BE1022780B1 - Purification des polysaccharides secretes par s. agalactiae - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne des mutants bactériens, en particulier de Streptococcus agalactiae, qui sécrètent un polysaccharide capsulaire et des procédés de purification des polysaccharides capsulaires bactériens sécrétés à partir du milieu de culture. Les polysaccharides extraits sont utiles pour produire des vaccins comprenant les polysaccharides seuls ou conjugués à des protéines.

Description

PURIFICATION DES POLYSACCHARIDES SECRETES PAR S. AGALACTIAE Domaine de l'invention

Cette invention concerne des mutants bactériens, en particulier de Streptococcus agalactiae, qui secrétent un polysaccharide capsulaire et des procédés de purification des polysaccharides capsulaires bactériens sécrétés à partir du milieu de culture. Les polysaccharides extraits sont utiles pour produire des vaccins comprenant les polysaccharides seuls ou conjugués à des protéines.

Contexte de l’invention

Au cours de ces 25 dernières années, des vaccins conjugués, comprenant des polysaccharides capsulaires bactériens (cps) conjugués à des protéines porteuses ont été développés. Les polysaccharides capsulaires sont des immunogènes importants que l'on trouve à la surface de bactéries impliquées dans diverses maladies bactériennes. Cette caractéristique les a conduits à devenir un composant important dans la conception des vaccins. Les saccharides étant des antigènes T-indépendants, généralement les cps sont peu immunogènes. La conjugaison à une protéine porteuse peut convertir des antigènes T-indépendants en antigènes T-dépendants, améliorant ainsi les réponses « mémoire » et permettant à une immunité protectrice de se développer.

Par conséquent, les vaccins saccharidiques les plus efficaces se basent sur des glycoconjugués. Des exemples comprennent, entre autres, le vaccin conjugué contre Haemophilus influenzae type b (Hib), les vaccins conjugués contre Streptococcus pneumoniae et Neisseria meningitidis de sérotype C (MenC). Une autre bactérie pour laquelle des vaccins conjugués ont été décrits est Streptococcus agalactiae, également connue sous le nom de « Streptococcus de Groupe B », ou simplement « GBS ». Le « B » dans « GBS » fait référence à la classification de Lancefield qui se base sur l'antigénicité d'un glucide, dit « glucide C », qui est soluble dans l'acide dilué. Lancefield a identifié 13 types de glucide C (désignés de A à 0) qui ont pu être différenciés sérologiquement. Les organismes qui infectent l'homme le plus souvent appartiennent aux groupes A, B, D, et G. Dans le groupe B, les souches de Streptococcus agalactiae ont été subdivisées en 10 sérotypes (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII and IX) en fonction de la structure de leur polysaccharide capsulaire. ,

Streptococcus agalactiae de groupe B provoque des maladies graves, dont la bactériémie et la méningite chez les individus immunodéprimés et les nouveau-nés. Il existe deux principaux types d'infections à GBS chez le nouveau-né : la maladie d'apparition précoce qui survient dans les 5 jours après la naissance et se manifeste par une bactériémie (septicémie ou infection du sang) et une pneumonie (infection des poumons) et la maladie d'apparition tardive qui survient entre une semaine et environ trois mois après la naissance et se caractérise généralement par une méningite (infection du liquide et des enveloppes du cerveau) bien qu'une bactériémie et une pneumonie puissent également apparaître. Le GBS colonise le vagin d'environ 25 % des jeunes femmes et se contracte verticalement lorsque le bébé traverse la filière pelvi-génitale. Chez les mères colonisées, environ 1 % des bébés nés par voie vaginale seront infectés à un taux de mortalité entre 50 et 70 %.

Des investigations ont été menées sur le développement de vaccins contre GBS à base de protéines et à base de polysaccharides. Il a été démontré que les conjugués de chacun des polysaccharides capsulaires provenant de GBS des sérotypes la, Ib, II, III, et V sont sans danger et immunogènes chez l'homme. Par exemple, il a été démontré que la vaccination de femmes enceintes avec un cps de type III réduit l'incidence de la méningite d'apparition tardive - les nourrissons acquièrent des anticorps protecteurs par transfert placentaire et sont immunisés passivement.

La production à grande échelle de vaccins à polysaccharides capsulaires exige des provisions adéquates de polysaccharides capsulaires purifiés. Des procédés d'isolement des polysaccharides capsulaires à partir de cellules bactériennes existent dans l'état de la technique. Par exemple EP0038265 décrit un procédé de préparation de polysaccharides antigéniques qui comprend la phénolisation du bouillon de fermentation pour lyser les bactéries et libérer le polysaccharide dans le bouillon de fermentation. EP0302887 décrit l'extraction d'un polysaccharide de GBS de type III par la technique générale de Jennings et al. (Canadian J. Biochem. 58:112-120 (1980)). EP1664319 décrit un procédé de production d'un polysaccharide qui comprend : a) l'utilisation d'un détergent cationique pour précipiter le polysaccharide ou une partie des contaminants à partir du surnageant pour obtenir une première fraction polysaccharidique ; b) l'utilisation d'un alcool pour précipiter le polysaccharide à partir de la première fraction polysaccharidique et obtenir une seconde fraction polysaccharidique ; c) la soumission de la seconde fraction polysaccharidique à précipitation par ajout d'un alcool en présence d'un détergent anionique, de façon que l'alcool soit présent à une concentration qui est inférieure à la concentration à laquelle le polysaccharide précipite ; d) la précipitation du polysaccharide à partir de la fraction soluble par ajout d'un alcool pour obtenir un précipité polysaccharidique ; e) la dissolution du précipité polysaccharidique et sa soumission à concentration et diafiltration. EP1828230 décrit un procédé pour l'expression hétérologue et la sécrétion de polysaccharides complexes chez des bactéries non pathogènes, non invasives à Gram positif. EP1951887 et EP2004223 concernent de nouvelles souches de Staphylococcus aureus qui produisent un polysaccharide capsulaire de type 5 à des niveaux plus élevés que les bactéries de type sauvage. EP1051506 décrit un procédé de purification de polysaccharides capsulaires à partir de composants cellulaires et de surnageants de culture. Le procédé utilise un traitement alcalin pour lyser les bactéries mais celui-ci provoque également l'hydrolyse de la liaison labile basique qui relie le polysaccharide capsulaire aux composants cellulaires et désacétyle également les groupes N-acétyle.

Cependant, les procédés ci-dessus exigent de nombreuses étapes de purification, rendues plus complexes encore par l'adhérence du polysaccharide capsulaire à la paroi cellulaire. L'objet de l'invention est par conséquent de proposer des procédés de production de polysaccharides capsulaires améliorés n'ayant pas besoin de lyse bactérienne ou de traitement enzymatique pour libérer le polysaccharide, simplifiant ainsi la purification et augmentant le rendement. Résumé de 1'invention

Les inventeurs proposent un procédé de production simplifié qui permet d'obtenir un polysaccharide capsulaire à partir du milieu de culture en des quantités significativement supérieures à celles pouvant être obtenues antérieurement. En extrayant le polysaccharide capsulaire du milieu de culture, le procédé évite la nécessité d'inactiver et de lyser les bactéries, réduisant ainsi la complexité du procédé et le laps de temps requis. De manière avantageuse, les mutants CpsA et CpsD manifestent une virulence réduite de sorte que les risques associés à la manipulation des bactéries sont réduits.

De manière similaire, le fait d'éviter de recourir à une extraction basique a pour résultats d'augmenter la sécurité de l'opérateur tout en conservant l'immunogénicité des polysaccharides extraits dans la mesure où le procédé évite la désacétylation des groupes N-acétyle.

Par conséquent, selon un premier aspect de l'invention, il est proposé un procédé de production d'un polysaccharide capsulaire à partir de Streptococcus agalactiae comprenant : la culture dans un milieu de culture convenable d'un mutant CpsA ou CpsD et la récupération du polysaccharide à partir du milieu de culture. Les mutants CpsA et CpsD selon la présente invention présentent une sécrétion accrue du polysaccharide capsulaire comparée à la souche de type sauvage.

