JP2774875B2 - Ｃｋ−ｍｂに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｃｋ−ｍｂに対するモノクローナル抗体Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、CK−MBイソ酵素に結合するが、CK−MBのＢ
サブユニットにもＭサブユニットにも、CK−MM及びCK−
BBイソ酵素にも結合しないモノクローナル抗体、並びに
診断検査においてこれら抗体を用いてCK−MBを検出する
方法に関する。
サブユニットにもＭサブユニットにも、CK−MM及びCK−
BBイソ酵素にも結合しないモノクローナル抗体、並びに
診断検査においてこれら抗体を用いてCK−MBを検出する
方法に関する。
クレアチンキナーゼ（ATP:クレアチン−Ｎ−ホスホト
ランスフェラーゼ,EC2.7.3.2.）は、ATPの存在下でのク
レアチンのリン酸クレアチンへの可逆的リン酸化を触媒
する。この酵素は、そのＭ（筋特異性）型及びＢ（脳特
異性）型が知られている２つのサブユニットから構成さ
れており、それらは互いに78.7％の相同性を有する。こ
のダイマー酵素は、２つの同一サブユニットから構成さ
れている（筋特異性CK−MMイソ酵素及び脳特異性CK−BB
イソ酵素）か又はヘテロダイマーとして存在している。
このヘテロダイマーCK−MBイソ酵素は、心筋に対して特
異性であるので心筋層が傷ついた場合、例えば、心筋梗
塞、進行性筋ジストロフィー又は毒性ミオパシーの場合
にはとりわけ血清中で検出できる。その高い特異性のた
めに、血清中でのCK−MBの確認は、心筋梗塞の診断の重
要な緊急パラメーターである。従って、血清中のCK−MB
を確認する幾つかの方法が既に記載されており、それら
方法では、CK−MBは電気泳動若しくイオンクロマトグラ
フィー分離により検出され、又はある抗体でＭサブユニ
ットを阻害しながら活性をラジオイムノアッセイにより
若しくは酵素的測定により検出されている。しかしなが
ら、これら方法は非常に時間を浪費する。CK−MBの確認
は特に緊急時に重要なので、適する検査はCK−MBに特異
性であるだけでなく、迅速に行われるものでなければな
らない。
ランスフェラーゼ,EC2.7.3.2.）は、ATPの存在下でのク
レアチンのリン酸クレアチンへの可逆的リン酸化を触媒
する。この酵素は、そのＭ（筋特異性）型及びＢ（脳特
異性）型が知られている２つのサブユニットから構成さ
れており、それらは互いに78.7％の相同性を有する。こ
のダイマー酵素は、２つの同一サブユニットから構成さ
れている（筋特異性CK−MMイソ酵素及び脳特異性CK−BB
イソ酵素）か又はヘテロダイマーとして存在している。
このヘテロダイマーCK−MBイソ酵素は、心筋に対して特
異性であるので心筋層が傷ついた場合、例えば、心筋梗
塞、進行性筋ジストロフィー又は毒性ミオパシーの場合
にはとりわけ血清中で検出できる。その高い特異性のた
めに、血清中でのCK−MBの確認は、心筋梗塞の診断の重
要な緊急パラメーターである。従って、血清中のCK−MB
を確認する幾つかの方法が既に記載されており、それら
方法では、CK−MBは電気泳動若しくイオンクロマトグラ
フィー分離により検出され、又はある抗体でＭサブユニ
ットを阻害しながら活性をラジオイムノアッセイにより
若しくは酵素的測定により検出されている。しかしなが
ら、これら方法は非常に時間を浪費する。CK−MBの確認
は特に緊急時に重要なので、適する検査はCK−MBに特異
性であるだけでなく、迅速に行われるものでなければな
らない。
従って、CK−MM及びCK−BBに対する抗体を用いてサン
ドイッチアッセイによりCK−MBを検出するイムノアッセ
イも記載されている。理論的にはこの方法によりCK−MB
だけが検出可能な筈であるが、そのようなサンドイッチ
アッセイは、CK−MM及びCK−BBによる干渉を非常に受け
易いことが明らかになった。というのは、抗CK−MM抗体
はCK−BBとも交叉反応し、そして抗CK−BB抗体もCK−MM
と交叉反応するからである。従って、そのようなサンド
イッチアッセイは、容易に偽陽性結果をもたらす。CK−
MBに対して特異的なモノクローナル抗体も、Vaidyaら
（Clin.Chem.32,1986,657−663）により開発された。こ
れら抗体のうちの１種は、特によく特徴づけされてい
る。この抗体は、いわゆる“Conan"抗体と言われてお
り、CK−MBに対するモノクローナル抗体の基準抗体であ
ると考えられている。しかしながら、この抗体及びこれ
までに開発されたCK−MBに対する他の一連のモノクロー
ナル抗体はCK−MBに対して低い親和性しか有さず、更
に、全てが同じエピトープ、つまりCK−MBのいわゆる
“Conan"エピトープしか認識しないので、これら抗体で
のサンドイッチアッセイは可能ではない。
ドイッチアッセイによりCK−MBを検出するイムノアッセ
イも記載されている。理論的にはこの方法によりCK−MB
だけが検出可能な筈であるが、そのようなサンドイッチ
アッセイは、CK−MM及びCK−BBによる干渉を非常に受け
易いことが明らかになった。というのは、抗CK−MM抗体
はCK−BBとも交叉反応し、そして抗CK−BB抗体もCK−MM
と交叉反応するからである。従って、そのようなサンド
イッチアッセイは、容易に偽陽性結果をもたらす。CK−
MBに対して特異的なモノクローナル抗体も、Vaidyaら
（Clin.Chem.32,1986,657−663）により開発された。こ
れら抗体のうちの１種は、特によく特徴づけされてい
る。この抗体は、いわゆる“Conan"抗体と言われてお
り、CK−MBに対するモノクローナル抗体の基準抗体であ
ると考えられている。しかしながら、この抗体及びこれ
までに開発されたCK−MBに対する他の一連のモノクロー
ナル抗体はCK−MBに対して低い親和性しか有さず、更
に、全てが同じエピトープ、つまりCK−MBのいわゆる
“Conan"エピトープしか認識しないので、これら抗体で
のサンドイッチアッセイは可能ではない。
これまでに記載されたサンドイッチアッセイでは、た
だ１種のCK−MB特異的モノクローナル抗体を用いるに過
ぎない。第２抗体はＭ又はＢサブユニットに対する抗体
なのでCK−MM又はCK−BBをも認識する。
だ１種のCK−MB特異的モノクローナル抗体を用いるに過
ぎない。第２抗体はＭ又はＢサブユニットに対する抗体
なのでCK−MM又はCK−BBをも認識する。
従って、本発明の目的は、CK−MMイソ酵素にもCK−BB
イソ酵素にも結合しないCK−MBイソ酵素に対するモノク
ローナル抗体を提供することである。この目的は、CK−
MBイソ酵素に結合するが、CK−MBの単独のＢサブユニッ
トにもＭサブユニットにも結合せず、CK−MMイソ酵素に
もCK−BBイソ酵素にも実質的に結合せず、CK−MBへのそ
の結合がモノクローナル抗体DSM ACC 2058、DSM ACC 20
60又はDSM ACC 2168の結合と同等の様式で起こるモノク
ローナル抗体により達成される。このモノクローナル抗
体は、A/Jマウス（Ｈ−2aハプロタイプ）をCK−MBイソ
酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて
免疫感作し、その免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化
し、そしてCK−MBイソ酵素に結合するがCK−MMにもCK−
BBにも実質的に結合せずかつ“Conan MB抗体”（ATCC H
B 8939）によりCK−MBへの結合から放逐されない抗体を
産生する不死化細胞をクローニングすることにより得る
ことができる。
イソ酵素にも結合しないCK−MBイソ酵素に対するモノク
ローナル抗体を提供することである。この目的は、CK−
MBイソ酵素に結合するが、CK−MBの単独のＢサブユニッ
トにもＭサブユニットにも結合せず、CK−MMイソ酵素に
もCK−BBイソ酵素にも実質的に結合せず、CK−MBへのそ
の結合がモノクローナル抗体DSM ACC 2058、DSM ACC 20
60又はDSM ACC 2168の結合と同等の様式で起こるモノク
ローナル抗体により達成される。このモノクローナル抗
体は、A/Jマウス（Ｈ−2aハプロタイプ）をCK−MBイソ
酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて
免疫感作し、その免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化
し、そしてCK−MBイソ酵素に結合するがCK−MMにもCK−
BBにも実質的に結合せずかつ“Conan MB抗体”（ATCC H
B 8939）によりCK−MBへの結合から放逐されない抗体を
産生する不死化細胞をクローニングすることにより得る
ことができる。
CK−MBと特異的に反応するがCK−MMにもCK−BBにも実
質的に反応しないそのような抗体は、Ｍサブユニット並
びにＢサブユニットにより形成されるコンフォメーショ
ンエピトープを認識するに違いない。抗体の結合領域は
約６〜10アミノ酸の抗原をエピトープとして認識するの
で、CK−MBの２つのサブユニットそれぞれはこのコンフ
ォメーションエピトープの約５アミノ酸を分担する。加
えて、そのアミノ酸側鎖の立体配置並びにそれらの親水
性のために、タンパク質配列の特定の部分だけが免疫原
性であるに過ぎない。このことから、ダイマー抗原は、
通常は、両サブユニットが互いにそれらの特異性に貢献
している非常に少数のコンフォメーションエピトープを
有するに過ぎない。従って、CK−MBイソ酵素上の４つの
異なるコンフォメーションエピトープを認識し、かくし
てサンドイッチアッセイに適するか又はトリプレット形
成（triplet formation）にさえ適するCK−MBイソ酵素
に対するモノクローナル抗体を見出せたのは驚くべきこ
とである。これら４エピトープは、第１エピトープにつ
いての“Conan MB抗体"ATCC HB 8939の結合並びに本発
明のモノクローナル抗体DSM ACC 2059及び／又はDSM AC
C 2057の結合により、第２エピトープについてのモノク
ローナル抗体DSM ACC 2058の結合により、第３エピトー
プについてのモノクローナル抗体DSM ACC 2060の結合に
より、並びに第４エピトープについてのモノクローナル
抗体DSM ACC 2168の結合により特徴付けられる。
