JPS62157571A - Ｃｋ−ｍｂの免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定された抗体−イソ酵素、複合物の活性を測
定することによる試料中におけるクレアチンキナーゼイ
ソ酵素の測定に関する。より詳細には、結合型および可
溶性抗体を使用して、固定されたクレアチンキナーゼＭ
またはＢサブユニットの実質上完全な免疫阻害を得、続
いて固定奎れたクレアチンキナーゼＢまたはＭサブユニ
ットの酵素活性をそれぞれ測定す゛るものである。

クレアチンキナーゼ（ＣＫ：Ｅ、Ｃ２，７，３，２）の
３種の主要なイソ酵素が認識されている。これらはＭお
よびＢサブユニットからなる二ｍ体である。これら二ｍ
体は２個のＭまたは２（１２ＴのＢサブユニット、また
は１個のＭと１１のＢサブユニットからなるこ−とがで
きる。正常な個体の血液、血清または血漿中に存在する
優勢な二量体はＣＫ−ＭＮイソ酵素であり、他に骨格筋
の通常の分解を反映するものである変動量ではあるが通
常はほんの痕跡量のＣＫ−ＭＢが存在する。ＣＫ−ＢＢ
イソ酵素は正常な人間の血清中に検出しうる量にては通
常存在しないが、脳組織および平滑筋中に相当量存在す
る。ＢＢイソ酵素の増大は転移癌または重症の火傷のよ
うな病的状態においておこりうる。ＣＫ−ＭＢイソ酵素
のレベルが上昇していることは、有意な骨格筋損傷源の
可能性が排除されうる場合は心筋梗塞の臨床的に重要な
指標として用いられてきた。より詳しくは、血清中にお
けるＣＫ−ＪＡＢレベルを反復測定することにより梗塞
の時間的経過および重さが示されうる。それゆえクレア
チンキナーゼのイソ酵素間の区別は臨床的に重要であり
そしてＣＫＮイソ酵素ための迅速で、効率的で、かつ高
度に弁別的な検定法を利用しうろことが必要とされた。

ＣＫＮイソ酵素分析するいくつかの方法が過去−におい
て用いられてきた。それらはイソ酵素を物理的に分離し
続いて固定するか、またはイソ酵素と抗体との間の高度
に選択的な反応のいずれかによるものである。物理的分
離法例えば電気泳動またはカラムクロマトグラフィーは
時間を消費し、相当の熟練を要し、そしてＣＫ−ＭＢレ
ベルの早期変化を監視するに充分な感度を以ってイソ酵
素を適切に解明するための高度に再現性ある分離を行う
ことがしばしば不可能である。

物理的分離法が不都合なことおよびそれら方法がＣＫＮ
イソ酵素明確に解明できないことから免疫化学的方法が
考えられ、この方法はそれらの独特の構造的なまたは免
疫化学的な決定基に基づき複雑な混合物中におけるイソ
酵素間を区別できる。

Ｊｏｃｋｅｒｓ−Ｗｒｅｔｏｕ氏他のｒｃｌｉｎ、　Ｃ
ｈｅｍ、　ＡｃｔａＪ５８、２２３　（１９７５）にお
いてはヒト筋肉組織および脳組織からそれぞれ得られた
結晶ＭＭおよびＢＢイソ酵素によりウサギで誘導された
抗血清を用いる免疫沈澱法が用いられた。この２種の形
態のイソ酵素は測定しうる交差反応を伴うことなく組織
抽出物および血清から定量的に沈澱された。

ＣＫ−ＭＢイソ酵素は両方の血清とある程度まで反応す
るが、いずれとも完全には反応しなかった。

ＣＫ−ＭＭイソ酵素活性は抗ＣＫ−ＭＭ抗体との反応後
には完全に阻害されることも示された。ＣＫ−ＭＢイソ
酵素活”性は抗ＣＫ−ＢＢ抗血清または抗ＣＫ−ＭＭ抗
血清のいずれと反応した場合も８０％まで阻害された。

ＣＫ−ＢＢイソ酵素は抗ＣＫ−ＢＢ抗体への結合によっ
ては完全には阻害されないが、遠心分離により完全に除
去できた。それゆえ、イソ酵素の選択的な免疫沈澱およ
び免疫阻害の組み合せによりそれらの区別ができるが、
この方法は別々の遠心分離および、イソ酵素、特にＣＫ
−ＭＭおよびＣＫ−ＢＢ試料との比較によるＣＫ−ＭＢ
活性の相対的な寄与を測定するには１種以上の活性検定
を必要とした。加えて、ＣＫ−ＭＢ活性の約１０％はこ
の開示された操作では沈澱も阻害もされ得ず、このこと
が酵素サブユニット推計に誤差を生じていた。

米国特許第４，０６７．７７５号にはＭサブユニット活
性を完全に阻害しうる抗体を溶液中で適当な試料と組み
合わせることからなるＣＫ−ＭＢの免疫阻害検定法が開
示されている。混合物をＭサブユニットを実質上または
完全に阻害するに充分な時間反応せしめそして溶液中の
残留酵素活性が測定された。この方法は非沈澱性抗体を
使用、しているので長いインキュベーションおよび遠心
分離を行う必要が回避される点で進歩しており、そして
また付加的な試料処置を行うことな　　゛く溶液中の未
阻害Ｂサブユニットを直接試験できるようにもなってい
る。この方法は速やかでかつ簡単であるが１．しかしＢ
サブユニットは実質的に阻害されないので試料中の狭雑
ＢＢイソ酵素は濃度が重要である場合の誤差源となりう
るという欠点を有する。非定形ＣＫイソ酵素例えばミト
コンドリアまたはマクロＣＫ　　Ｌ型および２型も誤差
源となりうる。アデニル酸キナーゼにより寄与される活
性は通常のＣＫ基質であるホスホクレアヂンを欠く別の
反応媒体中で測定されねばならず、そしてこの活性値は
抗体で処理された反応混合物の活性値から差し引かれね
ばならない。これら種々の要素によりＣＫ−ＭＢ活性の
測定に誤差源が持ち込まれモして狭雑アデニル酸キナー
ゼ活性のブランク値を得るために付加的な対照検定を必
要とする。

米国特許第４，２６０，６７８号にはＣＫ−Ｍサブユニ
ットまたはＣＫ−Ｂサブユニットのいずれかまたはその
両者に対する固定された抗体を用いるＣＸ検定法が開示
されている。結合型サブユニットの活性を阻害しないか
または実質的に変化させない選択された抗体を多孔性ガ
ラスピーズのような担体上に固定させそして次に試料と
反応させ続いて固定された抗体−イソ゛酵素複合物を反
応混合物から分離して担体に結合したサブユニットの酵
素活性を測定した。この方法は抗ＣＫ−Ｍおよび抗ＣＫ
−Ｂ担体の両方を試料と反応させることにより総活性を
測定するのに有用であるし、または担体の一方または他
方を試料と反応させることによりそれぞれのサブユニッ
ト活性を測定するのに有用である。この方法により所望
のイソ酵素をマクロ−〇にのような狭雑形から分離でき
るが、しかしながら各サブユニット型に関連した活性を
測定するには多数の検定を行いその結果を差し引く必要
がある。この手段を用いてはハイブリッド二量体ＣＫ−
ＭＢに関連する活性は測定できない。それゆえ、この方
法は臨床試験室における有用性が限定される。

