FI110993B - Menetelmä B-ryhmän streptokokkityyppien II ja V polysakkaridi-proteiinikonjugaatin valmistamiseksi - Google Patents

Description

110993

Menetelmä B-ryhmän streptokokkityyppien II ja V polysakkaridi-proteiinikonju-gaatin valmistamiseksi c f 5 Tämä hakemus on jatkohakemus US-patenttihakemukselle 07/949970, joka on jätetty 24. syyskuuta 1992.

Selvitys oikeudesta keksintöön Tämä keksintö on tehty hallituksen tuella National Institute of Healthin myöntämällä 10 NIH-apurahalla A123339, A130628 ja A128040. Hallituksella on määrättyjä oikeuksia tähän keksintöön.

Keksinnön ala Tämä keksintö koskee antigeenisten konjugaattimolekyylien, jotka käsittävät ryhmän B 15 streptokokkityypin II tai V kapselipolysakkaridin, liittämistä kovalenttisesti proteiiniin. Hakemuksessa kuvataan myös rokotteita ja menetelmiä nisäkkäiden, ihmiset mukaan lukien, immunisoimiseksi B-ryhmän streptokokkityypin II (GBSII) ja/tai tyypin V (GBS V) aiheuttamaa infektiota vastaan. Monivalenssiset rokotteet, jotka käsittävät tämän keksinnön mukaisesti saatuja konjugaattimolekyylejä ja antigeenejä muille 20 patogeenisille bakteereille, sisältyvät myös hakemukseen.

Keksinnön tausta B-ryhmän streptokokista (GBS) johtuvat infektiot ovat yleisin yksittäinen syy vastasyntyneiden sepsikseen ja meningiittiin kehittyneissä maissa (3, 31). Viimeaikaiset ra-.: 25 portit eräistä Yhdysvaltain keskuksista heijastavat alhaisempaa kuolleisuutta (9-13 %) kuin sarjassa 1970-luvun raportteja, kenties diagnoosien aikaistumisen ja tehohoidon tuloksena (1, 10). Kuolemaan johtavia infektioita esiintyy kuitenkin yhä, ja mikä on yhtä tärkeää, jopa 50 %:lla GBS-meningiitistä selviytyneistä on kroonisia neurologisia vaurioita kuuroudesta ja lievästä oppimiskyvyn heikentymisestä vaikeaan motoriseen, 30 sensoriseen ja kognitiiviseen toiminnanvajaukseen (3). Merkittävin vaikutus GBS:ään liittyvän sairastuvuuden ja kuolleisuuden vähentämiseen edelleen on todennäköisesti ii ennemminkin ennaltaehkäisyllä kuin diagnoosin ja hoidon parantamisella.

r

Koska GBS-kapselipolysakkaridille spesifiset vasta-aineet näyttävät suojaavan sekä 35 koe-eläimiä (23,24) että pikkulapsia (4, 5) GBS-infektiolta, eräitä polysakkarideja on puhdistettuja testattu terveissä aikuisissa koerokotteina (6). Jos käytettävissä olisi turvallinen ja tehokas GBS-rokote, sitä voitaisiin antaa naisille ennen raskautta tai sen 2 110993 aikana vasta-aineiden esille saamiseksi, jotka sitten siirtyisivät sikiöön ja antaisivat suojan vastasyntyneen infektoitumista vastaan. Kolmesta vapaaehtoisissa testatusta GBS-polysakkaridista (tyypit la, II ja III) tyypillä II oli korkein immunogeenisyys, se tuotti tyypille II spesifisen vasta-ainevasteen 88 %;ssa aikaisemmin ei-immuuneista 5 saajista (6). Vaikka erilaisten GBS-serotyyppien on tiedetty myötävaikuttavan merkittävästi GBS-infektion saaneiden potilaiden prosentuaaliseen osuuteen, tyypillä V ei ole katsottu olevan merkittävää prosenttiosuutta GBS-infektioista. Vastasyntyneille ei ole määritetty vaadittavaa spesifistä vasta-ainetasoa, joka suojaisi tyypin II GBS-infektiol-ta, mutta se on arvioitu 2 tai 3 pg:ksi/ml (6). Rokotetulla, jonka vasta-ainevaste yltää 10 vain hieman yli minimitason, joka tarvitaan suojan saamiseen, äidin vasta-ainemäärä, joka siirtyy istukan kautta, saattaa olla riittämätön suojaamaan keskosta, koska äidin immunoglobuliini G (IgG) siirtyy epätäydellisesti sikiöön, tai pikkulasta, jolla on "late-onset" -infektio, koska äidin IgG-vasta-aineiden puoliintumisaika vastasyntyneessä on noin 25 vuorokautta (13). Monet näihin kahteen potilasryhmään kuuluvista pikkulap-15 sista voitaisiin suojata, jos rokotuksen spesifisen vasta-ainevasteen suuruusluokka olisi korkeampi. Äidin IgG:n siirtyminen sikiöön kasvaa koko raskauden kolmannen kolmanneksen ajan, joten korkeampi äidin vasta-aineen taso antaisi suojan aikaisemmin, toisin sanoen varhaisemmalle keskoselle (16). Samaten äidin suurempi vasta-ainetaso aikaansaisi äidin vasta-aineiden säilymisen pitempään vauvassa, jolloin saataisiin yhtä 20 hyvin suoja "late-onset"-tautia vastaan.

