CN114034683A - 一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114034683A CN114034683A CN202111451511.1A CN202111451511A CN114034683A CN 114034683 A CN114034683 A CN 114034683A CN 202111451511 A CN202111451511 A CN 202111451511A CN 114034683 A CN114034683 A CN 114034683A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chip
- diabetes
- type
- immune
- immuno
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 56
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- GFLJTEHFZZNCTR-UHFFFAOYSA-N 3-prop-2-enoyloxypropyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCCCOC(=O)C=C GFLJTEHFZZNCTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 33
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 abstract description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 15
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 4
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 22
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 19
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 150000003376 silicon Chemical class 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 4
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102000004248 Zinc Transporter 8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000702 Zinc Transporter 8 Proteins 0.000 description 1
- NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N [(1r,2s,4r,5r)-3-hydroxy-4-(4-methylphenyl)sulfonyloxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-2-yl] 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)O[C@H]1C(O)[C@@H](OS(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)[C@@H]2OC[C@H]1O2 NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003698 laser cutting Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010905 molecular spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明提供了一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用，属于糖尿病检测技术领域。本发明提供的快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片是将表面增强拉曼光谱技术与蛋白芯片相结合，利用待检血清中抗体与芯片上抗原特异性结合，引起拉曼探针的特征峰发生蓝移，从而实现快速筛查1型糖尿病的目的。同时多重免疫芯片可同时检测多种胰岛自身抗体，具体检测迅速、检测结果准确性高的特点，这对1型糖尿病的早期诊断和初筛方面有着良好的应用前景，同时降低了芯片制作成本。
Description
技术领域
本发明属于糖尿病检测技术领域，具体涉及一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是威胁人类健康的重大疾病，糖尿病人群中约10％为1型糖尿病。1型糖尿病，以往称为胰岛素依赖型糖尿病，常发生于儿童和青少年，但也可发生于任何年龄，甚至80～90岁时也可患病。病因是由于胰岛B细胞受到细胞介导的自身免疫性破坏，自身不能合成和分泌胰岛素。鉴于1型糖尿病大量胰岛细胞衰竭，极易发生多种并发症，病情不易控制的特点，已成为世界重大公共卫生问题之一。不同类型的糖尿病治疗方法不同，因此精准的分型诊断是给予糖尿病患者合适治疗的前提。