米国特許第４，３８７，１６０号には所定の試料に対し
３種の別々の抗体製剤および２種の別々の検定法を用い
るＣＫ−ＭＢの検定法が開示されている。

一方の検定法においては、Ｂサブユニット活性に有意に
影響することなくＭサブユニット活性を実質上または完
全に阻害しうる抗Ｃ’に−Ｍ抗体を試料の一部分と合し
そして反応せしめる。この反応中に沈澱が生ずる場合は
、その沈澱はこの反応が経過する間均質に懸蜀されたま
まであろう。この溶液中における残存イソ酵素活性は慣
用の手段により測定される。少くともＣＫ−Ｍサブユニ
ットを含有する試料の第二の部分を抗ＣＫ−Ｍ抗体と反
応させそしてかくして形成された複合物を抗ＣＫ−Ｍ抗
体上の決定基と反応しうる沈澱性の第二の抗体とさらに
反応させる。反応混合物から沈澱を分離しそして恐らく
は上澄み液中に残存するＢサブユニットを表わす残留活
性を慣用の手段により測定する。狭雑Ｂサブユニットを
表わす第２の試料から得られる活性をＭＢおよび挟雑Ｂ
サブユニットを表わす第一の試料の活性から差し引いて
ＭＢ活性を測定する。この検定法は試料中におけるＣＫ
−ＭＢレベルを測定するために免疫阻止法を沈澱法と組
み合せているが処理工程が時間を消費するというかなり
の不都合を有しそして数種の高度に限定さｈた試薬を使
用しなければならない。

終りに、酵素活性ではなく質量濃度を測定するための２
一部位免疫測定手段を用いるサンドイッチ免疫検定法（
米国特許第４，３７６．１１０号参照）が、それ自身固
相に共有により結合したサブユニットの一種に特異的で
あるモノクローナル抗体に結合させることによりすべて
のＭまたはＢを含有するサブユニットを固相に固定させ
ろことによるＣＫ−〜ＩＢの検出に用いられうる。所望
のサブユニットが、そのサブユニソ１−に特異ＦＫＩで
ある標識された第二のモノクローナル抗体と結合させる
ことにより検出される。例えば酵素活性のような標識の
量はもとの試料中の所望のサブユニット濃度の直接の尺
度である。この測定手段は２種の高度に特異的な試薬を
必要とし、そのうちの一方は適当な指示酵素で標識され
ておりかつ酵素標識された第二の抗体と固形支持体との
非特異的様式における相互作用ゆえに誤った正の結果を
生ずる場合が多くなりがちである。この欠点は固宵のＣ
Ｋサブユニット活性を分析して適当な状況の下のＣＫ−
ＭＢレベルを測定することにより克服されうる。

急性心筋梗塞に罹患しているのではないかと疑われる個
体の体液中におけるＣＫ−ＭＢハイブリッド二量体レベ
ルの正確な評価を簡単・に、精密に、かつ経済的に提供
しうる（Ｊ−ＭＢ検出法が必要であった。

本発明の免疫阻害検出法は、 （ａ）　ＣＫ−！ＡＢイソ酵素の含有が疑われる液体試
料を、結合型サブユニットの酵素活性を実質上完全に阻
害できかつ固相に固定されたものである１モル過剰の抗
ＣＫ−Ｍまたは抗ＣＫ−Ｂサブユニット抗体のいずれか
と接触させることに上り第１の反応混合物を形成させる
工程、（ｂ）反応を起こさせてそれによりＭまたはＢサ
ブユニット含有イソ酵素と前記固定された抗体との間に
複合物を形成させる工程、 （ｃ）固相を反応混合物から分離する工程、（ｄ）同相
を、結合型サブユニットの酵素活性を実質上完全に阻害
できかつ前記固定された抗体と同じサブユニット特異性
を有する可溶性抗ｃＫ−Ｍまたは抗ＣＫ−８サブユニッ
ト抗体と接触させることにより第２の反応混合物を形成
させる工程、および （ｅ）固相と結合した阻害されなかったイソ酵素の酵素
活性を測定する工程、 からなる。

本発明の方法は液体試料中のタレアチンキナーゼー晃Ｂ
（（Ｊ−ＭＢ）イソ酵素の酵素活性を迅速で、簡単で、
効率的で、かつ経済的方法で特異的に測定することがで
きる。液体試料には全血、１（狂清、血漿、脳を髄液、
尿、胸膜液およびリンパ液、およびＧＫ−ＭＢイソ酵素
を含有することが疑われる任意の他の生物学的液体が包
含される。

適当な器官系の生検のような重要でありうる個々の物質
はＣＫ−ＭＢイソ酵素の活性を保存する知られた方法に
より抽出されそしてその抽出物か２つの方法により分析
されうる。

本発明の重要な局面は、ＭまたはＢサブユニットとそれ
ぞれ結合でき、かつ結合型サブユニットの活性を実質上
完全に阻害しうる適当な抗ＣＫ−Ｍ抗体または抗ＣＫ−
Ｂ抗体の調整にある。抗ＣＫ昌１または抗ＣＫ−Ｂ活性
阻害性抗体がＣＫ−ＭＢの結合型サブユニットと会合し
たサブユニットの酵素活性に実質上影響しないであろう
ことかもう一つの要件である。　これらの抗体は既知方
法′により得られうる。適当な阻害性抗ＣＫ−Ｍサブユ
ニットは米国特許第４，０６７．７７５号に記載されて
いる。例えば、を推動物、好ましくはヒト起源の骨格筋
組織から得られる結晶ＣＫ−ＭＭ抗原を、その抗原と反
応する循環性抗体の量を増大せしめる適当なスケジュー
ルに従い免疫能のある宿主に接種する。抗原源は猿、チ
ンパンジー、無尾猿および家畜例えば豚、羊、牛、馬、
ロバ、ウサギおよびモルモットのような種々の動物の骨
格筋から選択されうる。ラット、マウスお上び曵のよう
な他の動物ら使用されうる。免疫血清は収穫しそして適
当な活性測定に続き直接使用されうるし、または抗体は
動物免疫面〆：１１かみ既知方法により精製されうる。

精製された抗体は全体として使用されうるし、ま１こは
パパイン、ペプシン等を用いる酵素消化により断片とな
してそれぞれ一価または二価部分抗体を生成させること
ができる。免疫血清から精製された全抗体が好ましい。

あるいはまた、免疫リンパ球を宿主動物から得ることが
できそしてこれらリンパ球をミエローマ細胞のような適
当な不死細胞と融合させると、所望のモノクローナル抗
体を分泌しうるハイブリドーマ細胞を生成しよう。

