EP0308473A1 - Dosage immunologique infrarouge - Google Patents
Dosage immunologique infrarougeInfo
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- EP0308473A1 EP0308473A1 EP19880903268 EP88903268A EP0308473A1 EP 0308473 A1 EP0308473 A1 EP 0308473A1 EP 19880903268 EP19880903268 EP 19880903268 EP 88903268 A EP88903268 A EP 88903268A EP 0308473 A1 EP0308473 A1 EP 0308473A1
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Definitions
- the present invention relates to a new type of immunoassay and a new type of Fourier transform infrared spectroscopy device useful for said assays.
- Urmunological methods are powerful, very selective analytical techniques which allow the determination of very small quantities of analyte. Their use holds a preponderant place in clinical analysis. Indeed, the interaction between an antigen and corresponding antibodies can be extremely specific.
- the invention therefore relates to a new immunological assay called IRIA ("INFRA / RED IMMUNOASSAY”), characterized in that a marker is used carrying carbonyl functions linked to a metal.
- the antigen is therefore marked with the marker.
- the antigen can be directly complexed with the carbonyl metal complex, in particular when the antigen comprises an unsaturated carbonaceous organic site, such as an aromatic nucleus, a cyclopentadienic cycle or a double or triple c-c bond.
- An advantageous alternative from the point of view of stability consists in binding the antigen to a molecule comprising an unsaturated organic site, in particular a carbon unsaturation, such as an aromatic nucleus, a cyclopentadienic cycle or a double or triple cc bond, which is then complexed with a complex of carbonyl metals.
- the marker then consists of this molecule complexed by a complex of carbonyl metals.
- carbonyl metal complex is understood to mean an organometallic complex of formula M x L y , L y representing the ligands linked to one or more metals M, at least one of the ligands being a carbonyl function.
- the dosing principle is as follows.
- the labeled antigen (Ag-M (CO)) and the unlabeled assay antigen (Ag) are put in competition in variable proportions in the presence of a small amount of anticoros (Ac).
- the tracer is evaluated in one of the two fractions by measuring the intensity of the signals corresponding to the frequencies characteristic of the carbonyl groups. The determination of an unknown sample is made by comparison with a standard curve carried out with pure unlabeled antigen.
- This immunoassay method makes it possible to quantitatively determine very small quantities of drugs in various biological media (plasma, urine, saliva, etc.) in humans, animals or plants.
- the detection is carried out by an infrared spectroscopy device with Fourier transform which makes it possible to detect the CO ligands. This technique retains the specific characteristics of the immunological reaction and appears to be sensitive enough to be applied to the dosage of many drugs.
- Fourier transform spectroscopy allows the immunological assay of substances that the metallo immunological test, also using metallic markers, could not detect.
- tricyclic antidepressants marked with a cyclopentadienylmanganese andricarbonyl fragment are made possible.
- antidepressants mention may be made of the tricyclics: desipramine, imipramine, nortriptyline, amitriptyline, clomipramine, maprotiline, and atypicals: nomifensine, mianserine, amineptine, zimelidine.
- barbiturate antiepileptics phenobarbital, mephobarbital
- hydantoin derivatives phenytoin, mephenytoin
- tranquilizers derived from benzodiazepines (diazepam, nitrazepam) or tricyclic neuroleptics (chlorpromazine, trifluoperazine), as well as neuroleptics (haloperidol, fluspirilene) or antitumor drugs (methotrexate, 5-fluorouracil, azathioprine), alkaloids antibiotics, cardiotonics.
- Suitable markers are shown below: cymantrene derivatives of the type
- markers carrying a COOH function at the end of the R chain are particularly suitable for being coupled to an antigen carrying an amino function (primary or secondary), which is the case for most drugs, via a amide bond between the two functions.
- an antigen carrying an amino function primary or secondary
- markers Another type of marker can be cited according to the present invention, these markers have the formula
- M x L y represents an organometallic compound in which
- M x represents one or more metals from groups VI to IX of the periodic table which may be different and L y represents one or more ligands of which at least one ligand is the CO ligand, this (these) ligand (s) comprising the metals, this (s) ligand (s) can be very varied (s), in particular cyclopentadienyl Cp or even CS.
- M x L y is chosen from Mo 2 Cp 2 (CO) 4 , Co 2 (CO) 6 and Os 3 (CO) 9 .
- these markers can be coupled to the antigen by an alkylation reaction, the complexation of the carbonyl metal complex M x L y on the triple bond being able to take place before or after said coupling.
- D represents the antigen
- This alkylation can be done via the complexed carbocation:
- the marker can be coupled to a COOH function of the antigen, but this type of marker is also suitable when the antigen has an amide function.
- the tracer is then prepared from an antigen derivative for which the amide function is changed to the amino function which is reacted with phosgene and the amino marker. In general, then, an alkylation is obtained on the antigen, the tracer having the formula
- the drug to be assayed does not have an NH 2 function
- such a function can be created, for example thereby reducing a nitrated NO 2 function which is easy to introduce. Consequently, the markers mentioned above can be coupled to any drug with a view to their infrared immunoassay according to the invention whether it has an NH 2 function or whether it is introduced.
- the use of IR-FT spectroscopy requires that all instrumental parameters are optimized to obtain the maximum sensitivity of the spectrometer, i.e. the lowest possible level of background noise in the specific region that interests us, namely 2200-1800 cm-1.
- the IR spectroscopy device with Fourier transform, useful for immunological assays using markers M x (L) y according to the invention is characterized by a low level of noise in the region 2200-1800 cm- 1 not exceeding 0.002% absorbance units.
- the device according to the invention will advantageously include the following elements taken separately or in combination:
- a liquid sample to be dosed with a solvent which does not absorb or little in the region 2200-1800 cm-1 a liquid sample to be dosed with a solvent which does not absorb or little in the region 2200-1800 cm-1.
- the use of an InSb detector rather than an MCT detector increases the signal-to-noise ratio (SNR) in the region 2200-1850 cm-1 by a factor of 40. In this region, the reduction of the spectral window increases the dynamic range of the detector and reduces the noise reaching the detector.
- the reduction of the spectral window can be obtained by means of a narrow band optical filter.
- the spectral window can be reduced, for example, to 50 cm-1.
- optical filters have certain drawbacks, since they do not transmit all the energy in the region where they are transparent.
- small variations in the ambient temperature cause oscillations of the order of
- the filter consists of a paste deposited on the surface of the detector, which is refrigerated with liquid nitrogen and under vacuum.
- a disadvantage of using optical filters is that one must avoid making measurements near their cut-off zones.
- the present invention proposes two devices limiting the frequencies around 1800-2300 cm-1 including the specific region of carbonyl metals: 1. a sandwich type detector composed of an MCT element (mercury-cadmium-telluride) limiting the high energies to 2300 cm-1 and an InSb element (indiumantimony) limiting the low energies to 1300 cm-1. 2. an InSb detector, cutting at low energies around 1800 cm-1, coupled with a broadband optical filter cutting high energies at 2300 cm-1.
- MCT element cury-cadmium-telluride
- InSb element indiumantimony
- the absorbance is proportional to the path of the infrared ray passing through the solution. It is therefore desirable to use long-range cells, but this can lead to saturation of the detector by absorption of the solvent leading to a loss of sensitivity in detection.
- the absorption of the solvent in the region of interest should preferably not exceed 0.5-0.7 absorbance units. This element should be considered when choosing the cell route.
- any solvent, including water can be used provided that its length is carefully controlled.
- the suitable solvents can be alkanes (pentane, hexane, etc.) or halogenated alkanes of low molecular weight (CH 2 Cl 2 , CHCl 3 , CCI, etc.). Indeed, these have no absorption or very low absorption in the region v (CO).
- IR-FT infrared spectra of these solvents were produced in 5 to 30 mm path cells. It is noted that, even with a path of 30 mm, which represents a path a hundred times longer than the path of cells of conventional solutions, such a cell can be effectively used without degrading the energy transmission in the region v (CO ) in a significative way.
- the infrared spectroscopy device can therefore comprise a path cell of the order of 30 mm.
- the diameter of the cell does not exceed 1 mm and can even drop to 0.1 mm. This characteristic makes it possible to reduce the volume of solutions required.
- the device of the present invention it is possible to use a detection element of 0.25 mm (diameter or side if it is a square) instead of 1 mm, the reduction in the surface of the detector leading to an increase in SNR.
