FR2613490A1 - Dosage immunologique infrarouge - Google Patents

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Gerard Jaouen
Ashraf A Ismail
Pierre Brossier
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN NOUVEAU TYPE DE DOSAGE IMMUNOLOGIQUE DENOMME " IRIA ". SELON LA PRESENTE INVENTION, ON UTILISE UN MARQUEUR PORTANT DES FONCTIONS CARBONYLES LIEES A AU MOINS UN METAL. L'INVENTION CONCERNE EGALEMENT UNE DETECTION DU MARQUEUR QUI EST REALISEE PAR UN DISPOSITIF DE SPECTROSCOPIE INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE FOURIER. L'INVENTION CONCERNE EGALEMENT UN DISPOSITIF DE SPECTROSCOPIE IR A TRANSFORMEE DE FOURIER QUI COMPORTE SEPAREMENT OU COMBINES ENTRE EUX LES ELEMENTS SUIVANTS : UN DETECTEUR INSB; UNE FENETRE SPECTRALE REDUITE; UNE CELLULE A LONG PARCOURS DE LUMIERE ET FAIBLE DIAMETRE; UN ECHANTILLON A DOSER LIQUIDE AVEC, DE PREFERENCE, UN SOLVANT QUI N'ABSORBE PAS OU PEU DANS LA REGION 2200-1800 CM-1.

Description

La présente invention concerne un nouveau type de dosage immunologique et un nouveau type de dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier utile pour lesdits dosages.
Les méthodes immunologiques sont des techniques analytiques puissantes, très sélectives qui permettent le dosage de très faibles quantités d'analyte. Leur utilisation tient une place prépondérante en analyse clinique. En effet, l'interaction entre un antigène et des anticorps correspondant peut être extrêmement spécifique.
Le principe général de ces méthodes est toujours basé sur le fait que des anticorps (Ac) reconnaissent, puis se lient de manière spécifique aux antigènes qui lui ont donné naissance pour donner un complexe antigène-anticorps selon la réaction équilibrée suivante
Figure img00010001
Si l'antigène est remplacé par le même antigène marqué (Ag.M0), on aura un autre équilibre possible
Figure img00010002

avec MO = marqueur.
A l'origine, ce sont BERSON et YALLOW (1959) qui ont introduit ce concept où intervenait un marqueur radioactif. Cette technique de dosage RADIO
IMMUNOLOGIQUE s'est largement développée depuis, bien que présentant de très sérieux inconvénients : risques pour la santé, prix de revient élevé, utilisation réglementée .... C'est pourquoi, de nombreux autres marqueurs "non isotopiques" ont été envisagés. Les principaux sont : les enzymes, les marqueurs fluorescents ou chimiluminescents, les marqueurs de spin et plus récemment les marqueurs métalliques.
L'invention a donc pour objet un nouveau dosage immunologique dénommé IRIA ("INFRA/RED IMMUNO
ASSAY"), caractérisé en ce qu'on utilise un marqueur portant des fonctions carbonyles liées à un métal.
Le principe de dosage est le suivant.
L'antigène marqué (Ag-M(CO)) et l'antigène à doser non marqué (Ag) sont mis en compétition en proportions variables en présence d'une faible quantité d'anticorps (Ac). Après séparation des fractions liées et libres, on évalue le traceur dans l'une des deux fractions par la mesure de l'intensité des signaux correspondant aux fréquences caractéristiques des groupements carbonyles. La détermination d'un échantillon inconnu se fait par comparaison à une courbe standard réalisée avec de l'antigène pur non marqué.
Cette méthode de dosage immunologique permet de déterminer quantitativement de très faibles quantités de drogues dans divers milieux biologiques (plasma, urine, salive, etc.) chez l'homme, l'animal ou les plantes.
La détection est réalisée par un dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.
Cette technique garde les caractères de spécificité de la réaction immunologique et se révèle être suffisamment sensible pour être appliquée au dosage de nombreux médicaments.
L'utilisation de techniques spectroscopiques d'analyses, utilisant 11 infrarouge comme méthode d'évaluation de marqueurs constitués par des complexes de métaux carbonyles, est très intéressante, car ces complexes présentent des bandes I.R. spécifiques dues aux carbonyles liés à un métal dans la région 18002200 cm-1, fenêtre justement laissée libre par les protéines et où très peu de molécules sont susceptibles d'absorber.