Dans un second aspect selon l'invention, il est proposé un polysaccharide isolé à partir de Streptococcus agalactiae dans lequel le polysaccharide a un poids moléculaire, en particulier un poids moléculaire moyen, supérieur à 800 kDa, supérieur à 900 kDa, supérieur à 1000 kDa, supérieur à 1100 kDa, supérieur à 1200 kDa, supérieur à 1300 kDa, supérieur à 1400 kDa, supérieur à 1500 kDa, supérieur à 1600 kDa, d'environ 1700 kDa, en particulier d'environ 1758 kDa ou dans toute plage intermédiaire.

Brève description des Figures

Figure 1 : Transfert sur membrane par la méthode « Dot blot » avec l'anticorps monoclonal anti-polysaccharide capsulaire la du polysaccharide capsulaire sécrété. Les mutants CpsA ont sécrété des quantités significativement supérieures de polysaccharide comparativement aux bactéries de type sauvage (souche 515).

Figure 2 : Les mutants CpsA ont significativement moins de polysaccharide capsulaire adhérant à la surface de la cellule bactérienne comparativement aux bactéries de type sauvage (souche 515).

Figure 3 : Les mutants CpsA sécrètent des quantités significativement supérieures de polysaccharide capsulaire ayant une plus large plage de tailles (kDa).

Figure 4 : Transfert sur membrane par la méthode « Dot blot » avec l'anticorps monoclonal anti-polysaccharide capsulaire la du polysaccharide capsulaire sécrété. Les mutants CpsD ont sécrété des quantités significativement supérieures de polysaccharide comparativement aux bactéries de type sauvage (souche 515). Parmi les mutants donnés en exemples, K49 et ΔΡ-tyr ont sécrété des quantités supérieures à la fois par rapport au type sauvage et à ACpsD. Par conséquent, les mutations préférées sont celles survenant sur le site actif de l'autokinase.

Figure 5 : Les mutants CpsD sécrètent des quantités significativement supérieures de polysaccharide capsulaire ayant une taille supérieure à celle des polysaccharides capsulaires sécrétés par la souche de type sauvage 515 (kDa).

Description détaillée de 1'invention

En introduisant des mutations dans la séquence du polynucléotide et/ou de la protéine CpsA ou CpsD, les présents inventeurs ont découvert de manière surprenante que ces bactéries produisent des quantités supérieures de polysaccharide capsulaire et que le polysaccharide capsulaire est sécrété dans le milieu de culture.

Les souches recombinées de Streptococcus agalactiae sécrètent une quantité de polysaccharide capsulaire, en mg/1, déterminée par les procédés décrits dans les Exemples, qui est supérieure à celle sécrétée par la souche de type sauvage cultivée dans les mêmes conditions de culture. En particulier, ces mutants présentent un accroissement du niveau ou de la quantité de polysaccharide capsulaire sécrété dans le milieu de culture. En particulier, la quantité ou le niveau est au moins de 10 pour cent, au moins de 20 pour cent, au moins de 30 pour cent, au moins de 40 pour cent, au moins de 50 pour cent, au moins de 60 pour cent, au moins de 70 pour cent, au moins de 80 pour cent, au moins de 90 pour cent, au moins de 100 pour cent ou plus supérieur à celui d'une cellule de type sauvage du même sérotype. Plus particulièrement encore, ces mutants présentent une quantité réduite de polysaccharide capsulaire adhérant à la paroi cellulaire, en particulier, une quantité ou un niveau de 10 pour cent, 20 pour cent, 30 pour cent, 40 pour cent, 50 pour cent, 60 pour cent, 70 pour cent ou 80 pour cent inférieur à celui d'une cellule de type sauvage du même sérotype.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « polysaccharide capsulaire » est destiné à désigner les polysaccharides capsulaires de Streptococcus agalactiae. Dans le GBS, un des facteurs de virulence les plus importants est le polysaccharide capsulaire. A ce jour, dix sérotypes du polysaccharide capsulaire ont été découverts : Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII et IX.

Saccharides capsulaires

Le saccharide capsulaire de Streptococcus agalactiae est lié par covalence au squelette peptidoglycane du GBS, et est distinct de l'antigène de groupe B, qui est un autre saccharide lié au squelette peptidoglycane. Les saccharides capsulaires du GBS sont chimiquement apparentés, mais sont très différents du point de vue antigénique. Tous les polysaccharides capsulaires du GBS partagent le « core » trisaccharidique suivant : B-D-GlcpNAc ( 1-3 ) ß-D-Galp ( 1-4 ) ß-D-Glcp

Les divers sérotypes du GBS diffèrent par la façon dont ce « core' est modifié. La différence entre les sérotypes la et III, par exemple, provient de l'utilisation soit de GlcNAc (la), soit de Gal (III) dans ce « core » pour lier les « cores » trisaccharidiques consécutifs. Les sérotypes la et Ib ont tous deux un disaccharide [a D NeupNAc (2->3 ) ß D Galp (1-»] lié à GlcNAc dans le « core », mais la liaison est soit l->4 (la), soit l-»3 (Ib) . Les maladies associées au GBS sont principalement provoquées par les sérotypes la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, et VIII, plus de 85 % d'entre elles étant provoquées par cinq sérotypes : la, Ib, II, III & V. L'invention concerne préférablement un saccharide provenant de l’un ou de plusieurs de ces cinq sérotypes, en particulier de l'un ou de plusieurs des sérotypes II et V. Les saccharides capsulaires comprennent généralement : (a) un résidu acide N- acétyl-neuraminique (NeuNAc) terminal (couramment appelé « acide sialique ») , qui dans tous les cas est lié 2->3 à un résidu galactose ; et (b) un résidu N-acétyl-glucosamine (GlcNAc) au sein du « core » trisaccharidique.

Quand le saccharide du GBS a été purifié par extraction basique, la O-acétylation est typiquement perdue. En particulier, les polysaccharides capsulaires extraits par les procédés selon l'invention sont entièrement O-acétylés et/ou N-acétylés et ne sont pas désacétylés (ni partiellement, ni entièrement). L'effet de la désacétylation etc. peut être évalué par des dosages de routine.

En particulier, le degré d'oxydation de l’acide sialique du polysaccharide capsulaire du GBS n'est pas inférieur à 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % et en particulier la teneur en acide N-acétyl- neuraminique (NeuNAc ou acide sialique) du polysaccharide capsulaire du GBS de sérotype V est supérieure à 50 %, supérieure à 60 %, supérieure à 70 %, supérieure à 75 %, supérieure à 80 %, supérieure à 85 %, supérieure à 90 %, supérieure à 95 %, comparée à celle du polysaccharide natif dans lequel la teneur en NeuNAc est considérée comme étant d'environ 100 %. En particulier, le polysaccharide du GBS est un polysaccharide entièrement sialylé ou « natif », par exemple, ayant une teneur en acide sialique d'environ 100 %, 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, d'environ 90 % (ou toute plage entre ces valeurs) comparativement au polysaccharide du GBS natif.

Le saccharide purifié selon l'invention peut être plus court ou plus long que le polysaccharide du GBS à l'état naturel ou isolé à partir d'une bactérie de type sauvage. Les polysaccharides plus longs peuvent être dépolymérisés pour obtenir des fragments plus courts p. ex. par hydrolyse dans un acide doux, par chauffage, par chromatographie d'exclusion de taille, etc.