質的に反応しないそのような抗体は、Ｍサブユニット並
びにＢサブユニットにより形成されるコンフォメーショ
ンエピトープを認識するに違いない。抗体の結合領域は
約６〜10アミノ酸の抗原をエピトープとして認識するの
で、CK−MBの２つのサブユニットそれぞれはこのコンフ
ォメーションエピトープの約５アミノ酸を分担する。加
えて、そのアミノ酸側鎖の立体配置並びにそれらの親水
性のために、タンパク質配列の特定の部分だけが免疫原
性であるに過ぎない。このことから、ダイマー抗原は、
通常は、両サブユニットが互いにそれらの特異性に貢献
している非常に少数のコンフォメーションエピトープを
有するに過ぎない。従って、CK−MBイソ酵素上の４つの
異なるコンフォメーションエピトープを認識し、かくし
てサンドイッチアッセイに適するか又はトリプレット形
成（triplet formation）にさえ適するCK−MBイソ酵素
に対するモノクローナル抗体を見出せたのは驚くべきこ
とである。これら４エピトープは、第１エピトープにつ
いての“Conan MB抗体"ATCC HB 8939の結合並びに本発
明のモノクローナル抗体DSM ACC 2059及び／又はDSM AC
C 2057の結合により、第２エピトープについてのモノク
ローナル抗体DSM ACC 2058の結合により、第３エピトー
プについてのモノクローナル抗体DSM ACC 2060の結合に
より、並びに第４エピトープについてのモノクローナル
抗体DSM ACC 2168の結合により特徴付けられる。
驚いたことに、モノクローナル抗体DSM ACC 2058、DS
M ACC 2060、DSM ACC 2057、DSM ACC 2059及びDSM ACC
2168がこれまでに知られているCK−MBに対するモノクロ
ーナル抗体よりもCK−MBへの結合について大きな結合定
数を有することが明らかになった。従って、これらモノ
クローナル抗体はCK−MBと非常に速やかに反応するので
迅速な診断検査に特に適する。
M ACC 2060、DSM ACC 2057、DSM ACC 2059及びDSM ACC
2168がこれまでに知られているCK−MBに対するモノクロ
ーナル抗体よりもCK−MBへの結合について大きな結合定
数を有することが明らかになった。従って、これらモノ
クローナル抗体はCK−MBと非常に速やかに反応するので
迅速な診断検査に特に適する。
従って、CK−MBへの結合について少なくとも１×105
モル-1×１×秒-1の結合定数を有する本発明のCK−MBイ
ソ酵素に対するモノクローナル抗体は好ましいものであ
る。
モル-1×１×秒-1の結合定数を有する本発明のCK−MBイ
ソ酵素に対するモノクローナル抗体は好ましいものであ
る。
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくはIgG1アイ
ソタイプのモノクローナル抗体である。
ソタイプのモノクローナル抗体である。
本発明のCK−MBに対するモノクローナル抗体は、CK−
MB上の異なるエピトープを認識する２種の抗体を用いる
ことを条件として、CK−MBを検出するためのサンドイッ
チイムノアッセイ用にどのようにお互いを組み合わせて
も並びにどのようにCK−MBに対する既知の抗体と組み合
わせてもよい。本発明の抗体は、もちろん、クレアチン
キナーゼのＭ又はＢサブユニットに対する抗体とも組み
合わせることができる。
MB上の異なるエピトープを認識する２種の抗体を用いる
ことを条件として、CK−MBを検出するためのサンドイッ
チイムノアッセイ用にどのようにお互いを組み合わせて
も並びにどのようにCK−MBに対する既知の抗体と組み合
わせてもよい。本発明の抗体は、もちろん、クレアチン
キナーゼのＭ又はＢサブユニットに対する抗体とも組み
合わせることができる。
できるだけ敏感である検査のためには、これら抗体は
CK−MBに対して高い親和性を更に有するべきである。驚
いたことに、前述のモノクローナル抗体DSM ACC 2059及
びDSM ACC 2057は、CK−MBのこのエピトープに対するこ
れまでに知られた抗体よりも高い親和定数（affinity c
onstant）を有することが明らかになった。
CK−MBに対して高い親和性を更に有するべきである。驚
いたことに、前述のモノクローナル抗体DSM ACC 2059及
びDSM ACC 2057は、CK−MBのこのエピトープに対するこ
れまでに知られた抗体よりも高い親和定数（affinity c
onstant）を有することが明らかになった。
従って、本発明は、CK−MBイソ酵素に結合するが、CK
−MBの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結
合せず、CK−MM及びCK−BBイソ酵素にも実質的に結合せ
ず、CK−MBへのその結合がモノクローナル抗体DSM ACC
2057又はDSM ACC 2059の結合と同等の様式で起こるモノ
クローナル抗体であって、CK−MBに対して少なくとも１
×108モル-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗
体にも関する。このモノクローナル抗体は、A/Jマウス
（Ｈ−2aハプロタイプ）をCK−MBイソ酵素でアジュバン
トとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、その
免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてCK−MBに
結合するがCK−MMにもCK−BBにも実質的に結合せず、
“Conan MB抗体”（ATCC HB 8939）によりCK−MBへの結
合から放逐されず、かつCK−MBに対して少なくとも１×
108モル-1×１×秒-1の親和定数を有する抗体を産生す
る不死化細胞をクローニングすることにより得ることが
できる。親和定数の測定は、BIAcore システム（Pharm
acia LKB）により速度評価キットソフトウェアー（Phar
macia LKB,識別番号BR−1000−19）を用いて行われる。
−MBの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結
合せず、CK−MM及びCK−BBイソ酵素にも実質的に結合せ
ず、CK−MBへのその結合がモノクローナル抗体DSM ACC
2057又はDSM ACC 2059の結合と同等の様式で起こるモノ
クローナル抗体であって、CK−MBに対して少なくとも１
×108モル-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗
体にも関する。このモノクローナル抗体は、A/Jマウス
（Ｈ−2aハプロタイプ）をCK−MBイソ酵素でアジュバン
トとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、その
免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてCK−MBに
結合するがCK−MMにもCK−BBにも実質的に結合せず、
“Conan MB抗体”（ATCC HB 8939）によりCK−MBへの結
合から放逐されず、かつCK−MBに対して少なくとも１×
108モル-1×１×秒-1の親和定数を有する抗体を産生す
る不死化細胞をクローニングすることにより得ることが
できる。親和定数の測定は、BIAcore システム（Pharm
acia LKB）により速度評価キットソフトウェアー（Phar
macia LKB,識別番号BR−1000−19）を用いて行われる。
上に挙げたモノクローナル抗体DSM ACC 2057及びDSM
ACC 2059は、更に４×10-4秒-1未満の解離定数しか有さ
ない。これは、抗体とCK−MBの複合体が非常にゆっくり
にしか再び解離しないことを意味している。このこと
は、例えば、IEMA（イムノエンザイムメトリックアッセ
イ）の如き一定の免疫学的検査方法にとって大切であ
る。というのは、抗体−CK−MB複合体の急速な解離は、
標識抗体の分析物及び固定化抗原への結合の間に競合反
応をもたらし、かくして誤った測定値を生じ得るからで
ある。
ACC 2059は、更に４×10-4秒-1未満の解離定数しか有さ
ない。これは、抗体とCK−MBの複合体が非常にゆっくり
にしか再び解離しないことを意味している。このこと
は、例えば、IEMA（イムノエンザイムメトリックアッセ
イ）の如き一定の免疫学的検査方法にとって大切であ
る。というのは、抗体−CK−MB複合体の急速な解離は、
標識抗体の分析物及び固定化抗原への結合の間に競合反
応をもたらし、かくして誤った測定値を生じ得るからで
ある。
従って、本発明の好ましい主題は、モノクローナル抗
体DSM ACC 2057又はDSM ACC 2059と同等の様式でCK−MB
に結合し、かつ４×10-4秒-1未満の解離定数しか有さな
いCK−MBイソ酵素に対する本発明のモノクローナル抗体
である。本発明のそれらモノクローナル抗体は、更にCK
−MBへの結合について少なくとも１×105モル-1×１×
秒-1の結合定数を有する。
体DSM ACC 2057又はDSM ACC 2059と同等の様式でCK−MB
に結合し、かつ４×10-4秒-1未満の解離定数しか有さな
いCK−MBイソ酵素に対する本発明のモノクローナル抗体
である。本発明のそれらモノクローナル抗体は、更にCK
−MBへの結合について少なくとも１×105モル-1×１×
秒-1の結合定数を有する。
本発明の抗体は、A/Jマウス（Ｈ−2aハプロタイプ）
をCK−MBイソ酵素で免疫感作することにより得ることが
できる。驚いたことに、このマウス種を免疫感作する
と、これのために慣用的に用いられているBa1b/cマウス
よりもかなり高い抗体力価が得られることが明らかにな
った。加えて、免疫感作のために水酸化アルミニウム及
び百日咳菌にCK−MBを吸着させることが、コンフォメー
ションエピトープに対する本発明の抗体を産生させるの
に特に有益であることが分かった。約４ヶ月後に免疫感
作したマウスの脾臓細胞を不死化し、所望の抗体を産生
する不死化細胞をクローン化する。脾臓細胞の不死化は
当業者にとって既知の方法に従って行われる。これら細
胞を好ましくは骨髄腫細胞と融合させる。所望の抗体を
産生する不死化細胞は、その培養上清液のサンプルのCK
−MB、CK−MM又はCK−BBとの反応性を並行して確認する
