CN112114012B - 一种抗干扰光电化学生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗干扰光电化学生物传感器及其制备方法与应用，属于生物传感器技术领域。本发明用于对人绒毛膜促性腺激素hCG的检测，所制备的光电化学生物传感器同时具有抗还原性小分子和抗生物大分子干扰检测信号的优良性能。通过将hCG识别多肽和防污多肽先后修饰于光阴极，以构建抗干扰光电化学生物传感器，并利用hCG明显的空间位阻效应对传感器电荷传递的阻碍作用实现光电流信号检测。本发明基于多肽构建的抗干扰光电化学生物传感器制备工艺简便，且具有在实际生物样品中准确灵敏检测hCG的应用潜力，适于市面推广与应用。

Description

一种抗干扰光电化学生物传感器及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种用于检测人绒毛膜促性腺激素的方法策略。更具体地，涉及一种同时基于识别多肽和防污多肽构建的抗干扰光电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
光电化学生物传感是将光电化学技术与电化学分析法有机结合而发展起来的新一代传感技术。它不仅继承了电化学生物传感具有装置简单、操作方便、花费低、易于集成化和微型化的优点，还使得背景干扰低；并且体系能够实现自供能，更易于实时快速的现场检测。
光电化学生物传感按传感类别分为阳极传感和阴极传感两种。虽然阳极光电化学生物传感输出的光电流信号明显，灵敏度较高，但由于阳极界面发生的是电子氧化反应，实际生物样品中多组分还原性物质如抗坏血酸、多巴胺、谷胱甘肽等对检测结果的准确性有一定的干扰；然而阴极界面发生的是电子还原反应，使得阴极光电化学生物传感具有优良的抗实际生物样品中多组分还原性物种干扰的能力，以致阴极光电化学生物传感更具有在实际复杂生物样品中准确检测的潜力。
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是一种由胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，被认为是妊娠期胚胎植入的主要指标，是早期诊断异位妊娠和产前唐氏综合征筛查的重要临床参数。此外，hCG的含量升高也与一些癌性肿瘤相关，如前列腺肿瘤、睾丸肿瘤、滋养细胞肿瘤及妊娠绒毛膜癌等。因此，hCG被认为是诊断妊娠及相关癌症的一种重要的生物标记物。目前，检测hCG最常用的是侧流免疫分析法，即hCG诊断试剂盒。这种检测方法操作简单，可以很容易给出定性结果，检出限为20mIU/mL，然而对于定量检测却是困难的；且这种检测方法很难量化癌症患者体液内低水平的hCG。
鉴于此，近年来出现了许多hCG定量检测的分析方法，如放射免疫分析、酶联免疫吸附法、荧光免疫分析、电致化学发光分析、电化学免疫传感等。虽然这些hCG检测方法取得了较大进步，但仍存在一些缺陷，例如价格昂贵、操作费时、样品消耗量大、检测灵敏度有限等。
因此，开发一种灵敏度高、抗干扰性强的光电化学生物传感器，不仅具有抵御实际复杂样品中还原性物质干扰的性能，还具有抵御蛋白质等生物大分子非特异性吸附的潜力，其对血液中hCG的检测具有潜在的实际应用能力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种灵敏度高并同时基于识别多肽和防污多肽构建的抗干扰光电化学生物传感器。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种抗干扰光电化学生物传感器，所述生物传感器是通过将人绒毛膜促性腺激素hCG识别多肽和防污多肽先后修饰于光阴极制得，并利用hCG明显的空间位阻效应对传感器电荷传递的阻碍作用实现光电流信号检测。
进一步的，所述人绒毛膜促性腺激素hCG识别多肽的序列为PPLRINRHILTR，SEQ IDNO.1；所述防污多肽的序列为CPPPPEKEKEKE，SEQ ID NO.2。
需要说明的是，在实际复杂样品如血液中，除了可能溶解有谷胱甘肽、抗坏血酸、多巴胺等小分子还原性物质，还共存有多组分蛋白质等生物大分子。为了防止蛋白质等生物大分子在传感电极表面的非特异性吸附，多肽防污染性能开始引起人们的关注，因为多肽同时含有氨基和羧基，亲水性好，而当特定序列的多肽总体电荷又接近中性时，这些多肽就可以表现出优良的防生物大分子污染的能力。