CpsA

Un exemple de séquence d'acides aminés de CpsA pleine longueur comprend la séquence déposée sous le numéro d'accès Uniprot Q9RPC7 ayant la séquence d'acides aminés suivantes (SEQ ID NO : 2) :

MSNHSRRQQKKHSHTPLRVINLFLLVIFILLSWSLFLMYRHHFLAFRHLNVIYGWIV

LIILASLFLCIKNKARIFTTIILVLASIFVATTLYGFKSTIDLTNNLNKTASYSEIEMSVIVP

KDSKITNIEAVSKLAAPVKNDTSNITDLIEHIKSEKGISITPQKTDSYQDAYNRIKNGDS

QAMVLNNAYVSLIELSTPDFKSQIKTIYTYKIKKKINRKNTNHKEGVFNIYISGIDTFGSI

STVSRSDVNIIMTVNTNTHKVLLTTTPRDAYVKIPDGGGNQYDKLTHAGLYGVETSM

KTLENLYDINLDYYARINFSSFLKLIDLLGGVTVYNDQAFTSKHGNFDFPVGQVTLNS

EQALGFVRERYSLQGGDNDRGRNQEKVIAAIINKLASSQSVTKLNSITSQLQTSVQT

NMTIDNINDLINNQLSTGQRFTVESQALTGHGSTGELPSYAMPGAQLYMMSIDQSSL SNAKSKIKNTMEE-

Dans certains modes de réalisation, la présente invention se base sur la mutation du gène CpsA par délétion dans le cadre de lecture ou autres mutations telles que des substitutions. Une délétion dans le cadre de lecture du gène CpsA peut comprendre toute troncature d'une partie quelconque du gène CpsA. Les délétions dans le cadre de lecture selon la présente invention comprennent les délétions qui éliminent un segment de la séquence codant pour la protéine, tout en conservant le cadre de lecture adéquat après la délétion. Certains modes de réalisation selon la présente invention peuvent inclure des délétions qui sont des « délétions propres » à savoir, qui ne contiennent pas de séquences d'ADN exogènes insérées dans le gène ou une délétion dans le cadre de lecture du gène CpsA peut comprendre une élimination à une position quelconque de 1 à 485 acides aminés. Les inventeurs ont ainsi identifié des résidus au sein de SEQ ID NO : 2 qui peuvent être modifiés pour altérer l'activité de CpsA de façon à ce que l'adhérence du polysaccharide capsulaire à la paroi cellulaire soit réduite tandis que la sécrétion ou la libération du polysaccharide capsulaire dans l'environnement externe, par exemple, dans le milieu de culture est augmentée. De plus, la mutation de ces résidus peut être combinée à d'autres modifications telles que des délétions.

Les mutants CpsA comprennent une mutation dans la séquence polynucléotidique (SEQ ID NO : 1) qui code pour la séquence polypeptidique du CpsA exposée dans SEQ ID NO : 2, la mutation ayant pour résultat une sécrétion accrue du polysaccharide capsulaire dans le milieu de culture. En particulier la mutation est choisie dans le groupe constitué par une délétion dans le cadre de lecture, une mutation ponctuelle telle qu'une substitution, une délétion, et une insertion.

Dans certains modes de réalisation, la mutation entraîne la délétion de la séquence polynucléotidique qui code pour tout le polypeptide CpsA. Dans d'autres modes de réalisation, la mutation comprend une délétion, dans laquelle la protéine correspondant à la mutation par délétion est privée d'au moins 2 acides aminés. Plus particulièrement, la mutation comprend une délétion d'une partie de la séquence polynucléotidique qui code pour la région LytR et/ou PFAM du polypeptide CpsA. Le domaine LytR peut comprendre les acides aminés 236 à 458 de SEQ ID NO : 2, en particulier les acides aminés 248 à 395 de SEQ ID NO : 2, en particulier le domaine LytR peut être constitué par SEQ ID NO : 40. La région ou le domaine PFAM du polypeptide CpsA peut comprendre ou être constitué par les acides aminés 72 à 187 de SEQ ID NO : 2, en particulier le domaine PFAM peut comprendre ou être constitué par SEQ ID NO : 41. Dans certains modes de réalisation, le gène CpsA comprend une mutation ponctuelle, en particulier une mutation ponctuelle d'un ou de plusieurs des résidus suivants, numérotés selon la protéine CpsA de SEQ ID NO : 2, qui provoque la perte ou la réduction de l'activité CpsA et un accroissement de la sécrétion du polysaccharide capsulaire : D238, R248, D250, K263, R271, R366, R368, R271, D375, R378, Q382, T437 et E439. Plus particulièrement encore, le gène CpsA comprend une ou plusieurs mutations ponctuelles choisies dans le groupe constitué par D238, R248, R271 et R366 numérotées selon la protéine CpsA de SEQ ID NO : 2. Sans vouloir être lié par une théorie, les inventeurs pensent que ces résidus, qui sont généralement conservés, peuvent être pertinents pour la liaison au substrat et/ou la reconnaissance du substrat.

Les polysaccharides capsulaires produits par Streptococcus agalactiae de type sauvage ont un poids moléculaire d'environ 367 kDa. Les polysaccharides capsulaires sécrétés par les mutants CpsA décrits ici ont un poids moléculaire supérieur à 800 kDa.

Par conséquent, l'invention concerne également un polysaccharide capsulaire purifié ayant un poids moléculaire, en particulier un poids moléculaire moyen, supérieur à 800 kDa, supérieur à 900 kDa, supérieur à 1000 kDa, supérieur à 1100 kDa, supérieur à 1200 kDa, supérieur à 1300 kDa, supérieur à 1400 kDa, supérieur à 1500 kDa, supérieur à 1600 kDa, d'environ 1700 kDa, en particulier d'environ 1758 kDa ou dans toute plage intermédiaire. L'analyse des mutants CpsA a révélé qu'une partie du polysaccharide capsulaire adhère à la paroi - de la cellule bactérienne, à savoir qu'il n'est pas totalement sécrété. L'analyse de ce polysaccharide capsulaire indique qu'il a un poids moléculaire d'environ 210 kDa. Par conséquent, dans certains modes de réalisation, le polysaccharide capsulaire peut être extrait de la paroi cellulaire des mutants CpsA à l'aide des procédés de l'état de de la technique antérieur pour obtenir un polysaccharide capsulaire ayant un poids moléculaire inférieur à 300 kDa, inférieur à 250 kDa, en particulier d'environ 210 kDa.

CpsD

Un exemple de séquence d'acides aminés de CpsD pleine longueur comprend la séquence déposée sous le numéro d'accès Uniprot K0JNC2 ayant la séquence d'acides aminés suivantes (SEQ ID NO : 11) :

MTRLEIVDSKLRQAKKTEEYFNAIRTNIQFSGKENKILAITSVREGEGKSTTSTSLALS

LAQAGFKTLLIDADTRNSVMSGTFKATGTIKGLTNYLSGNADLGDIICETNVPRLMW

PSGKVPPNPTALLQNAYFNKMIEAIKNIFDYIIIDTPPIGLWDAAIISNACDGFILVTQA

GRIKRNYVEKAKEQMEQSGSKFLGIILNKVSESVATYGDYGDYGNYGKRDRKRK

Dans certains modes de réalisation, la présente invention se base sur la mutation du gène CpsD par délétion dans le cadre de lecture ou autres mutations telles que des substitutions. Une délétion dans le cadre de lecture du gène CpsD peut comprendre toute troncature d'une partie quelconque du gène CpsD. Les délétions dans le cadre de lecture selon la présente invention comprennent les délétions qui éliminent un segment de la séquence codant pour la protéine, tout en conservant le cadre de lecture adéquat après la délétion. Certains modes de réalisation selon la présente invention peuvent inclure des délétions qui sont des « délétions propres » à savoir, qui ne contiennent pas de séquences d'ADN exogènes insérées dans le gène ou une délétion dans le cadre de lecture du gène CpsD peut comprendre une élimination à une position quelconque de 1 à 232 acides aminés. Les inventeurs ont ainsi identifié des résidus au sein de SEQ ID NO : 10 qui peuvent être modifiés pour altérer l'activité de CpsD de façon à ce que l'adhérence du polysaccharide capsulaire à la paroi cellulaire soit réduite tandis que la sécrétion ou la libération du polysaccharide capsulaire dans l'environnement externe, par exemple, dans le milieu de culture est augmentée. De plus, la mutation de ces résidus peut être combinée à d'autres modifications telles que des délétions.

Les mutants CpsD comprennent une mutation dans la séquence polynucléotidique (SEQ ID NO : 10) qui code pour la séquence polypeptidique du CpsD exposée dans SEQ ID NO : 11, la mutation ayant pour résultat une sécrétion accrue du polysaccharide capsulaire dans le milieu de culture. En particulier la mutation est choisie dans le groupe constitué par une délétion dans le cadre de lecture, une mutation ponctuelle telle qu'une substitution, une délétion, et une insertion.