L'obtention de spectres infrarouges avec un spectromètre à réseaux requiert usuellement des quantités de composé de l'ordre du mg.
L'utilisation de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, qui est basée sur la modulation du rayonnement de la source infrarouge par un interféromètre à la place de sa dispersion par un réseau, a augmenté la sensibilité, la vitesse et la précision des mesures infrarouges.
Dans les spectromètres infrarouges à réseaux conventionnels, chaque élément spectral est détecté séparément. La possibilité supplémentaire qu'offrent les spectromètres infrarouges à transformée de Fourier réside dans l'enregistrement simultané de tous les éléments spectraux, ce qui donne un rapport signal-bruit (SNR) supérieur.
L'utilisation de l'instrumentation spectroscopique infrarouge à transformée de Fourier a étendu les limites de détection de la spectroscopie infrarouge aux quantités des nanogrammes. Ces limites peuvent être dépassées par des modifications appropriées.
Ainsi, la spectroscopie à transformée de
Fourier permet le dosage immunologique de substances que le test métallo immunologique, utilisant également des marqueurs métalliques, ne pouvait détecter.
Par exemple sont rendus possibles les dosages d'antidépresseurs tricycliques marqués par un fragment cyclopentadiénylmanganèsetricarbonyl (CYMANTRENE).
Parmi les antidépresseurs, on peut citer les tricycliques : désipramine, imipramine, nortriptyline, amitriptyline, clomipramine, maprotiline, et les atypiques : nomifensine, mianserine, amineptine, zimelidine.
Mais, d'autres molécules peuvent être envisagées telles que les antiépileptiques barbituriques (phénobarbital, méphobarbital), ou les dérivés des hydantoines (phénytoine, méphénytoine), mais aussi des tranquillisants dérivés des benzodiazépines (diazépam, nitrazépam) ou encore des neuroleptiques tricycliques (chlorpromazine, trifluopérazine), ainsi que des neuroleptiques (halopéridol, fluspirilène) ou encore des antitumoraux (méthotrexate, 5-fluorouracile, azathioprine), des alcaloides, des amphétamines, des antibiotiques, des cardiotoniques.
Des marqueurs appropriés sont présentés cidessous
des dérivés du cymantrène du type
Figure img00040001

avec R = -(CH2)nCOOH
ou
Figure img00040002

où n varie de
0 à 5.
Figure img00050001
R = -(CH2)nCOOH ou
Figure img00050002

où n varie de
0 à 5.
. R- (C CR') Mo2Cp2(CO)4 avec R = -(CH2)nNH2
où n varie de 0 à 5
et R' = H,-CH3,-(CH2)n-CH3 R-(C # CR') CO2 CO2(CO)6 avec R = -(CH2)nNH2
où n varie de 0 à 5
et R' = H,-CH3,-(CH2)n-CH3
R-(C CR') Os3(CO)9 avec R = -(CH2)nNH2
où n varie de 0 à 5
et R' = H,-CH3,-(CH2)n-CH3 et
Mi M1(CO)5Cs avec M1 = Cr, W
Dans la mesure où les concentrations physiologiques de la plupart des antigènes ou médicaments à doser sont très faibles, l'utilisation de la spectroscopie IR-FT demande que tous les paramètres instrumentaux soient optimisés pour obtenir le maximum de sensibilité du spectromètre, c'est-d-dire un niveau de bruit de fond le plus bas possible dans la région spécifique qui nous intéresse, à savoir 2200-1800 cm-l.
Avantageusement, le dispositif de spectroscopie IR à transformée de Fourier, utile pour les dosages immunologiques à l'aide de marqueurs M(CO) selon l'invention, est caractérisé par un bas niveau de bruit dans la région 2200-1800 cm-l ne dépassant pas 0,002%
unités d'absorbance.
Par exemple, le dispositif selon l'invention comportera avantageusement les éléments suivants pris séparément ou en combinaison . un détecteur InSb une fenêtre spectrale réduite une cellule de mesure à long parcours de lumière et faible
diamètre . un échantillon à doser liquide avec un solvant qui
n'adsorbe pas ou peu dans la région 2200-1800 cm-1.
