CN115469100A - 前列腺癌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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黄又举
李明
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Abstract

本发明提供了一前列腺癌检测试剂盒及其应用，其中所述前列腺癌检测试剂盒包括肌氨酸氧化酶、金属基纳米粒子、金纳米材料和刻蚀金纳米材料的试剂进行显色反应以评估尿液中肌氨酸浓度，通过颜色辨别肌氨酸的浓度，以肉眼可视的用于检测前列腺癌，无创伤、成本低、使用方便、现场响应、适合推广应用于前列腺癌的诊断。

Description

前列腺癌检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及到生物材料及检测技术领域，尤其涉及到用于前列腺癌筛查的一种前列腺癌检测试剂盒及其应用。
背景技术
前列腺癌(PCa)是一个重大的健康问题，全世界每年诊断出大约1300万例新病例，是男性癌症死亡的第二大原因。因此，尽早发现对治疗具有重要意义。检测PCa最常用的方法是检测血清中的PCa异性抗原(PSA)水平。然而，PSA检测的敏感性有限，约为80％，在“正常”范围内特异性较差，约为20％，假阳性率高，导致患者进行许多不必要的活检和过度治疗。更重要的是，前列腺的非癌性疾病包括良性前列腺增生、前列腺炎和外伤，PSA水平也会升高，这引起了基于PSA筛查的巨大争议。并且对大多数患者而言，早期并无明显临床症状，因此早期筛查PCa对提高其生活质量和降低死亡率至关重要。因此，非常需要选择能够准确检测早期PCa的新生物标志物。
肌氨酸(Sarcosine,SA))作为一种重要的代谢中间体，因其在PCa进展和转移过程中的水平高度增加而受到越来越多的关注。研究表明，肌氨酸可以被用来有效区分良性PCa、局限性PCa和转移性PCa。检测尿液中的肌氨酸浓度水平可以进行简单且无创的早期诊断。通常，在正常生理条件下，人体尿液中产生的肌氨酸浓度为1-3×10-6M，而患者尿液中的肌氨酸浓度仅增加不到10倍。肌氨酸被认为是一种很有前途的生物标志物，对尿液中低浓度的肌氨酸异常表达检测可用于PCa的无创筛查。
即时检测(POCT)技术发展趋于成熟化，目前已在一定程度上应用于非实验室环境中的定量和定性筛选，由于其成本低、分析周期短、用户格式友好、干扰低而引起了极大的兴趣，并且非专业人员易于操作。通常POCT的设备被认为是定性工具，但是在许多情况下，仅确认生物标志物的存在是不够的。因此，开发定量POCT具有重要意义，但如何以廉价便捷的方式实现这一目标仍面临挑战。而光学检测在简单性、成本效益和快速性方面具有明显的优势，使其能够广泛用于POCT设备中。最近，因贵金属纳米材料具有局域表面等离子共振这一光学性质，在可见光范围内表现出丰富的颜色变化，被广泛用于构建比色传感器。新兴的具有模拟酶特征的纳米材料也引起了极大的关注，由于其非凡的催化性能、高稳定性和低成本，被认为是制造比色传感器的理想候选者。
综上，开发一种结合贵金属纳米材料和纳米酶材料的试剂盒及基于试剂盒的诊断方法在前列腺癌诊断方面具有很大的发展潜力。
发明内容
本发明的一个优势在于提供一前列腺癌检测试剂盒及其应用，通过多酶级联反应放大检测信号，并通过裸眼直接观察到的颜色信号作为检测标准，特异性强，可实现前列腺癌症疾病恶化程度的可视化检测，在前列腺癌的早期诊断中具有广阔的应用前景。
本发明的另一优势在于提供一前列腺癌检测试剂盒及其应用，通过对尿液中的SA进行定性、定量检测，从而通过颜色变化进行确认，无创伤、成本低、操作简单、使用方便，无需专门的人力和高价的设备就能进行前列腺癌诊断。
本发明的另一优势在于提供一前列腺癌检测试剂盒及其应用，灵敏度高、特异性强、准确性高、操作便捷、读数简单、结果快速且直观，可用肉眼分辨、现成响应，适合推广应用于前列腺癌的诊断。
本发明的另一优势在于提供一前列腺癌检测试剂盒及其应用，现场及时检测，显色迅速，颜色分辨率高，易于做现场疾病快速筛查，更有效的做到前列腺癌的早期诊断发现和早期治疗。
本发明的另一优势在于提供一前列腺癌检测试剂盒及其应用，简单高校、设备要求低、颜色分辨率高，且易于携带，尤其适于应用于前列腺癌的即时检测。
