CN113075193B - 基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，包括以下步骤：1)制备SERS基底；2)在SERS基底上偶联多药耐药蛋白；3)在偶联有多药耐药蛋白的SERS基底上随机选择多个点进行拉曼信号检测，计算多个点的平均拉曼强度值作为拉曼标准值；4)将待检测的多药耐药抑制剂与SERS基底共孵育，清洗后再检测SERS基底的拉曼强度，并与拉曼标准值进行比较，从而判断待检测的多药耐药抑制剂的抑制效果。本发明成功将表面增强拉曼光谱应用在了多药耐药抑制剂的筛选中，通过拉曼光谱的指纹图谱检测可实现多药耐药抑制剂的抑制效果的高灵敏度、快速鉴定，可以满足当今制药工业中对药物筛选速率的要求，具有很高的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物筛选领域，特别涉及一种基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法。
背景技术
多药耐药蛋白(Pgp)介导的多药耐药机制是化疗失败的主要原因，并导致了90％以上化疗患者的最终死亡。有鉴于此，筛选Pgp抑制剂，进行多药耐药逆转成为增强化疗效果的可能选择。到目前为止，Pgp抑制剂的发展已经过3代，从已知转运蛋白底物、底物衍生物及组合化学设计抑制剂等。然而到目前为止，尚未筛选出临床可用的有效抑制剂。这是因为，一方面这些抑制剂在体内的非特异性毒性反应仍无法避免，更重要的，随着多药耐药机制研究的深入，药物摄取下降、靶分子的改变，代谢解毒能力增强，DNA损伤修复等多种机制被发现与肿瘤耐药性相关，且不同转运蛋白及作用机制之间存在较强的补偿效应，导致单一抑制机理的药物往往收效甚微。有鉴于此，开发具有多作用靶点的多药耐药蛋白抑制剂将具有更大的应用潜力。
中药及天然药物具有资源丰富、毒副作用小、蕴含化学成分多样化、多作用靶点等特点，是寻找肿瘤多药耐药逆转剂的新的来源。经过多年的研究，已经发现了一些具有肿瘤多药耐药逆转活性的中药提取物或者中药单体。例如，研究表明，三七总皂苷、川芎嗪和槲皮素等可通过下调P-gp表达或调节P-gp及其他MDR相关蛋白的功能，从而降低耐药细胞的“药泵”功能，增加细胞内化疗药物的浓度，从而起到逆转肿瘤多药耐药的作用。但由于中药成分复杂，目前尚未有针对中药抑制剂筛选的相关方案出现。
拉曼光谱技术最早被发现于1928年，其检测具有无损测量、样品制备简单甚至无需样品制备，即可进行水溶液检测等优点，因此非常适合于原位进行药物作用检测。然而，常规的拉曼散射效应非常弱,其散射光强度约为入射光强度的10-6～10-9，极大地限制了拉曼光谱的应用和发展。表面增强拉曼光谱(SERS)克服了拉曼光谱灵敏度低的缺点,可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信息,被广泛用于表面研究、吸附界面表面状态研究、生物大小分子的界面取向及构型、构象研究、结构分析等,可以有效分析化合物在界面的吸附取向、吸附态的变化、界面信息等。但目前为止，SERS在药物筛选方面的应用尚未见公开。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，包括以下步骤：
1)制备SERS基底；
2)在SERS基底上偶联多药耐药蛋白；
3)在偶联有多药耐药蛋白的SERS基底上随机选择多个点进行拉曼信号检测，计算多个点的平均拉曼强度值作为拉曼标准值；
4)将待检测的多药耐药抑制剂与步骤3)中的偶联有多药耐药蛋白的SERS基底共孵育，清洗后再检测偶联有多药耐药蛋白的SERS基底的拉曼强度，并与步骤3)得到的拉曼标准值进行比较，从而判断待检测的多药耐药抑制剂的抑制效果。
优选的是，所述步骤2)具体包括：将步骤1)制备的SERS基底浸入到十一巯基十一烷酸的乙醇溶液中，取出后清洗吹干，再浸入EDC与NHS的混合液中反应，取出清洗后加入到多药耐药蛋白溶液中反应，之后清洗，得到偶联有多药耐药蛋白的SERS基底。