Useiden bakteeripolysakkaridiantigeenien immunogeenisyys on lisääntynyt, kun poly-sakkarideihin tai niistä johdettuihin oligosakkarideihin on liitetty sopivia kantajaproteiineja (2, 14, 17-19, 22, 27, 29, 30, 34). Toivottuja polysakkaridi-proteiini-konju-.: 25 gaattien ominaisuuksia ovat polysakkaridin parantunut immunogeenisyys, suurentunut hapteenispesifinen vasta-ainevaste tehosteannoksiin ja IgG-luokan vasta-aineiden hallitsevuus. Olemme äskettäin onnistuneet kehittämään GBS III-tetanus-toksoidi (TT) rokotteen käyttämällä sivuketjusiaalihappo-osia ohjatun proteiiniliitännän kohtina (33). III-TT-rokote toi esiin GBS-tyypille III spesifisiä, opsonisesti aktiivisia vasta-aineita, 30 kun sen sijaan konjugoimaton tyypin III polysakkaridi ei ollut immunogeeninen kaniineissa (33).

Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla valmistetaan antigeenisiä konjugaattimole-35 kyylejä, jotka käsittävät B-ryhmän streptokokin tyypistä II johdetun kapselipolysakka ridin ja jonkin proteiinikomponentin tai B-ryhmän streptokokin tyypistä V johdetun kapselipolysakkaridin ja jonkin proteiinikomponentin ja joissa kaksi tai useampi tyypin % 3 110993 II tai tyypin V polysakkaridikomponentin siaalihappotähteisiin päättyvä sivuketju on liitetty kukin sekundaarisella amiinisidoksella proteiiniin.

Keksintö koskee B-ryhmän streptokokkityypin II tai -tyypin V kapselipolysakkaridin ja 5 jonkin proteiinin konjugaattimolekyylien valmistusmenetelmää, jossa: (a) B-ryhmän streptokokkityypin II tai -tyypin V kapselipolysakkaridille suoritetaan periodaattihapetus, joka riittää viemään aldehydiryhmän polysakkaridin rankaan liittyvään kahteen tai useampaan terminaaliseen siaalihappotähteeseen; (b) hapetettu B-ryhmän streptokokkityypin II tai -tyypin V kapselipolysakkaridi liite-. 10 tään proteiiniin pelkistävän aminoinnin avulla sekundaarisen amiinisidoksen luomiseksi kapselipolysakkaridin ja proteiinin välille.

Edellä kuvatulla menetelmällä valmistetut konjugaattimolekyylit sisältyvät myös keksintöön.