- FIG. 1 represents the ratio of two emission spectra 0 with a DA 3 spectrometer in which a vacuum has been made (SNR);
- FIG. 2 represents an emission spectrum with an optical filter placed on an InSb detection element and then cooled with liquid nitrogen and under vacuum (with the same DA 3 spectrometer);
- FIG. 3 represents the ratio of two emission spectra with the spectrometer DA 3 after having placed an optical filter on the detection element as fig. 2;
- FIG. 4 represents an emission spectrum of an optical filter which cuts the high energies towards
- FIG. 5 represents a spectrum of CH 2 Cl 2 in an infrared cell with a path of 7 mm
- FIG. 6 represents the ratio of two emission spectra of CH 2 Cl 2
- FIG. 7 represents a spectrum of CHCl 3 in an infrared cell with a path of 7 mm
- FIG. 8 represents the ratio of two emission spectra of CHCl 3
- FIG. 9 represents a spectrum of n-pentane in an infrared cell with a path of 7 mm
- FIG. 10 represents the ratio of two emission spectra of n-pentane
- FIG. 5 represents a spectrum of CH 2 Cl 2 in an infrared cell with a path of 7 mm
- FIG. 6 represents the ratio of two emission spectra of CH 2 Cl 2
- FIG. 7 represents a spectrum of CHCl 3 in an infrared cell with a path of 7 mm
- FIG. 8 represents the ratio of two emission spectra of CHCl 3
- FIG. 9 represents a spectrum of
- FIG. 11 represents the infrared absorption of CCL 4 between 2200-1800 cm-1 using a 30 mm cell covered with gold;
- FIG. 12 represents an IR-FT spectrum (recorded with a 30 mm cell) of the carbonyl bands of the complex marked notriptyline-CpMn (CO) 3 after subtracting the bands of solvent CCl 4 ;
- FIG. 13 represents an IR-FT spectrum (recorded in a microcell of 1 mm in travel, with CClu as solvent) of the carbonyl bands of the complex labeled nortriptyline-CpMn (CO) 3 after subtracting the bands of the CCI 4 solvent;
- BSA bovine serum albumin
- DCC dicyclohexylcarbodiimide
- the dialyzed solution is then distributed in glass jars, then lyophilized.
- the immunogen is thus obtained in the form of a powdery bright white solid, the rate of coupling of which will be controlled according to the method described by ERLANGER and coll. (1957) based on the UV absorption of the drug.
- the calculation of the molecular extinction coefficients at 250 nm allowed us to estimate at 44 the number of desipramine molecules coupled to a SAB molecule.
- Desipramine base (600 mg; 2.25 mmol) is extracted from the hydrochloride, then dissolved in 50 ml of freshly distilled THF. Add 2 ml of pyridine, then with stirring add dropwise 600 mg (2.25 mmol) of CyCOCl dissolved in 20 ml of THF.
- the first injection 250 ⁇ g of immunogen per rabbit is carried out with the complete FREUND adjuvant (GIBCO product) and the booster injections with incomplete adjuvant. Blood is taken around ten days after each booster injection, from the marginal vein in the ear. The serum is then frozen at -20 ° C in fractions of 100 ⁇ l.
- the total radioactivity (T) is evaluated, thus ⁇ ue the non-specific binding (LNS).
- the percentage of bound antigen (B) is calculated for each point with respect to T after deduction of the non-specific binding.
- the antibody titers are then defined by the greatest dilution which binds 50% of the tracer.
- the specificity is evaluated from inhibition curves obtained according to the same protocol as for the calibration curves by replacing the cold antigen, with the molecule to be studied.
- the percentage of cross-reaction is then calculated according to the method of ABRAHAM (1969) compared to IMIPRAMINE. If X pg and Y pg are the quantities of imipramine and of the substance respectively necessary to displace 50% of tritiated imipramine bound to the antibodies, the percentage expressing the cross-reaction of the substance will be equal to X / Y x 100.
- H of HCG 4.52-4.3 (multiplet) and 4.47 (singlet).
- IR-FT BOMEM Michelson 100 RMN H1: BRUKER 250 MHz
- a transparent filter in the infrared region between 2030 and 2080 cm-1 was bonded to the surface of an InSb detector and the assembly was brought to a pressure below 10 -1 torr.
- the detector was then supplied with liquid nitrogen, it was cooled for 40 to 50 min. A displacement of the filter response was observed of the order of 50 cm-1, thus displacing the new frequency domain between 2080 and 2130 cm-1.
- Figures 1, 2 and 3 show that a significant stabilization of the optical filter is observed when it is cooled with liquid nitrogen with only slight residual oscillations of the order of 10 -5 units of absorbance.
- the spectra of FIGS. 5 to 10 show that the solvents chosen from alkanes or halogenated alkanes exhibit very low absorption in the v (CO) region.
- the device 2 on page 7 was used (see window in Figure 4), thus combining an InSb detector coupled with a broadband optical filter cutting the high energies around 2300 cm-1.
- FIG. 14 represents the calibration curve obtained using the device of example V- (1), by measuring the carbonyl strip at 2030 cm-1.
- the range was made from a solution of nortriptyline, HC1 at 2 ⁇ g / ml, ie values from 0 to 1000 picomoles per tube.
- This table presents the values which made it possible to establish the IRIA calibration curve for the nortriptyline shown in FIG. 14.
- New type of immunological dosing designated IRIA, employing a tag bearing carbonyl functions linked to at the one metal.
- a means of detecting the tag in the form of an infrared spectroscopie device with a Fourier transform. so an IR spectroscopy device with a Fourier transform, comprising, separately or in combination, the following element an InSb detector; a reduced spectral window; a cell with a long light trajectory and ofsmall diameter; a liquid dosing s ple with preferably one solvent which absorbs little or nothing in the region 2200-1800 cm-1.
- the invention relates to a new type of immunoassay called "IRIA".
- IRIA immunoassay
- the invention also relates to a detection of the marker which is carried out by an infrared spectroscopy device with Fourier transform.
- the invention also relates to a Fourier transform IR spectroscopy device which comprises the following elements separately or in combination: the InSb detector; a reduced spectral window; a long diameter light path cell; a liquid sample to be dosed with, preferably, a solvent which does not absorb or little in the 2200-1800 cm-1 regi.
- New type ofimmunological dosing designated IRIA, employing a tag bearing carbonyl functions linked to at l one metal. Also a means ofdetecting the tag, in the form ofan infrared spectroscopie device with a Fourier transform. so an IR spectroscopy device with a Fourier transform, comprising, separately or in combination, the following element an InSb detector; a reduced spectral window; a cell with a long lighttrajectory and ofsmall diameter; a liquid dosing s ple with preferably one solvent which absorbs little or nothing in the region 2200-1800 cm-1.
- the invention relates to a new type of immunoassay called "IRIA".
- IRIA immunoassay
- the invention also relates to a marker definition which is carried out by a Fourier transform infrared spectroscopy device.
- the invention also relates to an IR spectroscopy device with Fourier transform which comprises the following elements separately or in combination: the InSb detector; a reduced spectral window; a long diameter light path cell; a liquid sample to be dosed with, preferably, a solvent which does not absorb or little in the reg 2200-1800 cm-1.
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Abstract
L'invention concerne un nouveau type de dosage immunologique dénommé ''IRIA''. Selon la présente invention, on utilise un marqueur portant des fonctions carbonyles liées à au moins un métal. L'invention concerne également une détection du marqueur qui est réalisée par un dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. L'invention concerne également un dispositif de spectroscopie IR à transformée de Fourier qui comporte séparément ou combinés entre eux les éléments suivants: un détecteur InSb; une fenêtre spectrale réduite; une cellule à long parcours de lumière et faible diamètre; un échantillon à doser liquide avec, de préférence, un solvant qui n'absorbe pas ou peu dans la région 2200-1800 cm-1.
Description
DOSAGE IMMUNOLOGIQUE INFRAROUGE
La présente invention concerne un nouveau type de dosage immunologique et un nouveau type de dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier utile pour lesdits dosages. Les méthodes irmuunologiques sont des techniques analytiques puissantes, très sélectives qui permettent le dosage de très faibles quantités d'analyte. Leur utilisation tient une place prépondérante en analyse clinique. En effet, l'interaction entre un antigène et des anticorps correspondant peut être extrêmement spécifique.
Le principe général de ces méthodes est toujours basé sur le fait que des anticorps (Ac) reconnaissent, puis se lient de manière spécifique aux antigènes qui lui ont donné naissance pour donner un complexe antigène-anticorps selon la réaction équilibrée suivante :
Si l'antigène est remplacé par le même antigène marqué (Ag.Mº), on aura un autre équilibre possible :
A l'origine, ce sont BERSON et YALLOW (1959) qui ont introduit ce concept où intervenait un marqueur radioactif. Cette technique de dosage RADIO-IMMUNOLOGIQUE s'est largement développée depuis, bien que présentant de très sérieux inconvénients : risques pour la santé, prix de revient élevé, utilisation réglementée .... C'est pourquoi, de nombreux autres
marqueurs "non isotopiques" ont été envisagés. Les principaux sont : les enzymes, les marqueurs fluorescents ou chimiluminescents, les marqueurs de spin et plus récemment les marqueurs métalliques. L'invention a donc pour objet un nouveau dosage immunologique dénommé IRIA ("INFRA/RED IMMUNOASSAY"), caractérisé en ce qu'on utilise un marqueur portant des fonctions carbonyles liées à un métal.
