CN111983242A - 电化学发光免疫测定方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种电化学发光免疫测定方法，具体步骤包括：将样本、生物素化合皮质醇特异性抗体和吡啶钌标记的皮质醇衍生物充分反应，然后加入包被链霉亲和素的磁珠微粒进行孵育，得到抗原抗体磁性微粒复合体；将所述抗原抗体磁性微粒复合体吸入到测量池中并加入三丙胺，加电压发生ECL反应，使所述抗原抗体磁性微粒复合体化学发光，然后通过光电倍增器测量发光强度从而得出皮质醇的浓度。该方法方便迅速，实现了精确的全自动化。本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒可实现标记物的再循环利用，发光时间长、强度高、易于测定，从而提高了检测灵敏度和线性范围，减少了高值标本稀释误差。

Description

电化学发光免疫测定方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种电化学发光免疫测定方法及试剂盒。
背景技术
皮质醇(氢化可的松)是机体最主要的糖皮质激素，对维持机体的多项生理机能有重要作用。与其它糖皮质激素类似，皮质醇由共同的胆固醇前体在肾上腺皮质束状带合成。血循环中约有90％的皮质醇与皮质类固醇结合球蛋白(CBG)和白蛋白结合后进行运输。仅有少量的游离皮质醇与其受体发生反应。
血清皮质醇的浓度具有昼夜节律性变化。通常最高峰值出现在清晨 (700nmol/L或25.4mg/dL)，随后逐渐降低，到夜间可降至峰值浓度的一半左右。因此在解释结果时，明确采血时间是很重要的。检测患者血循环中皮质醇的含量可用于诊断肾上腺、垂体和下丘脑的机能是否正常。因此检测血清皮质醇的浓度可用监测多种疾病，如浓度明显增高的库欣氏综合征或浓度明显降低的艾迪生病。同时也可用于库欣氏综合征使用地塞米松抑制治疗或艾迪生病使用激素替代治疗的疗效监测。
库欣氏综合征实验室诊断的另一选择是检测24小时尿液中的皮质醇浓度，因为尿液中排泄的皮质醇不受昼夜节律性分泌的影响。这种方法能够准确的区分健康人与库欣氏综合征患者。尿液中排泄的皮质醇均未与转运蛋白结合，因此被称为尿游离皮质醇(UFC)。通常尿游离皮质醇与血中具有生物活性的游离皮质醇具有一定的比例关系。
近来研究发现对于库欣氏综合征的诊断，检测夜晚唾液中的皮质醇比检测尿液游离皮质醇更有价值。检测夜晚唾液中的皮质醇特别适用于儿童、精神病患者以及由于不同的压力因素影响肾上腺皮质过度分泌肾上腺类固醇激素的个体。Elecsys皮质醇检测采用竞争法原理，使用特异性识别皮质醇的多克隆抗体。通过达那唑释放样本中与蛋白结合的内源性皮质醇，并与试剂中钌复合物a标记的外源性皮质醇衍生物竞争结合生物素链接的抗体。尿液检测可通过二氯甲烷萃取以降低其它物质的干扰。未经处理的唾液经过离心可直接检测。但上述方法通常存在敏感度低、成本昂贵、操作步骤繁琐等缺陷。
发明内容
由鉴于此，本发明确有必要提供一种电化学发光免疫测定方法及试剂盒，以解决上述问题。
本发明所采用的技术方案是：一种电化学发光免疫测定方法，具体步骤包括：
步骤1：将样本、生物素化合皮质醇特异性抗体和吡啶钌标记的皮质醇衍生物充分反应，得到预反应复合物；
步骤2：向所述预反应复合物中加入包被链霉亲和素的磁珠微粒进行孵育，通过所述生物素化合皮质醇特异性抗体与链霉亲和素的相互作用，将所述预反应复合物结合到所述磁珠微粒上，得到抗原抗体磁性微粒复合体；
步骤3：将所述抗原抗体磁性微粒复合体吸入到测量池中并加入三丙胺，加电压发生ECL反应，使所述抗原抗体磁性微粒复合体化学发光，然后通过光电倍增器测量发光强度，从而得出皮质醇的浓度。
基于上述，所述的电化学发光免疫测定方法还包括配制梯度浓度的标准溶液，根据发光强度变化值对数与浓度对数绘制剂量反应曲线，通过换算得出样本中的皮质醇的浓度。
基于上述，所述样本为血清、尿液或组织液。
基于上述，所述样本为有机化合物、核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸、单糖、多糖、氨基酸、多肽或蛋白质。
基于上述，所述吡啶钌标记的皮质醇衍生物为4-二丙氨基丁基-4’-甲基 -2,2’-联吡啶、4-4’-二(二丙氨基丁基)-2,2’-联吡啶或4-乙醇氨基丁基-2,2’- 联吡啶。