15

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Esitetään myös rokotteita, jotka kukin muodostuvat edellä kuvatuista konjugaattimo-lekyyleistä. Lisäksi tämä hakemus koskee multivalentteja rokotteita, jotka käsittävät 20 keksinnön mukaisesti saatuja konjugaattimolekyylejä ja ainakin yhden muun immu-nogeenisen molekyylin, joka pystyy tuomaan esiin vasta-ainetuotannon jollekin patogeeniselle aineelle, joka on muu kuin B-ryhmän streptokokin tyyppi II tai tyyppi V. Erityisesti sen lisäksi, että multivalentti rokote käsittää B-ryhmän streptokokin tyypin II ja/tai GBS tyypin V konjugaattimolekyylejä, se käsittää lisäksi muita : 25 immunogeenisiä molekyylejä, jotka kykenevät tuomaan esiin vasta-ainetuotannon patogeeneille, jotka kuuluvat ryhmään, jonka muodostavat B-ryhmän streptokokin tyypit Ia, Ib, III, IV ja Haemophilus influenzaen tyyppi b ja E. colin tyyppi Kl.

Hakemuksessa kuvataan vastasyntyneiden immunisointimenetelmää, jossa rokote, 30 joka käsittää keksinnön mukaisia konjugaattimolekyylejä, annetaan immunogeenisenä määränä naishenkilölle vasta-aineiden tuottamiseksi, jotka pystyvät siirtymään sikiöön, joka on hedelmöitynyt ennen rokotteen antamista tai sen jälkeen, riittävänä määränä suojan antamiseksi infektiota vastaan vastasyntyneelle syntymähetkellä.

35 Aikuisten immunisointimenetelmä, jossa keksinnön mukaisesti saatuja konjugaattimolekyylejä sisältävä rokote annetaan immunogeenisenä määränä aikuiselle henkilölle, sisältyy myös hakemukseen. Lisäksi hakemuksessa kuvataan aikuisten immu 4 110993 nisointimenetelmää, jossa konjugaattimolekyylejä sisältävä rokote annetaan immu-nogeenisenä määränä henkilölle, joka on vaarassa saada B-ryhmän streptokokin tyypin II tai tyypin V infektio.

5 Keksinnön mukaisesti saatuja konjugaattimolekyylejä sisältävä rokote annetaan immunogeenisenä määränä vapaaehtoisille rokotteen saajille, jotka voisivat luovuttaa seerumia tai plasmaa, jota voitaisiin antaa passiivisesti edellä mainituille ryhmille. Hakemuksessa kuvataan myös henkilöiden, mukaan lukien vastasyntyneet, lapset ja aikuiset, jotka ovat vaarassa saada B-ryhmän streptokokin tyypin II tai tyypin V 10 infektion, immunisointimenetelmää. Vaarassa olevat voivat käsittää myös henkilöitä, joiden immuunijärjestelmä on heikentynyt erilaisista syistä, mukaan lukien syöpä tai diabetes, mutta rajoittumatta näihin.

Hakemuksessa kuvataan myös menetelmä lypsykarjan immunisoimiseksi naudan 15 mastiittia vastaan, jossa menetelmässä lypsylehmille annetaan immunogeenisenä määränä rokotetta, joka sisältää keksinnön mukaisesti saatuja konjugaattimolekyylejä.

Lvhvt piirustusten kuvaus

Kuvio 1. GBS-tyypin II kapselipolysakkaridin toistuvan heptasakkaridiyksikön 20 rakenne (20).

Kuvio 2. GBS-tyypin II polysakkaridin kompetitiivinen ELISA. GBS-tyypin Ia (o), tyypin II (·) ja tyypin III (a) polysakkarideja käytettiin II-TT -rokotteen vasta-aineen, joka sitoutui levyihin, jotka oli päällystetty tyypin II polysakkaridilla, inhibiittoreina. Tulokset on ilmoitettu inhibitioprosentteina vertailukuopista, joissa ei ollut : 25 inhibiittoria.

t <

Kuvio 3. GBS-tyypin II polysakkaridin kompetitiivinen ELISA. Natiiveja (·) ja desi-alyloituja tai ydinalueen (□) tyypin II polysakkarideja käytettiin II-TT-rokotteen esille tuomien vasta-aineiden inhibiittoreina. Tuloksiin merkityt pisteet ovat kolmen määrityksen keskiarvoja (standardipoikkeamin). Tulokset on ilmoitettu inhibitiopro-30 sentteinä vertailukuopista, joissa ei ollut inhibiittoria.