Dans ces dosages, l'antigène est donc marqué par le marqueur. L'antigène peut être directement complexé par le complexe de métaux carbonyles, notamment lorsque l'antigène comporte un site organique insaturé carboné, tel qu'un noyau aromatique , un cycle cyclopentadiénique ou une double ou triple liaison c-c. Une alternative avantageuse du point de vue de la stabilité consiste à lier l'antigène à une molécule comportant un site organique insaturé, notamment une insaturation carbonée, telle qu'un noyau aromatique, un cycle cyclopentadiénique ou une double ou triple liaison c-c, laquelle est ensuite complexée par un complexe de métaux carbonyles. Le marqueur consiste alors dans cette molécule complexée par un complexe de métaux carbonyles.
On entend dans la présente demande par complexe de métaux carbonyles un complexe organométallique de formule MxLy, Lyreprésentant les ligands liés à un ou plusieurs métaux M, un au moins des ligands étant une fonction carbonyle.
Le principe de dosage est le suivant.
L'antigène marqué (Ag-M(CO)) et l'antigène à doser non marqué (Ag) sont mis en compétition en proportions variables en présence d'une faible quantité d'anticoros (Ac). Après séparation des fractions liées
et libres, on évalue le traceur dans l'une des deux fractions par la mesure de l'intensité des signaux correspondant aux fréquences caractéristiques des groupements carbonyles. La détermination d'un échantillon inconnu se fait par comparaison à une courbe standard réalisée avec de l'antigène pur non marqué.
Cette méthode de dosage immunologique permet de déterminer quantitativement de très faibles quantités de drogues dans divers milieux biologiques (plasma, urine, salive, etc.) chez l'homme, l'animal ou les plantes.
La détection est réalisée par un dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier qui permet de détecter les ligands CO. Cette technique garde les caractères de spécificité de la réaction immunologique et se révèle être suffisamment sensible pour être appliquée au dosage de nombreux médicaments.
L'utilisation de techniques spectroscopiques d'analyses, utilisant l'infrarouge comme méthode d'évaluation de marqueurs constitués par des complexes de métaux carbonyles, est très intéressante, car ces complexes présentent des bandes I.R. spécifiques dues aux carbonyles liés à un métal dans la région 1800- 2200 cm-1, fenêtre justement laissée libre par les protéines et où très peu de molécules sont susceptibles d'absorber.
L'obtention de spectres infrarouges avec un spectromètre à réseaux requiert usuellement des quantités de composé de l'ordre du mg.
L'utilisation de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, qui est basée sur la modula
tion du rayonnement de la source infrarouge par un interféromètre à la place de sa dispersion par un réseau, a augmenté la sensibilité, la vitesse et la précision des mesures infrarouges. Dans les spectromètres infrarouges à réseaux conventionnels, chaque élément spectral est détecté séparément. La possibilité supplémentaire qu'offrent les spectromètres infrarouges à transformée de Fourier réside dans l'enregistrement simultané de tous les éléments spectraux, ce qui donne un rapport signal-bruit (SNR) supérieur.
L'utilisation de l'instrumentation spectroscopique infrarouge à transformée de Fourier a étendu les limites de détection de la spectroscopie infrarouge aux quantités des nanogrammes. Ces limites peuvent être dépassées par des modifications appropriées.
Ainsi, la spectroscopie à transformée de Fourier permet le dosage immunologique de substances que le test métallo immunologique, utilisant également des marqueurs métalliques, ne pouvait détecter.
Par exemple sont rendus possibles les dosages d'antidépresseurs tricycliques marqués par un fragment cyclopentadiénylmanganèsetricarbonyl (CYMANTRENE) . Parmi les antidépresseurs, on peut citer les tricycliques : désipramine, imipramine, nortriptyline, amitriptyline, clomipraminé, maprotiline, et les atypiques : nomifensine, mianserine, amineptine, zimelidine.
Mais, d'autres molécules peuvent être envisagées telles que les antiépileptiques barbituriques (phénobarbital, méphobarbital), ou les dérivés des hydantoines (phénytoine, méphénytoine), mais aussi des
tranquillisants dérivés des benzodiazépines (diazépam, nitrazépam) ou encore des neuroleptiques tricycliques (chlorpromazine, trifluopérazine), ainsi que des neuroleptiques (halopéridol, fluspirilène) ou encore des antitumoraux (méthotrexate, 5-fluorouracile, azathioprine), des alcaloïdes, des amphétamines, ces antibiotiques, des cardiotoniques.
Des marqueurs appropriés sont présentés cidessous : des dérivés du cymantrène du type
Ces marqueurs portant une fonction COOH à l'extrémité de la chaîne R sont particulièrement adaptés pour être couplés à un antigène portant une fonction aminé (primaire ou secondaire) ce qui est le cas de la plupart des médicaments, par l'intermédiaire d'une liaison amide entre les deux fonctions. Lorsque
on pourra par exemple coupler le marqueur à l'antigène sur sa fonction aminé par couplage peptidique à l'aide
de la N-hydroxysuccinimide et du di-cyclohexylcarbodiimide. Lorsque R = (CH2)-nCOOH, le marqueur pourra être couplé à l'antigène sur sa fonction aminé par l'intermédiaire de son dérivé chloré pour lequel R = (CH2)n-COCL en orésence de pyridine.
Pour une drogue de formule le traceur aura
pour formule
III
IV
avec A = Cymantrène ou Benchotrène.
On peut citer selon la présente invention un autre type de marqueurs, ces marqueurs ont pour formule
V
avec R' = (CH2)n1 +1-X et X = H,OH,NH2 ou halogène
R" = H, (CH3), (CH2)n2-CH3 ou n1 et n2 sont des nombres entiers variant de 0 à 5 et
MxLy représente un composé organométallique dans lequel
Mx représente un ou plusieurs métaux des groupes VI à IX de la classification périodique éventuellement différents et Ly représente un ou plusieurs ligands dont au moins un ligand est le ligand CO, ce(s) ligand (s) compiexant le on les métaux, ce(s) ligand(s) pouvant être très varié(s), notamment le cyclopentadiényle Cp ou encore CS.
En particulier, MxLy est choisi parmi Mo2 Cp2(CO)4 , Co2(CO)6 et Os3(CO)9.
Lorsque X = H, OH ou halogène, ces marqueurs peuvent être couplés sur l'antigène par une réaction d'alkylation, la complexation du complexe de métaux carbonyles MxLy sur la triple liaison pouvant se faire avant ou après ledit couplage.
Le traceur a alors pour formule générale
où D représente l'antigène.
Cette alkylation peut se faire par l'intermédiaire du carbocation complexé :
CH2 +-(CH2)n1-C≡C-R" , BF4- VII
MxLy obtenu par exemple à partir du complexe
en présence de HBF4.
En particulier, lorsque MxLy = Mo2Cp2(CO)4 on observe alors une très bonne alkylation des fonctions aminés.
Lorsque X = NH2 le marqueur peut être couplé à une fonction COOH de l'antigène, mais ce type de marqueur est aussi approprié lorsque l'antigène possède une fonction amide. On prépare alors le traceur à partir d'un dérivé de l'antigène pour lequel la fonction amide est changée en fonction aminé que l'on fait réagir avec du
phosgène et du marqueur aminé. On obtient alors globalement une alkylation sur l'antigène, le traceur ayant pour formule
(l'antigène ayant pour formule ).
Un autre type de marqueur est le complexe
M1 (CO)5CS avec M1 = Cr, W.
Ce type de complexe constitue un marqueur en tant que tel dans la mesure où il peut réagir par l'intermédiaire du ligand CS avec une fonction aminé de l'antigène par élimination de H2S pour donner un traceur de formule D-N=C-M1 (CO)5, l'antigène ayant pour formule D-NH2.
On notera que lorsque le médicament à doser ne possède pas de fonction NH2, une telle fonction peut être créée par exemple par là réduction d'une fonction nitrée NO2 facile à introduire. Par conséquent, les marqueurs cités ci-dessus peuvent être couplés à tout médicament en vue de leur dosage immunologique infrarouge selon l'invention qu'il possède une fonction NH2 ou que celle-ci soit introduite.
Dans la mesure où les concentrations physiologiques de la plupart des antigènes ou médicaments à doser sont très faibles, l'utilisation de la spectroscopie IR-FT demande que tous les paramètres instrumentaux
soient optimisés pour obtenir le maximum de sensibilité du spectromètre, c'est-à-dire un niveau de bruit de fond le plus bas possible dans la région spécifique qui nous intéresse, à savoir 2200-1800 cm-1. Avantageusement, le dispositif de spectroscopie IR à transformée de Fourier, utile pour les dosages immunologiques à l'aide de marqueurs Mx( L)y selon l'invention, est caractérisé par un bas niveau de bruit dans la région 2200-1800 cm-1 ne dépassant pas 0,002% unités d'absorbance.