进一步的，相关资料已证明，含有交替的带负电的谷氨酸(E)和带正点的赖氨酸(K)的多肽序列CPPPPEKEKEKE，SEQ ID NO.2；由于同时具有较强的亲水性和电中性的特点，能够有效防止非特异性蛋白质等生物大分子通过疏水相互作用和静电作用而吸附在电极表面，显示出了优良的防污能力。
因此，基于多肽构建的光电化学生物传感器不仅具有抵御实际复杂样品中还原性物质干扰的性能，同时亦具有抵御蛋白质等生物大分子非特异性吸附的潜力。然而，这种同时基于识别多肽和防污多肽构建的抗干扰光电化学生物传感器目前还未见任何报道，对血液中hCG的检测具有潜在的实际应用能力。
本发明的另一目的是提供上述抗干扰光电化学生物传感器的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗干扰光电化学生物传感器的制备方法，具体步骤包括：
(1)制备CuBi2O4/Au光阴极：以吸收可见光的P型半导体材料CuBi2O4作为阴极光电化学基底，在所述基底表面修饰增敏剂金纳米颗粒制备CuBi2O4/Au光阴极；
(2)将hCG识别多肽和防污多肽依次锚定修饰于步骤(1)制备的CuBi2O4/Au光阴极，即制得所述抗干扰光电化学生物传感器。
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明公开的制备方法简单、易于操作，适于推广与应用。
优选的，所述步骤(1)中，采用恒电位法在氧化铟锡电极上沉积CuBi2O4纳米膜，随后煅烧、冷却，得到CuBi2O4纳米膜修饰电极；配置HAuCl4溶液并将pH调至4.5；随后将所述HAuCl4溶液滴加分散至所述CuBi2O4修饰电极上，室温静置、煅烧，最终得到CuBi2O4/Au光阴极。
需要说明的是，CuBi2O4/Au光阴极使用的电极材料环境友好，制备工艺简单，且阴极电流信号响应明显，光化学稳定性好。
进一步优选的，制备所述CuBi2O4纳米膜的沉积时间为40～80s；且制备所述Au/CuBi2O4光阴极时，所述HAuCl4溶液的浓度为5～15mmol/L。
优选的，所述步骤(2)中，在CuBi2O4/Au光阴极上滴加hCG识别多肽溶液，低温孵育，随后用磷酸盐缓冲液冲洗干净后，滴加防污多肽溶液构建抗污染界面，低温孵育，最终得到所述抗干扰光电化学生物传感器。
需要说明的是，上述抗干扰光电化学生物传感器不仅构建条件温和、工艺步骤简单快速、生物样品消耗量小，而且对目标物hCG的检测操作简单、无需提纯，灵敏度高、准确、方便、快速。
进一步优选的，所述hCG识别多肽溶液低温孵育的浓度为0.2～0.4mg/mL，及所述防污多肽低温孵育的浓度为0.2～0.4mg/mL。
示范性的，本发明优选的制备方案为：
(1)以吸收可见光的P型半导体材料CuBi2O4作为阴极光电化学基底，继续原位生长金(Au)纳米颗粒后，制备CuBi2O4/Au光阴极：
1)采用恒电位法在氧化铟锡电极上沉积CuBi2O4纳米膜，以乙二醇溶液作为电解液，其中含有100mM Bi(NO3)3和30mM Cu(NO3)2，且沉积过程在恒定电位E＝-1.8V vs Hg/Hg2Cl2下进行，持续时间为60s；随后在450℃空气氛围中煅烧3h后，得到CuBi2O4修饰电极；
2)配置浓度为10mM的HAuCl4溶液，用浓度为0.1M的NaOH将HAuCl4溶液pH调至4.5；
3)取10μL HAuCl4溶液滴加至CuBi2O4修饰电极上，室温静置1h后，450℃煅烧2h，得到CuBi2O4/Au光阴极。
(2)将hCG识别多肽(序列为PPLRINRHILTR，SEQ ID NO.1；)和防污多肽(序列为CPPPPEKEKEKE，SEQ ID NO.2)依次锚定于步骤(1)制备的CuBi2O4/Au光阴极，即完成抗干扰光电化学生物传感器的制备：
1)在CuBi2O4/Au光阴极上滴加20μL 0.2mg/mL hCG识别多肽溶液，4℃冰箱中孵育12h；
2)用磷酸盐缓冲液(pH 7.4，10mM)将电极洗净后，滴加20μL 0.2mg/mL防污多肽溶液以构建抗污染界面，4℃冰箱中孵育12h，即可完成传感电极构建，最终得到所述抗干扰光电化学生物传感器。
本发明还有一个目的，就是提供上述抗干扰光电化学生物传感器在体外检测产品中的应用。
在一些应用场景中，还包括所述抗干扰光电化学生物传感器在血液中检测人绒毛膜促性腺激素的应用。