!., Kuvio 4. Tyypin V GBS-kapselipolysakkaridin toistuvan yksikön rakenne.

Kuvio 5. GBS-tyypin V polysakkaridin kompetitiivinen ELISA. GBS tyypin Ia (-A-), tyypin Ib (-Δ-), tyypin II (-·-), tyypin III (-o-), tyypin V (--) ja tyypin VI (-□ -) polysakkarideja käytettiin V-TT-rokotteen esille tuomien vasta-aineiden inhi-35 biittoreina. Tuloksien pisteet ovat kahden määrityksen keskiarvoja. Tulokset on ilmoitettu inhibitioprosentteina vertailukuopista, joissa ei ollut inhibiittoria.

Kuvio 6. GBS-tyypin V kannan CJB 111, joka on opsonisoitu GBS-tyypin V-TT- 110993 5 rokotteelle kehitetyillä kaniinin antiseerumeilla, tappaminen opsonofagosyyttisesti ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteillä. C on komplementti.

Suositeltavien toteutusmuotojen kuvaus 5 Keksintö koskee antigeenisiä konjugaattimolekyylejä, jotka käsittävät kapselipo- lysakkaridikomponentin ja proteiinikomponentin.

Bakteerikannat. GBS-tyypin II kanta 18RS21 ja tyypin Ia kanta 090 saatiin alunperin edesmenneeltä Rebecca Lancefieldiltä Rockefeller Universitystä ja niitä säily-10 tettiin pakasteviljelminä -80 °C:ssa. Kantaa 18RS21 käytettiin in vitro ja in vivo -määrityksissä ja ne olivat konjugaattirokotteessa käytetyn tyypin II kapselipolysakkaridin lähteenä. Kaksi GBS-tyypin II kliinistä isolaattia (kannat S16 ja S20) ja tyypin III kanta M781 saatiin Channing Laboratoryn viljelykokoelmasta.

15 Vaikka tyypin V serotyypin ei ole aikaisemmin todettu merkittävästi myötävaikuttavan moniin GBS-infektioihin ihmisissä, äskettäin saadut todisteet osoittavat nyt, että se on mukana noin 15 %:ssa GBS-infektioista. GBS-tyypin V konjugaattirokotteen valmistusta varten GBS-tyypin V kanta 1169-NT1 saatiin tri J. Jelinkovalta Kansanterveyden ja epidemiologian laitokselta, Prahasta, Tsekin tasavallasta, ja sitä säily-20 tettiin pakasteviljelmänä -80 °C:ssa. Kantaa 1169-NT1 käytettiin in vitro ja in vivo -kokeissa ja se oli konjugaattirokotteessa käytetyn tyypin V polysakkaridin lähteenä. GBS-tyypin V kanta CJB 111 saatiin alunperin tri Carol Bakerilta Baylor Universitystä.

25 GBS-tyypin II polysakkaridin tai -tyypin V polysakkaridin konjugointi TT:hen.

Tyypin II kapselipolysakkaridi puhdistettiin kannan 18RS21 soluista menetelmillä, joita on aikaisemmin kuvattu tyypin III polysakkaridin puhdistuksen yhteydessä (33). Tyypin II polysakkaridin konjugoiminen monomeeriseen TT:hen suoritettiin käyttämällä menetelmiä, joita on kuvattu aikaisemmin yksityiskohtaisesti TT:n konjugoi-30 miseksi GBS-tyypin III polysakkaridiin (33). Lyhyesti sanoen natiivi tyypin II polysakkaridi fraktioitiin koon mukaan Sepharose CL-6B -pylväässä (1,6 x 85 cm; . < Pharmacia Fine Chemicals). Materiaali, joka eluoitui suurimman piikin keskellä, : * - koottiin, dialysoitiin vettä vastaan ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin materiaali, jonka suhteellinen moolimassa oli 200 000. Tämän materiaalin tutkiminen ’H-NMR-• 35 spektroskopialla 500 MHz:llä vahvisti natiivin tyypin II polysakkaridin rakenteen (20) ja B-ryhmän antigeenin puuttumisen (26). Polysakkaridien, jotka sopivat käytettäviksi tämän keksinnön mukaisissa konjugaattimolekyy 1 eissä, moolimassat voivat vaihdella kovasti. Suositeltava moolimassa-alue polysakkaridikomponentille on noin 6 110993 5 000 - 1 000 000 daltonia. Vielä suositeltavampi alue on 100 000 - 300 000. Alueelta 100 000 - 300 000 daltonia polysakkaridit, joiden moolimassa on noin 200 000 daltonia, ovat suositeltavimmat.