ことにより同定される。CK−MBのコンフォメーションエ
ピトープに対する所望の抗体は、CK−MBと反応するが、
CK−MMともCK−BBとも実質的に反応しない。実質的に反
応しないという用語は、CK−MM及びCK−BBとの反応性が
低いために、CK−MBを検出するための免疫学的検査にお
いて、生理学的濃度のCK−MM及びCK−BBの存在により生
ずる干渉が１％未満、好ましくは0.1％未満であること
を意味する。この場合、CK−MMとの反応は極微でなけれ
ばならない。というのは、CK−MMは血清又は血漿中に高
濃度で存在するからである。CK−MBは血清又は血漿中に
極めて低濃度でしか存在しないので、これら抗体とこの
イソ酵素との僅かな反応は取るに足らない。適切な不死
化細胞は、慣用的方法により、例えば、蛍光活性化細胞
選別装置による分離によりクローン化される。モノクロ
ーナル抗体DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 21
68と同等の様式でCK−MBに結合する抗体を産生するクロ
ーンを同定するのに、競合検査系を用いる。この目的の
ために、例えば、エンザイムイムノアッセイを用いて、
その抗体がCK−MBへの結合について“Conan MB抗体”
（ATCC HB 8939）とどの程度競合するかを検査する。こ
のために、標識した形の“Conan MB抗体”（ATCC HB 89
39）及び過剰の検査対象の抗体と共にCK−MBをインキュ
ベートする。次いで、生成した複合体を固定化し、液相
からその固体を分離し、そしてその２相のうちの１相中
で結合した標識を測定することにより、検査対象の抗体
が“Conan MB抗体”（ATCC HB 8939）によりその結合か
ら放逐されるかを確認することができる。放逐されない
場合は、CK−MBへの結合は、殆ど間違いなく、モノクロ
ーナル抗体DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 21
68の結合と同等の様式に相当する。
をCK−MBイソ酵素で免疫感作することにより得ることが
できる。驚いたことに、このマウス種を免疫感作する
と、これのために慣用的に用いられているBa1b/cマウス
よりもかなり高い抗体力価が得られることが明らかにな
った。加えて、免疫感作のために水酸化アルミニウム及
び百日咳菌にCK−MBを吸着させることが、コンフォメー
ションエピトープに対する本発明の抗体を産生させるの
に特に有益であることが分かった。約４ヶ月後に免疫感
作したマウスの脾臓細胞を不死化し、所望の抗体を産生
する不死化細胞をクローン化する。脾臓細胞の不死化は
当業者にとって既知の方法に従って行われる。これら細
胞を好ましくは骨髄腫細胞と融合させる。所望の抗体を
産生する不死化細胞は、その培養上清液のサンプルのCK
−MB、CK−MM又はCK−BBとの反応性を並行して確認する
ことにより同定される。CK−MBのコンフォメーションエ
ピトープに対する所望の抗体は、CK−MBと反応するが、
CK−MMともCK−BBとも実質的に反応しない。実質的に反
応しないという用語は、CK−MM及びCK−BBとの反応性が
低いために、CK−MBを検出するための免疫学的検査にお
いて、生理学的濃度のCK−MM及びCK−BBの存在により生
ずる干渉が１％未満、好ましくは0.1％未満であること
を意味する。この場合、CK−MMとの反応は極微でなけれ
ばならない。というのは、CK−MMは血清又は血漿中に高
濃度で存在するからである。CK−MBは血清又は血漿中に
極めて低濃度でしか存在しないので、これら抗体とこの
イソ酵素との僅かな反応は取るに足らない。適切な不死
化細胞は、慣用的方法により、例えば、蛍光活性化細胞
選別装置による分離によりクローン化される。モノクロ
ーナル抗体DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 21
68と同等の様式でCK−MBに結合する抗体を産生するクロ
ーンを同定するのに、競合検査系を用いる。この目的の
ために、例えば、エンザイムイムノアッセイを用いて、
その抗体がCK−MBへの結合について“Conan MB抗体”
（ATCC HB 8939）とどの程度競合するかを検査する。こ
のために、標識した形の“Conan MB抗体”（ATCC HB 89
39）及び過剰の検査対象の抗体と共にCK−MBをインキュ
ベートする。次いで、生成した複合体を固定化し、液相
からその固体を分離し、そしてその２相のうちの１相中
で結合した標識を測定することにより、検査対象の抗体
が“Conan MB抗体”（ATCC HB 8939）によりその結合か
ら放逐されるかを確認することができる。放逐されない
場合は、CK−MBへの結合は、殆ど間違いなく、モノクロ
ーナル抗体DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 21
68の結合と同等の様式に相当する。
CK−MBへの結合について所望の結合定数若しくは解離
定数を有するか又はCK−MBに対する所望の親和性を有す
る抗体を産生するクローンを同定するには、生成した抗
体のCK−MBに対する結合定数、解離定数又は親和性を培
養上清液のサンプル中で測定する。この測定は、好まし
くは、BIAcore システム（Pharmacia LKB,速度評価キ
ット，識別番号BR−1000−19）により行われる。このよ
うにして、ハイブリドーマ細胞系DSM ACC 2059、DSM AC
C 2057、DSM ACC 2058、DSM ACC 2060及びDSM ACC 2168
を得ることが可能になった。
定数を有するか又はCK−MBに対する所望の親和性を有す
る抗体を産生するクローンを同定するには、生成した抗
体のCK−MBに対する結合定数、解離定数又は親和性を培
養上清液のサンプル中で測定する。この測定は、好まし
くは、BIAcore システム（Pharmacia LKB,速度評価キ
ット，識別番号BR−1000−19）により行われる。このよ
うにして、ハイブリドーマ細胞系DSM ACC 2059、DSM AC
C 2057、DSM ACC 2058、DSM ACC 2060及びDSM ACC 2168
を得ることが可能になった。
本発明の特に好ましい主題は、ハイブリドーマ系DSM
ACC 2059、DSM ACC 2057、DSM ACC 2058、DSM ACC 2060
及び／又はDSM ACC 2168のうちの１種から得ることがで
きるモノクローナル抗体並びに前記ハイブリドーマ系で
ある。
ACC 2059、DSM ACC 2057、DSM ACC 2058、DSM ACC 2060
及び／又はDSM ACC 2168のうちの１種から得ることがで
きるモノクローナル抗体並びに前記ハイブリドーマ系で
ある。
加えて、本発明は、CK−MBイソ酵素に結合するが、CK
−MBの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結
合せず、CK−MM及びCK−BBイソ酵素にも実質的に結合せ
ず、CK−MBへのその結合がモノクローナル抗体DSM ACC
2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 2168の結合と同等の様
式で起こるモノクローナル抗体を製造する方法であっ
て、A/Jマウス（Ｈ−2aハプロタイプ）をCK−MBイソ酵
素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免
疫感作し、その免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、
そしてCK−MBに結合するがCK−MMにもCK−BBにも実質的
に結合せず、かつ“Conan MB抗体”（ATCC HB 8939）に
よりCK−MBへの結合から放逐されない抗体を産生する不
死化細胞をクローニングし、そしてそのクローン化細胞
又はそれらの培養上清液から既知の方法によりそのモノ
クローナル抗体を単離することによる方法に関する。
−MBの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結
合せず、CK−MM及びCK−BBイソ酵素にも実質的に結合せ
ず、CK−MBへのその結合がモノクローナル抗体DSM ACC
2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 2168の結合と同等の様
式で起こるモノクローナル抗体を製造する方法であっ
て、A/Jマウス（Ｈ−2aハプロタイプ）をCK−MBイソ酵
素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免
疫感作し、その免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、
そしてCK−MBに結合するがCK−MMにもCK−BBにも実質的
に結合せず、かつ“Conan MB抗体”（ATCC HB 8939）に
よりCK−MBへの結合から放逐されない抗体を産生する不
死化細胞をクローニングし、そしてそのクローン化細胞
又はそれらの培養上清液から既知の方法によりそのモノ
クローナル抗体を単離することによる方法に関する。
本発明の方法の特定の態様では、CK−MBへの結合につ
いて少なくとも１×105モル-1×１×秒-1結合定数又は
４×10-4秒-1未満の解離定数又は少なくとも１×108モ
ル-1×１の親和定数を有する抗体を産生するクローンを
選択する。
いて少なくとも１×105モル-1×１×秒-1結合定数又は
４×10-4秒-1未満の解離定数又は少なくとも１×108モ
ル-1×１の親和定数を有する抗体を産生するクローンを
選択する。
本発明のモノクローナル抗体の助力により、CK−MBの
診断測定のための免疫学的検査操作であってCK−MBに特
異的で異なるエピトープに対して高親和生の２種の抗体
を必要とする操作が可能となる。
診断測定のための免疫学的検査操作であってCK−MBに特
異的で異なるエピトープに対して高親和生の２種の抗体
を必要とする操作が可能となる。
従って、本発明は、更に、診断検査においてCK−MBを
測定するための本発明のモノクローナル抗体の使用に関
する。
測定するための本発明のモノクローナル抗体の使用に関
する。
この測定は、例えば、ELISA、蛍光イムノアッセイ、