进一步的，所述抗干扰光电化学生物传感器的测试环境是pH为6.5～7.5的缓冲溶液，并以溶解氧作为电子受体。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种抗干扰光电化学生物传感器及其制备方法与应用，具有如下优异效果：
1)本发明公开制备的生物传感器具有装置简单、操作方便、花费低、背景干扰低、体系自供能的显著特点，同时利用防污多肽亲水性好且总体电荷接近中性，具有优良的抗生物大分子污染传感界面的能力，及hCG明显的空间位阻效应对传感器电荷传递的阻碍作用实现光电流信号检测。
2)本发明同时基于hCG识别多肽和防污多肽构建的抗干扰光电化学生物传感器制备工艺简便，对目标物hCG的检测无需提纯、方便、快速，且该生物传感器具有在实际生物样品中准确灵敏检测hCG的应用潜力，适于市面推广与应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为不同沉积时间对应CuBi2O4修饰电极的光电流响应图。
图2为不同浓度Au前驱体溶液对应CuBi2O4/Au光阴极的光电流响应图。
图3为不同孵育浓度hCG识别多肽对应修饰光阴极的光电流响应图。
图4为CuBi2O4纳米膜的扫描电子显微镜图。
图5为CuBi2O4/Au光阴极的扫描电子显微镜图。
图6为CuBi2O4/Au光阴极的X射线衍射图。
图7为抗干扰光电化学生物传感电极制备过程的光电流响应图。
图8为抗干扰光电化学生物传感器对不同浓度hCG检测的光电流信号图。
图9为抗干扰光电化学生物传感器对hCG检测的标准曲线图。
图10为抗干扰光电化学生物传感器在血清中对hCG检测的信号变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种灵敏度高、抗干扰性强的光电化学生物传感器。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1
因CuBi2O4/Au光阴极的光电流响应值对最终制备的抗干扰光电化学生物传感器的检测灵敏度有显著影响，所以下述对CuBi2O4/Au光阴极的制备工艺参数进行了优化：
1)因CuBi2O4在电极上的沉积量可以由沉积时间反映，所以对CuBi2O4的沉积时间进行优化，具体如下：
CuBi2O4纳米膜在ITO电极的制备采用恒电位法沉积，以乙二醇溶液作为电解液，其中含有100mM Bi(NO3)3和30mM Cu(NO3)2，沉积过程在恒定电位E＝-1.8V vs Hg/Hg2Cl2下进行，持续时间为分别选择为20s、40s、60s、80s、100s；随后在450℃空气氛围中煅烧3h后，得到CuBi2O4修饰电极。
通过进行光电流表征测试可得，如附图1所示。当沉积时间为60s时，CuBi2O4修饰电极的光电流响应最佳，因此选择60s沉积时间作为CuBi2O4最佳的制备工艺参数。
2)因Au纳米颗粒的修饰量可以通过在电极上加入Au前驱体HAuCl4溶液的浓度来调节，所以下述对HAuCl4溶液分散至CuBi2O4修饰电极的浓度进行了优化，具体如下：
分别配置浓度为5mM、10mM、15mM、20mM的HAuCl4溶液，用浓度为0.1M的NaOH将HAuCl4溶液pH调至4.5，取10μL上述不同浓度的HAuCl4溶液分别滴加至CuBi2O4修饰电极上，室温静置1h后，450℃煅烧2h，得到CuBi2O4/Au光阴极。
通过进行光电流表征测试可得，如附图2所示。当Au前驱体HAuCl4溶液的浓度为10mM时，CuBi2O4/Au光阴极对应的光电流响应最佳，因此选择10mM HAuCl4溶液作为CuBi2O4/Au光阴极最佳的制备工艺参数。
实施例2：
因传感电极上hCG识别多肽的修饰量，对抗干扰光电化学生物传感器的定量检测范围有显著影响，所以对修饰hCG识别多肽的工艺参数进行了优化：
且因hCG识别多肽在传感电极上的修饰量，可以通过其在电极上的孵育浓度体现，所以下述对hCG识别多肽的孵育浓度进行了优化，具体如下：
通过在优化的CuBi2O4/Au光阴极上滴加20μL浓度分别为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL hCG识别多肽溶液，4℃冰箱中孵育12h，并用磷酸盐缓冲液(pH7.4，10mM)将电极洗净后，得到hCG识别多肽修饰光阴极。