根据本发明的一方面，本发明提供了一前列腺癌检测试剂盒，包括：
肌氨酸氧化酶(SOX)、金属基纳米粒子、金纳米材料和刻蚀金纳米材料的试剂进行显色反应以评估尿液中SA浓度。
其中所述金属基纳米粒子为Fe3O4纳米粒子(Fe3O4 NPs)、Ni@Pt纳米粒子、Au@Pt纳米粒子、铁基MOFs(MIL-88B-Fe)纳米粒子、铜基MOFs纳米粒子、Fe3Ni-MOF纳米粒子、MoS2纳米粒子或Fe3O4@MoS2-Ag纳米粒子中的一种。
其中所述金纳米材料为金纳米双锥粒子(Au NBPs)或金纳米棒(Au NRs)。
其中刻蚀金纳米材料的试剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)或碘化钾(KI)。
其中Fe3O4 NPs的粒径约为50～150nm，浓度为0.4～0.6mg/mL，所述金纳米棒的长径比为2～3:1，长度为50～100nm。
其中所述前列腺癌检测试剂盒还包括用于调控催化环境的醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)缓冲液、调控酸性环境的物质盐酸，以及表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，其中所述盐酸浓度为5-7M，所述的CTAB浓度为0.15-0.25M。
其中所述SOX的浓度为50～150U/mL。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一前列腺癌检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(A)待测样品中的肌氨酸(SA)与试剂盒中的SOX发生水解反应，产生过氧化氢；
(B)调控催化环境，金属基纳米粒子催化过氧化氢产生活性氧；和
(C)显色反应：刻蚀金纳米材料，输出颜色信号，以评估SA的浓度。
其中在所述步骤(A)中，所述试剂盒中的SOX的浓度为50～150U/mL。
在所述步骤(B)中，所述金属基纳米粒子包括Fe3O4纳米粒子、Ni@Pt纳米粒子、Au@Pt纳米粒子、铁基MOFs(MIL-88B-Fe)纳米粒子、铜基MOFs纳米粒子、Fe3Ni-MOF纳米粒子、MoS2纳米粒子或Fe3O4@MoS2-Ag纳米粒子中的一种。
其中通过TMB或KI来刻蚀Au NBPs或Au NRs进行显色。
其中在所述步骤(B)和所述步骤(C)中，调控催化环境的缓冲液为HAc-NaAc溶液，调控酸性环境的物质为盐酸，使用的表面活性剂为CTAB。
其中在所述步骤(B)中，HAc-NaAc缓冲、Fe3O4 NPs、TMB的体积比为10～15：1:1.5～2.5，所述的HAc-NaAc缓冲浓度为0.15～0.25M，pH为4.5，所述的Fe3O4NPs浓度为0.4～0.6mg/mL，所述的TMB浓度为20～30mM。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一前列腺癌检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)金属纳米粒子的制备；
(2)金纳米材料的制备；以及
(3)加入适于刻蚀金纳米材料的试剂。
其中所述金属纳米粒子为Fe3O4 NPs，所用的Fe3O4 NPs采用经典的水热合成方法得到，以六水合氯化铁、柠檬酸三钠、醋酸钠、乙二醇为原料，制备方法如下：将FeCl3·6H2O溶于乙二醇溶液中，超声和搅拌，待固体完全溶解后再加入柠檬酸三钠，超声和搅拌，待固体完全溶解后再加入醋酸钠，超声和搅拌，待固体完全溶解后将溶液装入反应釜中于一定条件下进行反应，反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水冲洗，真空干燥。
所述金纳米材料为Au NRs，所述的Au NRs溶液以氯金酸、硝酸银、抗坏血酸(AA)、硼氢化钠、盐酸和CTAB为原料制备得到。
其中所述Au NRs溶液的制备方法如下：①纳米金核的制备：将HAuCl4溶液和冰水配制的NaBH4溶液依次加入到CTAB溶液中，然后剧烈搅拌，将反应液室温下静置备用；②水浴条件下依次把HAuCl4溶液、AgNO3溶液、抗坏血酸溶液和HCl溶液加入到CTAB溶液中得到混合液，再向混合液中加步骤①制得的纳米金核溶液，水浴下静置过夜，离心浓缩后制得所述的Au NRs溶液。