Dans certains modes de réalisation, la mutation entraîne la délétion de la séquence polynucléotidique qui code pour tout le polypeptide CpsD. Dans d'autres modes de réalisation, la mutation comprend une délétion, dans laquelle la protéine correspondant à la mutation par délétion est privée d'au moins 2 acides aminés. Plus particulièrement, la mutation comprend une délétion de la partie de la séquence polynucléotidique qui code pour le site du phosphoaccepteur (région P-tyr) du polypeptide CpsD. D'autres mutations comprennent une délétion d'une région allant du Tyr C-terminal à Phe. Dans certains modes de réalisation, le gène CpsD comprend une ou plusieurs mutations ponctuelles choisies dans le groupe constitué par K49, S50, D73 et P154, par exemple, à titre d'exemple non limitatif, K49M et/ou S50A. En particulier, des mutations dans le site actif de l'autokinase, en particulier une mutation ponctuelle à la position K49 numérotée selon la protéine CpsD de SEQ ID NO : 11 qui provoque la perte ou la réduction de l'activité CpsD et un accroissement de la sécrétion du polysaccharide capsulaire sont utiles.

Les polysaccharides capsulaires produits par Streptococcus agalactiae de type sauvage ont un poids moléculaire d'environ 367 kDa. Les polysaccharides capsulaires sécrétés par les mutants CpsD décrits ici ont un poids moléculaire supérieur à 800 kDa.

Par conséquent, l'invention peut également concerner un polysaccharide capsulaire purifié ayant un poids moléculaire, en particulier un poids moléculaire moyen, supérieur à 800 kDa, supérieur à 900 kDa, supérieur à 1000 kDa, supérieur à 2000 kDa, supérieur à 3000 kDa, supérieur à 4000 kDa, supérieur à 5000 kDa, supérieur à 6000 kDa, supérieur à 7000 kDa, supérieur à 8000 kDa, supérieur à 9000 kDa ou dans toute plage intermédiaire.

Variants

Des variants de CpsA et CpsD provenant d'autres souches de Streptococcus agalactiae sont connus et peuvent être facilement identifiés, par exemple, en utilisant les programmes BLAST pour rechercher la séquence ci-dessus. Les variants de CpsA comprennent à titre d'exemples non limitatifs les souches déposées sous les numéros d'accès Uniprot : M1Y5W8, S9KSV2, S9JM66 et S8YXF5, également désignées « régulateur transcriptionnel de la famille LytR », « protéine de régulation de CpsX », « protéine de biosynthèse du polysaccharide capsulaire CpsX » et autres. Les variants de CpsD comprennent à titre d'exemples non limitatifs les souches déposées sous les numéros d'accès Uniprot : V6H970, S9NRN3, S9PP30, S9E9Q3, également désignées « tyrosine protéine kinase » et « transporteur de polysaccharide capsulaire » et autres. .

Par conséquent, l'invention s'applique également aux variants alléliques des protéines CpsA et CpsD issues de

Streptococcus agalactiae décrites. Dans certains modes de réalisation, le degré d'identité de séquence est supérieur à 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 % ou plus. Ces polypeptides comprennent les homologues, les orthologues, les variants alléliques et les mutants fonctionnels. Généralement, une identité de 50 % ou plus entre deux polypeptides est considérée comme indiquant une équivalence fonctionnelle.

Purification

Matériau de départ : les mutants CpsA et CpsD sécrètent et libèrent d'importantes quantités de polysaccharide capsulaire dans le milieu de culture pendant la croissance bactérienne, de sorte que le matériau de départ pour la purification est généralement le surnageant d'une culture bactérienne centrifugée. Grâce à l'utilisation des mutants CpsA ou CpsD, il n'est pas nécessaire de traiter les bactéries capsulées elles-mêmes pour libérer le saccharide capsulaire. De manière avantageuse, comme le procédé selon l'invention n'exige pas l'utilisation de réactifs basiques tels que NaOH, le saccharide produit par les procédés selon l'invention n'est pas partiellement ou entièrement dés-N-acétylé et les procédés selon l'invention ne comprennent pas ou n'exigent pas d'étape de N-réacétylation.

Précipitation par ajout d'un alcool et échange de cations : Le saccharide capsulaire du GBS obtenu après culture sera généralement impur et peut être contaminé par des acides nucléiques et des protéines d'origine bactérienne. Le procédé selon l'invention utilise la précipitation par ajout d'alcool. L'extraction basique n'étant pas utilisée, les matériels n'auront pas besoin d'être neutralisés avant la précipitation, ce qui là encore réduit le temps requis pour purifier le polysaccharide capsulaire. L'alcool utilisé pour précipiter les acides nucléiques et/ou les protéines contaminant(e)s est de préférence un alcool inférieur, tel que le méthanol, l'éthanol, le propan-1-ol, le propan-2-ol, le butan-l-ol, le butan-2-ol, le 2-méthyl-propan-l-ol, le 2-méthyl-propan-2-ol, les diols, etc. Le choix de l'alcool approprié peut être testé empiriquement, sans alourdir indûment le procédé, mais les alcools tels que l'éthanol et 1 'isopropanol (propan-2-ol) sont préférés, plutôt que les alcools tels que le phénol. L'alcool est de préférence ajouté à la suspension de polysaccharide de façon à obtenir une concentration d'alcool finale entre 10 et 50 % (p. ex. environ 30 %) . Les concentrations les plus utiles sont celles qui induisent une précipitation adéquate des contaminants sans précipiter le polysaccharide en même temps. La concentration d'alcool finale optimale peut dépendre du sérotype du GBS à partir duquel le polysaccharide est obtenu, et peut être déterminée par des expériences classiques sans surcharge de travail excessive. Une précipitation des polysaccharides à des concentrations d'éthanol >50 % a été observée. L'alcool peut être ajouté sous une forme pure ou sous une forme diluée avec un solvant miscible (p. ex. eau). Les mélanges de solvants préférés sont les mélanges éthanol/eau, à un rapport préféré entre environ 70/30 et environ 95/5 (p. ex. 75/25, 80/20, 85/15, 90/10).

Le saccharide est également traité avec un cation métallique aqueux. Les cations métalliques monovalents et divalents sont préférés, et les cations divalents tels que Mg++, Mn++, Ca++, etc., sont particulièrement préférés car plus efficaces pour former des complexes. Les ions calcium sont particulièrement utiles, et de ce fait le mélange par ajout d'alcool contient de préférence des ions calcium solubles qui peuvent être ajoutés à un mélange saccharide/ alcool en tant que sels de calcium, soit sous forme solide, soit sous forme aqueuse. Les ions calcium sont de préférence fournis par le chlorure de calcium.

Les ions calcium sont de préférence présents à une concentration finale entre 10 et 500 mM p. ex. environ 0,1 M. La concentration de Ca++ finale optimale peut dépendre du sérotype du GBS à partir duquel le polysaccharide est obtenu, et peut être déterminée par des expériences classiques sans surcharge de travail excessive. ' L'alcool et le cation jouent des rôles différents (l'alcool sert à précipiter les contaminants, tandis le cation stabilise et forme un complexe avec le saccharide sous forme soluble) mais produisent un effet combiné. Bien que le but soit de préparer un mélange du saccharide, de l'alcool et du cation, ces trois composants n'ont pas nécessairement besoin d'être mélangés simultanément. L'alcool et le cation peuvent ainsi être utilisés séquentiellement ou simultanément. Le traitement séquentiel est préféré, et un procédé particulièrement préféré implique l'ajout du cation au saccharide suivi par l'ajout de l'alcool au mélange cation/saccharide, bien que l'alcool puisse être utilisé avant le cation si souhaité.

Après précipitation des protéines et/ou des acides nucléiques contaminant(e)s par ajout d'alcool, le polysaccharide capsulaire du GBS est laissé en solution. Le matériel ayant précipité peut être séparé du polysaccharide par tout moyen convenable, tel que par centrifugation. Le surnageant peut être soumis à microfiltration, et en particulier à une filtration frontale (filtration perpendiculaire) afin d'éliminer les particules susceptibles d'obturer les filtres dans les étapes ultérieures (p. ex. particules ayant précipité d'un diamètre supérieur à 0,22 micromètre) . A la place de la filtration frontale, une microfiltration tangentielle peut être utilisée.