通过进行光电流表征测试可得，如附图3所示。hCG识别多肽(图中简写为rP)的孵育浓度需要大于等于0.2mg/mL，这样才能保证hCG识别多肽在传感电极上的充分固定，以获得最佳的定量检测范围，因此选择大于等于0.2mg/mL的hCG识别多肽作为最优孵育浓度。
本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，其中一个或几个实施例的组合同样也可以实现本发明目的。
为了进一步验证本发明的优异效果，发明人还进行了如下实验：
首先需要说明的是，本发明下述实验中光电流信号是在光电化学系统上测试完成的，150W氙灯作为激发光源，光强度约为300mW/cm2，每10s开/关光源一次，光电流的记录由电化学工作站完成。
且使用的三电极体系为：修饰面积为0.25cm2的传感电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；以及系统外加电压为0.0V。
实验例一：
(1)CuBi2O4纳米膜修饰电极的制备步骤如下：
CuBi2O4纳米膜在修饰面积为0.25cm2氧化铟锡(ITO)电极的制备采用恒电位法沉积，具体以乙二醇溶液作为电解液，其中含有100mM Bi(NO3)3和30mM Cu(NO3)2，沉积过程在恒定电位E＝-1.8V vs Hg/Hg2Cl2下进行，持续时间为60s；在450℃空气氛围中煅烧3h后，得到CuBi2O4纳米膜修饰电极。
扫描电子显微镜如附图4所示，CuBi2O4纳米膜是由大量的尺寸为90-120nm的光滑颗粒组成的内部互联结构，具有较大的比表面积，有利于后续Au纳米颗粒的原位生长。
(2)CuBi2O4/Au光阴极的制备步骤如下：
配置浓度为10mM的HAuCl4溶液，用浓度为0.1M的NaOH将HAuCl4溶液的pH调至4.5，取10μL HAuCl4溶液滴加至CuBi2O4修饰电极上，室温静置1h后，450℃煅烧2h，自然冷却至室温后，得到CuBi2O4/Au光阴极。
扫描电子显微镜如附图5所示，许多直径为30-40nm的纳米颗粒较为均匀地分布在CuBi2O4纳米膜表面，表明Au纳米颗粒在CuBi2O4修饰电极上成功原位生长。
且所述CuBi2O4/Au光阴极的X射线衍射如附图6所示，CuBi2O4的特征衍射峰在2θ＝20.83°、28.11°、33.36°、37.51°、46.82°、53.09°和55.7°，分别对应于纯CuBi2O4相(PDFno.48-1886)的晶面(200)、(211)、(310)、(202)、(411)、(213)和(332)；
Au的特征衍射峰在2θ＝38.14°、44.34°、64.56°和77.38°，对应于纯Au相(PDFno.65-2876)的晶面(111)、(200)、(220)和(311)；
其他衍射峰2θ＝35.3°、50.84°和60.03°来自于ITO基底纯氧化铟锡(400)、(441)和(622)的晶面。由此证明CuBi2O4/Au光阴极成功制备。
实验例二：
抗干扰光电化学生物传感电极的制备步骤如下所示：
1)用磷酸盐缓冲液(pH7.4，10mM)分别配置含有0.2mg/mL hCG识别多肽(序列为PPLRINRHILTR，SEQ ID NO.1；)的溶液和含有0.2mg/mL防污多肽(序列为CPPPPEKEKEKE，SEQID NO.2)的溶液；
2)取20μL0.2mg/mL hCG识别多肽溶液滴加在实验例一制备的CuBi2O4/Au光阴极上，4℃冰箱中孵育12h；并用磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.4)清洗电极，以除去未结合的识别多肽；
3)再在电极上滴加20μL 0.2mg/mL防污多肽溶液，以构建抗污染界面，4℃冰箱中孵育12h，即可完成抗干扰光电化学生物传感电极的构建。
光电流响应如附图7所示，CuBi2O4修饰电极具有较明显的阴极光电流响应(曲线a)；原位生长Au纳米颗粒后，阴极光电流响应增加(曲线b)，这是由于Au纳米颗粒的增敏作用；依次锚定识别多肽(图中rP)和防污多肽(图中aP)后，阴极光电流响应逐渐减小(曲线c和d)，这是由于识别多肽和防污多肽较弱的电荷传导能力所致。由此证明抗干扰光电化学生物传感电极成功制备。
实验例三：
传感器对hCG的光电化学检测：
将实验例二制备的抗干扰光电化学生物传感电极在室温下孵育20μL不同浓度的待检测hCG 1h，让hCG与识别多肽发生特异性亲和反应；随后清洗电极，即得所述抗干扰光电化学生物传感器。