目前，普遍认为1型糖尿病主要受外界环境因素的影响导致患者体内存在胰岛自身抗体等免疫标志物，比如临床上常检测的谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛细胞抗体(ICA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)、胰岛素自身抗体(IAA)、羧基肽酶抗体(CPH-A)和锌转运体8自身抗体(ZnT8A)。自20世纪80年代末人们最初采用Western印迹法检测胰岛自身抗体以来，检测方法先后经历了免疫荧光法、免疫酶活性沉淀法、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射结合分析法(RBA)等阶段。新近建立的方法有时间分辨荧光免疫法、荧光素酶免疫沉淀法(LIPS)、等离子体纳米胶体金技术和电化学发光(ECL)分析法等。较早建立的Western印迹法和免疫酶活性沉淀法操作繁琐费时，不适合临床实际应用。免疫荧光法的非特异性荧光难以控制和消除，且胰岛切片带来异源性干扰，无法标准化。ELISA商品化试剂盒价格昂贵；离子体纳米胶体金技术重现性差，有待进一步优化；LIPS法能解决抗原蛋白翻译后的修饰问题，但变异系数较大的问题尚待解决。
表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是由拉曼光谱衍生出来的一种高灵敏度、高分辨率的检测手段，特指在物质表面拉曼散射强度得到大幅度提高的拉曼光谱技术。建立重复性好、灵敏度高、特异性强的快速、高通量、多组分、低成本蛋白检测方法，必将是1型糖尿病未来发展趋势。SERS是未来分子光谱研究的重要方向之一，检测灵敏度高，可达到单分子水平。然而目前SERS检测技术仅依赖于检测单一免疫标志物，容易出现假阳性和假阴性，为了保证获得准确检测结果，常常要检测多个生物标志物，这会大大提高检测成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用，具有较高的检测准确性和较低的检测成本，对改善临床预后有积极价值。
本发明提供了一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片，包括载体和免疫芯片；所述载体带有若干个容纳腔；不同容纳腔固定有不同种类免疫芯片；
所述免疫芯片的基底表面连接1种1型糖尿病标志物的捕获抗原。
优选的，所述1型糖尿病标志物的捕获抗原捕获以下两种或多种抗体：GADA、ICA、IAA、ZnT8A、IA-2A和CPH-A。
优选的，所述1型糖尿病标志物的捕获抗原的浓度为8～12μg/ml。
优选的，所述免疫芯片的基底为羟基化硅片。
优选的，所述羟基化硅片表面形成一层纳米贵金属基底，在所述纳米贵金属基底上连接探针MBA。
优选的，所述1型糖尿病标志物的捕获抗原通过探针MBA与免疫芯片的基底表面结合。
优选的，所述免疫芯片通过固定器与容纳腔固定。
本发明提供了所述多重免疫芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)将免疫芯片的基质材料羟基化，固定在载体的容纳腔内，得到安装有免疫芯片的载体；
2)在步骤1)中所述安装有免疫芯片的载体表面依次用PDDA、纳米贵金属颗粒溶胶、探针MBA和1型糖尿病标志物的捕获抗原进行处理，得到多重免疫芯片。
优选的，所述免疫芯片的基质材料羟基化的方法，将基质材料依次用水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇和水超声清洗5min，再用浓硫酸和过氧化氢混合液处理直至溶液中不再有气泡冒出，清洗，得到羟基化的免疫芯片的基质。
本发明提供了所述多重免疫芯片或所述制备方法制备得到的多重免疫芯片在制备检测1型糖尿病的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片，包括具有拉曼增强效果的载体；所述载体带有若干个容纳腔；每个容纳腔固定有免疫芯片；所述免疫芯片的基底表面连接若干种1型糖尿病标志物的捕获抗原。本发明首次将具有拉曼活性和良好生物相容性的贵金属纳米粒子连接的载体、免疫芯片相结合，制备得到一种高通量、同时读出多种糖尿病胰岛自身抗体的多重免疫芯片。根据免疫芯片包被的多种1型糖尿病标志物的捕获抗原能够特异性识别不同胰岛自身抗体的特性，将待检测样品滴加至多重免疫芯片上，仅需几十秒即可完成。以检测的SERS谱图与抗体阳性临界谱图重叠对比，若出现了两个及两个以上抗体对应的谱图有明显的蓝移现象(与抗体阳性临界图谱对比特征峰发生右移)，则要做进一步的检测，进一步确认是否患有1型糖尿病，这对1型糖尿病的早期诊断和初筛方面有着良好的应用前景，同时降低了芯片制作成本。
同时本发明提供的多重免疫芯片还具有以下优点：
1)通过与抗体阳性临界谱图重叠对比，可以快速地识别是否患有1型糖尿病；2)可以同时对多种胰岛自身抗体进行检测，节约时间；3)多重免疫芯片方便携带，当配有便携式拉曼仪时，可以随时随地做检测；4)检测时间很短，仅需几十秒就可以完成检测；5)使用简单，对制备人员无技术要求；6)蛋白芯片很小，所需样品量非常少，仅需几十微升即可。
附图说明
图1为本发明提供的多重免疫芯片中载体结构示意图；
图2为基于SERS的探针MBA在胰岛自身抗体趋近于阳性时的SERS谱图；
图3为图2中MBA在1072cm-1处特征峰的放大图；
图4为本发明实施例2中正常人血清检测结果SERS谱图；
图5为实施例3中的1型糖尿病患者血清检测结果SERS谱图；
图6为实施例4中的2型糖尿病患者血清检测结果SERS谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片，包括载体和免疫芯片；所述载体带有若干个容纳腔；不同容纳腔固定有不同种类免疫芯片；所述免疫芯片的基底表面连接1种1型糖尿病标志物的捕获抗原。