Diafiltration : Le procédé selon l'invention peut inclure une étape de diafiltration après la précipitation des protéines et/ou des acides nucléiques. Une diafiltration à flux tangentiel peut être utilisée. La membrane de filtration doit par conséquent être du type qui laisse passer les impuretés tout en retenant le polysaccharide capsulaire. Une coupure dans la plage de 10 à 30 kDa est typique. Les seuils de coupure bas peuvent être utilisés mais les seuils de coupure en limite haute permettent de manière avantageuse d'éliminer d'autres contaminants sans provoquer la perte du saccharide capsulaire. Au moins 1 cycle de diafiltration peut être mis en œuvre, p. ex. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou plus.

Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend en outre une étape d'élimination des acides nucléiques et/ou des protéines contaminant (e)s. Les acides nucléiques et/ou protéines particulièrement contaminant(e)s peuvent être éliminés par précipitation. Plus particulièrement encore, les acides nucléiques et/ou protéines contaminant(e)s peuvent être séparés du polysaccharide capsulaire sous forme aqueuse par précipitation par ajout d'alcool. Quand une étape de précipitation par ajout d'alcool est incluse, un alcool et un cation métallique aqueux peuvent être utilisés pour précipiter les acides nucléiques et/ou protéines, laissant le polysaccharide en solution. Quand une étape de précipitation par ajout d'alcool est incluse, le procédé peut inclure une étape supplémentaire de séparation du matériel ayant précipité du polysaccharide. En particulier, le matériel ayant précipité peut être séparé du polysaccharide par filtration et plus particulièrement encore, le procédé peut comprendre une étape de diafiltration après la précipitation des acides nucléiques et/ou des protéines. Dans certains modes de réalisation, l'alcool est l'éthanol ou 1'isopropanol. Dans certains modes de réalisation, le cation métallique aqueux est CaCl2. En particulier, les procédés selon l'invention comprendront une ou plusieurs étapes de filtration, par exemple, d'ultrafiltration et/ou de filtration sur gel. Dans des modes de réalisations particuliers, une filtration sur gel de Sephacryl® est mise en œuvre, par exemple, sur gel de Sephacryl® S-500.

Traitement supplémentaire du polysaccharide capsulaire : Le polysaccharide peut en outre être traité pour éliminer les contaminants. C'est particulièrement important dans les cas où même une contamination mineure est inacceptable (p. ex. pour la production de vaccins à usage humain). Par exemple, d'autres étapes de précipitation peuvent être utilisées. Quand une re-solubilisation aqueuse a été effectuée, alors cette précipitation utilisera typiquement un alcool, comme décrit dans la section précédente ; à l'inverse, quand une resolubilisation par ajout d'alcool a été effectuée, alors cette précipitation utilisera typiquement une solution cationique aqueuse, comme décrit dans la section précédente. Le saccharide ayant précipité peut ensuite être séparé des éventuels contaminants aqueux résiduels p. ex. par centrifugation. Le matériau ayant précipité est stable et peut être stocké pour une utilisation ultérieure. Des tours supplémentaires de précipitation et de filtration peuvent également être mis en œuvre. Une filtration en profondeur peut également être utilisée, p. ex. à la place de la centrifugation. La filtration en profondeur sera typiquement utilisée après solubilisation dans un alcool.

Le matériel ayant précipité peut être soumis à un séchage sous vide. Ce traitement sera typiquement utilisé non pas pour stabiliser le saccharide à des fins de stockage, mais pour le sécher et chasser tout alcool résiduaire. Le procédé donne un polysaccharide capsulaire de Streptococcus agalactiae purifié. En particulier, le polysaccharide capsulaire est un polysaccharide capsulaire sialylé, en d'autres termes, il n'est ni partiellement, ni entièrement dés-N-acétylé. Plus particulièrement encore, environ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % à environ 100 % des motifs répétitifs du polysaccharide capsulaire purifié comprennent des chaînes latérales terminées par un acide N-acétylneuraminique (acide sialique ; Neu5Ac) a2,3-lié au galactose (Gai) .

Le polysaccharide capsulaire purifié selon l'invention peut être utilisé à titre d'antigène sans autre modification p. ex. il peut être utilisé dans des dosages diagnostiques in vitro, pour l'immunisation, etc. A des fins d'immunisation, il est toutefois préférable de conjuguer le saccharide à une molécule porteuse, telle qu'une protéine. En général, la conjugaison covalente des saccharides à des protéines porteuses améliore l'immunogénicité des saccharides en les faisant passer d'antigènes T-indépendants à antigènes T-dépendants, permettant ainsi l'amorçage d'une mémoire immunologique. La conjugaison est une technique très connue. Par conséquent, les procédés selon l'invention peuvent inclure l'étape supplémentaire de conjugaison du saccharide purifié à une molécule porteuse. L'invention peut également concerner des procédés de préparation de compositions pharmaceutiques, comprenant les étapes de mélange (a) d'un polysaccharide selon l'invention (éventuellement sous la forme d'un conjugué) avec (b) un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le « véhicule pharmaceutiquement acceptable » typique comprend tout véhicule qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les véhicules convenables sont typiquement de grosses macromolécules, à métabolisme lent, telles que les protéines, les polysaccharides, les acides polylactiques, les acides polyglycoliques, les acides aminés polymères, les copolymères d'acides aminés, le lactose, et les agrégats lipidiques (tels que les gouttelettes d'huile ou les liposomes). Ces véhicules sont bien connus de l'homme du métier. Les vaccins peuvent également contenir des diluants, tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. De plus, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou émulsifiants, des substances de tamponnage du pH, et autres, peuvent être présentes. Le sérum physiologique stérile à tampon phosphate, apyrogène est un véhicule typique. Les compositions pharmaceutiques peuvent être conditionnées dans des flacons ou dans des seringues. Les seringues peuvent être fournies avec ou sans les aiguilles. Une seringue comprendra une monodose de la composition, tandis qu'un flacon peut contenir une monodose ou de multiples doses. Les compositions aqueuses de saccharides selon l'invention conviennent pour reconstituer d'autres vaccins à partir d'une forme lyophilisée. Quand une composition selon l'invention doit être utilisée pour ce type de reconstitution extemporanée, 1'invention propose un procédé de reconstitution de ce type de vaccin lyophilisé, comprenant l'étape de mélange du matériel lyophilisé avec une composition aqueuse selon l'invention. Le matériel reconstitué peut être utilisé en injection. Généralités

Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué par », p. ex. une composition « comprenant » X peut être exclusivement constituée par X ou peut inclure un élément supplémentaire p. ex. X + Y. Le terme « essentiellement constitué par » signifie que la composition, le procédé ou la structure peut comprendre des ingrédients, des étapes et/ou des parties supplémentaires, mais seulement si les ingrédients, les étapes et/ou les parties supplémentaires n'altèrent pas matériellement les caractéristiques basiques et nouvelles de la composition, du procédé ou de la structure revendiqué. Par « constitué par », on entend de manière générale que l'invention telle que revendiquée se limite aux éléments spécifiquement indiqués dans la revendication (et peut inclure leurs équivalents, si tant est que la doctrine des équivalents s'applique).

Le terme « environ » tel qu'il est utilisé dans la présente en référence à une valeur mesurable telle qu'une quantité, une durée temporelle, et autre, est destiné à englober les variations de ±20 % ou ±10 %, plus préférablement de ±5 %, plus préférablement encore de ±1 %, et mieux encore de ±0,1 % par rapport à la valeur spécifiée, dans la mesure où ces variations sont appropriées pour la mise en œuvre des procédés décrits.

Le terme « essentiellement » n'exclut pas « complètement » p. ex. une composition qui est « essentiellement exempte » de Y peut être complètement exempte de Y. Par exemple, « essentiellement exempte » de Y peut être entendu comme une composition ne contenant pas plus de 5 % de Y, pas plus de 4 % de Y, pas plus de 3 % de Y, pas plus de 2 % de Y, pas plus de 1 % de Y, ou pas plus de 0,1 % de Y. Si nécessaire, le terme « essentiellement » peut être omis de la définition de 1'invention.

Sauf indications contraires provenant du contexte, le terme « ou » tel qu'il est utilisé ici est inclusif et peut être utilisé de manière interchangeable avec le terme « et/ou ».