优选的是，所述步骤2)具体包括：将步骤1)制备的SERS基底浸入到十一巯基十一烷酸的乙醇溶液中，6-12小时后取出，乙醇清洗后氮气吹干，再浸入EDC与NHS的混合液中反应15分钟，取出清洗后加入到多药耐药蛋白溶液中反应1小时，之后用PBS缓冲液清洗，得到偶联有多药耐药蛋白的SERS基底。
优选的是，所述多药耐药蛋白为Pgp、Mrp1、Bcrp或Bsep。
优选的是，所述多药耐药蛋白为Pgp，且所述步骤2)中Pgp溶液的浓度为0.1mg/ml。
优选的是，所述步骤4)具体包括：将待检测的多药耐药抑制剂与步骤3)中的偶联有多药耐药蛋白的SERS基底共孵育，磷酸缓冲液清洗后再检测偶联有多药耐药蛋白的SERS基底的拉曼强度R，并在拉曼强度R中扣除步骤3)获得的拉曼标准值，若扣除后的结果中出现新的拉曼峰则代表待检测的多药耐药抑制剂对多药耐药蛋白具有抑制效果，且多药耐药抑制剂的抑制效果与新的拉曼峰的拉曼强度的大小呈正相关关系；若不会出现新的拉曼峰，则表明待检测的多药耐药抑制剂对多药耐药蛋白不具有抑制效果。
优选的是，所述步骤4)中待检测的多药耐药抑制剂与偶联有多药耐药蛋白的SERS基底共孵育的时间不小于1小时。
优选的是，所述步骤3)和步骤4)中，进行拉曼信号检测使用的激光波长为650nm，最大激发功率为10mW。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)对硅片进行预处理：将硅片用无水乙醇冲洗、吹干后置于体积比为3：1的H2SO4和H2O2的混合溶液中清洗，再分别用去离子水、超纯水冲洗，N2吹干；清洗后的硅片在室温下完全浸润在含有3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液中，然后依次用甲醇和纯水超声清洗，并用氮气干燥；
1-2)在预处理后的硅片上通过热蒸发法沉积金膜：以1×10-6mbar的压力、0.3-0.4nm/s速度在预处理后的硅片上沉积金膜，蒸发后，在恒定的氩气流动下退火，得到沉积有金膜的硅片；用巯基乙胺的乙醇溶液对硅片上的金膜进行修饰；将预先制备好地金纳米粒子洗涤后重悬在纯水中得到金纳米粒子溶液，将修饰有巯基乙胺的硅片浸润在金纳米粒子溶液中，反应结束后，将硅片用纯水洗涤并用氮气干燥，制得SERS基底。
优选的是，所述SERS基底上的金膜的厚度为40nm，所述步骤1-2)中的金纳米粒子溶液的浓度为100mg/L，其中的金纳米粒子的直径小于10nm。
本发明的有益效果是：本发明成功将表面增强拉曼光谱应用在了多药耐药抑制剂的筛选中，本发明通过拉曼光谱的指纹图谱检测可实现多药耐药抑制剂的抑制效果的高灵敏度、快速鉴定，可以满足当今制药工业中对药物筛选速率的要求，具有很高的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明的基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法的流程图；
图2为本发明的实施例中不同浓度的维拉帕米的抑制效果的结果；
图3为本发明的实施例中不同浓度的环孢素的抑制效果的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
参照图1，本实施例的一种基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，包括以下步骤：
S1、制备SERS基底
具体包括：
S1-1、对硅片进行预处理：将硅片用无水乙醇冲洗、吹干后置于体积比为3：1的H2SO4和H2O2的混合溶液中清洗15分钟，再分别用去离子水、超纯水充分冲洗，N2吹干；清洗后的硅片在室温下完全浸润在含有3-氨丙基三乙氧基硅烷(体积分数为5％)的甲醇溶液中1小时，以增加Au与玻璃的附着力，然后依次用甲醇和纯水超声清洗3次，并用氮气干燥。
在另一种实施例中，对硅片进行预处理的方法为：将硅片用无水乙醇冲洗、吹干后置于体积比为3：1的H2SO4和H2O2的混合溶液中清洗，然后在丙酮、乙醇中各超声5分钟后，放入氧等离子体处理仪(功率：120W-200W；氧气流量：100sccm～200sccm)处理2分钟；清洗后的硅片在室温下完全浸润在含有3-氨丙基三乙氧基硅烷(体积分数为5％)的甲醇溶液中1小时，以增加Au与玻璃的附着力，然后依次用甲醇和纯水超声清洗3次，并用氮气干燥。