L'emploi d'un détecteur InSb plutôt que d'un détecteur MCT accentue le rapport signal/bruit (SNR) dans la région 2200-1850 cm-1 par un facteur de 40. Dans cette région, la réduction de la fenêtre spectrale augmente le domaine dynamique du détecteur et diminue le bruit atteignant le détecteur.
La réduction de la fenêtre spectrale peut être obtenue grâce à un filtre optique à bande étroite.
La fenêtre spectrale peut être réduite par exemple à 50 cm-l.
Cependant, les filtres optiques présentent certains inconvénients, car ils ne transmettent pas toute l'énergie dans la région où ils sont transparents.
D'autre part, de petites variations dans la température ambiante provoquent des oscillations de l'ordre de 10 unités d'absorbance dans le spectre rapporté.
Ces oscillations sont très difficiles à soustraire, car leurs périodes varient en fonction des températures.
On a trouvé, selon l'invention, que pour combler ces inconvénients il fallait que le filtre optique soit refroidi, par exemple à la température de l'azote liquide.
Avantageusement, donc, le filtre consiste en une pâte déposée à la surface du détecteur, lequel est réfrigéré à l'azote liquide et sous vide.
On observe alors une stabilisation significative du filtre optique avec seulement de légères oscillations résiduelles (10'5 unités d'absorbance).
Un inconvénient de l'emploi des filtres optiques est que l'on doit éviter de faire des mesures à proximité de leurs zones de coupure.
Cet effet doit être particulièrement pris en compte pour le meilleur choix des filtres, disponibles pour la région des métaux carbonyles, qui présentent une fenêtre spectrale de l'ordre de 50 cm-l.
Pour pallier cet inconvénient et pour améliorer la transmission d'énergie, la présente invention propose deux dispositifs limitant les fréquences aux environs de 1800-2300 cm-l englobant la région spécifique des métaux carbonyles 1. un détecteur de type sandwich composé d'un élément
MCT (mercury-cadmium-telluride) limitant les hautes
énergies vers 2300 cm-l et d'un élément InSb (indium
antimony) limitant les basses énergies vers 1800 cm-l.
2. un détecteur InSb, coupant aux basses énergies aux
environs de 1800 cm-i, couplé avec un filtre optique
à large bande coupant les hautes énergies vers
2300 cm-l.
Avec ces dispositifs, on obtient ainsi - une plus grande stabilité de la ligne de base, - une meilleure réponse linéaire, - une élimination des oscillations résiduelles, - une meilleure sensibilité, --plus d'énergie transmise.
Une caractéristique importante du dispositif pour dosage immunologique basée sur la détection infrarouge à transformée de Fourier est le choix du solvant.
En vertu de la loi de BEER-LAMBERT, l'absor- bance est proportionnelle au parcours du rayon infraroute traversant la solution. Il est donc souhaitable d'utiliser des cellules à longs parcours, mais ceci peut conduire à la saturation du détecteur par absorption du solvant conduisant à une perte de sensibilité dansa détection. L'absorption du solvant dans la région qui nous intéresse ne doit pas, de préférence, dépasser 0,5-0,7 unité d'absorbance. Cet élément est à considérer dans le choix du parcours de la cellule. En principe, tout solvant, y compris l'eau, peut être utilisé à condition de contrôler judicieusement sa longueur.
Les solvants appropriés peuvent être des alcanes (pentane, hexane, ...) ou des alcanes halogénés de faibles poids moléculaires (CH2C12, CHCl3, CCl4 ...).
En effet, ceux-ci ne présentent pas d'absorption ou une absorption très faible dans la région v(CO).
On a réalisé des spectres infrarouges IR-FT de ces solvants dans des cellules de parcours de 5 à 30 mm. On constate que, même avec un parcours de 30 mm, ce qui représente un parcours cent fois plus long que le parcours de cellules de solutions classiques, une telle cellule peut être efficacement utilisée sans dégrader la transmission d'énergie dans la région v(CO) de manière significative.
Le dispositif de spectroscopie infrarouge selon la présente invention peut donc comporter une cellule de parcours de l'ordre de 30 mm.