其中还包括加入SOX以及刻蚀金纳米材料的试剂TMB和CTAB，所述SOX的浓度为50～150U/mL，HAc-NaAc缓冲液、Fe3O4 NPs、TMB的体积比为10～15：1:1.5～2.5，所述的HAc-NaAc缓冲浓度为0.15～0.25M，pH为4.5，所述的Fe3O4NPs浓度为0.4～0.6mg/mL，所述的TMB浓度为20～30mM，所述的盐酸、CTAB、Au NRs的体积比为1:10～15：4～6，所述的盐酸浓度为5～7M，所述的CTAB浓度为0.15～0.25M，所述的Au NRs浓度为1.2～1.6nM。
其中所述金属纳米粒子的制备还包括以下材料的其中一种：Fe3O4纳米粒子的制备、Au@Pt纳米粒子的制备、铁基MOFs(MIL-88B-Fe)纳米粒子的制备、铜基MOFs纳米粒子的制备、Fe3Ni-MOF纳米粒子的制备、MoS2纳米粒子的制备或Fe3O4@MoS2-Ag纳米粒子的制备。
其中刻蚀金纳米材料的试剂为TMB或KI。
根据本发明的另一方面，上述检测试剂盒和检测方法适于应用于前列腺癌的检测。
附图说明
图1为本发明的较佳实施例的患者尿液中肌氨酸的检测过程的流程图。
图2为本发明的上述较佳实施例的Fe3O4 NPs的TEM图和紫外吸收光谱图。
图3为本发明的上述较佳实施例的Au NRs的TEM图和紫外吸收光谱图。
图4为本发明的上述较佳实施例的SA诱导催化效果示意图。
图5为本发明的上述较佳实施例的SA的诱导刻蚀效果示意图。
图6为本发明的上述较佳实施例的不同浓度的SA检测示意图。
图7为本发明的上述较佳实施例的不同浓度的SA与紫外吸收光谱峰位移的线性关系图。
图8为本发明的上述较佳实施例的不同浓度的SA检测中的颜色变化示意图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
具体实施例方式
本发明采用包括SOX、金属基纳米粒子、金纳米材料和刻蚀金纳米材料的试剂在内的材料制备前列腺癌检测试剂盒，然后使用前列腺癌检测试剂盒直接检测尿液，进而得以检测尿液中的SA，SA与试剂盒中的物质反应后进行显色反应，通过试剂盒的颜色来评估尿液中SA浓度，进而得以直观的判断前列腺癌及其癌变程度。
参考附图1，使用本发明中的试剂盒检测尿液中SA的检测过程包括以下步骤：
(A)SA与SOX发生水解反应，产生过氧化氢；
(B)调控催化环境，金属基纳米粒子催化过氧化氢产生活性氧；
(C)显色反应：加入酸性物质调控成酸性环境，刻蚀金纳米材料，输出颜色信号，以评估SA的浓度。
其中前列腺癌检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)金属纳米粒子的制备；
(2)金纳米材料的制备；以及
(3)加入适于刻蚀金纳米材料的试剂。
其中在所述步骤(A)中，SA与SOX的体积比为1:0.6～1，所述的SA浓度为1～100μM，所述的SOX浓度为50～150U/mL，不同的SA浓度的显色为：红棕色→褐色→墨绿色→青色→蓝色→紫色→粉红色
优选的，在所述步骤(B)中和所述步骤(1)中，所述金属基纳米粒子包括Fe3O4纳米粒子(Fe3O4 NPs)、Ni@Pt纳米粒子、Au@Pt纳米粒子、铁基MOFs(MIL-88B-Fe)纳米粒子、铜基MOFs纳米粒子、Fe3Ni-MOF纳米粒子、MoS2纳米粒子、Fe3O4@MoS2-Ag纳米粒子等。
在所述步骤(C)中，用于颜色响应的所述金纳米材料包括Au NBPs,Au NRs等。
在上述步骤中，显色反应过程中，刻蚀金纳米材料的试剂为TMB、AA和AgNO3、KI等。
在上述步骤(B)和所述步骤(2)中，所用的Fe3O4 NPs采用经典的水热合成方法得到，以六水合氯化铁、柠檬酸三钠、醋酸钠、乙二醇为原料。
Fe3O4 NPs的粒子大小决定了其类过氧化物酶催化活性，粒径越小其催化效果越强，优选的，步骤(B)中，Fe3O4 NPs的粒径约为50～150nm。上述粒径范围内的Fe3O4 NPs具有较好催化过氧化氢的能力，能够实现对SA的高灵敏可视化检测。
具体地，使用本发明中的前列腺癌检测试剂盒的检测方法及原理如下：
SA与SOX发生水解反应，并生成过氧化氢；