電気化学発光イムノアッセイ（WO86/02734、WO87/0670
6、WO92/14138）、ラジオイムノアッセイ、蛍光偏光（p
olarization）イムノアッセイ、CEDIA（Hendersonら,Cl
in.Chem.32（1986）,1637−1641及び米国特許第4,708,9
29号）、IEMA又はEMITの如き全ての慣用的なイムノアッ
セイによって行うことができる。この場合、この検査
は、均一検査、例えば、競合イムノアッセイを経るもの
並びに不均一検査として行うことができる。検査は、好
ましくは、複数の反応パートナーのうちの１種の固定化
で行われる。いわゆるLPIA検査（ラテックス粒子イムノ
アッセイ）による測定が好ましい。このために、CK−MB
の異なるエピトープに対する２種の抗体をまずユニバー
サルストレプトアビジンラテックスマトリックスに結合
させる。次いで、これら結合体をサンプル又はCK−MB標
準物質と共にインキュベートし、その凝集により生ずる
吸光度の増加を測定することにより、CK−MBの測定を行
う。
電気化学発光イムノアッセイ（WO86/02734、WO87/0670
6、WO92/14138）、ラジオイムノアッセイ、蛍光偏光（p
olarization）イムノアッセイ、CEDIA（Hendersonら,Cl
in.Chem.32（1986）,1637−1641及び米国特許第4,708,9
29号）、IEMA又はEMITの如き全ての慣用的なイムノアッ
セイによって行うことができる。この場合、この検査
は、均一検査、例えば、競合イムノアッセイを経るもの
並びに不均一検査として行うことができる。検査は、好
ましくは、複数の反応パートナーのうちの１種の固定化
で行われる。いわゆるLPIA検査（ラテックス粒子イムノ
アッセイ）による測定が好ましい。このために、CK−MB
の異なるエピトープに対する２種の抗体をまずユニバー
サルストレプトアビジンラテックスマトリックスに結合
させる。次いで、これら結合体をサンプル又はCK−MB標
準物質と共にインキュベートし、その凝集により生ずる
吸光度の増加を測定することにより、CK−MBの測定を行
う。
従って、本発明は、均一診断検査でのCK−MBの診断的
検出方法であって、本発明の少なくとも１種の抗体をラ
テックス粒子に結合させ、そしてサンプル溶液と共に、
そして該第１抗体をそのCK−MBへの結合から放逐するこ
となくCK−MBに結合する更なるラテックス結合抗体と共
にインキュベーションした後、該ラテックス結合抗体の
凝集を該サンプル中のCK−MBの濃度の指標として測定す
る方法にも関する。
検出方法であって、本発明の少なくとも１種の抗体をラ
テックス粒子に結合させ、そしてサンプル溶液と共に、
そして該第１抗体をそのCK−MBへの結合から放逐するこ
となくCK−MBに結合する更なるラテックス結合抗体と共
にインキュベーションした後、該ラテックス結合抗体の
凝集を該サンプル中のCK−MBの濃度の指標として測定す
る方法にも関する。
この場合、血清サンプルがサンプル溶液として用いら
れる。原則として、CK−MBと反応するあらゆる抗体、即
ち、クレアチンキナーゼのＢ又はＭサブユニットに対す
る抗体も、ラテックス粒子に結合させる第２抗体として
用いることができる。しかしながら、好ましくは、CK−
MBのコンフォメーションエピトープに対する本発明の高
親和性抗体を第２ラテックス結合抗体として用いる。ハ
イブリドーマ細胞系DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDS
M ACC 2168により産生される抗体がこれら２種のラテッ
クス結合抗体の１種として特に好ましく用いられる。こ
の場合、抗体は完全抗体としてでも機能性抗体断片とし
てでも用いることができる。Fab′断片が好ましく用い
られる。
れる。原則として、CK−MBと反応するあらゆる抗体、即
ち、クレアチンキナーゼのＢ又はＭサブユニットに対す
る抗体も、ラテックス粒子に結合させる第２抗体として
用いることができる。しかしながら、好ましくは、CK−
MBのコンフォメーションエピトープに対する本発明の高
親和性抗体を第２ラテックス結合抗体として用いる。ハ
イブリドーマ細胞系DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDS
M ACC 2168により産生される抗体がこれら２種のラテッ
クス結合抗体の１種として特に好ましく用いられる。こ
の場合、抗体は完全抗体としてでも機能性抗体断片とし
てでも用いることができる。Fab′断片が好ましく用い
られる。
更に、本発明は、CEDIA法による不均一診断検査にお
いてCK−MBを検出する方法であって、本発明の抗体を用
いる方法に関する。このCEDIA法では、２種の成分とし
て存在するβ−ガラクトシダーゼの如き特定の酵素であ
って、そのそれぞれの成分が酵素的に不活性な大きなポ
リペプチド（酵素アクセプターEA）と小さなポリペプチ
ド（酵素ドナーED）である酵素をその検査に用いる。こ
れら成分は、自発的に結合して酵素的に活性なタンパク
質を形成する。ペプチド抗原は、CK−MBの場合にはこの
イソ酵素又はCK−MB特異的エピトープを含有するその断
片であるが、それがEDとEAとの結合を妨害しないように
してEDと結合する。このEDとEAとの結合は、そのペプチ
ド抗原に対する抗体がペプチド抗原−ED複合体に結合す
るときに阻害される。EA、ペプチド抗原−ED複合体、及
びペプチド抗原特異的抗体が存在する試薬溶液中では、
活性な酵素を生成することができない。ペプチド抗原、
又はCK−MB検査の場合におけるCK−MBイソ酵素を含有す
るサンプル溶液の添加後は、CK−MBが、活性なED/EA複
合体が生成するのを可能にする本発明の抗体への結合に
ついてそのペプチド抗原−ED複合体と競合する。かくし
て、測定されるシグナルは、そのサンプル中に存在する
CK−MBイソ酵素の量に比例する。このCEDIA法では、モ
ノクローナル抗体DSM ACC 2057又はDSM ACC 2059と同等
の様式でCK−MBに結合し、かつCK−MBに対して少なくと
も１×108モル-1×１の親和定数を有する抗体がよく適
している。7.0×108モル-1×１の特に高い親和定数を有
するモノクローナル抗体DSM ACC 2059が特に好ましい。
いてCK−MBを検出する方法であって、本発明の抗体を用
いる方法に関する。このCEDIA法では、２種の成分とし
て存在するβ−ガラクトシダーゼの如き特定の酵素であ
って、そのそれぞれの成分が酵素的に不活性な大きなポ
リペプチド（酵素アクセプターEA）と小さなポリペプチ
ド（酵素ドナーED）である酵素をその検査に用いる。こ
れら成分は、自発的に結合して酵素的に活性なタンパク
質を形成する。ペプチド抗原は、CK−MBの場合にはこの
イソ酵素又はCK−MB特異的エピトープを含有するその断
片であるが、それがEDとEAとの結合を妨害しないように
してEDと結合する。このEDとEAとの結合は、そのペプチ
ド抗原に対する抗体がペプチド抗原−ED複合体に結合す
るときに阻害される。EA、ペプチド抗原−ED複合体、及
びペプチド抗原特異的抗体が存在する試薬溶液中では、
活性な酵素を生成することができない。ペプチド抗原、
又はCK−MB検査の場合におけるCK−MBイソ酵素を含有す
るサンプル溶液の添加後は、CK−MBが、活性なED/EA複
合体が生成するのを可能にする本発明の抗体への結合に
ついてそのペプチド抗原−ED複合体と競合する。かくし
て、測定されるシグナルは、そのサンプル中に存在する
CK−MBイソ酵素の量に比例する。このCEDIA法では、モ
ノクローナル抗体DSM ACC 2057又はDSM ACC 2059と同等
の様式でCK−MBに結合し、かつCK−MBに対して少なくと
も１×108モル-1×１の親和定数を有する抗体がよく適
している。7.0×108モル-1×１の特に高い親和定数を有
するモノクローナル抗体DSM ACC 2059が特に好ましい。
本発明は、更に、サンドイッチアッセイによるCK−MB
の診断的検出方法であって、本発明の少なくとも１種の
抗体を固相に結合させ、サンプル溶液と共に、そして該
第１抗体をそのCK−MBへの結合から放逐することなくCK
−MBに結合する更なる標識抗体と共にインキュベートし
て該固相と液相とを分離した後に、該２相のうちの１相
中で該標識を該サンプル中のCK−MBの濃度の指標として
測定する方法に関する。この場合、好ましくは、ハイブ
リドーマ系DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 21
68により産生される抗体が、２種の抗体のうちの１種と
して用いられる。
の診断的検出方法であって、本発明の少なくとも１種の
抗体を固相に結合させ、サンプル溶液と共に、そして該
第１抗体をそのCK−MBへの結合から放逐することなくCK
−MBに結合する更なる標識抗体と共にインキュベートし
て該固相と液相とを分離した後に、該２相のうちの１相
中で該標識を該サンプル中のCK−MBの濃度の指標として
測定する方法に関する。この場合、好ましくは、ハイブ
リドーマ系DSM ACC 2058、DSM ACC 2060又はDSM ACC 21
68により産生される抗体が、２種の抗体のうちの１種と
して用いられる。
第１抗体の固相への固定化は、当業者にとって既知の
方法で達成される。好ましくは、抗体をビオチニル化
し、そしてストレプトアビジンでコーティングした固相
に結合させる。第２抗体は、慣用法で、例えば、酵素、
蛍光性色素若しくは化学発光性色素での直接標識によ
り、又は該第２抗体に向けられかつ適切な方法で標識さ
れた更なる抗体に結合させることにより標識される。
方法で達成される。好ましくは、抗体をビオチニル化
し、そしてストレプトアビジンでコーティングした固相
に結合させる。第２抗体は、慣用法で、例えば、酵素、
蛍光性色素若しくは化学発光性色素での直接標識によ
り、又は該第２抗体に向けられかつ適切な方法で標識さ
れた更なる抗体に結合させることにより標識される。
WO86/02734、WO87−06706又はWO92/14138に記載され
た電気化学発光（ECL）イムノアッセイによる検出も好
ましい。このためには、CK−MBに対する抗体をまず磁性
粒子に結合させる。この結合は、好ましくは、ストレプ
トアビジン及びビオチンにより達成される。ストレプト
アビジンでコーティングされた磁性粒子及びビオチニル