これらの技術は当業者にはよく知られている。

より完全な記述はＭａｙｅｒ氏他のｒ　Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ；Ｅｎｚｙ
ｍｅｓａｎｄ　ＰｒｏｔｅｉｎｓＪ　Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ出版、Ｌｏｎｄｏｎ。

１９８０年、第５〜１７頁に見られうる。

個々の動物源、抗体アイソタイプ、および全抗体が用い
られるかまたは部分抗体が用いられるかはある基準に合
致する限り本発明方法を実施する場合に限定的なもので
はない。選択された抗体は適当なＣＫサブユニットに結
合できなければならずそして数回の洗浄操作およびイソ
酵素活性測定を通してそれと結合したままでなければな
らない。この要件には少くとも１０６σ１モル、好まし
くは１０’１２１モルそして最も好ましくは１０９Ｑ１
モルの親和定数を有する抗体が最も容易に合致する。こ
れら抗体はまた結合型サブユニットの酵素活性を実質上
完全に阻害することもできなければならない。例えば、
２００Ｕ／ｆ２を含有する代表的な試料においては、抗
体結合後には１００／１２より多い残留サブユニット活
性が残存すべきでなく、そして好ましくは５　　Ｕ／Ｑ
より多くない活性が残存しよう。

適当な固相に抗体を付着させるための固定化操作は注意
深く選択される必要がある。この操作は適当なイソ酵素
サブユニットとの反応において抗体の結合能力および阻
害能力の両方を保存するに充分に緩和であるべきである
が、しかし免疫検定条件に抵抗する安定な生成物を生じ
るべきである。固相への抗体の共有結合は最も安定であ
ることが予期されそして既知方法に従い達成されうる（
例えば、ヨーロッパ特許出願節８８，６９５号、１９８
３年９月１４日公告、公報８３／　３７号参照）。ある
状況の下では、適当な固相の表面上に吸着されるかまた
はイオン的に結合した抗体は反応混合物の変換および洗
浄溶液による除去に対して充分に抵抗性でありうる。抗
ＣＫサブユニット抗体がイソ酵素サブユニットを・結合
および阻害する能力を妨害しないものである蛋白Ａまた
は抗−抗体のような結合性蛋白との抗体の非共有結合が
本発明の免疫検定法に必要な固定された抗体の調整に使
用されうろことも予想される。

抗体が固定される固相は有機または無機であることがで
き、多孔質または非多孔質であることができそして任意
の所望の形状または形態であることができる。固相は密
度、表面積、直径のような物理的性質が個々の検定用途
の必要に合致するように選択された微粒子であることが
できる。高い濃度の付着抗体を必要としそして反応混合
物中の抗原と長期間にわたり最大に接触しなければなら
ない粒子は体積に対する表面積比が大きく、抗体付着に
とって接近しうる反応性の基を有しそしてまた沈降を阻
止するために懸濁媒体のそれに近接した密度を有する粒
子から選択されうる。用いられる微粒子状試薬の体積に
対する表面積の比を高くするために粒子直径が小さいの
が好ましい。あるいはまた、固相は反応混合物を移動さ
せて固相と接触させおよび接触からはずすよう設計され
た手動または自動化システムの仕様書と一致させるため
−に平坦シート、円筒状シャフト、環状ウェファ−１ま
たは長方形または立方体状ブロックのような任意の所望
形態に成形されうる。固相はカラムクロマトグラフィー
または遠心分離のような慣用の操作に使用されるように
選択でき、そして特定の検定形態に適合させるために多
種類の知られた物質から選択−される任意の所望の寸法
、形状、多孔度、きめ、密度および組成のものが用いら
れうる。例えば、ポリスルホンの制御された有孔中空繊
維束または多孔質高密度ポリエチレン棒（Ｔ’ｏｒｅｘ
■　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　　Ｉｎｃ、社、Ｆａｉ
ｒｂｕｒｎ、　Ｇａ、から入手しうる）はいずれも抗体
の固定に好都合に使用できそしてまた受容しうる物理的
性質を提供しよう。

有機固相はホモ−またはへテロ−二官能性試薬と反応し
うる表面官能基例えばエポキシ、アミノ、イミノ、カル
ボキシル、アリール、ハロスルホニル、スルフヒドリル
を有しているべきである。これら二官能性試薬は固相へ
の露出の前または後に所望の抗ＣＫ抗体と反応されうる
。

あるいはまた、有機固相表面上の反応基は天然のまたは
部分的な抗ＣＫサブユニット抗体と制御された様式で直
接反応することもできる。抗体は固相に直接にかまたは
リンカ−基を介して付着しうる。代表的な結合化学は知
られておりそしてｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏ１ｏｇｙＪ第ＸＬＩＶ巻、１９７６年、５ｅｃｔｉｏ
ｎ　■、　Ａ、　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ。

Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ、　Ｍｏ５ｂａｃ
ｈ、　Ｋ、編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ出版、Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ、第１１〜１３３頁に詳細に記載されてい
る。

無機固相には珪酸性物質例えばガラス、シリ由　Ａ−・
、【エノＬ　８岬１Ｃ八開飴ＩしＡｈ＋　Ｍｌ斗１ギ社
−ニッケル、チタン、クロム等の酸化物が包含されうる
。選択された金属酸化物である鉄およびクロムの酸化物
の特別の利点の一つはそれらの磁性により反応混合物か
ら固相が磁気的に分離されうろことにある。これらの磁
性は常磁性および強磁性であることができる。これら固
相のそれぞれは知られた方法により処理されてそれらの
表面が蛋白を結合しうるように被覆されることができる
（例えば米国特許第３，６５２，７６１号参照）。珪酸
性ヒドロキシル基は抗体とアミド、エステル、エーテル
、ジスルフィッドおよびスルホンアミド結合を形成しう
る基を有する種々の試薬によりシラン化されうる。

本発明に使用するのに好ましい固相は米国特許出願第８
４１，１０７号記載の表面安定化された（保護された）
二酸化クロム（Ｃｒｏｗ）粒子である。

保護されたＣｒ０ｗ粒子は下記の性質を有する。

すなわち、 ・低い残留磁気および好ましい表面構造、それにより磁
力による分離／分散ザイクルが反復できる、 ・磁場における速やかな分離、 ・高い捕捉８飛を確保するための高い表面積、・最大の
試薬保存寿命を有するための・高度に安定な粒子。

磁気粒子は不均質免疫検定および対生物親和性分離にお
ける固形支持体として有用であるに充分に加水分解に対
し安定である。粒子の芯はとがったルチル二酸化クロム
である。この物質およびその製法は米国特許第２，９２
３，６８３号、同第４，５２４，００８号および同第３
，５１２．９：（０号に記載されている。二酸化クロム
粒子は表面積５〜１００ｍ”７ｇ、保磁力１００〜７５
０エルステツド、残留磁化５〜４５ｅｍｕ／９および飽
和磁化８〜８５ｅｍｕ／ｇを有する。