本发明还提供一种用于电化学发光免疫测定的试剂盒，该试剂盒包括二价三联吡啶钌标记的皮质醇肽段、生物素化合抗皮质醇抗体、链霉亲和素包被的磁性微粒、三丙胺溶液；其中，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒由浓度为0.72mg/mL的包被链霉亲和素的磁珠微粒和防腐剂组成；所述生物素化合抗皮质醇抗体由防腐剂、浓度为90ng/mL的生物素化抗皮质醇多克隆抗体和浓度为100mmol/L的MESb缓冲液组成；所述二价三联吡啶钌标记的皮质醇肽段是由防腐剂、浓度为25ng/mL的吡啶钌标记的皮质醇衍生物、浓度为20μg/mL达那唑和浓度为100mmol/L的MES缓冲液组成，所述吡啶钌标记的皮质醇衍生物为4-二丙氨基丁基-4’-甲基-2,2’-联吡啶、 4-4’-二(二丙氨基丁基)-2,2’-联吡啶或4-乙醇氨基丁基-2,2’-联吡啶。
其中，本案应用到的测量池是电化学发光过程中所有电化学发光反应进行的场所，是本领域的通用设备，具体结构是一个激发电极在测量池的下方，两个测定电极安装在激发电极上方的两侧，有一个光电倍增管的采集口以便于光信号采集和分析。在测量池下装置可移动的用以吸引磁性微粒的磁铁。反应液由蠕动泵运送入测量池，由于磁铁吸引，磁性微粒被吸着在电极上，其余反应物流出测量池，完成游离的和结合的标记抗体的分离。
而本案中ECL反应的原理为：电化学发光(ECL)是电场参与化学发光所产生的结果，是指通过施加一定的电压进行电化学反应：电极表面的三丙胺TPA释放电子，进而释放质子成为自由基TPA，同时，二价的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+释放电子成为三价的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+。具有强氧化性的三价的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+与具有强还原性的三丙胺自由基TPA发生氧化还原反应，结果使三价的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+还原成激发态的二价的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+，激发态[Ru(bpy)3]2+衰变并以释放出波长为620nm光子的方式释放能量，而成为基态的[Ru(bpy)3]2+。
与现有技术相比，本发明提供的电化学发光免疫测定方法具有突出的实质性特点和显著的进步，具体地，本发明所述提供的电化学发光免疫测定方法，同时采用结合了吡啶钌标记的皮质醇衍生物、结合了生物素的抗体与待测样品进行孵育反应，然后再将被链霉亲和素包被的磁性微粒加入，使生物素通过与亲和素的结合将磁性微粒、待测抗原、抗体连接为一体，形成“三明治”夹心的复合体。复合体通过磁性微粒被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面，利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离将结合标记物的复合体和游离标记物进行分离，加电压启动ECL反应，发光底物吡啶钌在电极表面失去电子而被氧化，电子供体二丁基乙醇胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，用光电倍增管检测光强度，其光强度与吡啶钌的浓度呈线性关系，根据吡啶钌在电极上发出的光强度对待测样本中的皮质醇的浓度进行检测，有效避免了现有技术中的敏感度低、成本昂贵、操作步骤繁琐等缺陷，为实验室诊断库欣氏综合征和艾迪生病提供了可靠的检测手段。
此外，本发明还采用链霉亲和素和生物素用来达到放大检测效果，一分子链霉亲和素可与四分子生物素相结合。链霉亲和素均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与生物素结合的固相载体。链霉亲和素包被的磁性微粒与生物素化的抗原或抗体接触，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。利用磁性使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化，同时可实现标记物的再循环利用，发光时间更长、强度更高、易于测定。从而提高了检测灵敏度和线性范围，减少了高值标本稀释误差，实验表明利用本方法对样本中的皮质醇最低检测限可达0.500nmol/L或0.018μg/dL。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