所制备的抗干扰光电化学生物传感器在含有溶解氧(O2)的磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)中进行光电流信号测试，并利用hCG明显的空间位阻效应对传感器电荷传递的阻碍作用实现光电流信号检测。
检测结果表明：随着待检测hCG浓度的增加，阴极光电流信号逐渐减弱，如附图8所示；
且在hCG浓度为0.5mIU/mL到1000mIU/mL范围内，阴极光电流信号与目标物hCG浓度的对数成线性关系，如附图9所示，线性相关系数为0.9989，实验最低检测限为0.5mIU/mL。
实验例四：
传感器在血清中的检测应用，且抗干扰光电化学生物传感器的实际应用能力通过在血清样品中的加标回收实验评估：
1)将血清稀释10倍后，分成三组，并分别加入浓度为10、100、500mIU/mL的hCG；
2)将实验例二制备的抗干扰光电化学生物传感电极在室温下孵育20μL不同浓度的血清加标样本1h，让hCG与识别多肽发生特异性亲和反应，清洗传感电极后，在含有溶解氧(O2)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4，0.1M)中进行光电流信号测试，并与实验例三的光电化学检测性能对比。
其中，加标回收实验对比结果如图10所示(图中PBS和Serum分别代表缓冲溶液和血清)，加标样品的回收率在93.8％～104.2％范围内，且测试结果的相对标准偏差在4.8％以内，证明了抗干扰光电化学生物传感器在血清样品中准确检测hCG的应用潜力。
对所公开的实施例及实验例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 一种抗干扰光电化学生物传感器及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Pro Leu Arg Ile Asn Arg His Ile Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Pro Pro Pro Pro Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu
1 5 10

Claims (3)

1.一种抗干扰光电化学生物传感器，其特征在于，所述生物传感器是通过将人绒毛膜促性腺激素hCG识别多肽和防污多肽先后修饰于光阴极制得，并利用hCG明显的空间位阻效应对传感器电荷传递的阻碍作用实现光电流信号检测；
所述人绒毛膜促性腺激素hCG识别多肽的序列为PPLRINRHILTR，SEQ ID NO.1；
所述防污多肽的序列为CPPPPEKEKEKE，SEQ ID NO.2；
所述的抗干扰光电化学生物传感器的制备方法具体步骤包括：
(1)制备CuBi2O4/Au光阴极：以吸收可见光的P型半导体材料CuBi2O4作为阴极光电化学基底，在所述基底表面修饰增敏剂金纳米颗粒制备CuBi2O4/Au光阴极；
(2)将hCG识别多肽和防污多肽依次锚定修饰于步骤(1)制备的CuBi2O4/Au光阴极，即制得所述抗干扰光电化学生物传感器；
所述步骤(1)中，采用恒电位法在氧化铟锡电极上沉积CuBi2O4纳米膜，随后煅烧、冷却，得到CuBi2O4纳米膜修饰电极；配置HAuCl4溶液并将pH调至4.5；随后将所述HAuCl4溶液滴加分散至所述CuBi2O4纳米膜修饰电极上，室温静置、煅烧，最终得到CuBi2O4/Au光阴极；制备所述CuBi2O4纳米膜的沉积时间为60 s；且制备所述Au/CuBi2O4光阴极时，所述HAuCl4溶液的浓度为10 mmol/L；
所述步骤(2)中，在CuBi2O4/Au光阴极上滴加hCG识别多肽溶液，低温孵育，随后用磷酸盐缓冲液冲洗干净后，滴加防污多肽溶液构建抗污染界面，低温孵育，最终得到所述抗干扰光电化学生物传感器；
所述hCG识别多肽溶液低温孵育的浓度为0.2～0.4mg/mL，及所述防污多肽低温孵育的浓度为0.2～0.4mg/mL。
2.一种如权利要求1所述的抗干扰光电化学生物传感器在体外检测产品中以非诊断为目的的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，还包括：所述抗干扰光电化学生物传感器在血液中检测人绒毛膜促性腺激素以非诊断为目的的应用。
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