在本发明中，所述免疫芯片的基底优选为羟基化硅片。本发明对所述羟基化硅片的规格没有特殊限制，硅片的规格与载体上容纳腔的规格相适应，使硅片能够水平固定于容纳腔中。硅片作为可修饰性强的基底，能够代替传统的蛋白芯片的基质材料，通过在其表面连接不同种类的1型糖尿病标志物的捕获抗原，从而识别不同种类的胰岛自身抗体。所述1型糖尿病标志物的捕获抗原优选捕获以下两种或多种抗体：GADA、ICA、IAA、ZnT8A、IA-2A和CPH-A。本发明对所述抗原的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的抗原来源即可。一个硅片上优选连接同一种抗原。所述羟基化硅片表面形成一层纳米贵金属基底，在所述纳米贵金属基底上连接探针MBA。所述1型糖尿病标志物的捕获抗原优选通过探针MBA与免疫芯片的纳米贵金属基底结合。所述纳米贵金属颗粒优选通过与聚二烯基丙二甲氨基氯化铵(PDDA)静电力组装在硅片上。所述1型糖尿病标志物的捕获抗原的浓度优选为8～12μg/ml，更优选为10μg/ml。所述免疫芯片优选通过固定器与容纳腔固定。所述固定器优选购自上海净信实业发展有限司。
在本发明中，所述载体优选为带有容纳腔的玻片。所述玻片上设置有若干个容纳腔，更优选为2～6个容纳腔。载体可将数个硅片同时固定于不同的容纳腔中，可实现一次性对多个胰岛自身抗体的定量分析。一个容纳腔优选固定一种免疫芯片。不同容纳腔固定的免疫芯片的种类不同，以便后续检测时根据抗原抗体特异性结合特性，不同的容纳腔同时测出不同胰岛自身抗体的所呈现的阳性或阴性状态，在整个检测过程中仅需几十秒即可完成。
在本发明中，所述多重免疫芯片是将拉曼技术与蛋白芯片相结合，不但可以增加拉曼检测的灵敏度，同时也将蛋白芯片的灵敏度大大提高；同时多重免疫芯片同时定性或半定量多种胰岛自身抗体，避免了单个胰岛自身抗体检测所导致的假阳性和假阴性，同时降低了检测成本。
本发明提供了所述多重免疫芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)将免疫芯片的基质材料羟基化，固定在载体的容纳腔内，得到安装有免疫芯片的载体；
2)在步骤1)中所述安装有免疫芯片的载体表面依次包被PDDA、纳米贵金属颗粒溶胶、探针MBA和1型糖尿病标志物的捕获抗原，得到多重免疫芯片。
本发明将免疫芯片的基质材料羟基化，固定在载体的容纳腔内，得到安装有免疫芯片的载体。
在本发明中，所述免疫芯片的基质材料羟基化的方法，优选将基质材料依次用水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇和水超声清洗5min，再用浓硫酸和过氧化氢混合液处理直至溶液中不再有气泡冒出，清洗，得到羟基化的免疫芯片的基质。
在本发明中，所述超声的条件优选如下：40KHZ，超声电功率：150W。超声用超声仪为KQ3200型超声波清洗器。浓硫酸和过氧化氢混合液中浓硫酸和过氧化氢的体积比为2:1。所述浓硫酸的体积浓度优选为98％。所述过氧化氢的体积分数优选为30％。
羟基化修饰后，本发明在所述安装有免疫芯片的载体表面依次包被PDDA、纳米贵金属颗粒溶胶、探针MBA和1型糖尿病标志物的捕获抗原，得到多重免疫芯片。
在本发明中，PDDA的质量浓度优选为0.05％。所述PDDA的溶剂优选为水。PDDA处理35～45min，更优选为40min。所述PDDA为纳米贵金属颗粒的组装提供静电力。
在本发明中，纳米贵金属溶胶的浓度优选为0.36mg/mL。所述纳米贵金属溶胶的处理时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h。所述纳米贵金属溶胶处理后，使纳米贵金属颗粒在基底上组装。
在本发明，所述探针MBA的浓度优选为10-4mol/L。所述探针MBA的处理时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h。本发明中，抗原抗体的特异性结合诱导了MBA分子的变形，即MBA分子极化率的改变，继而导致MBA特征峰发生位移变化，这种拉曼位移与目标检测物的浓度直接相关，所以可以选用MBA作为探针，通过MBA特征峰的变化，对胰岛自身抗体进行半定量的检测。
在本发明中，所述1型糖尿病标志物的捕获抗原的浓度优选为8～12μg/ml，更优选为10μg/ml。所述1型糖尿病标志物的捕获抗原的处理温度优选为4℃过夜或36～38℃处理4h，为了节约时间优选为37℃处理4h。所述1型糖尿病标志物的捕获抗原的处理时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h。
在本发明中，用1型糖尿病标志物的捕获抗原处理后，优选还包括对载体中的免疫芯片进行封闭。本发明对所述封闭的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的封闭方法即可。在本发明实施例中，所述封闭采用0.1mg/ml BSA溶液浸泡2h。
本发明提供了所述多重免疫芯片或所述制备方法制备得到的多重免疫芯片在制备检测1型糖尿病的试剂盒中的应用。
在本发明中，采用多重免疫芯片检测1型糖尿病的原理为当待检测样本中含有1型糖尿病的相关胰岛自身抗体，根据免疫芯片上抗原与抗体的特异性结合特性，多重免疫芯片中连接的抗原与样本中抗体结合，导致拉曼探针的特征峰(1072cm-1)发生位移(蓝移)，与阳性抗体的临界谱图作对比，若出现两个及两个以上抗体具有明显的位移，则要做进一步的检测是否患有1型糖尿病，可见，本发明提供的多重免疫芯片可实现1型糖尿病的早期诊断和初步筛查。
通过临床诊断和比对试剂确认样本阴阳性，用本方法测定其中的50份I型糖尿病患者血清样本和350例正常人群血清样本。对检测结果进行分析，确定出阳性抗体的临界拉曼谱图。探针MBA在胰岛自身抗体趋近于阳性时的特征峰谱图见图2。