Le terme « mutant » désigne un gène ou un produit génique qui présente des modifications dans sa séquence et/ou dans ses propriétés fonctionnelles (à savoir, des caractéristiques altérées) par rapport au gène ou au produit génique de type sauvage.

Tous les numéros d'accès GenBank mentionnés dans la présente sont incorporés par référence dans la version disponible à la date de dépôt de la présente demande.

Le terme « récupération » désigne l'isolement du polysaccharide capsulaire à différents degrés de pureté, par exemple une pureté entre 5 et 100 %, les puretés préférées étant dans la plage de 10 à 99 %, de 20 à 99 %, de 30 à 99 %, de 40 à 99 %, de 50 à 99 %, de 60 à 99 %, de 70 à 99 %, de 80 à 99 %, de 90 à 99 %. Les puretés particulières sont supérieures à 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 %. La récupération peut également être désignée sous les termes d'extraction ou de purification. Le terme « pureté » prend la signification générale utilisée dans l'état de la technique pour désigner le pourcentage de l'échantillon disponible, isolé représentant réellement le polysaccharide capsulaire.

Cette invention est en outre illustrée par les exemples qui suivent qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs.

EXEMPLES

Souches bactériennes et conditions de croissance GBS 515 (Wessels, et al. 1993) et ses dérivés isogènes ont été cultivés dans un bouillon Todd-Hewitt (milieu THB ; Difco Laboratories) à 37°C, 5 % de C02. Le bouillon de soja trypsique (Difco Laboratories), 15 g/L de gélose (TSA) a été utilisé sous forme de milieu solide. Les souches ont été stockées à -80°C dans le milieu THB + 15 % de glycérol. Des cellules compétentes MAX Efficiency® DH5a™ (Invitrogen) et des cellules HK100 d'E. coli compétentes préparées en interne ont été utilisées pour la transformation, la propagation, et la préparation des plasmides. E. coli a été cultivé à 37°C sous agitation (180 tours/min) dans un bouillon Luria-Bertani (LB, Difco laboratories) , ou sur plaques de gélose à 15 g/L (LBA) . L'érythromycine (Erm) a été utilisée pour la sélection du GBS (1 pg/ml) ou du E. coli (100 pg/ml) contenant les plasmides dérivés de pJRS233 (Perez-Casal et al. 1993) utilisés pour la mutagenèse. La kanamycine (Kan) a été utilisée pour la sélection du E. coli (50 pg/ml) contenant les plasmides dérivés de pET24b (Novagen) utilisés pour la mutagenèse initiale des inserts, avant transfert dans pJRS233.

Construction des plasmides CpsA pour la mutagenèse et la complémentation chromosomigue

Pour préparer chaque souche mutante, le vecteur navette pJRS233 (Perez-Casal J, et al. 1993) contenant le locus du gène portant une délétion dans le cadre de lecture ou une substitution de codon a été construit. Les souches mutantes développées sont décrites dans le Tableau 1 :

Les amorces utilisées sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous :

Les constructions pour les gènes portant des substitutions de codons ont été préparées à l'aide d'un épissage par la stratégie de la PCR extension-chevauchement (SOEing-PCR). Brièvement, les deux parties du gène en aval et en amont de la substitution de codon ont été amplifiées à partir de l'ADNg de la souche 515 en utilisant l'ADN polymérase PfuUltra II Fusion HS (Agilent Technologies) . 900-1000 pb en amont et en aval de la séquence codante du gène ont été ajoutées aux inserts. Les amorces utilisées pour amplifier les deux parties du gène ont des queues chevauchantes de 15 pb et introduisent la substitution de codon dans les deux produits de PCR qui sont ensuite assemblés par SOEing-PCR. Le fragment obtenu a été ligaturé dans pJRS233 à l'aide des sites de restriction BamHI et Xhol.

Les constructions pour les gènes portant des délétions dans le cadre de lecture ont été préparées par la méthode de l'extension d'amorce incomplète par polymérase (PIPE). Brièvement, le gène plus 900-1000 pb en amont et en aval de la séquence codante ont été amplifiés à partir de l'ADNg de la souche 515 et clonés dans pET24b en utilisant les sites de restriction Notl et Xhol (inserts cpsA) ou BamHI et Xhol (inserts cpsD) . Les délétions dans le cadre de lecture des gènes ont été développées par amplification du plasmide à l'aide d'amorces ayant des queues chevauchantes de 15 pb s'hybridant des deux côtés de la région à déléter. Les plasmides linéaires ont été transformés dans des cellules HK100 compétentes capables de re-circulariser le plasmide. Les inserts obtenus ont ensuite été transférés dans le plasmide pJRS233 par digestion de restriction et ligature.

Les constructions pour la complémentation chromosomique ont été préparées par transfert dans pJRS233 des inserts de type sauvage clonés dans pET24b.

Construction des plasmides CpsD pour la mutagenèse et la complémentation chromosomique

Pour préparer chaque souche mutante, le vecteur navette pJRS233 (Perez-Casal J, et al. 1993) contenant le locus du gène portant une délétion dans le cadre de lecture ou une substitution de codon a été construit. Les souches mutantes développées sont décrites dans le Tableau 3 :

Les amorces utilisées sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous : .

Les constructions pour les gènes portant des substitutions de codons ont été préparées à l'aide d'un épissage par la stratégie de la PCR extension-chevauchement (SOEing-PCR). Brièvement, les deux parties du gène en aval et en amont de la substitution de codon ont été amplifiées à partir de l'ADNg de la souche 515 en utilisant l'ADN polymérase PfuUltra II Fusion HS (Agilent Technologies) . 900-1000 pb en amont et en aval de la séquence codante du gène ont été ajoutées aux inserts. Les amorces utilisées pour amplifier les deux parties des gènes ont des queues chevauchantes de 15 pb et introduisent la substitution de codon dans les deux produits de PCR qui sont ensuite assemblés par SOEing-PCR. Le fragment obtenu a été ligaturé dans pJRS233 à l'aide des sites de restriction BamHI et Xhol.

Les constructions pour les gènes portant des délétions dans le cadre de lecture ont été préparées par la méthode de l'extension d'amorce incomplète par polymérase (PIPE). Brièvement, le gène plus 900-1000 pb en amont et en aval de la séquence codante ont été amplifiés à partir de 1'ADNg de la souche 515 et clonés dans pET24b en utilisant les sites de restriction Notl et Xhol (inserts cpsA) ou BamHI et Xhol (inserts cpsD) . Les délétions dans le cadre de lecture des gènes ont été développées par amplification du plasmide à l'aide d'amorces ayant des queues chevauchantes de 15 pb s'hybridant des deux côtés de la région à déléter. Les plasmides linéaires ont été transformés dans des cellules HK100 compétentes capables de re-circulariser le plasmide. Les inserts obtenus ont ensuite été transférés dans le plasmide pJRS233 par digestion de restriction et ligature.

Les constructions pour la complémentation chromosomique ont été préparées par transfert dans pJRS233 des inserts de type sauvage clonés dans pET24b.

Construction des mutants isogènes et des souches chromosomiquement complémentées

Une stratégie de mutagenèse par insertion/duplication et excision a été utilisée à la fois pour obtenir la délétion dans le cadre de lecture /substitution de codon dans les gènes et pour remplacer les mutations pour obtenir les souches chromosomiquement complémentées. Brièvement, les plasmides dérivés de pJRS233 purifiés à partir d'E. coli ont été utilisés pour transformer des cellules électrocompétentes de la souche 515 par électroporation. Les transformants ont été sélectionnés par croissance sur TSA + Erm à 30 °C pendant 48 heures. L'intégration a été effectuée par croissance des transformants à 37°C (température non permissive pour le vecteur navette suicide) avec sélection par Erm. L'excision du plasmide intégré a été effectuée par des passages en série dans THB à 30°C, et criblage parallèle pour détecter les colonies sensibles à Erm sur plaque. Les mutants ont été vérifiés par séquençage des loci par PCR.