加入缓冲调控催化环境，使得Fe3O4 NPs催化过氧化氢产生活性氧，并进一步将TMB氧化成TMB+伴随无色到蓝色的变化；
在加入酸性物质调控成酸性环境下，TMB+进一步转变成具有强氧化性的TMB2+，在表面活性剂CTAB的存在下可以氧化刻蚀Au NRs并输出颜色信号以评估SA的浓度。
优选的，所述的水解过程是在碱性环境下进行的，孵育温度为35～45℃，孵育时间为8～12min。SA与SOX的体积比为1:0.6～1，所述的SA浓度为1～100μM，所述的SOX浓度为50～150U/mL。
所述的Fe3O4 NPs的制备方法为：将0.4～0.7g FeCl3·6H2O溶于30～50mL乙二醇溶液中，超声和搅拌20～40min。待固体完全溶解后再加入0.4～0.7g柠檬酸三钠，超声和搅拌20～40min。待固体完全溶解后再加入2～3g醋酸钠，超声和搅拌20～40min。待固体完全溶解后将溶液装入100mL的反应釜中，并置于150～250℃反应7～10h。反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗2～4次，50～70℃真空干燥10～14h。
优选的，步骤(B)中，所述的调控催化环境的缓冲为HAc-NaAc缓冲。TMB为3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐，与Fe3O4 NPs都是用水分散。催化过程中孵育温度为35～45℃，孵育时间为8～12min。
优选的，步骤(B)中HAc-NaAc缓冲、Fe3O4 NPs、TMB的体积比为10～15：1:1.5～2.5，所述的HAc-NaAc缓冲浓度为0.15～0.25M，pH为4.5。所述的Fe3O4NPs浓度为0.4～0.6mg/mL，所述的TMB浓度为20～30mM。
优选的，步骤(C))中，调控酸性环境的物质为盐酸，表面活性剂为CTAB。所述的盐酸浓度为5～7M。所述的CTAB浓度为0.15～0.25M。
优选的，步骤(C)中，所述的Au NRs溶液采用经典的种子介导法，以氯金酸、硝酸银、AA、硼氢化钠、盐酸和CTAB为原料制备得到。
优选的，步骤(C)中，金纳米棒的长径比为2～3:1，长度为50～100nm。相应参数的Au NRs能够在被刻蚀的条件下基于LSPR光学性质产生丰富多彩的颜色，可视化检测灵敏度高。
进一步优选的，所述的Au NRs溶液的制备方法包括：
①纳米金核的制备：依次将0.15～0.3mL 5～20mM的HAuCl4溶液和0.5～0.7mL 5～20mM冰水配制的NaBH4溶液依次加入到9～11mL 50～200mM CTAB溶液中，然后在转速1100～1300rpm下剧烈搅拌1～3min，将反应液室温下静置至少1.5～3h备用；
②在转速600～800rpm和25～32℃水浴条件下依次把3～5mL 5～20mM的HAuCl4溶液,0.7～0.9mL 5～20mM的AgNO3溶液，0.5～0.7mL 50～200mM的AA溶液和1～2mL 0.5～1.5M HCl溶液加入到70～90mL 50～200mM的CTAB溶液中得到混合液，再向混合液中加入50～80μL步骤①制得的纳米金核溶液，25～32℃水浴下静置过夜，离心浓缩后制得所述的AuNRs溶液。
优选的，步骤
Figure BDA0003868070230000071
中，所述的盐酸、CTAB、Au NRs的体积比为1:10～15：4～6，所述的盐酸浓度为5～7M，所述的CTAB浓度为0.15～0.25M，所述的Au NRs浓度为1.2～1.6nM。
优选的，步骤(C)中，所述的Au NRs氧化刻蚀过程在35～45℃温度下进行，反应时间为25～35min。
其中SA诱导催化和诱导刻蚀的效果参考附图4和附图5所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明利用通过多酶级联反应放大检测信号，并通过裸眼直接观察得到的颜色信号作为检测标准。并且酶的专一识别使得检测特异性高。可实现癌症疾病恶化程度的可视化检测，在前列腺癌早期诊断中具有广阔的应用前景。
(2)本发明方法具有简单高效、设备要求低、成本低、显色快速、颜色分辨率高等优点，可用于前列腺癌的现场即时检测。
(3)本发明方法可在医疗资源受限的地区用于日常监测，更易于做现场疾病快速筛选，更有效的做到早期诊断发现和早期治疗。