これらの粒子は米国特許第３．５１２，９３０号に教示
されるように表面安定化される。安定化された表面層は
平面間格子間隔３１６．８　ｐｍに相当する線を示すそ
のＸ線回折パターンにより特徴づけられる。　　− 二酸化クロム粒子はさらにＳｉＯ２の被膜に−より安定
化される。粒子を被覆する５ｉＯｙの重量は二酸化クロ
ムの重量の約１％以上そして好ましくは２〜６％である
。

次にシリカで被覆された二酸化クロムをさらにシランで
被覆して粒子をさらに安定化さＵかつ蛋白にとっての結
合部位を付与する。シランを用いる無機支持体への抗体
の付着法は米国特許第３，６５２，７６１号および同第
３，９３３，９９７号に記載されている。シランの選択
は蛋白を磁気粒子に結合させる必要により指示され、そ
して多種類のかかる化合物が利用できる。

磁気粒子はシリカで被覆されそしてシラン化された場合
粒度０，５〜５虜および残留磁化８〜２１ｅｍｕを有す
る。これら粒子は初め以下のようにして還元される：品
質改善されたＣｒｙ、粒子２５０ｇを水１．７５Ｑ中電
亜硫酸ナトリウム１００ｇと室温で１時間粉砕する。次
にこの混合物を密閉された貯蔵容器中で約１週間熟成さ
せる。この還元的な表面処理により各強磁性芯の大部分
が非磁性Ｃｒ’　”層に変換され、このものが粒子間の
磁気相互作用を低下させそ°して粒子が磁場に反復露出
されると再分散できるようになる程度まで残磁性を低下
させる。粒子を水で透析して過剰の塩を除去しそして噴
霧乾燥された粉末として貯蔵するかまたは直ちに使用す
る。磁気集合を最小限に抑制するために工程全体にわた
り磁気による分離は回避される。過剰の不可逆的な凝集
を阻止するために遠心分離または濾過も回避される。

芯粒子を再酸化に対し安定化させるために、米国特許第
３．４３７，５０７号公報記載の方法に従いＣｒｏｗに
シリカを付着させる。好ましい態様においては、シリカ
上へのより良好な付着をもたらす少量のアルミナでＣｒ
０ｔを初めに状態調節する。

まださらに好ましいのは５ｉｆｔ層中への少量のＢ、０
３の混入である。好ましい粒子を被覆するのに用いられ
る溶液中におけるＣｒ（Ｌに対するアルミナの重量比は
０．００１〜０．１であり、そして溶液中における５ｉ
ｆｔに対するＢｔＯａの重量比は０．Ｏ１〜０．１２で
ある。より好ましいのはＡ　Ｑ　ｔ　Ｏａ　／　Ｃｒ　
Ｏ２比ｏ、ｏｏｓ〜０．０４、Ｂ、Ｏ，／ＳｉＯ３比０
，１２そしてＳｉｎ、／Ｃｒｏｔ比０１０５〜０．１２
である。前記した比率は溶液中におけるＡ１２ｔＯ，、
Ｂ、０．および５ｉｆｔの重量および被覆される予定の
Ｃｒｙ、粒子の重量を指す。好ましい粒子は以下のよう
にして調整される：水２．５Ｑ中に懸濁された表面還元
されたＣｒＯ２粒子ｔｏｏｇを一定の機械的撹拌を行い
ながら約７０〜９０℃に加熱する。これに４０％アルミ
ン酸ナトリウム（ＮａＡＩ２０ｔ）溶液５６０ｍ１を一
加えそしてこの懸濁液のｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウムを
用いて９．０に調整する。撹拌しながら、メタ珪酸ナト
リウム（ＮａｔＳｉＯ３）２５　ｇおよび硼酸ナトリウ
ム（Ｎａ２Ｂ２０４　’８１１．０）　６．２５９を含
有する試薬１５０　ｍＱを１時間かかって滴下する。こ
の混合物のｐＨは５％硫酸を同時に滴下することにより
９．０に維持される。この混合物を約７０〜９０℃でさ
らに３０分間撹拌して粒子を硬化させろ。５％硫酸を用
いてｐＨを７０に戻し、冷却しそして粒子を水で透析す
る。

表面還元された、シリカ被覆されたＣｒＯ２のシランに
よる被覆は水性系または非水系で実施されうるが、しか
し好ましい方法はシランそれ自身が塩基触媒として用い
られる水相シラン化である。これは３−アミノプロピル
トリエトキシシランのようなアミノ官能基を含有するシ
ランを用いると特にうまく行われる。この反応は２段階
からなり、これらは連続してまたは同時に行われうる。

第１番目は３−アミノプロピルトリエトキシシランの相
当するシラノールへの速やかな加水分解および続く塩基
触媒されｆこ縮合により重合シロキサンを形成させるこ
とである。

第２番目は粒子のヒドロキシル表面上へのシラノールお
よび重合シロキサンの付着および続く共有結合形成であ
る。水１．８ρ中に懸濁された表面還元された、シリカ
被覆された粒子１００ｇを上からの機械的撹拌器を用い
て分散させそして５５°Ｃに加熱する。こ机に３−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン２００戚を加えそしてこ
の懸濁液を約５５℃で１２〜１８時間機械撹拌する。充
分な分散を維持することはこの段階では凝集塊の寸法を
最小限に抑えるために決定的に重要である。あるいはま
た、ボールミルまたはサンドミルシラン化も微細に分散
された粒子の製造に等しく有効である。シラン化された
粒子を室温で充分に水洗する。仕上った粒子はミクロト
ラック（ＭｉｃｒｏｔｒａｃＯ）　［Ｐａｒｔｉｃｌｅ
　５ｉｚｅＡｎａｌｙｚｅｒ　（−Ｌｅｅｄｓ　＆　　
Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｎｏｒ
ｔｈ　１１ａｌｅｓ、ＰＡ）コでの光散乱法により測定
して平均体積直径ｌＯμより下、そして沈降時間２０分
より下である。ｌ　ｃｒｔｔギャップを有する１０００
ガウスの磁場における磁気分離時間は３分以下である。