化CK−MB抗体を用いる。本発明のCK−MBに対する第２抗
体は、第１抗体からの異なるエピトープを認識しなけれ
ばならない。この第２抗体を標識にカップリングさせ
る。WO86/02734及びWO87/06706に記載された電気化学発
光性化合物をこの標識として用いる。トリス（ビスピリ
ジル）ルテニウムがこの標識として好ましく用いられ
る。この標識をその抗体に当該技術分野の現状の方法に
従ってカップリングさせる。本発明の２種の抗体とサン
プル及び磁性粒子とのインキュベーションは、同時に行
っても連続的に行ってもよい。WO90/11511に記載された
装置が測定に用いられる。
た電気化学発光（ECL）イムノアッセイによる検出も好
ましい。このためには、CK−MBに対する抗体をまず磁性
粒子に結合させる。この結合は、好ましくは、ストレプ
トアビジン及びビオチンにより達成される。ストレプト
アビジンでコーティングされた磁性粒子及びビオチニル
化CK−MB抗体を用いる。本発明のCK−MBに対する第２抗
体は、第１抗体からの異なるエピトープを認識しなけれ
ばならない。この第２抗体を標識にカップリングさせ
る。WO86/02734及びWO87/06706に記載された電気化学発
光性化合物をこの標識として用いる。トリス（ビスピリ
ジル）ルテニウムがこの標識として好ましく用いられ
る。この標識をその抗体に当該技術分野の現状の方法に
従ってカップリングさせる。本発明の２種の抗体とサン
プル及び磁性粒子とのインキュベーションは、同時に行
っても連続的に行ってもよい。WO90/11511に記載された
装置が測定に用いられる。
このECLイムノアッセイでは、モノクローナル抗体DSM
ACC 2059又はDSM ACC 2057と同等の様式でCK−MBに結
合する第１抗体が好ましく用いられる。第２抗体はもう
１つのエピトープと好ましくはDSM ACC 2058と同等の様
式で結合する。
ACC 2059又はDSM ACC 2057と同等の様式でCK−MBに結
合する第１抗体が好ましく用いられる。第２抗体はもう
１つのエピトープと好ましくはDSM ACC 2058と同等の様
式で結合する。
サンドイッチアッセイでは、両方ともにCK−MBイソ酵
素に結合するがCK−MBイソ酵素の単独のＢサブユニット
にもＭサブユニットにも、そしてCK−MM及びCK−BBイソ
酵素にも結合せず、かつCK−MB上の同じ結合部位につい
て互いに競合しない２種のモノクローナル抗体であっ
て、その少なくとも１種がCK−MBに対して少なくとも１
×108モル-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗
体を用いるのが特に有益であることが分かった。特に好
ましくは、これら抗体のうち少なくとも１種は1.9×105
モル-1×１×秒-1の結合定数を有する。
素に結合するがCK−MBイソ酵素の単独のＢサブユニット
にもＭサブユニットにも、そしてCK−MM及びCK−BBイソ
酵素にも結合せず、かつCK−MB上の同じ結合部位につい
て互いに競合しない２種のモノクローナル抗体であっ
て、その少なくとも１種がCK−MBに対して少なくとも１
×108モル-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗
体を用いるのが特に有益であることが分かった。特に好
ましくは、これら抗体のうち少なくとも１種は1.9×105
モル-1×１×秒-1の結合定数を有する。
本発明の上述のハイブリドーマ細胞系DSM ACC 2059、
DSM ACC 2057、DSM ACC 2058及びDSM ACC 2060は1993年
２月３日に、そしてハイブリドーマ細胞系DSM ACC 2168
は1994年４月19日に、「細胞培養物及び微生物のドイツ
収集所（“Deutsche Sammlung fur Zellkulturen und M
ikroorganismen GmbH",Mascheroder Weg 1b,D−38124 B
raunschebeig）」にブタペスト条約に基づき国際寄託し
た。
DSM ACC 2057、DSM ACC 2058及びDSM ACC 2060は1993年
２月３日に、そしてハイブリドーマ細胞系DSM ACC 2168
は1994年４月19日に、「細胞培養物及び微生物のドイツ
収集所（“Deutsche Sammlung fur Zellkulturen und M
ikroorganismen GmbH",Mascheroder Weg 1b,D−38124 B
raunschebeig）」にブタペスト条約に基づき国際寄託し
た。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例１ CK−MBイソ酵素に対するモノクローナル抗体の産生 ａ）マウスの免疫感作 12週齢A/Jマウスを最初に100μｇのCK−MB（Aalto C
o.Dublin）で腹腔内に免疫感作する。この６週間後に更
に２回の腹腔内免疫感作を１月の間隔を置いて行う。こ
の過程で、各マウスに水酸化アルミニウムに吸着された
100μｇのCK−MB（Paesel Company,Frankfurt）及び109
の百日咳菌（Bordetella pertussis）（Behring Co.Fra
nkfurt）を投与する。続いて２回の最終免疫感作を、融
合の３日前及び２日前に各回についてPBS緩衝液中の100
μｇのCK−MBを用いて静脈内に行う。
o.Dublin）で腹腔内に免疫感作する。この６週間後に更
に２回の腹腔内免疫感作を１月の間隔を置いて行う。こ
の過程で、各マウスに水酸化アルミニウムに吸着された
100μｇのCK−MB（Paesel Company,Frankfurt）及び109
の百日咳菌（Bordetella pertussis）（Behring Co.Fra
nkfurt）を投与する。続いて２回の最終免疫感作を、融
合の３日前及び２日前に各回についてPBS緩衝液中の100
μｇのCK−MBを用いて静脈内に行う。
ｂ）融合及びクローニング ａ）に従って免疫感作したマウスの脾臓細胞をGalfr
e,Methods in Enzymology 73,1981,3に従って骨髄腫細
胞と融合させる。この過程で、免疫感作マウスの約１×
108の脾臓細胞を２×107の骨髄腫細胞（P3×63−Ag8−6
53,ATCC CRL1580）と混合しそして遠心分離する（300g
及び４℃で10分間）。次いて、これら細胞をウシ胎児血
清（FCS）無しのRPMI1640培地で１回洗浄して再び400g
で50ml円錐管中で遠心分離する。上清液を捨て、細胞堆
積物をタッピングにより静かにほぐし、1mlのPEG（分子
量4000,Merck,Darmstadt）を添加し、そしてピペッティ
ングにより混合する。37℃の水浴中で１分してから、FC
S無しの5mlのRPMI1640を室温で４〜５分以内に滴下す
る。その後、10％FCSを含有する5mlのRPMI1640を約１分
以内に滴下し、十分に混合し、培地（RPMI1640＋10％FC
S）で50mlにし、続いて400g及び４℃で10分間遠心分離
する。堆積した細胞を10％FCSを含有するRPMI1640培地
中に取り込み、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地
（RPMI1640＋10％FCS中100mmol/ヒポキサンチン,1μg
/mlアザセリン）中にまく。インターロイキン６（Boehr
inger Mannheim GmbH,カタログ番号1271172,100U/ml）
を増殖因子としてこの培地に添加する。
e,Methods in Enzymology 73,1981,3に従って骨髄腫細
胞と融合させる。この過程で、免疫感作マウスの約１×
108の脾臓細胞を２×107の骨髄腫細胞（P3×63−Ag8−6
53,ATCC CRL1580）と混合しそして遠心分離する（300g
及び４℃で10分間）。次いて、これら細胞をウシ胎児血
清（FCS）無しのRPMI1640培地で１回洗浄して再び400g
で50ml円錐管中で遠心分離する。上清液を捨て、細胞堆
積物をタッピングにより静かにほぐし、1mlのPEG（分子
量4000,Merck,Darmstadt）を添加し、そしてピペッティ
ングにより混合する。37℃の水浴中で１分してから、FC
S無しの5mlのRPMI1640を室温で４〜５分以内に滴下す
る。その後、10％FCSを含有する5mlのRPMI1640を約１分
以内に滴下し、十分に混合し、培地（RPMI1640＋10％FC
S）で50mlにし、続いて400g及び４℃で10分間遠心分離
する。堆積した細胞を10％FCSを含有するRPMI1640培地
中に取り込み、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地
（RPMI1640＋10％FCS中100mmol/ヒポキサンチン,1μg
/mlアザセリン）中にまく。インターロイキン６（Boehr
inger Mannheim GmbH,カタログ番号1271172,100U/ml）
を増殖因子としてこの培地に添加する。
約10日後、一次培養物を特異生抗体合成及び交叉反応
（実施例２を参照のこと）について検査する。イソ酵素
CK−MM及びCK−BBと実質的な交叉反応を示さないCK−MB
陽性一次培養物を、蛍光活性化細胞選別装置により96ウ
ェル細胞培養プレート中にクローン化する。この過程
で、インターロイキン６（Boehringer Mannheim GmbH,
カタログ番号1271172,100U/ml）を増殖添加剤としてこ
の培地に添加する。CK−MBのコンフォメーションエピト
ープに対する抗体を産生するクローン（実施例２に従っ
て確認する）のうち、CK−MBに対して少なくとも９×10
7モル-1×１の親和性を有する抗体（実施例３に従って
確認する）及び／又は“Conan MB抗体”とは異なるエピ
トープを認識する抗体（実施例４に従って確認する）を
有する培養物を選択する。
（実施例２を参照のこと）について検査する。イソ酵素
CK−MM及びCK−BBと実質的な交叉反応を示さないCK−MB
陽性一次培養物を、蛍光活性化細胞選別装置により96ウ
ェル細胞培養プレート中にクローン化する。この過程
で、インターロイキン６（Boehringer Mannheim GmbH,
カタログ番号1271172,100U/ml）を増殖添加剤としてこ
の培地に添加する。CK−MBのコンフォメーションエピト