本发明的试剂盒涉及到金属纳米粒子和金纳米材料的具体制备方法如下：
实施例1
(1)Fe3O4 NPs的制备
将0.7g FeCl3·6H2O溶于40mL乙二醇溶液中，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后再加入0.4g柠檬酸三钠，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后再加入2g醋酸钠，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后将溶液装入100mL的反应釜中，并置于200℃反应9h。反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗3次，70℃真空干燥14h。
(2)Au NRs溶液的制备
①纳米金核的制备：依次将0.25mL 10mM的HAuCl4溶液和0.6mL 10mM冰水配制的NaBH4溶液依次加入到9.75mL 100mM CTAB溶液中，然后在转速1200rpm下剧烈搅拌2min，将反应液室温下静置至少2h备用；
②在转速700rpm和30℃水浴条件下依次把4mL 10mM的HAuCl4溶液,0.8mL 5～20mM的AgNO3溶液，0.64mL 100mM的AA溶液和1.6mL 1M HCl溶液加入到80mL 100mM的CTAB溶液中得到混合液，再向混合液中加入50μL步骤①制得的纳米金核溶液，30℃水浴下静置过夜，离心浓缩后制得所述的Au NRs溶液。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：
(1)Fe3O4 NPs的制备
将0.5g FeCl3·6H2O溶于40mL乙二醇溶液中，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后再加入0.5g柠檬酸三钠，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后再加入2.4g醋酸钠，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后将溶液装入100mL的反应釜中，并置于200℃反应9h。反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗3次，70℃真空干燥14h。
(2)Au NRs溶液的制备
①纳米金核的制备：依次将0.25mL 10mM的HAuCl4溶液和0.6mL 10mM冰水配制的NaBH4溶液依次加入到9.75mL 100mM CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液中，然后在转速1200rpm下剧烈搅拌2min，将反应液室温下静置至少2h备用；
②在转速700rpm和30℃水浴条件下依次把4mL 10mM的HAuCl4溶液,0.8mL 5～20mM的AgNO3溶液，0.64mL 100mM的AA溶液和1.6mL 1M HCl溶液加入到80mL 100mM的CTAB溶液中得到混合液，再向混合液中加入70μL步骤①制得的纳米金核溶液，30℃水浴下静置过夜，离心浓缩后制得所述的Au NRs溶液。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：
(1)Fe3O4 NPs的制备
将0.4g FeCl3·6H2O溶于40mL乙二醇溶液中，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后再加入0.7g柠檬酸三钠，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后再加入3g醋酸钠，超声和搅拌30min。待固体完全溶解后将溶液装入100mL的反应釜中，并置于200℃反应9h。反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗3次，70℃真空干燥14h。
(2)Au NRs溶液的制备