すべての吸着されたシランを確実に除去するために粒子
を充分に洗いそしてｐＨ７，４のｌ０ｍＭ燐酸塩緩衝液
中の５％懸蜀液として貯蔵する。

本発明の免疫検定法は適当な試薬混合物を抗ＣＫ−Ｍ抗
体または抗ＣＫ−Ｂ抗体が表面に付着された固相と連続
して接触されることにより行われる不均質免疫検定法で
ある。ＣＫイソ酵素の混合物を含有する臨床試料を、結
合を生せしめるに適切な時間にわたり固相と接触させる
。固相を反応混合物からとり出すか、または反応混合物
は反応が起ったのち特定の間隔で固相から除去されるこ
とができる。詳細には、ＣＫ−ＭＢを含有することか疑
われる生物学的試料を抗ＣＫ−ＭまたはＣＫ−８抗体を
担持する固相と接触させて第１の反応混合物を形成させ
る。生物学的試料中の実質上すべてのＣＫ−ＭまたはＣ
Ｋ−８サブユニツトが固定された抗体にそれぞれ結合さ
れることを確実にするためにこの混合物を５〜５０℃、
好ましくは２５〜４０℃で１分〜１時間、好ましくは５
〜３０分間反応せしめる。同相は任意の好都合な手段に
より反応混合物から分離し続いて緩衝液で洗浄して固相
に結合しなかった試料成分および狭雑物を除去すること
ができろ。次に洗浄した固相を固形支持体に結合したそ
れと同じサブユニット特異性を有する可溶性抗ＣＫ　−
ＭまたはＣＫ−Ｂ抗体と接触させて第２の反応混合物を
形成させる。固定されたおよび可溶性の抗ＣＫ抗体は、
それらが適当なＣＫサブユニットを結合できそしてその
酵素活性を実質上完全に阻害しうる限り同一でも異なっ
ていてもよい。可溶性抗体を結金型ＣＫ−ＭＭまたはＣ
Ｋ−ＢＢイソ酵素と反応せしめて残留ＭまたはＢサブユ
ニット活性をそれぞれ阻害する。固相は第２の反応混合
物から分離されうるがしかし分離されねばならないわけ
ではなくそして水または適当な緩衝液で洗浄してすべて
の可溶性抗ＣＫ抗体を除去しうる。これを次にＣＫイソ
酵素活性を測定するための適当な基質と接触させる。基
質は検出しうるシグナルを生ずるように選択されそして
色原体、蛍光原、化学ルミネセンス原等でありうる。検
出しうるシグナルは基質に対するＣＫの作用により直接
生成されることもできるし、またはＣＫイソ酵素の活性
にその活性が依存している他の試薬の作用により間接的
に生成されることもできる。これらの基質試薬は知られ
ておりそして米国特許第４．２６０，６７８号に詳細に
記載されている。

本発明の免疫検定法により実現される利点のうちでは、
生物学的試料中に存在するＣＫ−ＭＢ活性の酵素的測定
を妨害しうる狭雑ＣＫ断片（ミトコンドリアＣＫ等）お
よびその他の酵素例えばアデニル酸キナーゼの除去があ
げられる。また、検定中におけるＣＫ−ＭＭまたはＣＫ
−ＢＢサブユニットからのＣＫ−ＭＢ酵素活性への何ら
かの寄与は抗ＣＫ−Ｍまたは抗ＣＫ−Ｂ免疫阻害性抗体
によりそれぞれ排除される。その結果唯Ｉ種の抗体のみ
しか必要とせず、所定の試料に対し１種活性測定のみし
か要せず、そして免疫沈澱法に典型的に要する長い反応
時間の必要が排除されるより特異的なＣＫ−ＭＢ活性の
免疫阻害検定法が得られる。

以下の実施例により本発明を説明する。

実施例　Ｉ Ａ、抗ＣＫ−Ｍ活性阻害性抗体の磁気粒子への共有結合 ５０頬の組織培養用Ｔ−フラスコ中にスーパー常磁性バ
イオマグ（Ｂｉｏ　Ｍａｇ＠）磁気粒子（Ｆｅ”および
Ｆｅ３”酸化物のシラン化混合物、粒径０，１〜１．５
μ、表面積１００〜１５０ｍ”７ｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ
　Ｍａｇｎｅ−ｔｉｃｓ　　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、社製、ボ
ストン、Ｍａ、）の５％固体懸濁液１０ｍＱを入れそし
てｐＨ７、０の０．０１Ｍ　、に２１１ＰＯ４（結合緩
衝液）４０顧を添加することにより磁気粒子の予備洗浄
を行なう。この懸濁液を１０秒間手で振盪させそしてフ
ラスコを永久磁石上に１０分間装いて液相から粒子を分
離する。この操作を結合緩衝液５０ｍＱを用いてさらに
２回反復して洗浄操作を完了した。

この洗浄した粒子を５％（Ｗ／Ｖ）水性グルタルアルデ
ヒド２０１１Ｑ中に懸濁させそして１０秒間手動により
振盪させそして次にヒユームフード中の振動台上で１時
間振盪させた。粒子分離は前述のようにして行ない、グ
ルタルアルデヒド溶液を捨て、そして粒子を前記したよ
うにして結合緩衝液中で２回洗浄した。次にグルタルア
ルデヒド活性化された粒子を活性阻害性抗ＣＫ−Ｍ抗体
（Ｅ、Ｍ、５ｃｉｅｎｃｅ製、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ニ
ューシャーシー）３．２ｍｇ／ｍＱを含有する結合緩衝
液１０ｚＱ中に懸濁させた。活性化された磁気粒子およ
び抗体の混合物を揺動台上室温で２０分間撹拌した。液
相から磁気粒子を前記したようにして分離しそして上澄
み液を捨てた。ｐＨ８，０の１Ｍグリシン遮断溶液であ
る（５０ｘ＆）を添加して粒子を懸濁させ、そしてこの
＠局液を揺動台上室温で１時間インキュベートして残留
反応括を遮断した。磁気分離したのち遮断溶液を捨てそ
して粒子をｐＨ７，４の０．０１Ｍ　Ｋ２１１ＰＯ，Ｃ
Ｏ，１％ヒト血清アルブミン（ＩＩ　Ｓ　Ａ　）含有）
溶液（洗浄緩衝液）　５０　ｍＱ中に＠３澗さ什、磁気
により分離しモして液相を除去する操作を反復すること
により３回洗浄した。

洗浄した粒子を使用に供するかまたは４℃で貯蔵するた
めに洗浄緩衝液１０ｚＱ中にｇＢさせた。

Ｂ、生物学的試料中のＣＫ−ＭＢ活性の測定プールされ
た正常ヒト血清中および検量用ベース物質中の両方にお
ける試料を調整した。血清または検量用ベースに精製カ
ニクイザル心臓ＣＫ−ＭＢｉｌｌ縮物を添加することに
よりＣＫ−ＭＢ活性レベル０１２５．５０．１２５およ
び２５０単位／Ｑのものを調整した。精製カニクイザル
心臓ＣＫ　−ＭＭ濃縮物または精製ヒト脳ＣＫ　−ＢＢ
ｉａ縮物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｅｈｒｉｎｇ社、
Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）のいずれかを血清に添加
してそれぞれ７００単位／ぐのＣＫ−ＭＭおよび１００
単位／Ｉ２のＣＫ−ＢＢ活性となすことにより（Ｊ−Ｈ
またはＣＫ−ＢＢ含量が高められた試料を調整した。米
国特許第４，２６４，４７１号公報に記載され何らＣＫ
−活性を含有しない混合イオン交換法を用いて血清を脱
脂質（ｄｅｌｉｐｉｆｙ）することにより検量用ベース
物質が得られた。

プールされた正常ヒト血清は２００Ｕ／＋２の天然のＣ
Ｋ−ＭＭ活性を含有していた。ＣＫ値はａｃａｏ分離臨
床分析器（Ｅ、１．ｄｕ　　Ｐｏｎｔ　　ｄｅ　Ｎｅｍ
ｏｕｒｓ　　ａｎｄＣｏｍｐａｎｙ社の登録商標）上で
ＣＫ法を用いて測定した。