S1-2、在预处理后的硅片上通过热蒸发法沉积金膜：以1×10-6mbar的压力、0.3-0.4nm/s速度在预处理后的硅片上沉积金膜，以确保沉积均匀；蒸发后，在恒定的氩气流动下于300℃下退火5-10分钟，，以减少蒸发层的表面粗糙度，得到沉积有金膜的硅片；用1.0mM巯基乙胺(MEA)的乙醇溶液对硅片上的金膜进行30分钟的修饰；将预先制备好地金纳米粒子在5000rpm下离心10分钟，洗涤三次后重悬在纯水中得到金纳米粒子溶液，将修饰有巯基乙胺的硅片浸润在金纳米粒子溶液中，反应1h后，将硅片用纯水洗涤3次并用氮气干燥，制得SERS基底。
在优选的实施例中，所述SERS基底上的金膜的厚度为40nm，金膜表面价电子集体震荡频率与激光光子的频率相当时，在金纳米表面会产生的强电磁场(即“热点”)和高浓度的高能载流子，从而可以极大地提高吸附在金表面的待测分子的拉曼信号强度。
在优选的实施例中，所述步骤1-2)中的金纳米粒子溶液的浓度为100mg/L，其中的金纳米粒子的直径小于10nm。该直径有利于后续检测信号的稳定，浓度则有利于尽可能多的纳米金固定于金膜上，且均匀分散，而不聚团。将所述的纳米金与金薄膜结合，在空间上增加了更多的热点位置，有利于局域表面等离子共振的扩大，进一步提高基底上的待测分子的拉曼信号强度。
S2、在SERS基底上偶联多药耐药蛋白
将步骤1)制备的SERS基底浸入到5～50mM十一巯基十一烷酸(MUA，这一步可引入羧基)的乙醇溶液中，6-12小时后取出，乙醇充分清洗后氮气吹干，再浸入EDC与NHS的混合液(EDC与NHS的浓度比为0.4M：0.1M)中反应15分钟，以活化表面羧基，取出后用超纯水冲洗，然后加入到多药耐药蛋白溶液中反应1小时，之后用PBS缓冲液清洗，得到偶联有多药耐药蛋白的SERS基底。
在优选的实施例中，所述多药耐药蛋白包括但不限于Pgp、Mrp1、Bcrp或Bsep。
在一种实施例中，所述多药耐药蛋白为Pgp，且所述步骤2)中Pgp溶液的浓度为0.1mg/ml，该浓度下既能保证蛋白分子数量足以与基底表面的羧基充分反应，又能使蛋白分子在拉曼增强基底上形成均匀的单分子层，保证基底上蛋白分子信号有一定的均一性。
S3、采集偶联有多药耐药蛋白的SERS基底的拉曼标准值
在偶联有多药耐药蛋白的SERS基底上随机选择至少3个点进行拉曼信号检测，计算随机选择的至少3个点的平均拉曼强度值作为拉曼标准值。
本实施例中，拉曼检测是采用Renishaw inVia拉曼光谱仪完成，使用的激光波长为650nm，最大激发功率为10mW，积分时间为10s。
S4、多药耐药抑制剂抑制效果的检测
将待检测的多药耐药抑制剂与步骤3)中的偶联有多药耐药蛋白的SERS基底共孵育1小时，磷酸缓冲液清洗2次后再检测偶联有多药耐药蛋白的SERS基底的拉曼强度R，并在拉曼强度R中扣除步骤3)得到的拉曼标准值，若扣除后的结果中出现明显的新的拉曼峰(即相当于将拉曼强度R与拉曼标准值做差，然后观察做差的结果中是否出现明显的新拉曼峰)，则表明待检测的多药耐药抑制剂对多药耐药蛋白具有抑制效果，且多药耐药抑制剂的抑制效果与新的拉曼峰的拉曼强度的大小呈正相关关系；若不出现明显新峰，则表明待检测的多药耐药抑制剂对多药耐药蛋白不具有抑制效果。
其中，进行拉曼信号检测使用的激光波长为650nm，最大激发功率为10mW。
多药耐药抑制剂对相应的多药耐药蛋白具有抑制效果时，多药耐药抑制剂会与多药耐药蛋白结合，从而在拉曼检测下产生新的特征信号，且产生的新的特征信号的强度随药物浓度上升而提高，且该新的特征信号的强度与抑制效果为正相关关系，从而能够根据检测的拉曼信号来判断多药耐药抑制剂的抑制效果。参照图2和图3，图2为用不同浓度的维拉帕米与偶联有Pgp的SERS基底共孵育1小时，并按上述步骤4)处理后检测得到的抑制效果的结果，图3为不同浓度的环孢素的抑制效果的结果。图2中，从下至上的3组曲线所代表的维拉帕米的浓度依次为：0.01g/L、0.1g/L、1g/L；图3中，从下至上的3组曲线所代表的环孢素的浓度依次为：0.01g/L、0.1g/L、1g/L。通过相同抑制剂在不同浓度下的拉曼信号结果可以看出，药物浓度越高，拉曼特征信号越强，抑制效果越强；通过两种抑制剂的结果对比可以看出，维拉帕米组获得的拉曼信号强于环孢素组，说明维拉帕米对多药耐药蛋白Pgp的抑制效果强于环孢素。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (6)