ープに対する抗体を産生するクローン（実施例２に従っ
て確認する）のうち、CK−MBに対して少なくとも９×10
7モル-1×１の親和性を有する抗体（実施例３に従って
確認する）及び／又は“Conan MB抗体”とは異なるエピ
トープを認識する抗体（実施例４に従って確認する）を
有する培養物を選択する。
ｃ）細胞培養上清液からのイムノグロブリンの単離 得られたハイブリドーマ細胞を、10％FCSを含有するR
PMI1640培地中に１×105細胞/mlの密度でまいて発酵器
（Thermodux Co.,Wertheim/Main,Model MCS−104XL,注
文番号144−050）内で７日間増殖させる。平均で100μ
ｇモノクローナル抗体/mlの濃度がその培養上清液中に
得られる。その培養上清液からのこの抗体の精製を、タ
ンパク質化学における慣用的な方法（例えば、Methods
in Enzymology 121（1986）,587−695に従う方法）によ
り行う。
PMI1640培地中に１×105細胞/mlの密度でまいて発酵器
（Thermodux Co.,Wertheim/Main,Model MCS−104XL,注
文番号144−050）内で７日間増殖させる。平均で100μ
ｇモノクローナル抗体/mlの濃度がその培養上清液中に
得られる。その培養上清液からのこの抗体の精製を、タ
ンパク質化学における慣用的な方法（例えば、Methods
in Enzymology 121（1986）,587−695に従う方法）によ
り行う。
実施例２ 産生した抗体の特異性の確認 ハイブリドーマ細胞の培養上清液中の抗体の特異性を
確認するために、CK−MB、CK−MM及びCK−BBとの反応性
を３つの並行ELISA混合液中で確認する。このために、9
6ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）をまず200μ
／ウェルのサーモ−BSA−ストレプトアビジン（10μg
/mlコーティング緩衝液＝0.2モル／炭酸ナトリウム／
重炭酸ナトリウム,pH9.3〜9.5,Boehringer Mannheim Gm
bH,カタログ番号0726559）でコーティング（震盪しなが
ら室温で１時間インキュベーション）し、0.9％NaCl/0.
05ツィーン20で１回洗浄する。CK−MB、CK−MM及びCK−
BB（Aalto Co.Dublin,カタログ番号10901,10217及び108
03）を並行してＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロン酸
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer
Mannheim GmbH,カタログ番号01008960）で製造業者の
使用説明書に従ってビオチニル化する。これらビオチニ
ル化クレアチンキナーゼイソ酵素を、0.05％ツィーン20
/1％ウシ血清アルブミンを含有するPBS中に250ng/mlの
濃度で吸収させ、ウェル当たり100μを、サーモ−BSA
−ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイ
タープレートに添加し、そして震盪しながら室温で１時
間インキュベートする。続いてそれらを３×0.9％塩化
ナトリウム/0.05％ツィーン20で洗浄する。検査すべき
各抗体溶液100μを、並行実験で、CK−MB、CK−MM又
はCK−BBでコーティングしたウェルに添加し、震盪しな
がら室温で１時間インキュベートする。0.9％塩化ナト
リウム/0.05％ツィーン20で３回洗浄した後、マウス−F
c−γに対するヒツジからのポリクローナル抗体のPOD標
識Fab断片100μ（Boehringer Mannheim GmbH,識別番
号1047523,100mUに相当する）を添加してサンプルから
の結合抗体を検出し、震盪しながら室温で１時間インキ
ュベートし、続いて0.9％塩化ナトリウム/0.05％ツィー
ン20で３回洗浄する。最後に100μ ABTS （Boehring
er Mannheim GmbH,カタログ番号1204521及び1204530）
を各ウェルに添加して、室温で30分した後、450/490nm
における吸光度をDynatech社からのMR700マイクロプレ
ートリーダーで測定する。
確認するために、CK−MB、CK−MM及びCK−BBとの反応性
を３つの並行ELISA混合液中で確認する。このために、9
6ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）をまず200μ
／ウェルのサーモ−BSA−ストレプトアビジン（10μg
/mlコーティング緩衝液＝0.2モル／炭酸ナトリウム／
重炭酸ナトリウム,pH9.3〜9.5,Boehringer Mannheim Gm
bH,カタログ番号0726559）でコーティング（震盪しなが
ら室温で１時間インキュベーション）し、0.9％NaCl/0.
05ツィーン20で１回洗浄する。CK−MB、CK−MM及びCK−
BB（Aalto Co.Dublin,カタログ番号10901,10217及び108
03）を並行してＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロン酸
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer
Mannheim GmbH,カタログ番号01008960）で製造業者の
使用説明書に従ってビオチニル化する。これらビオチニ
ル化クレアチンキナーゼイソ酵素を、0.05％ツィーン20
/1％ウシ血清アルブミンを含有するPBS中に250ng/mlの
濃度で吸収させ、ウェル当たり100μを、サーモ−BSA
−ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイ
タープレートに添加し、そして震盪しながら室温で１時
間インキュベートする。続いてそれらを３×0.9％塩化
ナトリウム/0.05％ツィーン20で洗浄する。検査すべき
各抗体溶液100μを、並行実験で、CK−MB、CK−MM又
はCK−BBでコーティングしたウェルに添加し、震盪しな
がら室温で１時間インキュベートする。0.9％塩化ナト
リウム/0.05％ツィーン20で３回洗浄した後、マウス−F
c−γに対するヒツジからのポリクローナル抗体のPOD標
識Fab断片100μ（Boehringer Mannheim GmbH,識別番
号1047523,100mUに相当する）を添加してサンプルから
の結合抗体を検出し、震盪しながら室温で１時間インキ
ュベートし、続いて0.9％塩化ナトリウム/0.05％ツィー
ン20で３回洗浄する。最後に100μ ABTS （Boehring
er Mannheim GmbH,カタログ番号1204521及び1204530）
を各ウェルに添加して、室温で30分した後、450/490nm
における吸光度をDynatech社からのMR700マイクロプレ
ートリーダーで測定する。
実施例３ 産生した抗体の親和性、結合定数及び解離定数の測定並
びにサンドイッチ適合性の確認 産生した抗体の親和生、結合定数及び解離定数の測定
並びにサンドイッチ適合性の確認を、Pharmacia LKB社
のBIAcore システムに従って行う。この方法では、CK
−MBイソ酵素は共有結合するので、いわゆるセンサーチ
ップの表面層に固定化される。測定すべき抗体の溶液を
流すと、その間に抗体が固定化CK−MBに非共有結合性相
互作用力により結合し、その表面層において嵩比重（ma
ss density）が増加する。この嵩比重の増加は、表面プ
ラズモン共鳴により直接追跡できる。この固定化反応パ
ートナー上に存在する結合部位の数に依存して第３及び
第４反応パートナーを更に付着させることができる。そ
れら結合は、第１反応パートナーの結合と全く同じく速
度及び量に関して観察することができる。
びにサンドイッチ適合性の確認 産生した抗体の親和生、結合定数及び解離定数の測定
並びにサンドイッチ適合性の確認を、Pharmacia LKB社
のBIAcore システムに従って行う。この方法では、CK
−MBイソ酵素は共有結合するので、いわゆるセンサーチ
ップの表面層に固定化される。測定すべき抗体の溶液を
流すと、その間に抗体が固定化CK−MBに非共有結合性相
互作用力により結合し、その表面層において嵩比重（ma
ss density）が増加する。この嵩比重の増加は、表面プ
ラズモン共鳴により直接追跡できる。この固定化反応パ
ートナー上に存在する結合部位の数に依存して第３及び
第４反応パートナーを更に付着させることができる。そ
れら結合は、第１反応パートナーの結合と全く同じく速
度及び量に関して観察することができる。
共有結合したCK−MBを除く全ての反応パートナーは、
CK−MBに損傷を与えることなく簡単な手段により離すこ
とができるので、同じ一次層上で同一の境界条件下で更
に結合実験を行うことができる。
CK−MBに損傷を与えることなく簡単な手段により離すこ
とができるので、同じ一次層上で同一の境界条件下で更
に結合実験を行うことができる。
このセンサーチップの表面層にCK−MBを結合させるに
は、10mmol/ HEPES/3.4mmol/ EDTA/150mmol/ NaC
l/pH7.4中の20μg/mlのCK−MB（Alto,Lot No.20410）の
溶液を、センサーチップ上に２μ／分の流速で流す。
は、10mmol/ HEPES/3.4mmol/ EDTA/150mmol/ NaC
l/pH7.4中の20μg/mlのCK−MB（Alto,Lot No.20410）の
溶液を、センサーチップ上に２μ／分の流速で流す。
続いて以下の抗体を添加して、CK−MBへの結合につい
ての結合定数又は解離定数並びにCK−MBへの抗体の親和
性を製造業者の使用説明書に従ってBIAcore システム
（Pharmacia LKB,ソフトウェアー速度評価キット，識別
番号BR−1000−19）により測定する。本発明の抗体並び
に“Conan MB抗体"ATCC HB 8939及びCK−MBに対する市
販の抗体（Bios PacificのBP172−A2720）について、こ
のようにして測定した値を表１に纏める。
ての結合定数又は解離定数並びにCK−MBへの抗体の親和
性を製造業者の使用説明書に従ってBIAcore システム
（Pharmacia LKB,ソフトウェアー速度評価キット，識別