適当な試料または対照溶液５００ｄおよび前記Ａ項で調
整された磁気粒子／抗ＣＫ−Ｍ試薬２００成を試験管中
で合しそして混合し、この混合物を３７℃で１０分間イ
ンキュベートせしめることにより検定を行った。各個々
の試験管挿入領域の両側に一連の永久磁石を備えた試験
管ラック中に試験管を１分間挿入し、次に上澄み液をと
り出して捨てた。磁気粒子試薬を前記したようにして洗
浄緩衝液（０，０４５Ｍ燐酸塩、０．００００３９Ｍエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．２Ｍ塩化ナト
リウム、０．０００５６Ｍメルカプトエタノール、ｐＨ
７，０）　Ｉ　ｘ（ｌを用いて２回洗浄した。

粒子を洗浄緩衝液１００ｄ、および２０　ｍｇ　／　ｍ
（１の抗ＣＫ−Ｍ抗体（Ｅ、　Ｍ、　Ｓｃ　１ｅｎｃｅ
）、３７６０／祿の酵母ヘキソースキナーゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉｍＣａｒｐ、）、２２４
ｔｌ／ｉ（２の細菌グリコース−６−燐酸デヒドロゲナ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　−ＭａｎｎｈｅｉｍＣｏ
ｒｐ、）、安定剤および微生物阻害剤を含有する溶液２
５成中に悲劇させた。管を数回穏やかに回転させること
によりこの懸濁液を混合しそして３７℃で５分間インキ
ュベートした。発色試薬３　、４　Ｒ（ｌ　ｌを混合し
ながら管に加えそしてこの混合物を３７℃で１０分間イ
ンキュベートせしメタ。発色試薬はクレアチン燐酸１６
η、クルコース１０１１ｇ、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ”）　５肩９、酢酸マグネシウム
２３ｔｔｔｇ、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）７．　
Ｌａｇ　、アデノシンジ燐酸（ＡＤＰ）９．１η、アデ
ノシンモノ燐酸（ＡＭＰ）６．１肩９、Ｐ＋、Ｐｓ−ジ
アデノシンー５−ジ燐酸（Ａｐ５Ａ）０．０２５ｍｙ、
およびＮ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホ
ン酸（Ａ　ＣＥ　Ｓ　）　５０　、６　ｉｔ９ヲ蒸留水
４．１城に溶解したものからなる。発色試薬のｐＨは６
．８であった。

３分間インキュベーションしたのち、第１番目の１　、
７　ｔｔｔ（１部分をとり出し、氷水浴中に浸漬されか
つ永久磁場にある試験管中に１分間入れた。

−この時間中に大多数の粒子か懸濁液から磁気により分
離された。上澄み液を１　ａｘのキュベツトに移しモし
てキュベツトホルダーがキュベツトの両側に永久磁石を
有するように修正されたＨｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒ
ｄ　Ｍｏｄｅｌ　８４５１Ａ分光光度計中に挿入した。

吸光度を３４０　ｎｍで測定した。

第２の部分をインキュベーション１０分後にとり出しそ
して第１の部分と同じ方法で処理した。　試料の活性は
第１の部分と第２の部分との吸光度差から測定された。

第１表および第２表にそれらのデータを示す。

第　　１　　表 ５０　　ｌｏｔ　　、２０４　１０３ ２５０　３６８　８Ｈ、５２０ ＊正常なヒト血清試料は２００　Ｕ／Ｑ　ＣＫ−ＭＭを
含有。

第　　２　　表 ５０００／ＱのＣＫ−ＭＭ（総ＣＫ−ＭＭ＝　７００　
Ｕ／１２）および１００Ｕ＃！のＣＫ−ＢＢ（ＣＫ−Ｂ
Ｂ＝　２００　Ｕ／り）を補強した血清試料を同じ方法
で処理した。３分間と１０分間の間の吸光度増大はそれ
ぞれ１７ｍＡおよび７ｍＡであった。

各レベルでの試料のミリ吸光単位における差（１０分で
のｍＡ−３分でのｍＡ）であるΔｍＡの計算により、Ｃ
Ｋ−ＭＢ活性の評価についての臨床的に受容されうる標
ω曲線が正常なヒト血清および脱脂質されたヒト血清の
いずれにおいても得られることが示された。この試験の
感度はｌｔｌ／（！のＣＫ−ＭＢにつき約２ｍＡである
。ＣＫ　−Ｍ　ＭまたはＣＫ　−ＢＢイソ酵素を補強さ
れた血清で測定されるように、試料中のＣＫ−ＭＭおよ
びＣＫ−ＢＩ３が総活性に何ら実際上有意な寄与をする
ことはなかった。このようにＣＫ　−Ｍ　ＭおよびＣＫ
−ＢＢ活性が存在しないことは本発明の方法がＣＫ−Ｍ
Ｂ検定における通常の干渉物からのバックグ、ラウンド
シグナルを最小限に抑制するのに特に有効であることを
示している。

実施例　２ 実施例１におけると同様にするが、しかしＢｉｏ　Ｌｇ
■磁気粒子の代りにシラン化された二酸化クロム磁気粒
子（Ｅ、　１．ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ
＆ＣＯ１社製、１１ｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用
して共有結合した活性阻害性抗ＣＫ　−１，１抗体を有
する磁気粒子を調整した。

Ｃｒｙ、の還元的表面処理 品質改善された加熱された二酸化クロム２５０ｇを水１
７５０ｍ１２中で重亜硫酸ナトリウム１００９と混合し
た。この混合物をＷ−２５０Ｖ−Ｂ　Ｖｅｒｔｉｃａｌ
　　Ｂｅ１ｔ−Ｄｒｉｖｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｍｉｌｌ
（Ｇｒｅｅｒｃｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、ｔｌ
ｕｄｓｏｎ、Ｎ、Ｈ，）中で４５分間粉砕しそしてガラ
ス容器中で１週間熟成させた。この粒子を蒸留水で透析
して過剰の重亜硫酸ナトリウムを除去した。クロム酸塩
浸出試験では吸光度０．０３、沈降時間１２分、か得ら
れた。

シリカコーティング 前記で得られた二酸化クロム粒子ｔｏｏｇを３Ｑのビー
カー中に入れそして蒸留水２．５Ｑを加えた。この粒子
を機械により撹拌しながら９０℃±２℃に加熱した。こ
の混合物にアルミン酸ナトリウム（４０％溶液）　５　
、　ＯｍＱを加えそしてこの一懸蜀液のｐＦＩを５％硫
酸の添加によっつに調整した。この混合物にメタ珪酸ナ
トリウム２５ｇおよび硼酸ナトリウム６．２５ｇを含有
する水１５０　ｍ（ｌを１時間かかって滴下した。５％
硫酸の同時滴下によりこの混合物のｐＨを９±０．５に
維持した。