Par exemple, le dispositif selon l'invention comportera avantageusement les éléments suivants pris séparément ou en combinaison :
. un détecteur InSb . une fenêtre spectrale réduite
. une cellule de mesure à long parcours de lumière et faible diamètre
. un échantillon à doser liquide avec un solvant qui n'adsorbe pas ou peu dans la région 2200-1800 cm-1. L'emploi d'un détecteur InSb plutôt que d'un détecteur MCT accentue le rapport signal/bruit (SNR) dans la région 2200-1850 cm-1 par un facteur de 40. Dans cette région, la réduction de la fenêtre spectrale augmente le domaine dynamique du détecteur et diminue le bruit atteignant le détecteur.
La réduction de la fenêtre spectrale peut être obtenue grâce à un filtre optique à bande étroite.
La fenêtre spectrale peut être réduite par exemole à 50 cm-1.
Cependant, les filtres optiques présentent certains inconvénients, car ils ne transmettent pas toute l'énergie dans la région où ils sont transparents. D'autre part, de petites variations dans la température ambiante provoquent des oscillations de l'ordre de
10-3 unités d'absorbance dans le spectre rapporté.
Ces oscillations sont très difficiles à soustraire, car leurs périodes varient en fonction des températures.
On a trouvé, selon l'invention, que pour combler ces inconvénients il fallait que le filtre optique soit refroidi, par exemple à la température de l'azote liquide.
Avantageusement, donc, le filtre consiste en une pâte déposée à la surface du détecteur, lequel est réfrigéré à l'azote liquide et sous vide.
On observe alors une stabilisation significative du filtre optique avec seulement de légères oscillations résiduelles (10-5 unités d'absorbance).
Un inconvénient de l'emploi des filtres optiques est que l'on doit éviter de faire des mesures à proximité de leurs zones de coupure.
Cet effet doit être particulièrement pris en compte pour le meilleur choix des filtres, disponibles pour la région des métaux carbonyles, qui présentent une fenêtre spectrale de l'ordre de 50 cm-1.
Pour pallier cet inconvénient et pour améliorer la transmission d'énergie, la présente invention propose deux dispositifs limitant les fréquences aux environs de 1800-2300 cm-1 englobant la région spécifique des métaux carbonyles :
1. un détecteur de type sandwich composé d'un élément MCT (mercury-cadmium-telluride) limitant les hautes énergies vers 2300 cm-1 et d'un élément InSb (indiumantimony) limitant les basses énergies vers 1300 cm-1. 2. un détecteur InSb, coupant aux basses énergies aux environs de 1800 cm-1, couplé avec un filtre optique à large bande coupant les hautes énergies vers 2300 cm-1.
Avec ces dispositifs, on obtient ainsi : - une plus grande stabilité de la ligne de base,
- une meilleure réponse linéaire,
- une élimination des oscillations résiduelles,
- une meilleure sensibilité,
- plus d'énergie transmise. Une caractéristique importante du dispositif pour dosage immunologique basée sur la détection infrarouge à transformée de Fourier est le choix du solvant.
En vertu de la loi de BEER-LAMBERT, l'absorbance est proportionnelle au parcours du rayon infraroute traversant la solution. Il est donc souhaitable d'utiliser des cellules à longs parcours, mais ceci peut conduire à la saturation du détecteur par absorption du solvant conduisant à une perte de sensibilité dans la détection. L'absorption du solvant dans la région qui nous intéresse ne doit pas, de préférence, dépasser 0,5-0,7 unité d'absorbance. Cet élément est à considérer dans le choix du parcours de la cellule. En principe, tout solvant, y compris l'eau, peut être utilisé à condition de contrôler judicieusement sa longueur.
Les solvants appropriés peuvent être des alcanes (pentane, hexane, ...) ou des alcanes halogènés de faibles poids moléculaires (CH2Cl2, CHCl3 , CCI ...). En effet, ceux-ci ne présentent pas d'absorption ou une absorption très faible dans la région v(CO).
On a réalisé des spectres infrarouges IR-FT de ces solvants dans des cellules de parcours de 5 à 30 mm. On constate que, même avec un parcours de 30 mm, ce qui représente un parcours cent fois plus long que le parcours de cellules de solutions classiques, une telle cellule peut être efficacement utilisée sans dégrader la transmission d'énergie dans la région v(CO) de manière significative.
Le dispositif de spectroscopie infrarouge selon la présente invention peut donc comporter une cellule de parcours de l'ordre de 30 mm.
Avantageusement, selon la présente invention, le diamètre de la cellule ne dépasse pas 1 mm et peut même descendre à 0,1 mm. Cette caractéristique permet de diminuer le volume de solutions nécessaires.
Ainsi, avec une cellule de 1 mm de diamètre et de 30 mm de longueur, on obtient un volume de l'ordre de 24 μl. D'autre part, l'utilisation d'un diamètre de 1 mm pour la cellule permet de diminuer également la surface de l'élément de détection d'un facteur quatre, ce qui conduit à l'accentuation du SNR.
Ainsi, selon le dispositif de la présente invention, on peut utiliser un élément de détection de 0,25 mm (de diamètre ou de côté si c'est un carré)au lieu de 1 mm, la diminution de la surface du détecteur conduisant à un accroissement du SNR.
L'invention sera maintenant mieux comprise à l'aide des exemples qui vont suivre. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention y apparaîtront.
La figure 1 représente le rapport de deux spectres d'émission0 avec un spectromètre DA3 dans lequel on a fait le vide (SNR) ; la figure 2 représente un spectre d'émission avec un filtre optique placé sur un élément de détection InSb et ensuite refroidi avec de l'azote liquide et sous vide (avec le même spectromètre DA3) ; la figure 3 représente le rapport de deux spectres d'émission avec le spectromètre DA3 après avoir placé un filtre optique sur l'élément de détection comme fig. 2; la figure 4 représente un spectre d'émission d'un filtre optique qui coupe les hautes énergies vers
2300 cm-1 (enregistré avec un élément détecteur InSb) ; la figure 5 représente un spectre de CH2Cl2 dans une cellule infrarouge de 7 mm de parcours ; la figure 6 représente le rapport de deux spectres d'émission de CH2Cl2 ; la figure 7 représente un spectre de CHCl3 dans une cellule infrarouge de 7 mm de parcours ; la figure 8 représente le rapport de deux spectres d'émission de CHCl3 ; la figure 9 représente un spectre de n-pentane dans une cellule infrarouge de 7 mm de parcours ; la figure 10 représente le rapport de deux spectres d'émission de n-pentane ;
la figure 11 représente l'absorption infrarouge de CCL4 entre 2200-1800 cm-1 en utilisant une cellule de 30 mm de parcours revêtu d'or ; la figure 12 représente un spectre IR-FT (enregistré avec une cellule de 30 mm) des bandes carbonyles du complexe marqué notriptyline-CpMn(CO)3 après soustraction des bandes de solvant CCl4 ; la figure 13 représente un spectre IR-FT (enregistré dans une microcellule de 1 mm de parcours, avec CClu comme solvant) des bandes carbonyles du complexe marqué nortriptyline-CpMn(CO)3 après soustraction des bandes du solvant CCI4 ; la figure 14 représente la courbe de dosage par compétition obtenue par la mesure de la bande carbonyle à 2030 cm-1 du complexe marqué notriptyline- CpMn(CO)3 (B0/T = 50 %).
EXEMPLE I : SYNTHESE D'UN IMMUNOGENE DERIVE DE LA DESIPRAMINE
L'exemple qui suit propose la synthèse d'un immunogène dérivé de la désipramine. Préparation du dérivé N-(carboxypropionyi-3) de la désipramine (Ib schéma I ci-après).
La désipramine base (1,9 g ; 7,1 mmoles) est extraite du chlorhydrate, puis mise à réagir avec l'anhydride succinique (0,760 g ; 7,6 mmoles) dans 90 ml d'éthanol selon HUBBARD et coll. (1978). Cette réaction fournit 2,2 g (Rendement = 85 %) de fins cristaux blancs (Ib) dont les propriétés sont conformes à celles de la littérature. Préparation de l'immunogène (lc) :
Le dérivé Ib (74 mg ; 0,2 mmole) est dissous dans 20 ml de soude 0,1 N et la solution est ajustée à pH = 8,0 avec de l'HCl 0,1 N. On ajoute alors sous agitation 140 mg (0,002 mmole) de sérum albumine bovine (SAB) dissous dans 10 ml d'eau distillée, puis 123,8 mg (0,6 mmole) de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) mis en suspension dans 2 ml d'eau distillée. Le mélange est agité une nuit à température ordinaire, puis introduit dans des tubes de dialyse (Polylabo-réf. 24003) d'environ 20 cm de long et de 2,5 cm de diamètre. La dialyse a lieu à 4°C tout d'abord contre du tampon phosphate 1/15 M pH = 8 (deux fois un litre contenant chacun 2 g d'acide de sodium) et, cela, pendant 24 h ; puis, contre du tampon acétate 0,048 m pH = 4 (2 fois un litre), mais pendant 48 h. La solution dialysée est alors distribuée dans des pots en verre, puis lyophylisée. On obtient ainsi l'immunogène sous la forme d'un solide blanc brillant pulvérulent dont on va contrôler le taux de couplaαe selon la méthode décrite par ERLANGER et
coll. (1957) basée sur l'absorption U.V. du médicament. Le calcul des coefficients d'extinction moléculaire à 250 nm nous a permis d'évaluer à 44 le nombre de molécules de désipramine couplées à une molécule de SAB.