Pour obtenir . les souches chromosomiquement complémentées, les plasmides dérivés de pJRS233 contenant la forme type sauvage des gènes et les 900-1000 pb flanquantes en amont et en aval ont été purifiés à partir d'E. coli et la complémentation des souches mutantes respectives a été mise en œuvre comme décrit pour la mutagenèse.

Analyse par qRT-PCR

Les bactéries ont été récoltées à deux points temporels : à ODêoo=0,4 (phase log) et OD50o=l,7 (phase stationnaire précoce). Pour arrêter rapidement la transcription, 10 ml de bactéries ont été refroidis sur de la glace et ajoutés à 10 ml de milieu THB congelé dans un tube conique de 50 ml. Les cellules GBS ont ensuite été collectées par centrifugation pendant 15 min à 4000 tours/min, 4°C, et remises en suspension dans 800 μΐ de TRIzol (Invitrogen) . Les bactéries ont été rompues mécaniquement par agitation dans la matrice de lyse B dans des tubes de 2 ml (DBA Italie) en utilisant un homogénéiseur (Fastprep-24, Millipore) pendant 60 sec à 6,5 m/s pendant deux cycles, et maintenues sur la glace pendant 2 min entre les cycles. Les échantillons ont ensuite été centrifugés pendant 5 min à 8000 x g, 4°C et l'ARN a été extrait à l'aide du kit Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo

Research) selon les instructions du fabricant. Les échantillons d'ARN ont été traités avec une DNase (Roche) pendant 2 h à 37°C, puis purifiés à l'aide du kit RNA MiniPrep (Qiagen), contenant un second traitement à la DNase sur colonne pendant 30 min à température ambiante (TA), selon les instructions du fabricant. L'ADNc a été préparé à l'aide du Système de transcription inverse (Promega) en utilisant 500 ng d'ARN par réaction. La PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) a été effectuée sur 50 ng d'ADNc qui ont été amplifiés à l'aide du LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master, (Roche). Les réactions ont été surveillées à l'aide du LightCycler® 480 et son logiciel (Roche). Trois réplicats techniques ont été surveillés pour chaque souche/condition analysée. Pour quantifier le niveau de transcription des opérons des cps , des amorces s'hybridant à cpsA et cpsE ont été utilisées respectivement pour les mutants cpsA. Les quantités de transcrit dans chaque condition ont été normalisées par rapport à un gène témoin interne (gyrA) -et comparées à l'expression normalisée chez la souche de type sauvage (méthode ΔΔΟτ) .

Quantification du polysaccharide capsulaire adhérant à la surface des cellules

Une culture d'une nuit a été utilisée pour inoculer (1:1000) 50 ml de THB frais et les bactéries ont été cultivées à 37°C pendant 8 heures. Les cellules GBS ont été collectées par centrifugation pendant 15 min à 4000 tours/min à 4°C, remises en suspension dans 1,1 ml de PBS + 0,8 M de NaOH et incubées à 37°C pendant 36 heures. Les échantillons ont été neutralisés et des culots ont été obtenus par centrifugation pendant 10 min à 4000 tours/min, 4°C. 850 μΐ du surnageant ont été dilués dans 7,15 ml d'eau, et centrifugés pendant 10 min à 4000 tours/min à 4°C. 7,2 μΐ du surnageant ont été chargés sur un tube Vivaspin 10 (Sartorius Stedim Biotech) qui a été centrifugé à 4000 tours/min jusqu'à ce que la majeure partie de la solution ait traversé la membrane. Après deux lavages avec 1 ml d'eau, l'extrait CPS a été récupéré à partir de la membrane et remis en suspension dans 1,6 ml d'eau. La quantité de CPS présente dans l'extrait a été estimée par mesure de la teneur en acide sialique à l'aide de la méthode colorimétrique au résorcinol-acide chlorhydrique (Svennerholm et al, 1957). Brièvement, 120 μΐ d'extrait ont été mélangés à 380 μΐ d'eau et à 500 μΐ de solution R3 récemment préparée (résorcinol 0,2 %, sulfate de cuivre 0,3 mM, HCl 30 % dans H2O) . Les échantillons ont été portés à ébullition pendant 20 min, puis refroidis jusqu'à la température ambiante avant d'être transférés dans des cuvettes de 1 ml pour mesurer leur absorbance à 564 nm. La teneur en acide sialique des échantillons a ensuite été calculée en utilisant une courbe standard préparée de manière concomitante en utilisant des dilutions en série d'acide sialique purifié. Les extraits CPS ont été préparés trois fois a partir de cultures indépendantes pour réduire au minimum la variabilité biologique.

Quantification du polysaccharide capsulaire libéré dans le milieu de croissance

Une culture d'une nuit a été utilisée pour inoculer (1:1000) 10 ml de THB frais et les bactéries ont été cultivées à 37 °C pendant 8 heures. Des culots de cellules GBS ont été obtenus par centrifugation pendant 15 min à 4000 tours/min à 4°C, et le milieu de croissance a été collecté et filtré à l'aide d'un disque filtrant de seringue Nalgene de 0,22 pm (Thermo Scientific). La quantité de polysaccharide capsulaire libérée dans le milieu de croissance a été estimée par transfert sur membrane par la technique du « dot blot ». 10 mg/ml de CPS de sérotype la purifié ont été utilisés comme étalon. Huit dilutions en série ont été préparées dans une plaque 96 puits par dilution de l'étalon et du milieu de croissance dans du PBS (taux de dilution 1:2 pour le milieu, 1:4 pour l'étalon) . 2 μΐ de chaque dilution en série ont été transférés sur une membrane en nitrocellulose. La membrane a été séchée pendant 20 min et bloquée par immersion dans 5 % (p/v) de lait écrémé dans du PBS-Tween à 0,05 %. La membrane a ensuite été testée avec un anticorps monoclonal primaire de souris conjugué de type anti-CPS sérotype Ia-CRM (30E9/B11) utilisé à 1:2000, lavée 3 fois dans du PBS-Tween à 0,05 %, et incubée dans 1:15000 d'anticorps anti-souris de chèvre secondaire conjugué à la peroxydase du raifort. La détection a été effectuée à l'aide d'un substrat pour transfert Western Thermo Scientific Pierce ECL selon les instructions du fabricant.

Transfert par Western blot du polysaccharide capsulaire libéré dans le milieu de croissance 20 μΐ du milieu ont été mélangés avec 10 μΐ de 3x tampon pour échantillon NuPAGE® LDS + agent de réduction et portés à ébullition pendant 5 min. Puis, 20 μΐ ont été chargés sur un gel Bis-Tris à 4-12 % NuPage 1,0 mm, 12 puits (Life Technologies) (tampon : MOPS lx) et soumis à 150 V jusqu'à ce que la bande correspondant à 28 kDa du SeeBlue® Plus2 Prestained Protein Standard (Life Technologies) ait atteint le fond du gel. Les échantillons séparés sur le gel ont été transférés sur une membrane en nitrocellulose à l'aide du système de transfert iBlot® 7-Minute Blotting System (Life Technologies). La membrane a été bloquée par immersion dans 5 % (p/v) de lait écrémé dans du PBS-Tween à 0,05 %. La membrane a ensuite été testée avec un anticorps monoclonal primaire de souris conjugué de type anti-CPS sérotype Ia-CRM (30E9/B11) utilisé à 1:2000, lavée 3 fois dans du PBS-Tween à 0,05 %, et incubée dans 1:15000 d'anticorps anti-souris de chèvre secondaire conjugué à la peroxydase du raifort. La détection a été effectuée à l'aide d'un substrat pour' transfert Western Thermo Scientific Pierce ECL selon les instructions du fabricant.

