DE2505267A1

DE2505267A1 - Digoxinderivate

Info

Publication number: DE2505267A1
Application number: DE19752505267
Authority: DE
Inventors: Roger Norman Piasio; James Edward Woiszwillo
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1974-03-01
Filing date: 1975-02-07
Publication date: 1975-09-04
Also published as: CA1051870A; GB1453583A; FR2262670B1; JPS50117766A; FR2262670A1; US3925355A

Description

Anmelderin: Corning Glass Works
Corning, N. Y., USA

Digoxinderivate

Die Erfindung betrifft Digoxinderivate, die z. B. radioaktiv gekennzeichnet und in der Radiοimmunanalyse verwendet werden können.

Bei der Radioimmunanalyse werden Stoffe radioaktiv gekennzeichnet, welche mit spezifischen Antikörpern immunchemische Komplexe bilden. Da eine bekannte Menge des radioaktiv gekennzeichneten Stoffs mit einer unbekannten Menge des gleichen, radioaktiv nicht gekennzeichneten Stoffs die gleiche Affinität zu der begrenzten Menge der komplexbildenden Stellen des Antikörpers hat, ist der radioaktive Zählwert entweder der von der TJm-setzungslösung getrennten immunchemischen Komplexe oder der verbleibenden Umsetzungslösung ein Maßstab für die Konzentration der unbekannten Stoffmenge, die zu einer mit bekannten Mengen aufgestellten Eichkurve in Beziehung gesetzt werden kann.

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Eine wesentliche Umsetzungskomponente ist hierbei der radioaktiv gekennzeichnete Stoff, der als solcher oder als sein komplexbildendes Derivat möglichst die gleiche Affinität zum Antikörper wie der ungekennzeichnete Stoff haben soll.

Digoacin (Digoxigenintridigitoxosid), ein Glycosid, wird in sehr kleinen Mengen als Her ζ stimulant ium verwendet. Da der Unterschied zur toxischen Menge sehr klein und die genaue Dosierung daher kritisch ist, ist die äusserst exakte Messung der Digoxinkonzentration im Serum oder Plasma wichtig, besonders da der klinisch erhebliche Bereich kleinste Mengen umfasst, etwa 0,5-5 ng/ml. Die Radioimmunanalyse bietet bisher das einzig zuverlässige Messverfahren. Die Kennzeichnung erfolgte bisher meist durch willkürliche oder spezifische Ersetzung von Η-Atomen des Digoxinmoleküls durch Tritium, *H. Infolge der langen Halbwertzeit von Tritium (etwa 12,3 Jahre), ist das so gekennzeichnete Digoxin gut lagerfähig. Nachteilig ist aber die schwache Beta-Strahlung von Tritium, die zusätzliche Bearbeitungsechritte erforderlich macht. So müssen z. B. nach Trennung der Komplexe eine getrennte Lösung mit dem gekennzeichneten Stoff bereitet werden. Die Zählwerte müssen verstärkt werden und die erforderliche Zählvorrichtung ist aufwendig.

Es ist daher bereits vorgeschlagen, zur Kennzeichnung das

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stärker emittierende lodisotop I zu verwenden. Hier ist

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allerdings die grösste Sorgfalt geboten, einen Abstand der Kennzeichnung von der Antigenhälfte des DigoxinmoleküTs zu wahren, damit diese bzw. der komplexbildende Teil durch die Strahlung von der Kennzeichnung nicht endgültig modifiziert wird und die Affinität des gekennzeichneten Digoxin für die Antikörper entsprechend leidet, was die Hessgenauigkeit und Zuverlässigkeit stark verfälscht.

Die folgende Literatur beschreibt Verfahren zur Kennzeichnung von Steroid-Eiweisskonjugaten, zur Konjugierung von Digoxin an die Aminogruppen von Lysinresten im Serumeiweies von Men-

125 sehen, und zur Kennzeichnung eines Digoxinderivats mit ^I (5-O-Succinyldigoxigenintyrosil), wobei die Affinitätgleichheit aber nicht ganz hergestellt wird:

S. L. Jeffocate et al, Clinica Chimica Acta, 43, 343-349 (1973);

T. W. Smith et al, Biochemistry, 9, No. 2, 331-337 (1970); V. P. Bulter et al, Proc. N.A.S., 57, 71-78 (1967); S. Gutcho et al, Clin. Ohem. 19/9, 1058-59 (1973).

Die Erfindung hat ein Digoxinderivat zur Aufgabe, welches

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leicht mit ^I gekennzeichnet werden kann und etwa die gleiche Affinität zu dem Antikörper hat, wie ungekennzeichnetes oder mit Tritium gekennzeichnetes Digoxin.