EXEMPLE II : SYNTHESE D'UN HAPTENE MARQUE AU CYMANTRENE (= METALLOHAPTENE) DERIVE DE LA DESIPRAMINE
. Préparation du chlorure d'acide de l'acide cymantrène carboxylique (CyCOCl) :
Il est obtenu, à partir du cymantrène après transformation en acétylcymantrène, puis en acide cymantrène carboxylique selon les méthodes décrites par KOZIKOWSKI et CAIS (1967) et RIEMSCHNEIDER et PETZOLD (1960).
. Préparation du dérivé cymantrénoylé de la désipramine :
La désipramine base (600 mg ; 2,25 mmoles) est extraite du chlorhydrate, puis dissoute dans 50 ml de THF fraîchement distillé. Ajouter 2 ml de pyridine, puis sous agitation additionner goutte à goutte 600 mg (2,25 mmoles) de CyCOCl dissous dans 20 ml de THF.
L'agitation est poursuivie pendant 24 heures à température ordinaire. Après filtration, évaporer le THF, reprendre par 100 ml de chlorure de méthylène, laver à l'acide dilué au 1/2, puis à la soude diluée au 1/10, puis à l'eau. Sécher, évaporer le solvant. Le résidu huileux obtenu (1g ; Rendement = 60 %) est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice 60 (éluant benzène-acétone 20:1. Les caractéristiques physicochimiques de l'huile purifiée sont les suivantes :
Spectrométrie de masse : ion moléculaire à m/e = 496
Infrarouge : C=0 : 1640, 950, 2050 cm-1.
Référence : HUBBARD J.W. et coll. J. Pharm. Sc. 1978,67, 1571.
Schéma I : Schéma de synthèse de l'immunogène et du métallohaptène issus de la Désipramine.
EXEMPLE III : PRODUCTION ET CARACTERISATION DE L'ANTISERUM
. Production :
Des lapins maies et femelles de type "fauve de bourgogne" sont immunisés avec l'antigène obtenu ci-dessus, selon la technique décrite par LANDON et
MOFFAT (1976). La première injection (250 ug d'immunogène par lapin) est réalisée avec l'adjuvant complet de FREUND (produit GIBCO) et les injections de rappel avec de l'adjuvant incomplet. Le sang est prélevé une dizaine de jours après chaque injection de rappel, à la veine marginale de l'oreille. Le sérum est alors congelé à -20 °C par fractions de 100 ul.
. Caractérisation : + courbes de titrage :
Des dilutions de l'antisérum sont introduites dans des tubes en verre à usage unique contenant de l'Imipramine tritiée (produit AMERSHAM à 21 Ci/mmole), dans un volume total de 300 ul de tampon phosphate 0,01 M pH = 7,4. Après incubation à 37 °C pendant 1h 15, on place les tubes dans un bain d'eau glacée et l'on ajoute 500 ul d'une suspension de charbon-dextran à
0,6 % . On agite vigoureusement pendant 30 s, on laisse reposer 10 mn, puis on centrifuge à 3500 g pendant 10 mn. Le surnageant contenant la fraction liée est décanté dans 10 ml de scintillant (UNISOLVE de chez KOCH-LIGH ou DYNAGEL de chez BAKER) contenus dans des flacons à scintillation en polypropylène. Après repos, les échantillons sont comptés au scintillateur liquide (modèle 3385 de PACKARD).
Parallèlement, on évalue la radioactivité totale (T), ainsi σue la liaison non spécifique (LNS).
Le pourcentage d'antigène lié (B) est calculé pour chaque point par rapport au T après déduction de la liaison non spécifique. Les titres en anticorps sont alors définis par la plus grande dilution qui lie 50 % du traceur.
+ étude de la spécificité (réactions croisées) :
La spécificité est évaluée à partir de courbes d'inhibition obtenues selon le même protocole que pour les courbes d'étalonnage en remplaçant l'antigène froid, par la molécule à étudier. Le pourcentage de réaction croisée est alors calculé selon la méthode d'ABRAHAM (1969) par rapport à l'IMIPRAMINE. Si X pg et Y pg sont les quantités d'imipramine et de la substance respectivement nécessaires pour déplacer 50 % d'imipramine tritiée liée aux anticorps, le pourcentage exprimant la réaction croisée de la substance sera égal à X/Y x 100.
Les molécules étudiées et les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-après. Les valeurs de ce tableau I montrent que l'antisérum étudié reconnaît, de manière similaire, les molécules qui sont issues du cycle iminodibenzyle (imipramine, désipramine, clomipramine, opipramol) et dans un degré moindre la nortriptyline (cycle dibenzocyclo-heptadiène). En revanche, les métabolites hydroxylés de l'imipramine ne sont pas reconnus, pas plus que les structures phénothiazinique ou benzodiazépinique. Dans le cadre du développement d'un nouveau test immunologique, il est nécessaire d'étudier les réactions croisées avec les métallohaotènes synthétisés. Avec la désipramine marquée, on a trouvé un pourcentage d'inhibition de 40 % toujours par rapport à l'imipramine tritiée.
Ce résultat est très important puisqu'il montre que la présence du marqueur n'a pas d'influence néfaste sur la reconnaissance de la molécule par les anticorps.
Tableau I. Etude des réactions croisées
Composé : % de réaction croisée par rapport à (3H) Imipramine prise égale à 100 %
Imipramine 100
Nortriptyline 20
Désipramine 50
Clomipraminé 100
Opipramol 200
2-OH Imipramine <2
10-OH Imipramine <2
Chlorpromazine <3
Diazépam <3
+ détermination de la constante d'affinité (K ou K') :
Deux méthodes ont été utilisées : soit la méthode SCATCHARD, soit la méthode d'ODELL qui fait intervenir des quantités croissantes de marqueurspour une dilution donnée de l'antisérum ; après équilibre, on sépare les fractions liées et libres par du charbon-dextran.
Avec l' (3H) imipramine, les méthodes de SCATCHARD et d'ODELL nous ont conduits à des valeurs de K voisines de 10+9 L/M, alors qu'avec le métallo- haptène décrit précédemment, par la méthode d'ODELL, nous obtenons une valeur de K' proche de 10 L/M.
Ces résultats mettent en évidence la très bonne affinité des antisérums obtenus pour les deux types de traceurs.
EXEMPLE IV : AUTRES SYNTHESES DE METALLOHAPTENES MOLECULES ETUDIEES (Exemples IV-1 a IV-6)
N
IV-1) (Cy)-CO-NORTRI :
mode opératoire : NORTRI : 600 mg (2,3 mmoles) dissous dans 30 ml de THF ; ajouter 2 ml de pyridine, puis goutte à goutte 620 mg (2,3 mmoles) de Cy-CO-Cl dissous dans 8 ml de THF. Agiter 24 heures à température ordinaire ; filtrer le précipité obtenu, puis évaporer le filtrat ; reprendre le résidu par 80 ml de dichlorométhane, puis laver et sécher. Le résidu huileux obtenu est chromatographié sur gel de silice (éluant : toluène/acétone 50/3). On obtient 820 mg (1-66 mmole ; rendement 72 %) d'une huile jaune pure par CCM.
Caractéristiques spectroscopiques : infrarouge : CO : 1938 ; 2017 ; 1628 cm-1 ; R.M.N. (C6D6) : H aromatiques : 7,25-6,85 (multiplet) ; =C-H: 5,60 (triplet) -CH2 CH2-N ; 3,35-2,75 (multiplet) ; -CH2-CH2- : 2,4 (singulet) ; -N-CH3: 2,1 (singulet) ; H de Cy ; 4,64 (multiplet) et 3,83 (triplet) ; masse : m/e = 493.
IV-2) Cy-CO CH2CH2- CO-NORTRI :
mode opératoire : dissoudre 604 mg (2 mmoles) de Cy-CO-CH2CH2-COOH dans 50 ml de THF. En maintenant la température à 4°C, ajouter 250 mg (22 mmoles) de N-hydroxysuccinimide, puis 600 mg (2,8 mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide. Après 3 heures d'agitation à 4°C, le précipité qui apparaît est éliminé par filtration. Sur le filtrat, on ajouté 595 mg (2,26 mmoles) de NORTRI dissoute dans 10 ml de THF, puis 1,2 ml de méthylamine. Agiter à nouveau 24 heures, évaporer le solvant. On obtient un solide marron qui est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : CH2Cl2/C6H5CH3/ CH3COCH,: 3/1/1). Le composé huileux obtenu (525 mg ; 0,95 mmole ; rendement 42 %) est pur par CCM.