Purification du saccharide capsulaire à partir du milieu de culture

Le surnageant provenant du milieu de culture a été collecté par centrifugation après culture de mutants CpsA de Streptococcus Groupe B. Un mélange d'éthanol aqueux (30 %) et de CaCl2 (0,1M) a été ajouté au milieu de culture. Un précipité s'est rapidement formé, qui a été séparé par centrifugation. Les dosages d'acide sialique ont montré que le saccharide capsulaire restait dans le surnageant. Le surnageant a été soumis à une microfiltration frontale sur des filtres en cellulose régénérée (coupure à 0,22 μιη) . Le surnageant a ensuite été soumis à une filtration à flux tangentiel (TFF) en utilisant une membrane en cellulose à seuil de coupure à 30 kDa contre Tris 50mM/NaCl 500mM pH 8,8 puis à une diafiltration contre NaPi lOmM, pH 7,2. Là encore, le précipité a été séparé par centrifugation. Une étape supplémentaire de filtration sur gel de type résine Sephacryl S-500 a été utilisée. Le polysaccharide peut être récupéré sous la forme d'un pool de fractions, qui dans certains cas, sont séchées, par exemple, par séchage sous vide. L'homme du métier reconnaîtra, ou sera capable de déterminer par des expérimentations de routine simples, de nombreux équivalents aux modes de réalisation spécifiques de l'invention décrits ici. Ces équivalents sont destinés à être englobés par les revendications qui suivent.

REFERENCES

Wessels, M. R., Paoletti, L. C., Rodewald, A. K., Michon, F., DiFabio, J., Jennings, H. J. & Kasper, D. L. (1993) Infect. Immun. 61, 4760-4766.

Perez-Casal J, Price JA, Maguin E, Scott JR. (1993) Mol Microbiol 8, 809-819.

Svennerholm L., (1957) Biochim Biophys Acta. 24(3), 604-611.

INDEX DES SEQUENCE ID

SEQ ID NO : 1 - Séquence ADN CpsA

SEQ ID NO : 2 - Séquence d'acides aminés CpsA SEQ ID NO : 3 - Séquence d'acides aminés CpsA LytR (aa 236-458)

SEQ ID NO : 4 - Séquence polynucléotidique CpsA ALytR

SEQ ID NO : 5 - Séquence d'acides aminés CpsA ALytR

SEQ ID NO : 6 - Séquence nucléotidique AcpsA

SEQ ID NO : 7 - Séquence d'acides aminés AcpsA SEQ ID NO : 8 - Séquence nucléotidique CpsA(Aext_domain) SEQ ID NO : 9 - Séquence d'acides aminés CpsA(Aext_domain)

SEQ ID NO : 10 - Séquence nucléotidique cpsD type sauvage SEQ ID NO : 11 - Séquence d'acides aminés cpsD type sauvage SEQ ID NO : 12 - Séquence nucléotidique AcpsD

SEQ ID NO : 13 - Séquence d'acides aminés AcpsD SEQ ID NO : 14 - Séquence nucléotidique CpsD(K49A) SEQ ID NO : 15 - Séquence d'acides aminés CpsD(K49A) SEQ ID NO : 16 - Séquence nucléotidique CpsD(AP-Tyr) SEQ ID NO : 17 - Séquence d'acides aminés CpsD(AP-Tyr) SEQ ID NO : 18 - Amorce NotA5Fsoe SEQ ID NO : 19 - Amorce XhA3Rsoe SEQ ID NO : 20 - Amorce KOA5Rsoe SEQ ID NO : 21 - Amorce KOA3Fsoe SEQ ID NO : 22 - Amorce MlA5Rsoe SEQ ID NO : 23 - Amorce MlA3Fsoe SEQ ID NO : 24 - Amorce M2A5Rsoe SEQ ID NO : 25 - Amorce M2A3Fsoe SEQ ID NO : 26 - Amorce BaD5Fsoe SEQ ID NO : 27 - Amorce XhD3Rsoe SEQ ID NO : 28 - Amorce KOD5Rsoe SEQ ID NO : 29 - Amorce KOD3Fsoe

SEQ ID NO : 30 - Amorce MlDmutF

SEQ ID NO : 31 - Amorce MlDmutR SEQ ID NO : 32 - Amorce M2D5Rsoe SEQ ID NO : 33 - Amorce M2D3Fsoe

SEQ ID NO : 34 - Amorce SAN_1047F

SEQ ID NO : 35 - Amorce SAN_1047R

SEQ ID NO : 36 - Amorce SAK_1262F

SEQ ID NO : 37 - Amorce SAK_1262R

SEQ ID NO : 38 - Amorce SAK_1258F

SEQ ID NO : 39 - Amorce SAK_1258R SEQ ID NO : 40 - Domaine CpsA LytR aa 248-395 SEQ ID NO : 41 - Domaine CpsA PPF/PFAM aa 72-187

Claims (15)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé de production d'un polysaccharide capsulaire à partir de Streptococcus agalactiae comprenant : la culture dans un milieu de culture convenable d'un mutant CpsA ou CpsD qui présente une sécrétion accrue du polysaccharide capsulaire comparée à la souche de type sauvage et la récupération du polysaccharide à partir du milieu de culture.
2. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le mutant CpsA comprend : (a) une protéine CpsA altérée dans laquelle la séquence nucléotidique qui code pour une séquence d'acides aminés comprenant la protéine CpsA (SEQ ID NO : 2) est délétée ou partiellement délétée ; ou (b) une protéine CpsA altérée dans laquelle la séquence nucléotidique qui code pour (i) le domaine LytR de SEQ ID NO : 40 ou SEQ ID NO : 3 et/ou (ii) le domaine PFAM de SEQ ID NO : 41 est délétée ; ou (c) une protéine CpsA altérée, la protéine CpsA altérée portant une substitution d'au moins un résidu acide aminé choisi dans le groupe constitué par : R271, R366, D375, R378 et Q382 numéroté selon la protéine CpsA (SEQ ID NO : 2) ; et/ou (d) une protéine CpsA altérée, la protéine CpsA altérée portant une substitution d'au moins un résidu acide aminé choisi dans le groupe constitué par : D238, R248, D250, R271 et R368 numéroté selon la protéine CpsA (SEQ ID NO : 2) ; et dans lequel le mutant CpsA présente une sécrétion accrue du polysaccharide capsulaire comparée à la souche de type sauvage.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le mutant CpsD comprend : (a) une protéine CpsD altérée dans laquelle la séquence nucléotidique qui code pour une séquence d'acides minés comprenant SEQ ID NO : 13 dans Streptococcus agalactiae de type sauvage est délétée ; ou (b) une protéine CpsD altérée, la protéine CpsD altérée portant une substitution d'au moins un résidu acide aminé choisi dans le groupe constitué par K49, S50, D73 and P154 numéroté selon la SEQ ID NO : 11 ; ou (c) une protéine CpsD altérée codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 16 ; dans lequel le mutant CpsD présente une sécrétion accrue du polysaccharide capsulaire comparée à la souche de type sauvage.
4. 4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel le mutant présente un accroissement du niveau de polysaccharide sécrété qui est au moins de 10 pour cent, au moins de 20 pour cent, au moins de 30 pour cent, au moins de 40 pour cent, au moins de 50 pour cent, au moins de 60 pour cent, au moins de 70 pour cent, au moins de 80 pour cent, au moins de 90 pour cent, au moins de 100 pour cent ou plus supérieur à celui d'une cellule de type sauvage du même sérotype.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le polysaccharide provient d'un sérotype de Streptococcus agalactiae choisi dans le groupe constitué par Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII ou VIII, en particulier des sérotypes la, Ib, II, III ou V.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le polysaccharide a un poids moléculaire supérieur à 800 kDa.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le saccharide n'est ni partiellement ni entièrement dés-N-acétylé.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre l'étape d'élimination des acides nucléiques et/ou des protéines contaminant(e)s par précipitation.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le procédé comprend les étapes de : (a) élimination des acides nucléiques et/ou des protéines contaminant(e)s du polysaccharide capsulaire sous forme aqueuse par précipitation par ajout d'un alcool, dans lequel un alcool et un cation métallique aqueux sont utilisés pour précipiter les acides nucléiques et/ou les protéines et laisser le polysaccharide en solution ; et (b) séparation du matériel précipité du polysaccharide.
10. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, dans lequel le procédé comprend en outre une étape de diafiltration après la précipitation des acides nucléiques et/ou des protéines.
11. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel l'alcool est l'éthanol ou 1'isopropanol.
12. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le cation métallique aqueux est CaCl2 ·
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, comprenant en outre une ou plusieurs étapes de filtration.
14. 14. Polysaccharide capsulaire purifié de Streptococcus agalactiae obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
15. 15. Composition immunogène, en particulier composition vaccinale, comprenant le polysaccharide capsulaire selon la revendication 14.