Avantageusement, selon la présente invention, le diamètre de la cellule ne dépasse pas 1 mm et peut même descendre à 0,1 mm. Cette caractéristique permet de diminuer le volume de solutions nécessaires.
Ainsi, avec une cellule de 1 mm de diamètre et de 30 mm de longueur, on obtient un volume de l'ordre de 24 ssl. D'autre part, l'utilisation d'un diamètre de 1 mm pour la cellule permet de diminuer également la surface de l'élément de détection d'un facteur quatre, ce qui conduit à l'accentuation du SNR.
Ainsi, selon le dispositif de la présente invention, on peut utiliser un élément de détection de 0,25 mm(de diamètre ou de côté si c'est un carré)au lieu de 1 mm, la diminution de la surface du détecteur conduisant à un accroissement du SNR.
L'invention sera maintenant mieux comprise à l'aide des exemples qui vont suivre. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention y apparattront.
La figure 1 représente le rapport de deux spectres d'émission avec un spectromètre DA3 dans lequel on a fait le vide (SNR)
la figure 2 représente un spectre d'émission avec un filtre optique placé sur un élément de détection
InSb et ensuite refroidi avec de l'azote liquide et sous vide (avec le même spectromètre DA3) ;;
la figure 3 représente le rapport de deux spectres d'émission avec le spectromètre DA3 après avoir placé un filtre optique sur l'élément de détection tomme fig. 2
la figure 4 représente un spectre d'émission d'un filtre optique qui coupe les hautes énergies vers 2300 cm-l (enregistré avec un élément détecteur InSb)
la figure 5 représente un spectre de CH2 Cl2 dans une cellule infrarouge de 7 mm de parcours
la figure 6 représente le rapport de deux spectres d'émission de CH2 ;
la figure 7 représente un spectre de CHCl3 dans une cellule infrarouge de 7 mm de parcours
la figure 8 représente le rapport de deux spectres d'émission de CHCl3 ;;
la figure 9 représente un spectre de n-pentane dans une cellule infrarouge de 7 mm de parcours
la figure 10 représente le rapport de deux spectres d'émission de n-pentane
la figure 11 représente l'absorption infrarouge de CCL4 entre 2200-1800 cm-1 en utilisant une cellule de 30 mm de parcours revêtu d'or
la figure 12 représente un spectre IR-FT (enregistré avec une cellule de 30 mm) des bandes carbonyles du complexe marqué notriptyline-CpMn(CO)3 après soustraction des bandes de solvant CCl4
la figure 13 représente un spectre IR-FT (enregistré dans une microcellule de 1 mm de parcours, avec CCl4 comme solvant) des bandes carbonyles du complexe marqué nortriptyline-CpMn(CO)3 après soustraction des bandes du solvant CC14 ; ;
la figure 14 représente la courbe de dosage par compétition obtenue par la mesure de la bande carbonyle à 2030 cm-1 du complexe marqué notriptyline CpMn(CO)3 (B0/T = 50 %).
EXEMPLE I : SYNTHESE D'UN IMMUNOGENE
t'exemple qui suit propose la synthèse d'un immunogène dérivé de la désipramine.
Préparation du dérivé N-(carboxypropionyl-3)
de la désipramine (Ib schéma I ci-après).
La désipramine base (1,9 g ; 7,1 mmoles) est
extraite du chlorhydrate, puis mise à réagir avec l'anhy
dride succinique (0,760 g ; 7,6 mmoles) dans 90 ml
d'éthanol selon HUBBARD et coll. (1978). Cette réaction
fournit 2,2 g (Rendement = 85 %) de fins cristaux blancs
(Ib) dont les propriétés sont conformes à celles de la
littérature.
