenden Prozeß. Auch im Falle von Vergiftungen kann ein schnelles und einfach durchführbares Verfahren zur Bestimmung des Giftes bzw. Toxins außerordentlich wichtig sein, um das erforderliche Antidot zu bestimmen. Eine der wichtigsten Anforderungen an diese Bestimmung ist offensichtlich die Spezifität der Bestimmung und die Tatsache, daß die Be; timmung nicht durch andere Bestandteile der für die Analyse verwendeten Probe gestört wird. Derzeit ist dies der Hauptnachteil von vielen bekannten Verfahi en, wie der Spektrophotometrie im UV- und sichtbaren Bereich, der Fluorometric, Massenspektrophotometrie, chromatographischer Verfahren, bei denen verschiedene Grade von Unspezifität und Störungen dazu führen können, daß diese Verfahren nicht praktisch anwendbar sind. In letzter Zeit ist in einer Spezialaustube des Journal of Chromatographie Science, 1974, (Band 12, Seiten 209-336) unter dem Titel »Analysis of Drugs of Abuse« eine seht komprimierte Zusammenfassung des Standes de" Technik derartiger Verfahren veröffentlicht werden.

Die Entwicklung analytischer Verfahren, bei denen spezifische Bindungsbestimmungen in den Bereich der Untersuchung von Flüssigkeiten ein- oführt wurden, wie Bioflüssigkeiten, auf Liganden, wie pharmakologischer Mittel, hat /u einer starken Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit geführt. Bei den bekannten Methoden können die folgenden vier spezifischen Bindungsbestirrsrr.ungen erwähnt werden: radioimmunologische Bestimmung (RIA), Bestimmung mit Hilfe freier Radikale (FRAT), Hämagglutinationshemmung (HI) und Enzym-vervielfältigte immunologische Bestimmungen (EMIT). Spezifische Bindungsbestimmungen beruhen auf dem Prinzip der Überwachung spezifischer Bindungsreaktionen, bei denen das Ausmaß der Bindung-. ne Funktion der Menge eines vorhandenen unbekannten Liganden ist, mit Hilfe einer markierten Komponente.

Im folgenden sind Beispiele angegeben, wie nach bekannten Verfahren eine Droge bzw. ein Arzneimittel, das eine Art eines durch spezifische Bindungsverfahren bestimmbaren Materials ist, bestimmt wird (im folgenden als pharmakologisches Material bezeichnet).

Bei der radioimmunologischen Bestimmung wird das pharmakologische Material mit einem radioaktiven Isotop, wie z. B. ¹²⁵J oder '⁴C markiert. Nachdem das Gemisch aus nicht markiertem Material, markiertem Material und Antikörper ein Gleichgewicht erreicht hat, wird das an den Antikörper gebundene Material nach einem üblichen Verfahren, z. B. durch Präzipitation bzw. Ausfällung mit Ammoniumsulfat, abgetrennt. Die Menge an freiem und/oder gebundenem markierten Material wird bestimmt durch Messung der Radioaktivität der überstehenden Flüssigkeit oder des Präzipitats. Obwohl dieses Verfahren sehr empfindlich und spezifisch ist, besitzt es den erheblichen Nachteil, daß radioaktive Substanzen angewandt werden müssen, die Erfahrung bei der Handhabung und aufwendige Apparaturen erfordern und bei der Beseitigung Probleme ergeben. Diese speziellen Erfordernisse verbieten die verbreitete und allgemeine Anwendung derartiger Bestimmungen, insbesondere in kleinen Laboratorien.

Bei der Bestimmung mit Hilfe freier Radikale wird ein Spin-markiertes Hapten synthetisiert, indem man ein verhältnismäßig kleines Nitroxidmolekül an das pharmakologische Material bindet. Haptene sind bekanntlich definiert als Substanzen, die bei der Injektion aufgrund ihrer geringen Größe selbst nicht zur Bildung von Antikorpern führen, aber wenn sie an größere Trägermoleküle gebunden sind, die Bildung von Antikörpern, die zu dem freien Hapten spezifisch sind, einleiten können. Substanzen mit Ireier Umorientierung bzw. Spin-Austausch führen /u sehr scharfen Elektronen-Spin-Resonanz-Spektren. Wenn das Spin-markierte Hapten mit dem Antikörper einen Komplex gebildet hat, nimmt die Umorientierungsgeschwindigkeit ab, was zu einer Linienverbreiterung im Elektronen-Spin-Resonanz-Spektrum führt. In Gegenwart des pharmakologischen Materials wird das Spin-markierte Hapten verdrängt und eine Verstärkung des Elektronen-Spin-Resonanz-(ESR)-Signals beobachtet. Die Menge an nicht-gebundenem pharmakologischen Material ist proportional der Intensität des Elektronen-Spin-Resonanz-Peaks. Eine unbekannte Konzentration kann bestimmt werden durch Vergleich der Höhe des ESR-Peaks mit derjenigen von Standards. Der Nachteil dieses Verfahrens sind die aufwendige Ausrüstung, die erforderlich ist und die verhältnismäßig geringe Empfindlichkeit.

Bei der Hemmung der Hämagglutination werden rote Blutkörperchen mit dem Komplex aus pharmakologischem Material und Trägerprotein überzogen. In Abwesenheit des pharmakologischen Materials führen die