①纳米金核的制备：依次将0.25mL 10mM的HAuCl4溶液和0.6mL 10mM冰水配制的NaBH4溶液依次加入到9.75mL 100mM CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液中，然后在转速1200rpm下剧烈搅拌2min，将反应液室温下静置至少2h备用；
②在转速700rpm和30℃水浴条件下依次把4mL 10mM的HAuCl4溶液,0.8mL 5～20mM的AgNO3溶液，0.64mL 100mM的AA溶液和1.6mL 1M HCl溶液加入到80mL 100mM的CTAB溶液中得到混合液，再向混合液中加入80μL步骤①制得的纳米金核溶液，30℃水浴下静置过夜，离心浓缩后制得所述的Au NRs溶液。
得到的Fe3O4 NPs的粒径为80～300nm，其中实施例2中制备所得Fe3O4 NPs的TEM图和紫外光谱图如图2中的A和B所示，粒径约为80～150nm。
得到的金纳米棒的长径比为2～3:1，长度为50～90nm，其中实施例2中制备所得AuNRs的长径比约为2.5:1，长度约为70nm，其TEM表征图和紫外光谱图如图3中的A和B所示，AuNRs的纵向LSPR峰在714nm处。
实施例4
(1)Ni@Pt纳米粒子的制备
首先通过磁力搅拌将10mg(0.025mmol)铂(II)乙酰丙酮化物[platinum(II)acetylacetonate]、7mg(0.025mmol)乙酸镍(II)四水合物[nickel(II)acetatetetrahydrate]、80mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW≈55000)和10mL四甘醇在100mL四颈烧瓶中混合，并在100℃的N2温和气流下脱气30min，形成澄清溶液。然后在N2保护下，将1mL乙醛/四甘醇混合物(体积比为1:1)快速注入溶液中。然后将溶液以10℃/min的速度加热至280℃，并在280℃下保持1h，然后冷却至室温。合成后，通过向反应溶液中加入100mL丙酮，然后以8000rpm离心10min，沉淀出的产物为Ni-Pt NPs。然后通过离心(14000rpm，10min)用去离子水洗涤产物两次。最后，将产品重新分散在去离子水中以供进一步使用。
实施例5
(1)Au@Pt纳米粒子的制备
金纳米粒子合成：首先，将240μL HAuCl4·3H2O(25mM)用10mL去离子水稀释，然后加热至100℃。然后，快速加入1mL二水合柠檬酸三钠(10mg/mL)，反应10min。冷却至室温后，通过离心分离产物并重新分散在去离子水中形成分散体(0.442mg/mL)。
金@铂纳米粒子合成：将1.0mL上述金纳米粒子分散体用8mL去离子水稀释，然后加入所需体积的H2PtCl6·6H2O水溶液(20mM)和0.1M AA(AA/Pt4+＝5)。在搅拌下将混合物在80℃加热30min。最后离心分离产物，反复洗涤，再分散于去离子水中，得到分散液。
实施例6
铁基MOFs(MIL-88B-Fe)纳米粒子的制备
氯化铁六水合化合物(270mg)和1,4-对苯二甲酸(116mg)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，然后再加入NaOH(2M,0.4mL)，最后在100℃下水热处理12h。溶剂热处理后，过滤收集合成的MIL-88B-Fe，用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和去离子水洗涤，直至上清液变为无色。最后在60℃真空干燥过夜得到MIL-88B-Fe固体材料以备使用。
实施例7
铜基MOFs纳米粒子的制备
将0.20g聚乙烯比咯烷酮溶解在含有4mL DMF和4mL乙醇的混合溶剂中，然后加入4mLDMF溶液，其中含有24.2mg CuNO3·3H2O(0.1mmol)和5.43mg 2-氨基对苯二甲酸(0.03mmol)。随后，将溶液转移到100℃下加热8h。最后，通过离心收集获得的产物并水洗，最后在真空冷冻干燥机中干燥。
实施例8
Fe3Ni-MOF纳米粒子的制备
1mmol FeCl3·6H2O和0.33mmol Ni(NO3)2·6H2O加入到20mL DMF中并与1mmol对苯二甲酸搅拌混合。上述混合物溶解后，缓慢滴加2mL NaOH溶液(0.4M)，滴加完成后再搅拌10min。然后将混合物转移到100℃下加热8h然后冷却至室温。最后，将产物用DMF和乙醇交替洗涤数次，并在60℃下干燥。