Caractéristiques spectroscopiques: * infrarouge (CH2Cl2) :
CO: 1950 ; 2018 ; 1682 cm-1 ;
* RMN (C6D6) :
H aromatiques: 7,3-6,85 (multiplet) = C-H : 5,78
(triplet) et 5,58 (triplet) ; -N- CH3 : 2,10 (singulet); 10 11 -CH2CH2- : 2,55 (singulet); -CO-CH2CH2-CO-Cy : 3,25
(triplet); -CO-CH2CH2-CO-Cy et -CH2CH2-N: 2,85-2,25
(multiplet); H de Cy 4,88 (triplet) et 3,78 (triplet).
IV-3) Cy-CH2CH2CH2-CO~NORTRI :
mode opératoire : dissoudre 637 mg (2,4 mmoles) de NORTRI dans 8 ml de benzène anhydre ; ajouter 1 ml de pyridine puis goutte à goutte 685 mg (2,2 moles) de Cy-CH2CH2CH2-CO-Cl dissous dans 8 ml de benzène. Agiter 4 heures à température ambiante, filtrer le précipité qui apparaît, évaporer le filtrat. On obtient une huile reprise par CH2Cl2 qui est lavée puis purifiée par chromatographie sur gel de silice (éluant : CH2Cl2/hexane: 5/2). Le composé huileux obtenu, pur par CCM pèse 320 mg (rendement 25 %).
Caractéristiques spectroscopiques : * infrarouge (toluène):
CO:1938 2018 1653 cm-1 * RMN (CD3 CO CD3) : H aromatiques 7,3-7 (multiplet); -CH : 5,9 (multiplet);
-CO-CH2- 4,0 (triplet) ; -CH2CH2- Cy : 2,5-2,0 (multiplet);
10 11 -CH2CH2- 2,9 (singulet); -N-CH3: 2,73 (singulet);
H de Cy: 4,84 (singulet) et 4,79 (singulet).
IV-4) BCT-CH2CH2CH2-CQ-NORTRI :
mode opératoire: il est identique à celui décrit pour Cy-CH2CH2CH2CO-NORTRI sauf que l'on a remplacé Cy-CH2CH2CH2COCl par BCT-CH2CH2CH2COCl (700 mg). L'huile jaune-orange obtenue cristallise au froid (383 mg; 0,7 mmole, rendement 32 %).
Caractéristiques spectroscopiques : infrarouge : CO : 1958; 1881; 1638 cm-1;
* RMN (C6D6) : H aromatiques : 7,3-6,9 (multiplet); -C-H : 5,8 (triplet) et
5,6 (triplet); -CO-CH2-: 3,35 (triplet); 10 11 -CH2-CH2- : 2,6 (singulet); -N-CH3 ; 2,17 (singulet);
H de HCG : 4,52-4,3 (multiplet) et 4,47 (singulet).
IV-5) Cy-CO-AMPHE :
Mode opératoire : 67 mg (0,5 mmole) d'amphétamine sont dissous dans 6 ml de THF. On ajoute 0,5 ml de pyridine, puis goutte à goutte 134 mg (0,5 mmole) de Cy-CO-Cl dissous dans 1,6 ml de THF. On agite 24 heures à température ordinaire, puis filtre le précipité obtenu. On évapore le filtrat qui est repris par CH2Cl2, on lave, sèche puis évapore le solvant. Le résidu huileux obtenu est chromatographié sur CCM en gel de silice (éluant : toluène/acétone 20/1). On obtient alors un solide jaune de Point de fusion 122°C.
Caracteristiques soectroscopiques : infrarouge : CO :
2025 ; 1937 ; 1638 cm-1
* RMN (CD3COCD3): H du cycle benzénique : 7,25 (singulet) CH3-C-H ; 4,27 (pseudo quintuplet) C6H5-CH2-: 2,8 (double doublet); N-H : 2,8 (singulet); -CH3 : 1,15 (doublet); H de Cy : 5,58 (triplet) 5,03 (triplet) et 4,95 (triplet).
IV-6) Cy-CO-PHENO :
Mode opératoire : 230 mg (0,93 mmoles) de para-aminophénobarbital est dissous dans 12 ml de THF. On ajoute 0,9 ml de pyridine, puis goutte à goutte 250 mg (0,95 mmole) de CyCOCl dissous dans 5 ml de THF. On agite
24 heures à température ordinaire, puis filtre le précipité obtenu. On obtient un solide jaune après évaporation du filtrat. Ce solide est abondamment lavé. On obtient ainsi 363 mg (0,76 mmole ; rendement 82 %) du produit recherché.
Caractéristiques spectroscopiques : * infrarouge (dans KBr) : CO du marquer : 2024 et 1939 cm-1, CO-NH: 1708 et épaulements à 1751 et 1731 cm-1 ; C-H de C6H5 : 1598 cm-1 ; * RMN : néant (produit insoluble) ;
* masse : m/e = 477..
IV-7) IRIA DE LA CARBAMAZEPINE : SYNTHESES D'ANTIGENES
La mise au point d'un dosage immunologique d'un médicament à l'aide de l'Infrarouge (IRIA) nécessite la synthèse d'antigènes possédant un groupe métal-carbonyle. Pour la carbamazépine (1) (voir schéma des molécules citées ci-après), on a synthétisé des dérivés possédant une triple liaison complexée par M2L6 avec M = Mo ou Co. Ces composés sont en effet connus pour leur stabilité et leur facilité d'accès. Les antigènes synthétisés sont (3), (4b) et (4c). Leur mode d'obtention est le suivant (toutes les synthèses ont été effectuées sous atmosphère inerte et avec des solvants anhydres) :
(3) : A 100 mg (0,5 mmole) d'iminostilbène (2) dissous dans l'acétone sont additionnés 120 mg (0,2 mmole) de (5). La solution vire instantanément au rouge. A celle-ci sont ajoutées quelques spatules d'alumine et le tout est évaporé sous pression réduite. La purification de (3) est effectuée par chromatographie (phase stationnaire : alumine neutre, phase mobile : éther/pentane 1/4, dépôt à sec). La fraction de tête est collectée puis évaporée à sec sous pression réduite. (3) est recristallisé dans un mélange dichlorométhane/hexane pendant 3 jours à -20°C. 64 mg de cristaux noirs sont récupérés (rendement 50 %). (4a) : 482 mg (2,5 mmoles) d'iminostilbène (2) sont placés dans un tricol surmonté d'une ampoule à brome, d'un réfrigérant et d'une arrivée d'argon. Ils sont dissous dans 10 ml de toluène. Par l'ampoule à brome sont ajoutés au goutte à goutte 2,5 ml d'une solution à 20 % de phosgène dans du toluène. Ce mélange est porté au reflux pendant 3 heures. Il est ensuite refroidi jusqu'à 0°C.0,2 ml
(2,5 mmoles) de propargylamine sont ensuite ajoutés et le mélange est porté au reflux pendant une heure. Après refroidissement, il est filtré, évaporé sous pression réduite et le résidu est repris dans du dichlorométhane. Cette phase organique est alors lavée par de l'acide chlorhydrique pH = 2, séchée sur sulfate de magnésium puis chromatographiée sur gel de silice déposé sur plaques, l'éluant étant du dichlorométhane. 350 mg (1,3 mmole ; 52 % de rendement) de (4a) ont été ainsi obtenus. (4b) : A 137 mg (0,5 mmole) de (4a) dissous dans 3 ml de THF sont ajoutés 200 mg (0,6 mmole) de
CO2CO8. Le mélange est agité pendant 3 heures à température ambiante. (4b) a été purifié par chromatographie sur gel de silice en couche mince avec du dichlorométhane comme éluant. Il est ensuite recristallié dans un mélange éther/pentane une nuit à -20 °C. 60 mg (rendement 21 %) de cristaux rouge-orangé ont été obtenus.
(4c) : Mode opératoire identique à celui de (4b) avec 217 mg (0,5 mmole) de Mo2Cp2CO4 et une chromatographie finale avec comme éluant éther/pentane 1/1.
100 mg de cristaux rouges ont été obtenus (rendement 31 %).
Les caractéristiques spectroscopiques sont obtenues sur :
IR-FT : BOMEM Michelson 100 RMN H1 : BRUKER 250 MHz
U.V. Visible : KONTRON Uvikon 860 et données ci-aorès.