实施例
本实施例具体提供一种电化学发光免疫测定方法，具体步骤包括：
第一次孵育：20μL样本、生物素化合皮质醇特异性抗体和吡啶钌标记的皮质醇衍生物一起孵育，被标记的抗体结合位点部分被样品分析物占据，部分被钌标记的半抗原占据，取决于样品中分析物的浓度和各自免疫复合物的形成，其中，所述吡啶钌标记的皮质醇衍生物为4-二丙氨基丁基-4’-甲基 -2,2’-联吡啶。
第二次孵育：加入包被链霉亲和素的磁珠微粒进行孵育，通过生物素和链霉亲和素的相互作用，复合物结合到磁珠微粒上，得到抗原抗体磁性微粒复合体；
将所述抗原抗体磁性微粒复合体吸入到测量池中并加入三丙胺，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面；未与磁珠结合的物质通过ProCell被去除。给电极加以一定的电压，使复合物化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度。
仪器通过2点定标校正试剂条形码包含的厂商定标曲线，自动计算得到检测结果。
本实施例还提供本发明还提供一种用于电化学发光免疫测定的试剂盒，该试剂盒包括二价三联吡啶钌标记的皮质醇肽段、生物素化合抗皮质醇抗体、链霉亲和素包被的磁性微粒、三丙胺溶液；其中，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒由浓度为0.72mg/mL的包被链霉亲和素的磁珠微粒和防腐剂组成；所述生物素化合抗皮质醇抗体由防腐剂、浓度为90ng/mL的生物素化抗皮质醇多克隆抗体和浓度为100mmol/L的MESb缓冲液组成；所述二价三联吡啶钌标记的皮质醇肽段是由防腐剂、浓度为25ng/mL的吡啶钌标记的皮质醇衍生物、浓度为20μg/mL达那唑和浓度为100mmol/L的 MES缓冲液组成，其中，所述吡啶钌标记的皮质醇衍生物为4-二丙氨基丁基-4’-甲基-2,2’-联吡啶。
具体地，利用本实施例提供的电化学发光免疫测定方法及试剂盒进行检测时的具体操作步骤如下：
实验室基础设备：Elecsys 1010/2010，MODULAR ANALYTICS E170 或cobas e分析仪
所需试剂如下：
M规格为0.72mg/mL的包被链霉亲和素的磁珠微粒(透明瓶盖)1瓶，
6.5mL；防腐剂。
R1生物素化的抗皮质醇抗体(灰盖)，1瓶9mL：生物素化抗皮质醇
多克隆抗体(羊)浓度90ng/mL，MESb缓冲液100mmol/L，pH 6.0；防
腐剂。
R2 Ru(bpy)32+标记的皮质醇肽段(黑盖)，1瓶9mL：钌复合物标记的皮质醇衍生物(合成)，25ng/mL；达那唑20μg/mL；MES冲液 100mmol/L，PH6.0；防腐剂。所述吡啶钌标记的皮质醇衍生物为4-二丙氨基丁基-4’-甲基-2,2’-联吡啶。
b)MES＝2-溴-乙烷磺酸。
样本的采集和准备：
血清：血清样本须用标准试管或含有分离胶的真空管收集。
肝素锂、钠或铵，EDTA-K2、K3或Na2，枸橼酸钠血浆均适用。使用枸橼酸抗凝血浆检测结果需+10％纠正。标准：血清值回收率90％-110％，斜率 0.9-1.1，截距在＜±2倍分析灵敏度(LDL)，相关系数＞0.95。氟化钠/草酸钾抗凝血浆的检测结果比血清低27％。
唾液：
使用唾液收集专用容器收集样本。且不能含有柠檬酸的小瓶。将采集拭子于口腔内轻轻咀嚼2分钟，待采集拭子移浸满唾液后取出。然后将拭子悬空插入采集管并加盖。1000g离心力离心2分钟后分离唾液至另一干净试管。取上清液进行检测，检测唾液方式与血清或血浆样本一致。
尿液：
收集24小时尿液于干净容器并注明尿量，勿加防腐剂。尿液萃取前最好先进行离心。萃取后的尿液样本的检测方式与血清或血浆样本一致。
尿液样本的萃取和复溶：在玻璃试管中将600μL尿液和3mL二氯甲烷完全混匀静置7分钟；利用2500g离心力进行离心5分钟；去除上层的水相和界面上的残渣；用另一干净的玻璃试管吸取1.5mL已萃取的二氯甲烷，并用流速较缓的氮气吹干。
定标