番号BR−1000−19）により測定する。本発明の抗体並び
に“Conan MB抗体"ATCC HB 8939及びCK−MBに対する市
販の抗体（Bios PacificのBP172−A2720）について、こ
のようにして測定した値を表１に纏める。
同じように、BIAcore システムにより本発明の抗体
のサンドイッチ適合性を確認することが可能である。こ
のために、マウスIgG1に対するポリクローナル抗体又は
マウスFcγに対するポリクローナル抗体をまずセンサー
チップ上に捕捉抗体として固定化する。続いてそれにま
ず検査すべきCK−MBに対する第１抗体を1000共鳴単位の
量まで付着させ、そして依然として遊離の捕捉抗体を、
CK−MBと交叉反応しないイムノグロブリンを流すことに
よりブロックする。CK−MBを含有する溶液を流した後、
平衡になるまでその結合を追跡し、続いて検査すべき潜
在的サンドイッチパートナーを添加してそのサンドイッ
チ複合体の結合を平衡になるまで追跡する。この過程
で、次の表２に列挙した本発明の抗体の組み合わせがCK
−MB検査に適するものであることが明らかになった。DS
M ACC 2057とDSM ACC 2058若しくはDSM ACC 2060との組
み合わせ、又はDSM ACC 2059とDSM ACC 2058若しくはDS
M ACC 2060との組み合わせが特に適していることが分か
った。対照的に、CK−MBに対する従来の標準的抗体（AT
CC HB 8939）では弱いサンドイッチ形成しか認めること
ができなかったので、信頼できる診断検査には不適であ
るとみなさざるを得ない。
のサンドイッチ適合性を確認することが可能である。こ
のために、マウスIgG1に対するポリクローナル抗体又は
マウスFcγに対するポリクローナル抗体をまずセンサー
チップ上に捕捉抗体として固定化する。続いてそれにま
ず検査すべきCK−MBに対する第１抗体を1000共鳴単位の
量まで付着させ、そして依然として遊離の捕捉抗体を、
CK−MBと交叉反応しないイムノグロブリンを流すことに
よりブロックする。CK−MBを含有する溶液を流した後、
平衡になるまでその結合を追跡し、続いて検査すべき潜
在的サンドイッチパートナーを添加してそのサンドイッ
チ複合体の結合を平衡になるまで追跡する。この過程
で、次の表２に列挙した本発明の抗体の組み合わせがCK
−MB検査に適するものであることが明らかになった。DS
M ACC 2057とDSM ACC 2058若しくはDSM ACC 2060との組
み合わせ、又はDSM ACC 2059とDSM ACC 2058若しくはDS
M ACC 2060との組み合わせが特に適していることが分か
った。対照的に、CK−MBに対する従来の標準的抗体（AT
CC HB 8939）では弱いサンドイッチ形成しか認めること
ができなかったので、信頼できる診断検査には不適であ
るとみなさざるを得ない。
モノクローナル抗体DSM ACC 2057及びDSM ACC 2059を
用いて、３種の抗体がCK−MBに結合するトリプレット形
成を次の表３に示した組み合わせで達成することもでき
る。これにより、普通のサンドイッチアッセイと比較し
て感度及び特異性を更に向上できることを意味してい
る。
用いて、３種の抗体がCK−MBに結合するトリプレット形
成を次の表３に示した組み合わせで達成することもでき
る。これにより、普通のサンドイッチアッセイと比較し
て感度及び特異性を更に向上できることを意味してい
る。
実施例４ CK−MBに対する抗体のエピトープ重複部分の確認 競合エンザイムイムノアッセイを行って、本発明の抗
体と抗体とのエピトープ重複部分を確認する。このため
に、CK−MBをまずＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロン
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehring
er Mannheim GmbH,カタログ番号01008960）で製造業者
の使用説明書に従ってビオチニル化する。100μの容
量のPBS中のこのビオチニル化抗原300ngを、ストレプト
アビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート
（EP−A0344578に従って調製したもの）に室温で１時間
インキュベートすることによって結合させる。PBS/0.05
％ツィーン20で３回洗浄した後、それをペルオキシダー
ゼで標識した基準抗体（例えば、DSM ACC 2059）（最終
濃度52mU/ml）及び評価すべき抗体と共に同時にインキ
ュベートする。PBS/0.05％ツィーン20で更に３回洗浄し
た後、それを酵素基質溶液ABTS と共に過ホウ酸ナトリ
ウムを含有する緩衝液中で室温で30分間インキュベート
し、続いて405nmにおける吸光度を、結合したPOD標識モ
ノクローナル抗体の量の指標として測定する。この値を
標識モノクローナル抗体単独でのインキュベーションで
得られる吸光度と比較する。少なくとも50％の競合が標
識抗体の105倍過剰までの評価対象の抗体で検出できた
場合は、エピトープ重複部分が存在する。
体と抗体とのエピトープ重複部分を確認する。このため
に、CK−MBをまずＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロン
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehring
er Mannheim GmbH,カタログ番号01008960）で製造業者
の使用説明書に従ってビオチニル化する。100μの容
量のPBS中のこのビオチニル化抗原300ngを、ストレプト
アビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート
（EP−A0344578に従って調製したもの）に室温で１時間
インキュベートすることによって結合させる。PBS/0.05
％ツィーン20で３回洗浄した後、それをペルオキシダー
ゼで標識した基準抗体（例えば、DSM ACC 2059）（最終
濃度52mU/ml）及び評価すべき抗体と共に同時にインキ
ュベートする。PBS/0.05％ツィーン20で更に３回洗浄し
た後、それを酵素基質溶液ABTS と共に過ホウ酸ナトリ
ウムを含有する緩衝液中で室温で30分間インキュベート
し、続いて405nmにおける吸光度を、結合したPOD標識モ
ノクローナル抗体の量の指標として測定する。この値を
標識モノクローナル抗体単独でのインキュベーションで
得られる吸光度と比較する。少なくとも50％の競合が標
識抗体の105倍過剰までの評価対象の抗体で検出できた
場合は、エピトープ重複部分が存在する。
細胞系DSM ACC 2057及びDSM ACC 2059からの抗体は強
い競合を示したが、このことは、それらがいわゆる“Co
nan抗体”によっても認識される同じエピトープを認識
するか又はそれらに結合することを意味している。細胞
系DSM ACC 2058、DSM ACC 2060及びDSM ACC 2168からの
抗体は、これら他の２種の細胞系（DSM ACC 2057及びDS
M ACC 2059）からの抗体と競合しない。細胞系DSM ACC
2060及びDSM ACC 2168からの２種の抗体を除いて、これ
ら３種の抗体は競合を示さない。抗体DSM ACC 2060及び
DSM ACC 2168は弱い競合を示すので、これら２種のエピ
トープは僅かにオーバーラップしていると結論できる。
従って、これら２種の抗体を例えばサンドイッチ検査に
一緒に用いることは有利ではない。しかしながら、本発
明の他の抗体との組み合わせでは、これら各々の抗体は
非常に都合よく用いることができる。
い競合を示したが、このことは、それらがいわゆる“Co
nan抗体”によっても認識される同じエピトープを認識
するか又はそれらに結合することを意味している。細胞
系DSM ACC 2058、DSM ACC 2060及びDSM ACC 2168からの
抗体は、これら他の２種の細胞系（DSM ACC 2057及びDS
M ACC 2059）からの抗体と競合しない。細胞系DSM ACC
2060及びDSM ACC 2168からの２種の抗体を除いて、これ
ら３種の抗体は競合を示さない。抗体DSM ACC 2060及び
DSM ACC 2168は弱い競合を示すので、これら２種のエピ
トープは僅かにオーバーラップしていると結論できる。
従って、これら２種の抗体を例えばサンドイッチ検査に
一緒に用いることは有利ではない。しかしながら、本発
明の他の抗体との組み合わせでは、これら各々の抗体は
非常に都合よく用いることができる。
実施例５ LPIA検査によるCK−MBの測定 まず、サンドイッチ検査に適する本発明の２種の抗体
を選び（実施例３を参照のこと）、そしてFab′断片をE
P−A0464554の説明に従ってビオチニル化する。
を選び（実施例３を参照のこと）、そしてFab′断片をE
P−A0464554の説明に従ってビオチニル化する。
各場合において、20μのCK−MB標準物質（０、110
及び220ngCK−MB/mlヒト血清）又は分析すべきサンプル
をｔ＝０分で日立717光度計でのサンプルとしてピペッ
ティングする。これに、すぐに330μの試薬１（反応
緩衝液＝50mmol/トリスHCl,pH7.5、75mmol/塩化ナ
トリウム、３％PEG35,000、１％Pluronic F68、0.1％Br
ij35及び0.1％アジ化ナトリウム）をその装置により自
動的にピペッティングする。ｔ＝4.5分で、50μの試
薬２（ラテックス懸濁液;200mmol/グリシン,pH7.5、
２％スクロース、0.5％BSA I（BSA純度レベルＩ、0.1％
アジ化ナトリウム）中の各場合において1.6μｇの抗体/
mlで予めコーティングした0.083％ストレプトアビジン
ラテックス）をその装置により添加する。続いて凝集の
増加を340nm（主波長）及び700nm（副波長）で二色測定
する（測定温度37℃）。ｔ＝5.3分及びｔ＝9.5分の間の
吸光度の差をシグナルパラメーターとして用いる。この
場合、抗体DSM ACC 2059とDSM ACC 2058との組み合わせ
が特に適していることが分かった（342mAの高いダイナ
ミックレンジ（第２測定値とブランク値間の差）並びに
検量線における高い初期増加（2.3mA×ml/ng）に相当す
る）。