Schéma des molécules citées Exemple IV-7)
Données spectroscopiques de l'Exemple IV-7)
RMN H1 ( en ppm/TMS) IR(cm-1 dans N.V. Visible KBr)
(3)3 7,11;7,06-H aromatiques 1982,9 535 nm-ε=530 6,69-H vinyliques 1897,0 359 nm-ε=1240 5,35-H-C≡C 1832,8 258 nm-ε=31450 4,80-CH2- 1819,6 (dans CHCL3) (dans CDCL3)
(4a) 7,57-H aromatiques 3429;3288 284nm-ε=10350 6,63-H vinyliques 3022-2922 237nm-ε=13230 4,72-NH- 2115 216nm-ε=27920 4,04-CH2- 1668 (dans MeOH) 2,15-H-C≡C 1494 (dans CDCL3)
(4b) 7,30-H aromatiques 1998 6,65-H vinyliques 2017 5,95-H-C≡C 2034,5 4,72-NH- 2055,5 4,35-CH2- 2091,5 (dans CD2CL2)
(4c) 7,30-H aromatiques 1983,2 6,70-H vinyliques 1900,4 5,66-H-C≡C 1827,3 5,22-Cp 4,21-NH- 4,12-CH2- (dans CD2CL2)
EXEMPLE V : DISPOSITIFS DE SPECTROSCOPIE IR-FT POUR LES FIGURES 1 A 13
Les modifications ont été effectuées sur des spectrophotomètres IR-FT DA3 (commercialisés par BOMEN Inc.).
Un filtre transparent dans la région infrarouge entre 2030 et 2080 cm-1 a été collé à la surface d'un détecteur InSb et l'assemblage a été amené jusqu'à une pression inférieure à 10-1 torr.
Le détecteur a été ensuite alimenté en azote liquide, il a été refroidi pendant 40 à 50 mn. On a observé un déplacement de la réponse du filtre de l'ordre de 50 cm-1, déplaçant ainsi le nouveau domaine de fréquences entre 2080 et 2130 cm-1.
Les figures 1, 2 et 3 montrent qu'on observe une stabilisation significative de filtre optique lorsqu'il est refroidi à l'azote liquide avec seulement de légères oscillations résiduelles de l'ordre de 10-5 unités d'absorbance. Les spectres des figures 5 à 10 montrent que les solvants choisis alcanes ou alcanes halogènés présentent une absorption très faible dans la région v (CO). La courbe de la figure 12 est obtenue avec une quantité d'haptène marqué de 2 pmoles, sans utilisation de filtre optique. Dans ce cas, on a utilisé, pour la dissolution de l'haptène marqué, 40 ul de CCI . 24 μl étaient recueillis et transférés dans une cellule ayant 1 mm de diamètre et 30 mm de longueur avec des fenêtres
de CaF2. La cellule était également revêtue d'or pour augmenter le parcours de la lumière à travers la solution . On observe une absorbance trente fois supérieure à celle obtenue figure 13, par une concentration similaire, d'où l'intérêt d'augmenter la longueur de la cellule (figure 13 = cellule de 1 mm).
EXEMPLE VI : DOSAGE IRIA DE LA NORTRIPTYLINE
(1) DISPOSITIF DE SPECTROSCOPIE IR-FT POUR LE DOSAGE IRIA
Les modifications proposées par la présente invention ont été effectuées sur un spectrophotomètre IR-FT Michelson (commercialisé par BOMEN Inc.).
Le dispositif 2 de la page 7 a été utilisé (cf. fenêtre figure 4), combinant donc un détecteur InSb couplé avec un filtre optique à large bande coupant les hautes énergies vers 2300 cm-1.
Pour les dosages immunologiques, on a employé, pour la dissolution des fractions liées : 20 μl de CCI . 4 μl étaient recueillis et transférés dans une microcellule de 1 mm de longueur suffisante pour ce type de dosage avec des fenêtres de NaCl.
(2) COURBE D'ETALONNAGE DE LA NORTRIPTYLINE
La méthodologie est semblable à celle décrite précédemment pour les courbes de titrage des antisérums. On ajoute, en plus, des quantités variables d'antigène froid (Ag) pour une même dilution de l'antisérum et du marqueur tritié. Le principe du dosage est résumé sur le schéma II suivant :
Schéma II
1. Incubation :
fraction libre fraction liée
2. Séparation par charbon-dextran oar solvant
Extraction : de la fraction liée par 1 ml d'un mélange pentane-éther (90/10) si la séparation précédente a été réalisée par le charbon-dextran.
4. Evaporation du solvant
Dissolution : dans un solvant chloré (CC14, CHC13, ...)
6. Evaluation :
FT-IR
Les changements d'intensité du signal v (CO) de la fraction liée (figure 13) ont été enregistrés à partir de différents tubes obtenus après incubation d'une quantité connue et fixe d'haptène, dérivé de la nortriptyune marquée selon l'Exemple II avec du CpMn(CO)3, mise en compétition avec des concentrations connues et va
riables de nortriptyline non marquée (sous forme de chlorhydrate), pour une quantité d'anticorps fixée.
La figure 14 représente la courbe d'étalonnage obtenue grâce au dispositif de l'exemple V-(1), par la mesure de la bande carbonyle à 2030 cm-1. La gamme a été réalisée à partir d'une solution de nortriptyline, HC1 à 2 μg/ml, soit des valeurs de 0 à 1000 picomoles par tube. Les mesures ont été effectuées dans une cellule de NaCl d'1 mm de parcours, le tableau II ci-après donnant les valeurs : de B = intensité de la bande carbonyle du complexe
Ac-Ag.Mx(CO)y; de Bo = intensité de la bande carbonyle du même complexe, en l'absence de produit non marqué. Par ailleurs, la valeur de T correspond à l'intensité de la bande carbonyle de l'haptène marqué en l'absence d'antisérum.
Tableau II
(cy)-nortriptyline Xomol nortripty Y%8/80 B./T : 50 %
0 100 150 73.72 301 41.35 602 25.55 902 21.9
Ce tableau présente les valeurs qui ont permis d'établir la courbe d'étalonnage IRIA pour la nortriptyline représentée figure 14.
DEMANDE INTERNATIONALE PUBLIEE EN VERTU DU TRAITE DE COOPERATION EN MATIERE DE BREVETS (P
(51) Classification internationale des brevets** (11) Numéro de publication internationale: WO 88/ 07 G01N33/58, G01J 3/00 A3 (43) Date de publication inteπsationale: 6 octobre 1988 (06.10
(21) Numéro de la demande internationale: PCT/FR88/00161 (74) Mandataire: WARCOIN, Jacques; Cabinet Re beau, 26, avenue Kléber, F-75116 Paris (FR).
(22) Date de dépôt international: 31 mars 1988 (31.03.88)
(81) Etats désignés: AT (brevet européen), BE (brevet e
(31) Numéro de la demande prioritaire: 87/04698 péen), CH (brevet européen), DE (brevet europé FR (brevet européen), GB (brevet européen), IT (
(32) Date de priorité: 3 avril 1987 (03.04.87) vet européen), LU (brevet européen), NL (br européen), SE (brevet européen), US.
(33) Pays de priorité: FR
Publiée
(71) Déposant (pour tous les Etats désignés sauf US): CENAvec rapport de recherche internationale.
TRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIAvant l'expiration du délai prévu pour la modification FIQUE (CNRS) [FR/FR]; 15, quai Anatole-France, revendications, sera republiée si de telles modifications F-75007 Paris (FR). reçues.
(72) Inventeurs; et (88) Date de publication du rapport de recherche internatio
(75) Inventeurs/Déposants (US seulement) : JAOUEN, Gé15 décembre 1988 (15.12 rard [FR/FR]; 15, allée du Parc-de-la-Bièvre, F-94240 L'Hay-Les-Roses (FR). ISMAIL, Ashraf, A. [FR/FR]; Maison du Canada, Cité Universitaire, Boulevard Jourdan, F-75014 Paris (FR). BROSSIER, Pierre [FR/ FR]; 53, rue des Charrières, F-21800 Quetigny (FR).
(54) Title: INFRARED IMMUNOLOGICAL DOSING (54) Titre: DOSAGE IMMUNOLOGIQUE INFRAROUGE (57) Abstract
New type of immunological dosing, designated IRIA, employing a tag bearing carbonyl functions linked to at le one métal. Also a means of detecting the tag, in the form of an infrared spectroscopie device with a Fourier transform. so an IR spectroscopie device with a Fourier transform, comprising, separately or in combination, the following élémen an InSb detector; a reduced spectral window; a cell with a long light trajectory and ofsmall diameter; a liquid dosing s ple with preferably one solvent which absorbs little or nothing in the région 2200-1800 cm-1.
(57) Abrégé
L'invention concerne un nouveau type de dosage immunologique dénommé "IRIA". Selon la présente invention, utilise un marqueur portant des fonctions carbonyles liées à au moins un métal. L'invention concerne également une dét tion du marqueur qui est réalisée par un dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. L'inventi concerne également un dispositifde spectroscopie IR à transformée de Fourier qui comporte séparément ou combinés tre eux les éléments suivants: un détecteur InSb; une fenêtre spectrale réduite; une cellule à long parcours de lumière faible diamètre; un échantillon à doser liquide avec, de préférence, un solvant qui n'absorbe pas ou peu dans la régi 2200-1800 cm-1.