反応の間中はげしい撹拌を維持した。すべての試薬か添
加されたのち、この混合物を９０℃に加熱しそしてさら
に３０分間撹拌し、次に５％硫酸を用いてｐＨを７に調
整しそして室温に冷却せしめた。この粒子を水で透析し
た。クロム酸塩浸出試験では吸光度０．０３、沈降時間
１５分であった。この一部分を乾燥しそして２５℃、８
０℃および夏４０℃に９０分間加熱しそれから試験を行
うと、クロム酸塩浸出試験では表面還元された粒子につ
いての０，３３．０．８３、および２．０に比較してそ
れぞれ０．１．０．２および０．２５なる吸光度が、示
された。

シランコーティング シリカ被覆された二酸化クロム粒子１００９を機械的撹
拌器、還流冷却器および温度センサーを備えた２Ｑの火
室フラスコ中の蒸留水１．８Ｑ中に懸濁させた。アミノ
プロピルトリエトキシシラン２００　ｍ（ｌを加えそし
てこの混合物を５５°Ｃで１８時間撹拌した。この粒子
・を蒸留水１３σを用い沈降およびデカンテーションに
より３回洗浄した。洗浄した粒子を１０ｍＭ燐酸塩緩衝
液（ｐＨ７）中に５０　ｓｇ　／　ｒｈ（ｌで懸濁させ
た。クロム酸塩浸出試験では吸光度０．０２、沈降時間
８分であった。一部分を乾燥しそして２５℃、８０℃お
よび１４０°Ｃで９０分間加熱してから試験すると、ク
ロム酸塩吸光度はそれぞれ０．０５．０２０および０．
２５であった。

試料は実施例ＩＡにおけるようにして精製カニクイザル
心臓ＣＫ−ＭＢ！Ｉ物を検量用ベースに添加することに
より調整された標準物であるか、または個々のヒト血清
標本のどちらかであった。

総ＣＫ値はＤｕ　Ｐｏｎｔ社のａｃａ［Ｆ］分分離臨床
分析器Ｃ演法用いて測定された。電気泳動による測定は
Ｃａｒｄｉｏｔｒａｃ”　ＣＫ操作（Ｃｏｒｎｉｎｇ　
Ｍｅｄｉｃａ１社製、Ｍｅｄｆｉｅｌｄ、　）ＡＡ）に
より行われた。

すべてのインキュベーションおよび分離はそれぞれの試
験管に対する多数の部位を含有する特別に設計された反
応室中でなされた。各部位は遠隔操作されるモーター上
に据えられた試験管保有用カップおよび各保有用カップ
に対し向い合わせの位置にあってフレーム構造中に据え
られた２個の永久磁石からなる。モーターを活動させる
と、カップおよび試験管が、磁気粒子および試験管中に
含有される溶液の、混合物を懸濁させかつ懸濁液中に保
持するに充分なエネルギーを以て回転方向に振動された
。モーターが停止されると、振動性の回転動きが止んで
、それにより磁場の作用により磁気粒子が悲劇溶液から
分離された。反応室の温度は３７℃に制御された。

適当な試料１００ｄおよび磁気粒子−抗ＣＫ−Ｍ阻害性
抗体試薬１００ＪＩＩｌを反応室中の試験管内で混合す
ることにより検定を行った。ミキサーを活動させそして
この混合物を５分間インキュベートせしめた。

モーターを停止させ、懸濁液を分離しそして溶液をとり
出して捨てた。この磁気粒子を洗浄緩衝液（１％八へＥ
ＳＳＯ，１５％ＤＴＥ、　ｐＨ６，８）　５００成を用
い前記したようにして磁気粒子を懸濁さけ、分離し、そ
して上澄み液を吸い出すことにより３回洗浄した。次に
粒子を洗浄緩衝液１２５μＱおよび酵素−抗体試薬溶液
（実施例ＩＢに記載）６成と混合しそして反応室中で撹
拌しながら５分間インキュベートした。発色試薬１２５
ｔｌｆｌｉを管に加えそしてこの混合物をインキュベー
トせしめた。

発色試薬の各Ｉ　ＲＱはグルコース４　ｍｇ、酢酸マグ
ネシウム１０ｚｇ、ｎ−アセチシソスティン５次ｇ、Ｎ
ＡＤ”２＊ｇ、クレアヂン燐酸５　、４　ｍｇ、ＡＤ　
１．Ｏ１９およびＡＣＥＳ４０　ｍｇを含有した。この
発色試薬のｐＨは６．８であった。

３分間インキュベーションしたのち、反応混合物１２０
ｄを水３００成および急冷試薬（Ｔａｎｄｅｍ■−モノ
クローナル免疫酵素測定用Ｑｕｅｎｃｈ　Ｒｅａｇｅｎ
ｔ　ｌ１ｙｂｒｉｔｅｃｈ、　　Ｉｎｃ、　　社製、Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）　６０　ＩＩｆｌを含有する第
２の試験管に移した。この混合物を軽く混ぜ合せそして
Ｍ４７００磁気分離器（Ａｄｖａｎｃｅｄ〜＋ａｇｎｅ
ｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、社製、Ｃａｍｂｒ　ｉｄｇｅ　、
　ＭＡ）に入れた。

磁気粒子を含まない溶液吸光度をＩｆ　ｅ　ｗ　Ｉ　ｅ
　Ｌ　ｔＰａｃｋａｒｄ　８４５１Ａ型分光光度計中３
４０ｎｍおよび４００ｎｍで測定した。

最初の反応混合物の第２の１２０７ｆｆ１部分をインキ
ュベーション−１０分後ノことり出しそして第１の部分
と同じ方法で処理した。

試料の正味７分間の吸光度変化は等式　ｍＡ＝（ｍＡ３
４ｏ　　ｍＡ＋ｏｏ）＋ｏ分　　（ｍＡ３＊ｏ　　ｍＡ
＋ｏｏ）３分により測定された。

一連の標孕物についての検定から得られる結果を第３表
に示す。これらの結果は検定が直線であることを示す。

この試験の感度は約１．５ｍＡ／Ｕ＃！　ＣＫ−ＭＢ　
（傾斜＋１．５４ｍＡ／Ｕ＃２）であった。標準曲線切
片は−２，３ｍＡでありそして１旧関係数は０．９９９
９３であると計算された。

第　　３　　表 ＋０９　　１６５ ２＋９　　３３５ 第４表はそれぞれのヒト血清標本の検定結果を示す。総
ＣＫ値はＤｕ　Ｐｏｎｔ社のａＣａ■分離臨床分析器を
用いＣＫ法により測定された。電気泳動はＣａｒｄｉｏ
ｔｒａｃＴＭＣＫ法（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ
、５ｌｅｄｆｉｅｌｄ。