Préparation de l'immunogène (Ic)
Le dérivé Ib (74 mg ; 0,2 mmole) est dissous dans 20 ml de soude 0,1 N et la solution est ajustée à pH = 8,0 avec de l'HCl 0,1 N. On ajoute alors sous agitation 140 mg (0,002 mmole) de sérum albumine bovine (SAB) dissous dans 10 ml d'eau distillée, puis 123,8 mg (0,6 mmole) de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) mis en suspension dans 2 ml d'eau distillée. Le mélange est agité une nuit à température ordinaire, puis introduit dans des tubes de dialyse (Polylabo-réf. 24003) d'environ 20 cm de long et de 2,5 cm de diamètre. La dialyse a lieu à 40C tout d'abord contre du tampon phosphate 1/15 M pH = 8 (deux fois un litre contenant chacun 2 g d'acide de sodium) et, cela, pendant 24 h ; puis, contre du tampon acétate 0,048 m pH = 4 (2 fois un litre), mais pendant 48 h.La solution dialysée est alors distribuée dans des pots en verre, puis lyophylisée. On obtient ainsi l'immunogène sous la forme d'un solide blanc brillant pulvérulent dont on va contrôler le taux de couplage selon la méthode décrite par ERLANGER et coll. (1957) basée sur l'absorption U.V. du médicament.
Le calcul des coefficients d'extinction moléculaire à 250 nm nous a permis d'évaluer à 44 le nombre de molécules de désipramine couplées à une molécule de SAB.
EXEMPLE II : SYNTHESE D'UN HAPTENE MARQUE AU CYMANTRENE
(= METALLOHAPTENE)
Préparation du chlorure d'acide de l'acide cymantrène carboxylique (CyCOCl) :
Il est obtenu, à partir du cymantrène après transformation en acétylcymantrène, puis en acide cymantrène carboxylique selon les méthodes décrites par
KOZIKOWSKI et CAIS (1967) et RIEMSCHNEIDER et PETZOLD (1960).
Préparation du dérivé cymantrénoylé de la désipramine
La désipramine base (600 mg ; 2,25 mmoles) est extraite du chlorhydrate, puis dissoute dans 50 ml de THF fraîchement distillé. Ajouter 2 ml de pyridine, puis sous agitation additionner goutte à goutte 600 mg (2,25 mmoles) de CyCOCl dissous dans 20 ml de THF.
L'agitation est poursuivie pendant 24 heures à température ordinaire. Après filtration, évaporer le TNF, reprendre par 100 ml de chlorure de méthylène, laver à l'acide dilué au 1/2, puis à la soude diluée au 1/10, puis à l'eau. Sécher, évaporer le solvant. Le résidu huileux obtenu (1g ; Rendement = 60 %) est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice 60 (éluant benzène-acétone 20:1. Les caractéristiques physicochimiques de l'huile purifiée sont les suivantes
Spectrométrie de masse : ion moléculaire à m/e = 496
Infrarouge : C=0 : 1640, 1950, 2050 cm-1.
Référence : HUBBARD J.W. et coll. J. Pharm. Sc. 1978,67,
1571.
Figure img00140001
Schéma I : Schéma de synthèse de l'immunogène et du métallohaptène
issus de la Désipramine.
EXEMPLE III : PRODUCTION ET CARACTERISATION DE L'ANTISERUM Production
Des lapins males et femelles de type "fauve de bourgogne" sont immunisés avec l'antigène obtenu ci-dessus, selon la technique décrite par LANDON et
MOFFAT (1976). La première injection (250 tig d'immunogène par lapin) est réalisée avec l'adjuvant complet de
FREUND (produit GIBCO) et les injections de rappel avec de l'adjuvant incomplet. Le sang est prélevé une dizaine de jours après chaque injection de rappel, à la veine marginale de l'oreille. Le sérum est alors congelé à -200C par fractions de 100 iil.
Caractérisation : + courbes de titrage
Des dilutions de l'antisérum sont introduites dans des tubes en verre à usage unique contenant de l'Imipramine tritiée (produit AMERSHAM à 21 Ci/mmole), dans un volume total de 300 l de tampon phosphate 0,01 M pH = 7,4. Après incubation à 370C pendant 1h 15, on place les tubes dans un bain d'eau glacée et l'on ajoute 500 l d'une suspension de charbon-dextran à 0,6 %#. On agite vigoureusement pendant 30 s, on laisse reposer 10 mn, puis on centrifuge à 3500 g pendant 10 mn. Le surnageant contenant la fraction liée est décanté dans 10 ml de scintillant (UNISOLVE de chez
KOCH-LIGH ou DYNAGEL de chez BAKER) contenus dans des flacons à scintillation en polypropylène. Après repos, les échantillons sont comptés au scintillateur liquide (modèle 3385 de PACKARD).