下面结合实施例对本发明提供的一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.载体的制作
以玻片为载体，玻片上设有6个相同规格的容纳腔(3×3mm大小)，容纳腔配有固定器，用于固定芯片。
选用硅片作为免疫芯片的基质材料，使用激光切割设备将硅片切成3×3mm大小，依次按照水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水的顺序超声清洗硅片5分钟，洗净后将硅片置于体积比为2:1的浓硫酸(质量分数为98％)过氧化氢(质量分数为30％)混合溶液中，直至溶液中不再有气泡冒出，取出硅片用水清洗，硅片羟基化修饰完成，泡于超纯水中以备待用。取适量的硅片分别安装到载体的容纳腔中，将固定器扣在容纳腔中，用于固定硅片。
2.多重免疫芯片的制作方法
将羟基化后的硅片固定到具有6个容纳腔的载体上，将其泡于质量分数为0.05％聚二烯基丙二甲氨基氯化铵(PDDA)中40min，用大量超纯水冲洗，氮气吹干；再将其浸泡于纳米银溶胶(通过与PDDA静电力组装在硅片)中4小时，超纯水清洗，氮气吹干；浸泡于10- 4mol/L探针MBA溶液中4小时，超纯水冲洗，氮气吹干；浸泡于与胰岛自身抗体特异性结合的10μg/ml抗原中，恒温37℃下孵育4小时，用PBS缓冲液冲洗，氮气吹干；在浸泡于0.1mg/mlBSA溶液(封闭抗原未与MBA连接的位点)中2小时，PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，得到连接一种抗原的载体；按照上述步骤1和2的操作，分别连接GADA、ICA、IAA、ZnT8A、IA-2A、CPH-A所对应的捕获抗原，形成六重免疫芯片，具体见图1，其中1号容纳腔：GADA；2号容纳腔：ZnT8A；3号容纳腔：IAA；4号容纳腔：ICA；5号容纳腔：IA-2A；6号容纳腔：CPH-A。
实施例2
正常人血清的检测
将多重免疫芯片浸泡于正常人血清中，恒温37℃孵育4小时，PBS缓冲液冲洗，氮气吹干。使用便携式拉曼仪检测，因为在不同容纳腔中连接有不同的抗原，而抗原只能与其可特异性识别结合的抗体所结合，所以容纳腔依次分别检测的是GADA、ZnT8A、IAA、ICA、IA-2A、CPH-A。
结果见图4。根据与临界SERS拉曼谱图(图2和图3)重叠对比发现，六个抗体中MBA特征峰都没有蓝移(特征峰向右移动)的现象，说明各个胰岛自身抗体在血清中浓度都很低而显阴性。
实施例3
1型糖尿病患者血清的检测
将多重免疫芯片浸泡于1型糖尿病患者血清中，恒温37℃孵育4小时，去取出多重免疫芯片用PBS缓冲液冲洗，氮气吹干。使用便携式拉曼仪检测，因为在不同容纳腔中连接有不同的抗原，而抗原只能与其可特异性识别结合的抗体所结合。
结果见图5。根据与临界SERS拉曼谱图(图2和图3)重叠对比发现，IAA、ICA、IA-2A、CPH-A抗体的MBA特征峰(1072cm-1)都发生了明显的蓝移，说明胰岛自身抗体在血清中浓度很高已显阳性，患有1型糖尿病的可能性极大。
实施例4
2型糖尿病患者血清的检测
将多重免疫芯片浸泡于正常人血清中，恒温37℃孵育4小时，取出多重免疫芯片PBS缓冲液冲洗，氮气吹干。使用便携式拉曼仪检测，因为在不同容纳腔中连接有不同的抗原，而抗原只能与其可特异性识别结合的抗体所结合，所以容纳腔依次分别检测的是GADA、ZnT8A、IAA、ICA、IA-2A、CPH-A。
结果见图6。根据与临界SERS拉曼谱图(图2和图3)重叠对比发现，六个抗体中MBA特征峰都没有蓝移的现象，说明各个胰岛自身抗体在血清中浓度都很低而显阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片，其特征在于，包括载体和免疫芯片；所述载体带有若干个容纳腔；不同容纳腔固定有不同种类免疫芯片；
所述免疫芯片的基底表面连接1种1型糖尿病标志物的捕获抗原。
2.根据权利要求1所述多重免疫芯片，其特征在于，所述1型糖尿病标志物的捕获抗原捕获以下两种或多种抗体：GADA、ICA、IAA、ZnT8A、IA-2A和CPH-A。
3.根据权利要求1所述多重免疫芯片，其特征在于，所述1型糖尿病标志物的捕获抗原的浓度为8～12μg/ml。
4.根据权利要求1所述多重免疫芯片，其特征在于，所述免疫芯片的基底为羟基化硅片。
5.根据权利要求4所述多重免疫芯片，其特征在于，所述羟基化硅片表面形成一层纳米贵金属基底，在所述纳米贵金属基底上连接探针MBA。
6.根据权利要求5所述多重免疫芯片，其特征在于，所述1型糖尿病标志物的捕获抗原通过探针MBA与免疫芯片的基底表面结合。
7.根据权利要求1～6任意一项所述多重免疫芯片，其特征在于，所述免疫芯片通过固定器与容纳腔固定。
8.权利要求1～7任意一项所述多重免疫芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将免疫芯片的基质材料羟基化，固定在载体的容纳腔内，得到安装有免疫芯片的载体；
2)在步骤1)中所述安装有免疫芯片的载体表面依次包被PDDA、纳米贵金属颗粒溶胶、探针MBA和1型糖尿病标志物的捕获抗原，得到多重免疫芯片。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述免疫芯片的基质材料羟基化的方法，将基质材料依次用水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇和水超声清洗5min，再用浓硫酸和过氧化氢混合液处理直至溶液中不再有气泡冒出，清洗，得到羟基化的免疫芯片的基质。