-r 4 -

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Die Aufgabe wird durch ein Digoxinderivat mit einer weiter unten dargestellten Struktur gelöst. Diese Verbindung erhält man durch Umsetzen der € -Aminogruppe des Lysinrestes von Lyayltyrosinmethylester mit dem geöffneten Endauckerrest von Digoxin bei Einhalten der unten näher beschriebenen Umsetzungsbedingungen ·

125 Der Benzylring des Tyrosinrests kann dann mit ^yI iodiniert werden. Die Kennzeichnung hat einen ausreichenden Abstand und das so gekennzeichnete Digoxinderivat hat etwa die gleiche Affinität zu Digoxinantikörpern wie Digoxin.

In den Zeichnungen zeigen die Fig. 1-8 Eichkurven verschieden lange und unter verschiedenen Bedingungen gelagerter, erfindungsgemässer Digoxinderivatβ; die Fig. 9 zeigt einen Vergleich solcher Eichkurven mit Digoxin, das mit Tritium gekennzeichnet wurde.

Darstellung von Lysyltyrosinmethylester

Im Beispielfall wurden L-Aminosaurereste verwendet, jedoch ist die Herstellung auch mit D-Besten möglich. Nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden 2,3 g Tyrosinmethylester in 20 ml Dimethylformamid (DMF) in einer Kolbenflasche gelöst und magnetisch gerührt. Der pH-Wert wird mit Triethylamin (TEA) auf 8 eingestellt. In 10 ml DMF gelöste 5,01 g o6 -t BOC- £ -OBZ L-Lysin ONP (et-tertiärer Butyloxycarbonyl €-(Carbobenzoxy)-L-Lysin £-Nitrophenylester| werden zugesetzt

- 5 509836/0859

und das Ganze 24- Std. gemischt, wobei mit TEA ein pH-Wert von 8 eingehalten wird. Nach vollendeter Kopplung wird das DMF abkonzentriert. Das Produkt bildet eLn dickes Gel. Dieses wird in 100 ml Ithylazetat gelöst und 30 Min. magnetisch gerührt, nachdem 300 ml 10%iges Ammoniumhydroxid zugesetzt wurden. Mit einem Trichter werden die beiden Schichten getrennt. Die Äthylazetatschicht wird mit dest. Wasser gewaschen und über Natriumsulfatanhydrid getrocknet, von diesem abfiltriert und zu einem öl eingedickt, dieses in kalter, 100%iger Trifluoressigsäure (TFE) gelöst und 15 Min. gerührt. Durch Abdampfen der TFE wird dns Produkt getrocknet und dann in 15 ml Eisessigsäure gelöst,'mit 15 ml kalter, 4-N Hydrobromsäure versetzt und ? Std. gemischt. Sodann werden 300 ml Ithyläther eingemischt. Die entstehende Ausfällung wird abfiltriert und 24- Std. ins Vakuum gebracht. Das Peptid wird in lO^iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Die Verbindung hat fo.lgende Struktur:

OH

H₂C 0 I Il H C-NH-C-CH-CH₄-CHi-CHj-CH₄-NH₁

I I O-C NH_t

I 0

CH,

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Kopplung von Lysyltyrosinmethylester an Digoxin
Digoxin hat die Struktur:

Zur Kopplung des Lysyltyrosinmethylesters an Digoxin wird
der Endzuckerrest am Digoxin mit Metaperiodat geöffnet. Es entsteht

Bei einem pH von 9 - 9» 5 wird die ^-Aminogruppe des Lyainrestes des Lysyltyrosinmethylesters an den geöffneten Endzuckerrest von Digoxin gekoppelt und bildet

OH

I Il H C-NH-C-CH-CH,-CHt-CH»-CH,-CHa

C-C C-

NH,

CH,

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Durch Zusatz von Natriumborhydrid wird diese Verbindung reduziert zu:

OH

I Il

HC-NH-C-CH-CHi-CHt-CHt-CH₁-I I H

O-C NH| O CH,

Die Herstellung dieser Verbindung umfasst folgende Schritte: zunächst werden 4-36» mg (0,56 Mol) Digoxin in 20 ml absolutem Äthanol bei Zimmertemperatur in einem 250 ml Erlenmeyerkolben suspendiert. Dann werden 20 ml 0,1 M Natriummetaperiodat und nach 25 Min. 0,6 ml 1 M Äthylenglykol zugesetzt. Nach 5 Min. wird die Mischung in zuvor mit 5% ^Ko^^ ^au^ 9»5 pH gepuffer ter 20 ml Methylesterlösunp gegeben. Der pH wird mit KpCO, auf 9-9,5 gehalten. Dann werden in 20 ml Wasser frisch ge löste 300 mg Natriumborhydrid zugesetzt. 3 Std. später wird der pH durch Zusatz von 1 M Ammoniumhydroxid auf 8,5 gebracht. Der Ansatz wird über· Nacht gerührt und dann mit 0,1 N HCl auf pH 4,5 eingestellt. Nach 4 Std. bei 4⁰C wird die Mischung zentrifugiert, die Ausfällung in 10%iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Das Produkt wird bei -2Ö° gelagert.