Parallèlement, on évalue la radioactivité totale (T), ainsi que la liaison non spécifique (LNS).
Le pourcentage d'antigène lié (B) est calculé pour chaque point par rapport au T après déduction de la liaison non spécifique. Les titres en anticorps sont alors définis par la plus grande dilution qui lie 50 % du traceur.
+ étude de la spécificité (réactions croisées)
La spécificité est évaluée à partir de courbes d'inhibition obtenues selon le même protocole que pour les courbes d'étalonnage en remplaçant l'antigène froid, par la molécule à étudier. Le pourcentage de réaction croisée est alors calculé selon la méthode d'ABRAHAM (1969) par rapport à l'IMIPRAMINE. Si X pg et Y pg sont les quantités d'imipramine et de la substance respectivement nécessaires pour déplacer 50 % d'imipramine tritiée liée aux anticorps, le pourcentage exprimant la réaction croisée de la substance sera égal à X/Y x 100.
Les molécules étudiées et les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-après.
Les valeurs de ce tableau I montrent que l'antisérum étudié reconnaît, de manière similaire, les molécules qui sont issues du cycle iminodibenzyle (imipramine, désipramine, clomipramine, opipramol) et dans un degré moindre la nortriptyline (cycle dibenzocycloheptadiène). En revanche, les métabolites hydroxylés de l'imipramine ne sont pas reconnus, pas plus que les structures phénothiazinique ou benzodiazépinique. Dans le cadre du développement d'un nouveau test immunologique, il est nécessaire d'étudier les réactions croisées avec les métallohaptènes synthétisés. Avec la désipramine marquée, on a trouvé un pourcentage d'inhibition de 40 % toujours par rapport à l'imipramine tritiée.
Ce résultat est très important puisqu'il montre que la présence du marqueur n'a pas d'influence néfaste sur la reconnaissance de la molécule par les anticorps.
Tableau I. Etude des réactions croisées
Composé : % de réaction croisée par
rapport à (3H) Imipramine
prise égale à 100 %
Imipramine 100
Nortriptyline 20
Désipramine 50
Clomipramine 100
Opipramol 200 2-OH Imipramine < 2 10-OH Imipramine < 2
Chlorpromazine < 3
Diazépam < 3
+ détermination de la constante d'affinité (K ou K')
Deux méthodes ont été utilisées : soit la méthode SCATCHARD,soit la méthode d'ODELL qui fait intervenir des quantités croissantes de marqueurs pour une dilution donnée de l'antisérum ; après équilibre, on sépare les fractions liées et libres par du charbondextran.
Avec 1' (3H) imipramine, les méthodes de
SCATCHARD et d'ODELL nous ont conduits à des valeurs de K voisines de 10 L/M, alors qu'avec le métallohaptène décrit précédemment, par la méthode d'ODELL, nous obtenons une valeur de K' proche de 10 L/M.
Ces résultats mettent en évidence la très bonne affinité des antisérums obtenus pour les deux types de traceurs.
EXEMPLE IV : DISPOSITIFS DE SPECTROSCOPIE IR-FT POUR
LES FIGURES 1 A 13
Les modifications ont été effectuées
sur des spectrophotomètres IR-FT DA3 (commercialisés par BOMEN Inc.).
Un filtre transparent dans la région infrarouge entre 2030 et 2080 cm-l a été collé à la surface d'un détecteur InSb et l'assemblage a été amené jusqu'à une pression inférieure à 10-1 torr.
Le détecteur a été ensuite alimenté en azote liquide, il a été refroidi pendant 40 à 50 mn. On a observé un déplacement de la réponse du filtre de l'ordre de 50 cm-l, déplaçant ainsi le nouveau domaine de fréquences entre 2080 et 2130 cm-1.
Les figures 1, 2 et 3 montrent qu'on observe une stabilisation significative de filtre optique lorsqu'il est refroidi à l'azote liquide avec seulement de légères oscillations résiduelles de l'ordre de 10 5 unités d'absorbance.