10.权利要求1～7任意一项所述多重免疫芯片或权利要求8或9所述制备方法制备得到的多重免疫芯片在制备检测1型糖尿病的试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111451511.1A CN114034683A (zh) | 2021-12-01 | 2021-12-01 | 一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111451511.1A CN114034683A (zh) | 2021-12-01 | 2021-12-01 | 一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114034683A true CN114034683A (zh) | 2022-02-11 |
Family
ID=80139509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111451511.1A Pending CN114034683A (zh) | 2021-12-01 | 2021-12-01 | 一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114034683A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423131A (zh) * | 2002-12-30 | 2003-06-11 | 陕西超英生物医学研究开发有限公司 | 糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法 |
| WO2009088408A1 (en) * | 2008-01-07 | 2009-07-16 | Dynamic Throughput Inc. | Discovery tool with integrated microfluidic biomarker optical detection array device and methods for use |
| CN102967704A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-03-13 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒 |
| CN103698510A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-04-02 | 欧普图斯(苏州)光学纳米科技有限公司 | 用基于纳米结构的光谱检测法分析化学物和生化物的方法 |
| CN103969234A (zh) * | 2014-04-17 | 2014-08-06 | 山东东兴汇智生物科技有限公司 | 可同时检测四种i型糖尿病自身免疫抗体的方法 |
| CN110646399A (zh) * | 2019-09-29 | 2020-01-03 | 吉林大学 | 基于sers的高通量蛋白检测芯片 |
| US20210215610A1 (en) * | 2020-01-09 | 2021-07-15 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Methods of disease detection and characterization using computational analysis of urine raman spectra |
-
2021
- 2021-12-01 CN CN202111451511.1A patent/CN114034683A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423131A (zh) * | 2002-12-30 | 2003-06-11 | 陕西超英生物医学研究开发有限公司 | 糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法 |
| WO2009088408A1 (en) * | 2008-01-07 | 2009-07-16 | Dynamic Throughput Inc. | Discovery tool with integrated microfluidic biomarker optical detection array device and methods for use |
| CN102967704A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-03-13 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒 |
| CN103698510A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-04-02 | 欧普图斯(苏州)光学纳米科技有限公司 | 用基于纳米结构的光谱检测法分析化学物和生化物的方法 |
| CN103969234A (zh) * | 2014-04-17 | 2014-08-06 | 山东东兴汇智生物科技有限公司 | 可同时检测四种i型糖尿病自身免疫抗体的方法 |
| CN110646399A (zh) * | 2019-09-29 | 2020-01-03 | 吉林大学 | 基于sers的高通量蛋白检测芯片 |