1.一种基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备SERS基底；
2)在SERS基底上偶联多药耐药蛋白；
3)在偶联有多药耐药蛋白的SERS基底上随机选择多个点进行拉曼信号检测，计算多个点的平均拉曼强度值作为拉曼标准值；
4)将待检测的多药耐药抑制剂与步骤3)中的偶联有多药耐药蛋白的SERS基底共孵育，清洗后再检测偶联有多药耐药蛋白的SERS基底的拉曼强度，并与步骤3)得到的拉曼标准值进行比较，从而判断待检测的多药耐药抑制剂的抑制效果；
所述步骤1)具体包括：
1-1)对硅片进行预处理：将硅片用无水乙醇冲洗、吹干后置于体积比为3：1的H2SO4和H2O2的混合溶液中清洗，再分别用去离子水、超纯水冲洗，N2吹干；清洗后的硅片在室温下完全浸润在含有3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液中，然后依次用甲醇和纯水超声清洗，并用氮气干燥；
1-2)在预处理后的硅片上通过热蒸发法沉积金膜：以1×10-6mbar的压力、0.3-0.4nm/s速度在预处理后的硅片上沉积金膜，蒸发后，在恒定的氩气流动下退火，得到沉积有金膜的硅片；用巯基乙胺的乙醇溶液对硅片上的金膜进行修饰；将预先制备好地金纳米粒子洗涤后重悬在纯水中得到金纳米粒子溶液，将修饰有巯基乙胺的硅片浸润在金纳米粒子溶液中，反应结束后，将硅片用纯水洗涤并用氮气干燥，制得SERS基底；
所述步骤2)具体包括：将步骤1)制备的SERS基底浸入到十一巯基十一烷酸的乙醇溶液中，6-12小时后取出，乙醇清洗后氮气吹干，再浸入EDC与NHS的混合液中反应15分钟，取出清洗后加入到多药耐药蛋白溶液中反应1小时，之后用PBS缓冲液清洗，得到偶联有多药耐药蛋白的SERS基底；
所述步骤4)具体包括：将待检测的多药耐药抑制剂与步骤3)中的偶联有多药耐药蛋白的SERS基底共孵育，磷酸缓冲液清洗后再检测偶联有多药耐药蛋白的SERS基底的拉曼强度R，并在拉曼强度R中扣除步骤3)获得的拉曼标准值，若扣除后的结果中出现新的拉曼峰则代表待检测的多药耐药抑制剂对多药耐药蛋白具有抑制效果，且多药耐药抑制剂的抑制效果与新的拉曼峰的拉曼强度的大小呈正相关关系；若不会出现新的拉曼峰，则表明待检测的多药耐药抑制剂对多药耐药蛋白不具有抑制效果。
2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，其特征在于，所述多药耐药蛋白为Pgp、Mrp1、Bcrp或Bsep。
3.根据权利要求2所述的基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，其特征在于，所述多药耐药蛋白为Pgp，且所述步骤2)中Pgp溶液的浓度为0.1mg/ml。
4.根据权利要求3所述的基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，其特征在于，所述步骤4)中待检测的多药耐药抑制剂与偶联有多药耐药蛋白的SERS基底共孵育的时间不小于1小时。
5.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，其特征在于，所述步骤3)和步骤4)中，进行拉曼信号检测使用的激光波长为650nm，最大激发功率为10mW。
6.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的多药耐药抑制剂筛选方法，其特征在于，所述SERS基底上的金膜的厚度为40nm，所述步骤1-2)中的金纳米粒子溶液的浓度为100mg/L，其中的金纳米粒子的直径小于10nm。
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