Les spectres des figures 5 à 10 montrent que les solvants choisis alcanes ou alcanes halogénés présentent une absorption très faible dans la région v(CO).
La courbe de la figure 12 est obtenue avec une quantité d'haptène marqué de 2 pmoles, sans utilisation de filtre optique. Dans ce cas, on a utilisé, pour la dissolution de l'haptène marqué, 40 l de CCl4. 24 ul étaient recueillis et transférés dans une cellule ayant 1 mm de diamètre et 30 mm de longueur avec des fenêtres de CaF2. La cellule était également revêtue d'or pour augmenter le parcours de la lumière à travers la solution . On observe une absorbance trente fois supérieure à celle obtenue figure 13, par une concentration similaire, d'où l'intérêt d'augmenter la longueur de la cellule (figure 13 = cellule de 1 mm).
EXEMPLE V : DOSAGE IRIA DE LA NORTRIPTYLINE (1) DISPOSITIF DE SPECTROSCOPIE IR-FT POUR LE DOSAGE IRIA
Les modifications proposées par la présente invention ont été effectuées sur un spectrophotomètre
IR-FT Michelson (commercialisé par BOMEN Inc.).
Le dispositif 2 de la page 7 a été utilisé (cf.
fenêtre figure 4), combinant donc un détecteur InSb couplé avec un filtre optique à large bande coupant les hautes énergies vers 2300 cm-l.
Pour les dosages immunologiques, on a employé, pour la dissolution des fractions liées : 20 ssl de CCl4.
4 l étaient recueillis et transférés dans une microcellule de 1 mm de longueur suffisante pour ce type de dosage avec des fenêtres de NaCl.
(2) COURBE D'ETALONNAGE DE LA NORTRIPTYLINE
La méthodologie est semblable à celle décrite précédemment pour les courbes de titrage des antisérums.
On ajoute, en plus, des quantités variables d'antigène froid (Ag) pour une même dilution de l'antisérum et du marqueur tritié. Le principe du dosage est résumé sur le schéma II suivant
Schéma II 1. Incubation
Figure img00200001
fraction libre fraction liée 2. Séparation
par charbon-dextran
par solvant 3. Extraction
de la fraction liée par 1 ml d'un
mélange pentane-éther (90/10) si la séparation pré
cédente a été réalisée par le charbon-dextran.
4. Evaporation du solvant 5. Dissolution
dans un solvant chloré (CC14, CHC13, ...) 6. Evaluation
FT-IR
Les changements d'intensité du signal v(CO) de la fraction liée (figure 13) ont été enregistrés à partir de différents tubes obtenus après incubation d'une quantité connue et fixe d'haptène, dérivé de la nortriptyline marquée selon l'Exemple II avec du CpMn(CO)3, mise en compétition avec des concentrations connues et va riables de nortriptyline non marquée (sous forme de chlorhydrate), pour une quantité d'anticorps fixée.
La figure 14 représente la courbe d'étalonnage obtenue grâce au dispositif de l'exemple V-(1), par la mesure de la bande carbonyle à 2030 cm-1. La
gamme a été réalisée à partir d'une solution de nortriptyline, HC1 à 2 g/ml, soit des valeurs de 0 à
1000 picomoles par tube. Les mesures ont été effectuées dans une cellule de NaCl d'1 mm de parcours, le tableau
II ci-après donnant les valeurs
de B = intensité de la bande carbonyle du complexe
Ac-Ag.M(CO) ;
de Bo = intensité de la bande carbonyle du même com
plexe, en l'absence de produit non marqué.
Par ailleurs, la valeur de T correspond à l'intensité de la bande carbonyle de l'haptène marqué en l'absence d'antisérum.
Tableau II
(cy)-nortri
Xpmol.nortripty Y%B/B0 Bo/T : 50 %
0 100
150 73.72
301 41.35
602 25.55
902 21.9
Ce tableau présente les valeurs qui ont permis d'établir la courbe d'étalonnage IRIA pour la nortriptyline représentée figure 14.

Claims (16)

REVENDICATIONS
1. Nouveau type de dosage immunologique dénommé "IRIA", caractérisé tn ce qu'on utilise un antigène marqué avec un marqueur portant des fonctions carbonyles liées à au moins un métal.