ＭＡ）により行われた。ＣＫ−ＭＢ活性はミリ吸光度の
差（△、単位＝　ｍＡ）から等式 を用いて計算された。

これらの結果は、本発明の検定法がＣＫ−！ｔｌＢにと
って感度が良くか一つ特異的であること、およびＣＫ−
ＭＢ測測定おける通常の干渉物例えばＣＫ−ＭＭ。

ＣＫ−ＢＢおよび非定形ＣＫ−ＭＭの影響が最小限に抑
制されることを示す。

第　　４　　表 ＩＮ　　　５６　０　　３ ２Ｎ　　１２７　０　　５ ３Ｎ　　　２５　０　　２ ４Ｎ　　２１２　０　　９ ５Ｎ　　　７０　０　　４ ６Ｎ　　３９７　０　　９ ７Ｓ　　２２８　０　　５ ８Ｓ　　１３８　０　　４ ９Ｎ　　１２５　０　　６ １ＯＳ　　１２８　０　　１ １１Ｎ＊＊　　１２５　０　　５ １３Ｓ＊＊＊　　４４　０　　５ １４Ｓ　　　９９　７　１０ １８０　　　　　２３５　　　　　４　　　　．１９１
９＋　　　　　　２３１　　　　　’４　　　　　２３
２０＋　　　　　　１６０　　　　１５　　　　　２０
２１Ｓ　　　　　　８２９　　　　　　６　　　　　２
５２３＋　　　　１３０６　　　　１７　　　　　９６
＊゛Ｎ″　「正常」で健康なヒトの血清試料を示す。

Ｓ″　（心臓以外の）外科手術患者の血清試料を示す。

０“　心臓外科手術患者の血清試料を示す。

＋″　心筋梗塞と診断された患者の血Ｉｎ試料を示す。

＊＊　　５Ｕ＃２のＣＫ−ＢＢおよび５０Ｕ／Ｑの非定
形ＣＫ−ＭＭを含有する試料。

＊＊＊　　脂血性試料 実施例　３ 磁気粒子−抗ＣＫ−Ｍ阻害性抗体試薬、試料、および検
定装置は実施例２におけると同じであった。

第１の試験管中で試料１００ｔｉｌおよび磁気粒子試薬
６０１．Ｉｉを混合することにより検定を行った。イン
キュベーションは５分間行われ、その後に洗浄緩衝液（
５％ＡＣＥＳ、　０．７５％ＮＡＣ，０，１％ナトリウ
ムアジド、ｐＨ６，７５）　９０　Ｊおよび脱イオン水
３６０μＱを加えた。この＠副液を混合し、分離しモし
て液相を捨てた。粒子をさらに２回洗浄した。最後の洗
浄後下記の試薬を連続して加えた。

（１）酵素−抗体試薬（Ｉｆｆ（当り抗ＣＫ−Ｍ抗体８
１ｇ、酵母ヘキソースキナーゼ９０単位、細菌グルコー
ス−６−燐酸デヒドロゲナーゼ５４単位、安定剤および
微生物阻害剤を含有）１５ｍ、（２）洗浄緩衝液（前記
）３０成、 （３）脱イオン水１２０成、および （４）基質試薬（２５ｍＭ　ＡＣＥＳ緩衝液、６ｄジア
デノシン５燐酸、１．５ｍＭ　ＮＡＤ”、１５　ｍＭ　
ＮＡＣ。

２０ｍＭ酢酸マグネンウム、１２ｍＭグルコース、１．
４４ｍＭ　ＡＤＰ、　　１３　ｍＭクレアチン燐酸、５
．４ｍＭＥＤＴＡ、および９０ｍＭ）レバロースを含有
、ｐＨ−６，７５）　Ｉ　ＯＯ／ｉｌ。

この混合物を混ぜ合せながらインキュベートし、そして
一部分をとり、急冷しそして実施例２におけると同様に
して測定した。

この実施例では洗浄工程および試薬添加工［呈遂行にと
ってさらにより効率的な手段を示し、そして基質試薬中
に一ジアデノシン５燐酸を包含させると恐らくはアデニ
ル酸キナーゼからくる干渉が排除されることが示される
。この干渉は溶血した標本中の固形支持体への非特異的
結合によるものであった。この操作により試験された個
々のヒト血清標本の結果および実施例２の結果を第５表
に示す。

第　　５　　表 ｔＮ　　　９　　　　ｇ ３Ｓ　　　Ｉｔ　　　　９゛ ５Ｎ＊＊　　２３　　　３ ６Ｎ＊＊　　２７　　　３ ７ＮＨ１１６ ＊゛Ｎ″は「正常」な人間からの血清を示す。

Ｓ″は外科手術患者からの血清を示す。

０″は心臓外科手術患者からの血清を示す。

＊＊　試料は視認しうる程度に溶血された。

特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）ＣＫ−ＭＢイソ酵素の含有が疑われる液体試
   料を、結合型サブユニットの酵素活性を実 質上完全に阻害できかつ固相に固定された ものである１モル過剰の抗ＣＫ−Ｍまたは抗ＣＫ−Ｂサ
   ブユニット抗体のいずれかと接触させることにより第１
   の反応混合物を形成さ せる工程、 （ｂ）反応を起こさせてそれによりＭまたはＢサブユニ
   ット含有イソ酵素と前記固定された 抗体との間に複合物を形成させる工程、 （ｃ）固相を反応混合物から分離する工程、（ｄ）固相
   を、結合型サブユニットの酵素活性を実質上完全に阻害
   できかつ前記固定され た抗体と同じサブユニット特異性を有する 可溶性抗ＣＫ−Ｍまたは抗ＣＫ−Ｂサブユニット抗体と
   接触させることにより第２の反応混 合物を形成させる工程、および （ｅ）固相と結合した阻害されなかったイソ酵素の酵素
   活性を測定する工程、 からなるＣＫ−ＭＢの免疫阻害検定法。 ２）抗体が前記固相上に共有結合により固定される前記
   特許請求の範囲第１項記載の免疫阻害検定法。 ３）固相が無機性である前記特許請求の範囲第１項記載
   の免疫阻害検定法。 ４）固相が磁性物質である前記特許請求の範囲第３項記
   載の免疫阻害検定法。 ５）固相が表面還元された、シリカ被覆された、シラン
   化されたＣｒＯ＿２である前記特許請求の範囲第３項記
   載の免疫阻害検定法。 ６）固相が有機性である前記特許請求の範囲第１項記載
   の免疫阻害検定法。 ７）固相が抗体と結合を形成しうる基を有する試薬で被
   覆された前記特許請求の範囲第３項記載の免疫阻害検定
   法。 ８）固相がシラン化されている前記特許請求の範囲第３
   項記載の免疫阻害検定法。 ９）固相が工程（Ｃ）において磁気により反応混合物か
   ら分離される前記特許請求の範囲第１項記載の免疫阻害
   検定法。 １０）酵素活性測定がジアデノシン５−燐酸の存在下に
   実施される前記特許請求の範囲第１項記載の免疫阻害検
   定法。 １１）固相がシラン化された二酸化クロムでありかつ固
   相が磁気により反応混合物から分離される前記第１０項
   記載の免疫阻害検定法。