| US20210215610A1 (en) * | 2020-01-09 | 2021-07-15 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Methods of disease detection and characterization using computational analysis of urine raman spectra |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 余元勋等: "现代医学临床与护理", 中国海洋大学出版社, pages: 140 - 315 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101431062B1 (ko) | 유방암 진단용 다중 바이오마커 세트, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트 | |
| EP2516995B1 (en) | Sers-based analyte detection | |
| CN107561054B (zh) | 金银双金属三维有序大孔结构作为sers基底用于心肾综合征多种蛋白质同时检测 | |
| WO2009154377A2 (ko) | 실시간 연속 검출장치 | |
| US9377433B2 (en) | Accurate integrated low-cost electrode chips for point-of-need analysis and a method of utilization in hot electron-induced electrochemiluminescent systems | |
| WO2021180132A1 (zh) | 基于Fe2O3材料单层光电化学传感器的癌胚抗原检测方法 | |
| WO2014160175A1 (en) | Plasmonic substrate for multiplex assessment of type 1 diabetes | |
| Hu et al. | SERS-based immunoassay using core–shell nanotags and magnetic separation for rapid and sensitive detection of cTnI | |
| Zia et al. | Electrochemical sensing: carcinogens in beverages | |
| Kumar et al. | Recent progress in the sensing techniques for the detection of human thyroid stimulating hormone | |
| CN113075193B (zh) | 基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法 | |
| CN110646616B (zh) | 一种检测血清中人cTnI的超敏荧光猝灭免疫传感器及检测方法 | |
| US8920718B2 (en) | Methods and devices to generate luminescence from integrated electrode chips by cathodic and bipolar pulses | |
| CN114034683A (zh) | 一种快速诊断1型糖尿病的多重免疫芯片及其制备方法和应用 | |
| CN111707825A (zh) | 联合检测肿瘤标志物mct1和mct4的试剂盒及其制备方法、应用 | |
| CN111239402B (zh) | 一种可用于疾病标志物检测的质谱免疫分析方法及应用 | |
| CN111579801A (zh) | 用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒及其检测方法 | |
| CN110618261A (zh) | 一种定量检测地高辛的化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN112114012B (zh) | 一种抗干扰光电化学生物传感器及其制备方法与应用 | |
| Sidki et al. | Direct determination of phenobarbital in serum or plasma by polarization fluoroimmunoassay | |
| CN109298187B (zh) | 一种测定c反应蛋白的化学发光免疫方法 | |
| Lin et al. | One‐droplet saliva detection on photonic crystal‐based competitive immunoassay for precise diagnosis of migraine | |
| US8110408B2 (en) | Method for quantitative detection of diabetes related immunological markers | |
| Liu et al. | A plasmon-enhanced fluorescence protein microchip with high-sensitivity for multiple islet autoantibodies measurements in autoimmune diabetes diagnosis | |
| CN114166825B (zh) | 一种应用于表面增强拉曼光谱（SERS）免疫试验的MXene探针 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220211 |