2. Dosage immunologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection du marqueur est réalisée par un dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.
3. Dosage immunologique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on dose des molécules antigènes choisis parmi - les antidépresseurs tricycliques tels que la désipra
mine, l'imipramine, la nortriptyline, l'amitriptyline,
la clomipramine, la maprotiline et atypiques tels .que
la nomifensine, la miansérine, l'amineptine, la zimé
lidine, - les antiépileptiques tels que les dérivés des barbi
turiques, notamment le phénobarbital, le méphobarbital,
ou tels que les hydantoines, notamment le phénytoine,
le méphénytoine, - les tranquillisants dérivés des benzodiazépines, no
tamment le diazépam, le nitrazépam, - les neuroleptiques tricycliques tels que la chlorpro
mazine, et la trifluopérazine, - les neuroleptiques tels que l'halopéridol, le flus
pirilène, - les antitumoraux tels que le méthotrexate, le 5-fluoro
uracile et l'azathioprine, - des alcaloides, - des amphétamines, - des antibiotiques, et - des cardiotoniques.
4. Dosage immunologique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le marqeur est un composé organométallique comportant des groupements carbonyles liés à des métaux choisis parmi les métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique.
5. Dosage immunologique selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le marqueur est choisi notamment parmi des structures du type des dérivés du cymantrène du type :
Figure img00230001
avec
R = -(CH2) nCOOH ou
Figure img00230002
où n varie de
o à 5.
Figure img00230003
o à 5.
où n varie de
Figure img00230004
R = -(CH2)nCOOH ou
avec
et Rl = H,-CH3,-(CH2)n-CH3 et . M1(CO)5Cs avec notamment M1 = Cr, W
où n varie de O à 5
et R' = H,-CH3,-(CH2)n-CH3 . R-(C E CR') Os3(CO)9 avec R = -(CH2)nNH2
où n varie de O à 5
et R' = H,-CH3,-(CH2)n-CH3 . R-(C E CR') CO2(CO)6 avec R = -(CH2)nNH2
où n varie de 0 à 5
. R-(C E CR') Mo2Cp2(CO)4 avec R = -(CH2)nNH2
6. Dispositif de spectroscopie IR à transformée de Fourier, utile notamment pour les dosages immunologiques selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente un bas niveau de bruit dans la région 2200-1800 cm-1 ne dépassant pas 0,002 % d'unités d'adsorbance.
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte séparément ou combinés entre eux les éléments suivants un détecteur InSb une fenêtre spectrale réduite une cellule de mesure à long parcours de lumière et
faible diamètre un échantillon à doser liquide avec de préférence un
solvant qui n'absorbe pas ou peu dans la région
2200-1800 cm-1.
8. Dispositif selon l'une des revendications
6 et 7, caractérisé en ce que la fenêtre spectrale est
réduite grâce à un filtre optique à bande étroite.
9. Dispositif selon l'une des revendications
6 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte une fenêtre
spectrale réduite à 50 cm-1.
10. Dispositif selon l'une des revendications
6 à 9, caractérisé en ce que le filtre à bande étroite
est refroidi, notamment à la température de l'azote
liquide.
11. Dispositif selon l'une des revendications
6 à 10, caractérisé en ce que le filtre à bande étroite consiste en une pâte à la surface du détecteur réfrigéré à l'azote liquide et sous vide.
12. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte un détecteur du type sandwich combinant un élément InSb pour l'extrémit basse énergie de
1800 cm-1, un élément MCT pour l'extrémité haute énergie de
2300 cm-1.
13. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte un détecteur
InSb avec une extrémité basse énergie aux environs de 1800 cm-1, couplé avec un filtre optique large bande qui limite les hautes énergies aux environs de 2300 cm-1.
14. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi les solvants alcanes ou alcanes halogénés, notamment le pentane, l'hexane v H2Cl2, CHCl3, CC14.
15. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisé en ce que le parcours de la cellule est d'environ 30 mm, pour les solvants alcaneshalogénés de faibles poids moléculaires, notamment CH2Cl2,
CHCl3, CCl4.
16. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 15, caractérisé en ce que le diamètre de la cellule peut être réduit jusqu'à environ 0,1 mm.
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