溯源性：该检测方法通过酶免法进行标准化，后者可溯源至同位素稀释－质谱分析测量法。
Elecsys皮质醇检测使用IRMM(参考物质和测量局，Geel，比利时)的 IFCC-451参考盘(ID/GC/MS)，进行回收试验，此参考盘包括了34个样本，浓度范围为83-764nmol/L，回收率结果为89-111％。
计算
仪器会自动计算各样本分析物浓度，单位以：nmol/L，μg/dL或μg/L表示。
转换系数：nmol/L×0.03625＝ug/dL；nmol/L×0.3625＝ug/L；μg/dL× 27.586＝nmol/L；μg/L×2.7586＝nmol/L。
尿游离皮质醇的浓度需要进行手工换算(以皮质醇浓度/24h表示)：检测结果乘以24小时尿量(如果结果单位为ug/dL须再乘10以转换为μg/24h)。平均萃取率(n＝25)约为94％。
需要说明的是，该实验通常存在以下干扰因素：
如样品是血清或血浆时，以下情况检测结果不受干扰：黄疸(胆红素 <1026μmol/L或<60mg/dL),溶血(血红蛋白<1.2mmol/L或<1.9g/dL)，血脂 (甘油三脂<2700mg/dL)和生物素<123nmol/L或<30ng/mL。
标准：回收率在初值±10％之内。
尿液检测结果不受60mg/dL的蛋白，750mmol/L的氯化钠，350mmol/L的尿素，5mmol/L的肌酐，2mmol/L的葡萄糖的影响。标准：回收率在初值±15％之内。对于接受高剂量生物素治疗的患者(＞5mg/天)，需在末次生物素治疗8小时后采集样本。类风湿因子≤1100IU/mL时，检测结果不受影响。对17 种常用药物进行体外检测未发现会影响检测结果。少数病例中，高滴度的抗分析物特异性抗体，钌抗体和生物素抗体会影响检测结果。通过合适的实验设计可将影响因素降到最低。
检测范围
0.5-1750nmol/L或0.018-63.4μg/dL(通过最低检测限和厂商定标曲线的最高值确定)。检测值低于检出低限则报告＜0.5nmol/L(＜0.018μg/dL)。检测值高于检测上限时则报告＞1750nmol/L(＞63.4μg/dL)(十倍稀释的样品要多达17500nmol/L或634μg/dL)。
其中，操作过程中有时还需要进行稀释：高于检测范围的血清或血浆样本可用通用稀释液稀释。建议1:10稀释(MODULAR ANALYTICS E170， Elecsys 1010/2010和cobas e分析仪可以自动稀释，也可以手工稀释)。稀释的样本皮质醇浓度必须高于50nmol/L或1.8μg/dL。如用手工稀释，结果应乘稀释倍数。如果是机器自动稀释，机器会自动计算结果。尿液样本的检测结果如果超出检测范围可在样本萃取前用低浓度的尿液样本进行稀释，结果换算时必须考虑稀释比。
期望值
(1)血清或血浆样本的期望值
Elecsys皮质醇检测的健康个体研究结果数据如下(取5％-95％的参考区间)早晨7-10AM采血：171-536nmol/L或6.2-19.4μg/dL(n＝144)；下午 4-8PM采血：64-327nmol/L或2.3-11.9μg/dL(n＝135)。
(2)尿样本的期望值
88例健康个体尿液样本的Elecsys皮质醇检测结果数据如下(取5％-95％的参考区间)100-379nmol/24h(36-137ug/24h)。唾液：154例健康个体尿液样本的Elecsys皮质醇检测结果数据如下(取单侧95％位点值)；早晨 8-10AM：<19.1nmol/L或<0.69μg/dL；下午2:30-3:30PM:<11.9nmol/L或 <0.43μg/dL。
(3)精密度
根据NCCLS(临床实验室标准化委员会)中EP5-A准则，采用Elecsys 试剂、人混合血清和质控品进行重复性检测：每天测定6次，共10天(n＝60)； MODULAR ANALYTICS E170分析仪批内精密度，n＝21。所得结果如表1和表2所示。
其中，表中CV代表批内重复性检测试验变异系数(coefficient of variation)；SD代表标准偏差(Std Dev,Standard Deviation)；Mean代表均值； Within-run precision代表批内精密度；Toltal precision代表总精密度； Sample代表样本组；HS1/HS2/HS3代表人混合血清样品组；PC U1/PC U2 代表质控品样本组。
表1、人混合血清和质控品充当样本的精密度