5 Koon mukaan fraktioidulle tyypin II polysakkaridille suoritettiin mieto hapetus nat-riummetaperiodaatilla (18). Tämän menettelyn tuloksena osa polysakkaridilla olevista siaalihappotähteistä muuttui siaalihapon kahdeksanhiiliseksi analogiksi, 5-asetami-do-3,5-dideoksi-D-galaktosyylioktulosonihapoksi (33). Hapettuneiden siaalihappo-tähteiden prosenttiosuus määritettiin siaalihappotähteiden ja niiden hapettuneiden 10 johdoksien kaasukromatografia-massaspektrometrialla, kuten aikaisemmin on kuvattu (33). On suositeltavaa, että noin 5 - 50 % kunkin GBS-tyypin II polysakkaridin siaalihappotähteistä muuttuu ja on käytettävissä proteiiniin liittymistä varten. Mitä suositeltavinta on, että noin 5 - 25 % GBS-tyypin II polysakkaridin siaalihappotähteistä muuttuu ja on käytettävissä proteiiniin liittymistä varten. Kaikkein suositelta-15 vinta on, että noin 5 -10 % GBS-tyypin II polysakkarideista muuttuu.

Suositeltavaa on hapettaa GBS-tyypin V polysakkaridi, jotta päästään noin 5 - 80 % terminaalisista siaalihappotähteistä muuttumiseen reaktiivisten aldehydien muodostamiseksi. Vielä suositeltavampaa on muuttaa noin 10 - 50 % terminaalisista siaali-20 happotähteistä.

Keksinnön mukaisten konjugaattimolekyylien proteiinikomponentti voi olla mikä tahansa fysiologisesti siedetty proteiini. Suositeltavimpia proteiineja ovat tetanustok-soidi, difteriatoksoidi ja ristireaktiiviset materiaalit, kuten CRMi97.

25

Hapetettu tyypin II polysakkaridi liitettiin monomeeriseen tetanustoksoidiin ("TT") * (Institute Armand Frappier, Montreal, Kanada) pelkistävällä aminoinnilla, kuten ai kaisemmin on kuvattu (33). TT puhdistettiin monomeerikseen geelisuodatuskroma-tografialla myös kuten aikaisemmin on kuvattu (33). Lyhyesti sanottuna 10 mg peri-30 odaatilla käsiteltyä tyypin II polysakkaridia ja 10 mg puhdistettua TT:a liuotettiin 0,6 ml:aan 0,1 M natriumbikarbonaattia (pH 8,1). Natriumsyanoboorihydridiä -t. (20 mg) lisättiin seokseen ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 vuorokautta. Konjugaation ete nemistä seurattiin nopealla proteiininestekromatografialla (FPLC) pienistä reaktiose-oksen näytteistä, jotka analysoitiin Superase 6 (Pharmacia) geelisuodatuspylväällä.

35 Reaktio oli päättynyt, kun pylvään tyhjätilassa eluoituvan piikin korkeus pysyi muuttumattomana (edustaen suuren moolimassan omaavaa konjugaattia). Konju-gaatti puhdistettiin kromatografialla Biogel A -pylväässä, 0,5 M (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia), kuten aikaisemmin on kuvattu (33). Rokotteen proteii 110993 7 nipitoisuus määritettiin Lowryn et ai. menetelmällä (25) käyttäen naudanseerumial-bumiinia standardina. Hiilihydraattipitoisuus määritettiin Dubois'n et ai. menetelmällä (11) käyttäen puhdistettua tyypin II polysakkaridia standardina.