实施例9
MoS2纳米粒子的制备
0.5g聚乙烯比咯烷酮(PEG，Mw＝20000)和0.1766g钼酸铵四水合物溶解在20mL去离子水中。然后，加入10mL含2mmol的硫脲水溶液并搅拌直至形成透明溶液。然后，将混合物转移180℃下保持12h。最后，将黑色产物用乙醇和去离子水各洗涤3次，然后通过离心分离并重新分散在水中以备用。
实施例10
Fe3O4@MoS2-Ag纳米粒子的制备
将1.35g FeCl3·6H2O溶解在40m乙二醇中，搅拌均匀，形成黄色透明溶液，然后依次加入3.6g NaAc和1.0g聚乙烯比咯烷酮(PEG，Mw＝1000)。将混合溶液剧烈搅拌，然后转移到200℃下保持8h。将得到的黑色样品分别用水和乙醇彻底洗涤3次，并通过磁分离收集。最终的黑色产物在60℃的真空烘箱中干燥过夜。
通过强超声处理30min，将20mg Fe3O4纳米颗粒均匀分散在30mL蒸馏水中。之后，向溶液中加入1.05g(NH4)6Mo7O24·4H2O和2.28g硫脲，再超声处理30min。将混合物转移80℃下加热10h，然后自然冷却。将制备好的样品依次用水和乙醇洗涤3次，磁选收集除去MoS2。黑色产物在60℃的真空烘箱中干燥过夜。
将100mg Fe3O4@MoS2粉末通过超声处理20min完全分散在100mL甲醇中。在机械搅拌下将AgNO3水溶液(0.1mol/L)的设计体积(46.7、93.5、280.4和467.3μL对应于Fe3O4@MoS2粉末质量的0.5、1、3和5％)缓慢滴入悬浮液中15min将Ag+静电吸引到MoS2片上，然后将N2(99.999％)鼓泡到混合物中30min以去除O2。使用300W汞灯进行光沉积过程3h。用蒸馏水洗涤3次并通过磁力收集后，将最终产物在60℃的真空烘箱中干燥过夜。
根据本发明的上述实施方式，所用刻蚀剂除了TMB外，还可以更换成KI，氧化刻蚀的具体方式如下：
①将TMB替换成KI，在催化过氧化氢后活性氧生成下被氧化成I2，并可以刻蚀金纳米材料，改变其形貌大小产生颜色变化。
基于本发明的前列腺癌检测试剂盒及其检测方法用于检测不同浓度的SA，根据颜色变化以评估尿液中的SA浓度，进而得以判断前列腺癌。按照上述步骤(A)、(B)和(C)具体操作如下：
取6～12μL SA样品溶液和6～12μL SOX溶液于0.5mL的离心管中，并在37～45℃的水浴锅中孵育5～15min。然后，再在依次在离心管内加入39～78μLHAc-NaAc缓冲(0.2M，pH4.5)、6～12μL TMB(20～30mM)和3～6μL Fe3O4 NPs(0.4～0.6mg/mL)，搅拌混合均匀并在37～45℃的水浴锅中孵育5～15min。接着，再在离心管中依次加入6～12μL HCl(5～7M)、72～144μL CTAB(0.15～0.25M)和30～60μL Au NRs(1.2～1.6nM)，搅拌混合均匀并在37～45℃的水浴锅中孵育20～40min。待反应完成后，对反应终溶液测量紫外吸收光谱并拍摄溶液颜色照片。
不同浓度SA的紫外吸收峰位移信号(y)与其浓度(x)线性图如图6和7所示，线性方程为：y＝19.52+1.42*x，相关系数R2＝0.9932，由图7表明，该传感器的线性范围为2μM～70μM，线性良好，可以用于未知样品中SA浓度的检测。将标样检测浓度与颜色相对应绘制成比色卡，如图8所示，可用于后续裸眼直接半定量检测SA浓度。不同浓度的SA检测中颜色变化为：红棕色→褐色→墨绿色→青色→蓝色→紫色→粉红色。
检测结果分析如表1所示：
表1人尿液中肌氨酸浓度的检测(n＝3)
尿液样品 加标量 检出量 RSD 回收率
1 10(μM) 9.49(μM) 4.8 95.0％
2 30(μM) 30.62(μM) 7.6 102.1％
3 50(μM) 51.27(μM) 5.1 102.5％
由表1检测结果可知，在真实人尿液样本中检测SA浓度的相对标准偏差(RSD)小于7.6％，回收率为95％～102.5％，表明本发明对于尿液中不同浓度SA的检测精密度高，结果准确可靠。证明了本发明的前列腺癌检测试剂盒及其检测方法用于肌氨酸检测时的可行性和准确性，并说明本发明方法在前列腺癌诊断评估方面应用前景广泛。