Figure BDA0002070450520000091
表2、Elecsys试剂充当样本的精密度
Figure BDA0002070450520000101
考虑到尿液萃取及复溶可能对精密度造成的影响，下表的研究数据用于与上列的血清样本进行比较。
尿液皮质醇检测的精密度实验采用Elecsys试剂，尿液样本和尿液质控一次性25倍萃取并重复检测25次计算批内精密度实验(n＝25)；分别单独萃取的尿液样本单次检测并重复10次计算批间精密度(n＝10)：结果如表3所示：表中，Between-run precision代表批间精密度；Urine1/2/3/4代表尿液样本组；Urine Control代表尿液质控一次性25倍萃取样本组。
表3、尿液皮质醇充当样本的精密度
Figure BDA0002070450520000102
唾液皮质醇检测的精密度实验采用Elecsys试剂，原始唾液样本和穗状唾液样本重复检测21次计算批内精密度实验(n＝21)；单次检测重复10批次计算批间精密度实验(n＝10)；使用多份唾液样本用于批内和批间精密度的实验：结果如表4所示：表中，Saliva1/2/3/4/5代表唾液样本组。
表4、唾液皮质醇充当样本的精密度
Figure BDA0002070450520000111
(4)分析灵敏度(最低检测限)
检测限是指能够检测出的区别于零浓度最低分析物浓度。计算为最低标准以上两个标准差(主定标，标准1+2SD，批内精密度，n＝21)，通过实验表明本方法对样本中的皮质醇最低检测限可达0.500nmol/L或0.018μg/dL。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (6)

1.一种电化学发光免疫测定方法，具体步骤包括：
步骤1：将样本、生物素化合皮质醇特异性抗体和吡啶钌标记的皮质醇衍生物充分反应，得到预反应复合物；
步骤2：向所述预反应复合物中加入包被链霉亲和素的磁珠微粒进行孵育，通过所述生物素化合皮质醇特异性抗体与链霉亲和素的相互作用，将所述预反应复合物结合到所述磁珠微粒上，得到抗原抗体磁性微粒复合体；
步骤3：将所述抗原抗体磁性微粒复合体吸入到测量池中并向所述测量池中加入三丙胺，加电压发生ECL 反应，使所述抗原抗体磁性微粒复合体化学发光，然后通过光电倍增器测量发光强度，从而得出皮质醇的浓度。
2.根据权利要求1所述的电化学发光免疫测定方法，其特征在于，它还包括配制梯度浓度的标准溶液，根据发光强度变化值对数与浓度对数绘制剂量反应曲线，通过换算得出样本中的皮质醇的浓度。
3.根据权利要求2所述的电化学发光免疫测定方法，其特征在于，所述样本为血清、尿液或组织液。
4.根据权利要求2或3所述的电化学发光免疫测定方法，其特征在于，所述样本为有机化合物、核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸、单糖、多糖、氨基酸、多肽或蛋白质。
5.根据权利要求4所述的电化学发光免疫测定方法，其特征在于，所述吡啶钌标记的皮质醇衍生物为4-二丙氨基丁基-4’-甲基-2,2’-联吡啶、4-4’-二(二丙氨基丁基)-2,2’-联吡啶或4-乙醇氨基丁基-2,2’-联吡啶。
6.一种用于电化学发光免疫测定的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括二价三联吡啶钌标记的皮质醇肽段、生物素化合抗皮质醇抗体、链霉亲和素包被的磁性微粒、三丙胺溶液；其中，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒由浓度为0.72mg/mL的包被链霉亲和素的磁珠微粒和防腐剂组成；所述生物素化合抗皮质醇抗体由防腐剂、浓度为90ng/mL的生物素化抗皮质醇多克隆抗体和浓度为100mmol/L的MESb缓冲液组成；所述二价三联吡啶钌标记的皮质醇肽段是由防腐剂、浓度为25 ng/mL的吡啶钌标记的皮质醇衍生物、浓度为20μg /mL 达那唑和浓度为100mmol/L的MES缓冲液组成，所述吡啶钌标记的皮质醇衍生物为4-二丙氨基丁基-4’-甲基-2,2’-联吡啶、4-4’-二(二丙氨基丁基)-2,2’-联吡啶或4-乙醇氨基丁基-2,2’-联吡啶。
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