5 Tyypin V kapselipolysakkaridi puhdistettiin GBS-tyypin V kannan 1169-NT1 soluista menetelmillä, joita on aikaisemmin kuvattu tyypin II polysakkaridin puhdistuksen yhteydessä (33). Tyypin V polysakkaridin konjugoiminen monomeeriseen TT.iin suoritettiin käyttäen menetelmiä Joita on aikaisemmin kuvattu yksityiskohtaisesti TT:n ja GBS-tyypin III polysakkaridin konjugoinnin yhteydessä (33).

10

Natiivin tyypin V polysakkaridin suhteellinen moolimassa oli 200 000 daltonia. Tämän materiaalin analyysi H-NMR-spektroskopialla 500 MHz:llä vahvisti natiivin tyypin V rakenteen (2) ja B-ryhmän antigeenin puuttumisen (26).

15 Reaktiivisten aldehydiryhmien tuomiseksi tyypin V polysakkaridin terminaalisiin siaalihappotähteisiin proteiiniin liittämistä varten tyypin V polysakkaridille suoritettiin mieto hapetus natriummetaperiodaatilla (18). Tämän menettelyn tuloksena osa polysakkaridilla olevista siaalihappotähteistä muuttui siaalihapon kahdeksanhiiliseksi analogiksi, 5-asetimido-3,5-dideoksi-D-galaktosyylioktulosonihapoksi (33). Hapettu-20 neiden siaalihappotähteiden prosentuaalinen osuus määritettiin siaalihappotähteiden ja niiden hapettuneiden johdoksien kaasukromatografia-massaspektrografialla.

Hapetettu tyypin V polysakkaridi liitettiin monomeeriseen TT:iin (Institute Armand Frappier, Montreal, Kanada) pelkistävällä aminoinnilla, kuten aikaisemmin on kuvat-25 tu (33). TT puhdistettiin monomeerikseen geelisuodatuskromatografialla myös kuten aikaisemmin on kuvattu (33). Lyhyesti sanottuna 8,6 mg periodaatilla käsiteltyä tyypin V polysakkaridia ja 8,7 mg puhdistettua TT:a liuotettiin 0,5 ml:aan 0,1 M natriumbikarbonaattia (pH 8,2). Natriumsyanoboorihydridiä (31,5 mg) lisättiin seokseen ja inkuboitiin 37 °C:ssa 10 vuorokautta. Konjugaation etenemistä seurattiin nopealla 30 proteiininestekromatografialla (FPLC) pienistä reaktioseoksen näytteistä, jotka analysoitiin Superose 6 (Pharmacia) geelisuodatuspylväällä. Reaktio oli päättynyt, kun 11 pylvään tyhjätilassa eluoituvan piikin korkeus pysyi muuttumattomana (edustaen suuren moolimassan omaavaa konjugaattia). Konjugaatti puhdistettiin kromatogra-fialla 2,6 x 91 cm Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) pylväässä, käyttäen 0,01 M fos-* 35 faattia, 0,15 M NaCl:a, pH 7, plus 0,01% timerosaalia ajopuskurina. Rokotteen pro teiinipitoisuus määritettiin Lowryn et ai. menetelmällä (25) käyttäen naudanseeru-mialbumiinia standardina. Hiilihydraattipitoisuus määritettiin Dubois'n et ai. menetelmällä (11) käyttäen galaktoosia standardina.

110993 8

Kaniinien rokottaminen II-TT-rokotteella ja V-TT-rokotteella. Kolmen Uuden-Seelannin valkoisen naaraskaniinin, joista kukin painoi noin 3 kg, ryhmiä rokotettiin ihon alle neljään kohtaan selkään 50 pg.lla joko konjugoimattoman natiivin tyypin II 5 polysakkaridin käsittävää rokotetta tai II-TT-rokotetta, jotka kummatkin oli emulgoi-tu Freundin täydelliseen adjuvanttiin 2 ml:n kokonaistilavuuteen. Nämä eläimet saivat tehosteruiskeet (50 pg) rokotetta, joka oli valmistettu epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin, päivinä 20 ja 41. Seerumia otettiin kustakin eläimestä päivinä 0,20, 34, 41, 55 ja 70; suodatettiin steriiliksi ja varastoitiin -80 °C:seen.