及び220ngCK−MB/mlヒト血清）又は分析すべきサンプル
をｔ＝０分で日立717光度計でのサンプルとしてピペッ
ティングする。これに、すぐに330μの試薬１（反応
緩衝液＝50mmol/トリスHCl,pH7.5、75mmol/塩化ナ
トリウム、３％PEG35,000、１％Pluronic F68、0.1％Br
ij35及び0.1％アジ化ナトリウム）をその装置により自
動的にピペッティングする。ｔ＝4.5分で、50μの試
薬２（ラテックス懸濁液;200mmol/グリシン,pH7.5、
２％スクロース、0.5％BSA I（BSA純度レベルＩ、0.1％
アジ化ナトリウム）中の各場合において1.6μｇの抗体/
mlで予めコーティングした0.083％ストレプトアビジン
ラテックス）をその装置により添加する。続いて凝集の
増加を340nm（主波長）及び700nm（副波長）で二色測定
する（測定温度37℃）。ｔ＝5.3分及びｔ＝9.5分の間の
吸光度の差をシグナルパラメーターとして用いる。この
場合、抗体DSM ACC 2059とDSM ACC 2058との組み合わせ
が特に適していることが分かった（342mAの高いダイナ
ミックレンジ（第２測定値とブランク値間の差）並びに
検量線における高い初期増加（2.3mA×ml/ng）に相当す
る）。
実施例６ 電気化学発光法を用いるサンドイッチ検査によるCK−MB
の測定 このECL法は、WO86/02734、WO87/06706及びWO92/1413
8に従って行った。モノクローナル抗体DSM ACC 2059を
当該技術分野の現状の方法に従ってビオチニル化した
（溶液２）。モノクローナル抗体DSM ACC 2058は、DSS
（ジスクシニル基質）（塩化トリス（2,2′−ビピリジ
ル）ルテニウム・６水和物）でルテニル化した（溶液
３）。両方の抗体をCK−MBを含有するサンプルと共に溶
液１中で５分間インキュベートし、続いてストレプトア
ビジンでコーティングした磁性粒子（ドイツのDeutsche
Dynal GmbH CompanyからのDynabeads M−280ストレプ
トアビジン）を添加し（溶液４）、そして再度５分間イ
ンキュベートした。この反応混合液を測定セル内に吸引
することによりこの反応を終結する。合衆国のIgen Com
panyからのOrigen1.0−装置を用いた。この測定チャン
バー内で磁性粒子を磁石により電極上に保持する。残留
反応混合物を吸引して測定チャンバーをアッセイ用緩衝
液（溶液５）で満たす。電圧をかけることにより発光を
刺激する。
の測定 このECL法は、WO86/02734、WO87/06706及びWO92/1413
8に従って行った。モノクローナル抗体DSM ACC 2059を
当該技術分野の現状の方法に従ってビオチニル化した
（溶液２）。モノクローナル抗体DSM ACC 2058は、DSS
（ジスクシニル基質）（塩化トリス（2,2′−ビピリジ
ル）ルテニウム・６水和物）でルテニル化した（溶液
３）。両方の抗体をCK−MBを含有するサンプルと共に溶
液１中で５分間インキュベートし、続いてストレプトア
ビジンでコーティングした磁性粒子（ドイツのDeutsche
Dynal GmbH CompanyからのDynabeads M−280ストレプ
トアビジン）を添加し（溶液４）、そして再度５分間イ
ンキュベートした。この反応混合液を測定セル内に吸引
することによりこの反応を終結する。合衆国のIgen Com
panyからのOrigen1.0−装置を用いた。この測定チャン
バー内で磁性粒子を磁石により電極上に保持する。残留
反応混合物を吸引して測定チャンバーをアッセイ用緩衝
液（溶液５）で満たす。電圧をかけることにより発光を
刺激する。
次の溶液を用いた。
溶液1: インキュベーション緩衝液： 100mMリン酸ナトリウムpH7.0 0.1％BSA 0.1％メチルイソチアゾロン 0.1％安息香酸ナトリウム 溶液2: ビオチニル化MAB DSM ACC 2059 インキュベーション緩衝液中２μg/ml 溶液3: ルテニウム−ビスピリジル標識MAB DSM ACC 2058 インキュベーション緩衝液中２μg/ml 溶液4: 50mM Hepes、0.1％BSA、0.1％Thesit、0.1％クロロアセ
トアミド、0.01％メチルイソチアゾロン,pH7.0中にスト
レプトアビジンでコーティングされた磁性粒子500μg/m
l 溶液5: アッセイ用緩衝液:pH6.8 0.16Mトリス−プロピルアミン、0.2Mリン酸水素二カリ
ウム、0.1％ポリドカノール（Thesit）、0.1％Oxaban
A。
トアミド、0.01％メチルイソチアゾロン,pH7.0中にスト
レプトアビジンでコーティングされた磁性粒子500μg/m
l 溶液5: アッセイ用緩衝液:pH6.8 0.16Mトリス−プロピルアミン、0.2Mリン酸水素二カリ
ウム、0.1％ポリドカノール（Thesit）、0.1％Oxaban
A。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ラング，フリードル ドイツ連邦共和国 ディー―82327 チ ュトツィンク，ヘルツォグスタンドシュ トラーセ ２番地 (72)発明者 ヴォーゲル，ルドルフ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム，アム エッセルスバーグ ７番地 (56)参考文献 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．32［４ ］（1986）Ｐ．657−663 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．32［９ ］（1986）Ｐ．1517−1520 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．32［９ ］（1986）Ｐ．1637−1641 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】均一診断検査において試料中のCK−MBの存
在または量を決定する方法であって、以下の工程： ａ）ラテックス粒子上に固定化されており、CK−MBに特
異的に結合する少なくとも一つの第１モノクローナル抗
体と、CK−MBに特異的に結合するさらなるラテックス結
合第２モノクローナル抗体とに試料を接触させ、ここ
で、前記第２抗体は、前記第１抗体と異なるエピトープ
に結合し、前記第１モノクローナル抗体をそのCK−MBへ
の結合から放逐することはなく、前記第１および第２モ
ノクローナル抗体は、前記CK−MBに結合するが、CK−MB
の個々のＢまたはＭサブユニットに結合せず、実質的に
CK−MMおよびCK−BBに結合しない、 ｂ）前記試料中のCK−MBの量または存在の指標として、
凝集の増加を測定する を含む前記の方法。 - 【請求項２】前記ラテックス結合抗体の一つが、ハイブ
リドーマ系DSM ACC 2058又はDSM ACC 2060により産生さ
れるものである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】液体試料中のCK−MBの存在または量を決定
するサンドイッチイムノアッセイであって、以下の工
程： ａ）固相上に固定化されており、前記CK−MBに特異的に
結合する第１モノクローナル抗体と、標識に結合した第
２モノクローナル抗体とに液体試料を接触させ、ここ
で、前記第２抗体は前記CK−MBに特異的に結合し、前記
第２抗体は、前記第１抗体と異なるエピトープに結合
し、前記第１モノクローナル抗体をそのCK−MBへの結合
から放逐することはなく、前記第１および第２モノクロ
ーナル抗体は、前記CK−MBに結合するが、CK−MBの個々
のＢまたはＭサブユニットに結合せず、実質的にCK−MM
およびCK−BBに結合しない、 ｂ）前記固相および液相を分離し、 ｃ）前記の分離された固相または液相のいずれかに存在
する前記標識を測定し、 ｄ）測定した標識の量を前記液体試料中の前記CK−MBの
存在または量と相関させる を含む前記の方法。 - 【請求項４】前記抗体の少なくとも一つが、ハイブリド
ーマ系DSM ACC 2058又はDSM ACC 2060により産生される
ものである請求項３記載の方法。 - 【請求項５】モノクローナル抗体の少なくとも一つが、
前記CK−MBに対して少なくとも１×108モル-1×１×秒
-1の親和定数を有し、かつ、ハイブリドーマ系DSM ACC
2058又はDSM ACC 2060により産生されるものである請求
項１記載の方法。 - 【請求項６】モノクローナル抗体の少なくとも一つが、
前記CK−MBに対して少なくとも１×108モル-1×１×秒
-1の親和定数を有し、かつ、ハイブリドーマ系DSM ACC
2058又はDSM ACC 2060により産生されるものである請求
項３記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4314254.0 | 1993-04-30 | ||
| DE4314254A DE4314254A1 (de) | 1993-04-30 | 1993-04-30 | Monoklonale Antikörper gegen CK-MB |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08508510A JPH08508510A (ja) | 1996-09-10 |
| JP2774875B2 true JP2774875B2 (ja) | 1998-07-09 |
Family
ID=6486820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6523884A Expired - Fee Related JP2774875B2 (ja) | 1993-04-30 | 1994-04-28 | Ｃｋ−ｍｂに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5817469A (ja) |
| EP (2) | EP1254913A1 (ja) |
| JP (1) | JP2774875B2 (ja) |
| AT (1) | ATE229080T1 (ja) |
| DE (2) | DE4314254A1 (ja) |
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