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Kennzeichnung des Digoxinderivats mit Iodisotop Das Verfahren folgt im wesentlichen dem Vorschlag von Hunter und Greenwood in Nature, Bd. 194, S. 495-6 (1962).

Ein Millicurie Na ¹²^I wird mit 10 - 20 ^ug des Digoxinderivats umgesetzt. Chloramin T wird zugesetzt und rasch gemischt. Nach 8-10 Sek. werden 100 /Ug Natriummetabisulfit zugesetzt und ebenfalls rasch gemischt, sodann 500 /ug Natriumiodid eingemischt. Die Mischung wird nun in eine DEAE Sephadexkolonne gegeben und mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer eluiert. Drei ml Proben werden abgezapft und einzeln auf Bindung mit Digoxinantikörper untersucht. Teile mit der grössten Bindungsaktivität werden bei geeigneter Temperatur gelagert. In allen Fällen werden die Reagenzien in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, gelöst.

Das Digoxinderivat wird hierbei an den C, oder 0, und C,- Stellen des Benzylrings des Tyrosinrestes, Je nach der Dauer des Verfahrens, gekennzeichnet. Die genauen Prozentsätze des mono- und di-iodinierten Derivats können in bekannter Weise (z. B. durch stripscanning) bestimmt werden. Das gekennzeichnete Derivat hat daher eine oder beide der Strukturen:

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ZOUDZD /

.. 9 (mono-)

OH

I«·

H₁C 0

H C-NH-C-CH-CH₁-CHt-CHt-CHt-N^cP-

'I M

0-C NH,

OH

Ui-)

OH

CH₁

I II
H C-NH-C-CH-CH₂-CH₂-CH₂-CHt-N-

I I H

0-C - NH₁

Anfertigung der Eichkurven

Die Eichkurven der Fig. 1-8 zeigen die kouplexbildende Fähigkeit der Derivate nach verschiedener Lagerdauer und -temperatur. Die Kopplung des Antidigoxin-Antiaerums von der Fa. Biospheres, Miami, Florida, USA, an poröse Glaapartikel über ein Silan erfolgte nach dem Verfahren der gleich laufenden Anmeldung.

Nach einer Inkubationsdauer von 20 Min. wurden die Proben 5 Min. mit 2500 UpM zentrifugiert und die überstehende Flüs sigkeit nicht abgegossen sondern abgesaugt.

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- ίο -

125 Die Tabelle verzeichnet die Lagerbedingungen des "Ί

Digoxins.

Fig. No.	Lagertempera tur in ⁰C	Lagerdauer in Tagen
1	4°	26
2	Zimmertemp.	26
3	37°	26
4	gefroren	14
	Zimmert emp.	14
6	Zimmertemp.	14
7	37°	14
8	lyophilisiert	14

Lagerflüssigkeit

PBS/BSA, kein NaN,

PBS/BSA, kein NaN₅

PBS/BSA, kein NaN,

PBS/BSA, NaN,

PBS/BSA, NaN₅

PBS/BSA, NaN,

PBS/BSA, NaN₅

Vergleich mit anderen

TT^

I-Digoxinderivaten und mit

Fig. 9 zeigt die Vergleichskurven unter sonst gleichen Be-

126 ^

dingungen für -Ί-Digoxin und -Ή-Digoxin. Wie der Vergleich

zeigt, hat das erfindungsgemässe, gekennzeichnete Digoxinderivat nahezu die gleiche Affinität zu Antidigoxin Antikörpern wie ^H-Digoxin.

- 11 -

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Claims

- 1] Fa ί ent an sy>rü ehe

1. Digoxinderivat, gekennzeichnet durch die Strukturformel:

OH

H₂C HC-NH-C-CH-CIi₂-CH₂-CH₂-CH₂

I '

O=C NHi

0 I

fU CH« CHj y^^T¹

""'u"^ OH OH

?. Dipoxinderivat, gekennzeichnet durch die ßtrukturformel:

Am

CH

H₂C

ι ti

H C-NH-C-CH-C I I

O=C NH₁

I 0

CH₉

-CH₂-CH₂-N-

CH,

OH

Dipoxinderivai., gekennzeichnet durch die Strukturformel:

OH

125, I „tI23

H₂C

I Il

H C-NH -C- Cl I -CH₂-CHjI-CH₂-CH₂ -N-I I H

O~C NH₂

0 CH,

HO;

- 12 -

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4. Verfaliren zum Herstellen der Digoxinderivate nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass durch Umsetzen einer Digoxinlösung mit Natriummetaperiodat ein erstes Digoxinderivat erzeugt wird, durch Umsetzen dieses Derivats
mit Lysyltyrosinmethylester ein zweites Digoxinderivat erzeugt wird und dieses durch Umsetzen mit einer Natriumborhydridlösung reduziert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass

125
der Tyrosinrest mit I gekennzeichnet wird.

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