本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (15)

1.一前列腺癌检测试剂盒，以尿液中的肌氨酸为标志物，其特征在于，包括：
肌氨酸氧化酶、金属纳米粒子、金纳米材料和刻蚀剂，其中所述肌氨酸氧化酶用于催化肌氨酸氧化生成过氧化氢，所述金属纳米粒子用于催化过氧化氢生成活性氧，所述活性氧用于氧化所述刻蚀剂，所述刻蚀剂用于刻蚀所述金纳米材料以显色。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌检测试剂盒，其中所述金属纳米粒子为Fe3O4纳米粒子、Ni@Pt纳米粒子、Au@Pt纳米粒子、铁基MOFs(MIL-88B-Fe)纳米粒子、铜基MOFs纳米粒子、Fe3Ni-MOF纳米粒子、MoS2纳米粒子或Fe3O4@MoS2-Ag纳米粒子中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的前列腺癌检测试剂盒，其中所述金纳米材料为金纳米双锥粒子或金纳米棒。
4.根据权利要求3所述的前列腺癌检测试剂盒，其中所述刻蚀剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐或碘化钾。
5.根据权利要求4所述的前列腺癌检测试剂盒，其中Fe3O4 NPs的粒径约为50～150nm。
6.根据权利要求4所述的前列腺癌检测试剂盒，其中所述金纳米棒的长径比为2～3:1。
7.根据权利要求5所述的前列腺癌检测试剂盒，其中所述前列腺癌检测试剂盒还包括用于调控催化环境pH值的试剂。
8.一前列腺癌检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)催化样品中的肌氨酸产生过氧化氢；
(B)催化过氧化氢产生活性氧；和
(C)藉由活性氧促使刻蚀剂刻蚀金纳米材料以显色。
9.根据权利要求8所述的前列腺癌检测试剂盒的检测方法，其中在所述步骤(B)中，藉由金属纳米粒子催化过氧化氢，其中所述金属纳米粒子包括Fe3O4纳米粒子、Ni@Pt纳米粒子、Au@Pt纳米粒子、铁基MOFs(MIL-88B-Fe)纳米粒子、铜基MOFs纳米粒子、Fe3Ni-MOF纳米粒子、MoS2纳米粒子或Fe3O4@MoS2-Ag纳米粒子中的一种。
10.根据权利要求9所述的前列腺癌检测试剂盒的检测方法，其中通过TMB或碘化钾来刻蚀金纳米双锥粒子或金纳米棒进行显色。
11.根据权利要求10所述的前列腺癌检测试剂盒的检测方法，其中在所述步骤(B)和所述步骤(C)中，调控催化环境的缓冲液为醋酸-醋酸钠溶液，调控酸性环境的物质为盐酸，使用的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。
12.根据权利要求11所述的前列腺癌检测试剂盒的检测方法，其中在所述步骤(B)中，醋酸-醋酸钠缓冲、Fe3O4 NPs、TMB的体积比为10～15：1:1.5～2.5，所述醋酸-醋酸钠缓冲浓度为0.15～0.25M，pH为4.5，所述的Fe3O4 NPs浓度为0.4～0.6mg/mL，所述的TMB浓度为20～30mM。
13.根据权利要求8至12任一所述的前列腺癌检测试剂盒的检测方法，其中在所述步骤(A)中，所述试剂盒中的肌氨酸氧化酶的浓度为50～150U/mL。
14.一前列腺癌检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金属纳米粒子的制备；
(2)金纳米材料的制备；以及
(3)加入适于刻蚀金纳米材料的刻蚀剂。
15.根据权利要求14所述的前列腺癌检测试剂盒的制备方法，其中所述金属纳米粒子为Fe3O4 NPs，所用的Fe3O4 NPs采用经典的水热合成方法得到，以六水合氯化铁、柠檬酸三钠、醋酸钠、乙二醇为原料，制备方法如下：将FeCl3·6H2O溶于乙二醇溶液中，超声和搅拌，待固体完全溶解后再加入柠檬酸三钠，超声和搅拌，待固体完全溶解后再加入醋酸钠，超声和搅拌，待固体完全溶解后将溶液装入反应釜中于一定条件下进行反应，反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水冲洗，真空干燥。
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