UNIQUEMENTA THRED'INFORMATION
CodesutiliséspouridentifierlesEtatspartiesauPCT,surlespagesdecouverturedesbrochurespubliantdes demandes internationales en vertu du PCT.
AT Autriche GA Gabon MR Mauritanie
AU Australie GB Royaume-Uni MW Malawi
BB Barba e HU Hongrie NL Pays-Bas
BE Belgique IT Italie NO Norvège
BG Bulgarie JP Japon RO Roumanie
BR Brésil KP République populaire démocratique SD Soudan
CF République Centrafricaine de Corée SE Suède
CG Congo KR République de Corée SN Sénégal
CH Suisse LI Liechtenstein SU Union soviétique
CM Cameroun LK Sri Lanka TD Tchad
DE Allemagne, République fédérale d* LU Luxembourg TG Togo
DK Danemark MC Monaco US Etats-Unis d'Amérique
FI Finlande MG Madagascar
FR France ML Malt
Bureau international
DEMANDE INTERNATIONALE PUBLIEE EN VERTU DU TRAITE DE COOPERATION EN MATIERE DE BREVETS (
(51) Classification internationale des brevets^ : (11) Numéro de publication internationale: WO 88/ 0 G01N 33/58, G01J 3/00 A3 (43) Datede publication internationale: 6 octobre 1988 (06.1
(21) Numéro de lademande internationale: PCT/FR88/00161 (74) Mandataire: WARCOIN, Jacques; Cabinet Re beau, 26, avenue léber, F-75116 Paris (FR).
(22) Datededépôt international: 31 mars 1988 (31.03.88)
(31) Numéro de la demande prioritaire: 87/04698
(32) Date de priorité: 3 avril 1987 (03.04.87)
(33) Pays depriorité: FR
Publiée
(71) Déposant (pour tous les Etats désignés sauf US): CENAvec rapport de recherche internationale.
TRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIAvec revendications modifiées FIQUE (CNRS) [FR/FR]; 15, quai Anatole-France, F-75007 Paris (FR).
(72) Inventeurs; et (88) Date de publication du rapport de recherche internatio
(75) Inventeurs/Déposants (US seulement) : JAOUEN, Gé15 décembre 1988 (15.1 rard [FR/FR]; 15, allée du Parc-de-la-Bièvre, F-94240 L'Hay-Les-Roses (FR). ISMAIL, Ashraf, A. [FR/FR]; Date de publication des revendications modifiées: Maison du Canada, Cité Universitaire, Boulevard Jourdan, F-75014 Paris (FR). BROSSIER, Pierre [FR/ 29 décembre 1988 (29.1 FR]; 53, rue des Charrières, F-21800 Quetigny (FR).
(54)Title: INFRARED IMMUNOLOGICAL DOSING
(54)Titre: DOSAGE IMMUNOLOGIQUE INFRAROUGE
(57) Abstract
New type ofimmunological dosing, designated IRIA, employing a tag bearing carbonyl functions linked to at l one métal. Also a means ofdetecting the tag, in the form ofan infrared spectroscopie device with a Fourier transform. so an IR spectroscopie device with a Fourier transform, comprising, separately or in combination, the following éléme an InSb detector; a reduced spectral window; a cell with a long lighttrajectory and ofsmall diameter; a liquid dosing s ple with preferably one solvent which absorbs little or nothing in the région 2200-1800 cm-1.
(57) Abrégé
L'invention concerne un nouveau type de dosage immunologique dénommé "IRIA". Selon la présente invention, utilise un marqueur portant des fonctions carbonyles liées à au moins un métal. L'invention concerne égalementune dé tion du marqueur qui est réalisée par un dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. L'invent concerne égalementun dispositifde spectroscopie IR à transformée de Fourier qui comporte séparément ou combinés tre eux les éléments suivants: un détecteur InSb; une fenêtre spectrale réduite; une cellule à long parcours de lumièr faible diamètre; un échantillon à doser liquide avec, de préférence, un solvant qui n'absorbe pas ou peu dans la rég 2200-1800 cm-1.
UNIQUEMENTA TITRED'INFORMAHON
CodesutiliséspouridentifîerlesEtatspartiesauPCT,surlespagesdecouverturedesbrochurespubliantdes demandes internationales envertu duPCT.
AT Autriche FR France ML Mali
AU Australie GA Gabon MR Mauritanie
BB Barbade GB Royaume-Uni M Malawi
BE Belgique HU Hongrie NL Pays-Bas
BG Bulgarie IT Italie NO Norvège
BJ Bénin JP lapon RO Roumanie
BR Brésil KP République populaire démocratique SD Soudan
CF République Centrafricaine de Corée SE Suède
CG Congo KR République de Corée SN Sénégal
CH Suisse LI Liechtenstein SU Union soviétique
CM Cameroun K Sri Lanka TD Tchad
DE Allemagne, République fédérale d* LU Luxembourg TG Togo
DK Danemark MC Monaco US Etats-Unis d'Amérique
El Finlande MG Madagascar
Claims
1. Nouveau type de dosage immunologique dénommé "IRIA", caractérisé en ce qu'on utilise un antigène marqué avec un marqueur portant des fonctions carbonyles liées à au moins un métal.
2. Dosage immunologique selon la revendication
1 , caractérisé en ce que la détection du marqueur est réalisée par un dispositif de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.
3. Dosage immunologique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on dose des molécules antigènes choisis parmi :
- les antidépresseurs tricycliques tels que la désipramine, l'imipramine, la nortriptyline, l'amitriptyline, la clomipramine, la'maprotiline et atypiques tels que la nomifensine, la miansérine, l'amineptine, la zimélidine,
- les antiépileptiques tels que les dérivés des barbituriques, notamment le phénobarbital, le méphobarbital, ou tels que les hydantoines, notamment le phénytoine, le méphénytoine,
- les tranquillisants dérivés des benzodiazépines, notamment le diazépam, le nitrazépam, la carbamazépme,
- les neuroleptiques tricycliques tels que la chlorpromazine, et la trifluopérazine, - les neuroleptiques tels que l'halopéridol, le fluspirilène,
- les antitumoraux tels que le méthotrexate, le 5-fluorouracile et l'azathioprine,
- des alcaloïdes,
- des amphétamines,
- des antibiotiques, et
- des cardiotoniques.
4. Dosage immunologique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le marqeur est un composé organométallique comportant des groupements carbonyles liés à des métaux choisis parmi les métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique.
5. Dosage immunologique selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le marqueur est choisi notamment parmi des structures du type
. des dérivés du cymantrène du type :
.
avec R'= -(CH2)n1+1-X
et X = H, OH, NH2, halogène R" = H, (CH2)n2-CH3
n1 et n2 variant de 0 à 5 MxLy étant choisi parmi Mo2Cp2(CO)4, Co2(CO)6, Os3(CO)9
et
. M1(CO)5CS avecnotamment M1 = Cr, W
6. Dispositif de spectroscopie IR à transformée de Fourier, utile notamment pour les dosages immunologiques selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente un bas niveau de bruit dans la région 2200-1800 cm-1 ne dépassant pas 0,002 % d'unités d'adsorbance.
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte séparément ou combinés entre eux les éléments suivants : un détecteur InSb une fenêtre spectrale réduite une cellule de mesure à long parcours de lumière et faible diamètre un échantillon à doser liquide avec de préférence un solvant qui n'absorbe pas ou peu dans la région
2200-1800 cm-1.
8. Dispositif selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que la fenêtre spectrale est réduite grâce à un filtre optique à bande étroite.
9. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte une fenêtre spectrale réduite à 50 cm-1.
10. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que le filtre à bande étroite est refroidi, notamment à la température de l'azote liquide.
11. Dispositif selon l'une des revendications
6 à 10, caractérisé en ce que le filtre à bande étroite consiste en une pâte à la surface du détecteur réfrigéré à l'azote liquide et sous vide.
12. Dispositif selon l'une des revendications
6 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte un détecteur du type sandwich combinant :
. un élément InSb pour l'extrémité basse énergie de 1800 cm-1, . un élément MCT pour l'extrémité haute énergie de 2300 cm-1.
13. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte un détecteur InSb avec une extrémité basse énergie aux environs de 1800 cm-1, couplé avec un filtre optique large bande qui limite les hautes énergies aux environs de 2300 cm-1.
14. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi les solvants alcanes ou alcanes halogènés, notamment le pentane, l'hexane, CH2Cl2, CHCl3, CCI4.
15. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisé en ce que le parcours de la cellule est d'environ 30 mm, pour les solvants alcanes halogènés de faibles poids moléculaires, notamment CH2Cl2,
CHCl3, CCI4.
16. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 15, caractérisé en ce que le diamètre de la cellule peut être réduit jusqu'à environ 0,1 mm.
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