10

Uuden Seelannin valkoinen naaraskaniini (Millbrook Farms, Amherst, Mass.), joka painoi noin 3 kg, rokotettiin ihon alle neljään kohtaan selässä 50 pg;lla GBS-tyypin V-TT konjugaattirokotetta, joka oli sekoitettu alunaan 2 ml:n kokonaistilavuuteen. Tämä eläin sai tehosteruiskeet (50 pg) rokotetta päivinä 22 ja 42. Seerumia otettiin 15 kustakin eläimestä päivinä 0, 35, 56 ja 91; suodatettiin, steriloitiin ja varastoitiin -80°C:seen.

ELISA-määritykset. GBS-tyypille II spesifisiä kaniinin vasta-aineita kvantifioitiin entsyymi-immunologisella menetelmällä (ELISA) vuohen anti-kaniini-IgG:llä, joka 20 oli konjugoitu alkaliseen fosfataasiin (Tago Inc. Burlingham, Kalifornia) 1/3 000 laimennoksena. Mikrotitrauslevyjä (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Inc., Chan-tillty, Va.) päällystettiin 100 ng:lla puhdistettua tyypin II polysakkaridia, joka oli sidottu poly-L-lysiiniin, kuoppaa kohti, kuten aikaisemmin on kuvattu (15,33). Vasta-ainetiitterit rekisteröitiin resiprookkilaimennoksena, josta saatiin A405 > 0,3, kun 25 kuopat, jotka sisälsivät vertailuseerumia (kaniinin antiseerumi, joka oli kehitetty GBS 18RS21 kokosoluja vastaan) 1/800 laimennoksena, ylsivät A405 0,5:een. Kon-jugaattirokotteen proteiiniosalle spesifinen vasta-ainemäärä määritettiin ELISA; 11a käyttämällä levyjä, jotka oli päällystetty monomeerisella TT:lla (100 ng per kuoppa). TT-spesifiset IgG-tiitterit rekisteröitiin resiprookkilaimennoksena, jonka tuloksena 30 oli A405 > 0,3 35 minuuttia substraatin, p-nitrofenyylifosfaatin (Sigma 104 fosfataasi-substraattitabletit; Sigma Chemical Co.) lisäämisen jälkeen.

< ») GBS-tyypille V spesifisiä kaniinin vasta-aineita kvantifioitiin entsyymi-immunologisella menetelmällä (ELISA) vuohen anti-kaniini-IgG;llä, joka oli konjugoitu alkali-35 seen fosfataasiin (Tago Inc. Burlingham, Kalifornia) 1/3 000 laimennoksena. Mikrotitrauslevyjä (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Inc., Chantillty, Va.) päällystettiin 100 ng:lla puhdistettua tyypin V polysakkaridia, joka oli sidottu poly-L-lysiiniin, kuoppaa kohti, kuten aikaisemmin on kuvattu (15). Vasta-ainetiitterit rekisteröitiin 110993 9 resiprookkilaimennoksenaJosta saatiin A405 > 0,3, kun kuopat, jotka sisälsivät ver-tailuseerumia (kaniinin antiseerumi, joka oli kehitetty tyypin V kannan 1169-NT1 kokosoluja vastaan) 1/3 000 laimennoksena, ylsivät A405 0,3:een.

5 IgG:n ja IgM:n erottaminen immuunin kaniinin seerumista. Proteiini A-agaroo-siaffiniteettipylväskromatografiaa (Pierce Chemicals Co., Rockford, 111.) käytettiin immunoglobuliinien (IgG ja IgM) erottamiseen 0,5 ml.sta koottua immuunin kaniinin seerumia, joka saatiin päivänä 70 ja joka oli kehitetty II-TT-rokotteelle, kuten toisaalla on kuvattu (28). Vasta-aineluokkien erottuminen vahvistettiin tyypin II polysak-10 karidilla päällystetyillä ELISA-levyillä vuohen anti-kaniini-IgG:llä (y- ja kevytketju- spesifinen; Tago), jota käytettiin 1/500 laimennoksena Ja vuohen anti-kaniini-IgM.llä (μ-ketjuspesifinen; Sera-Lab, Westbury, N. Y.)Jota käytettiin 1/200 laimennoksena.

15 Kompetitiivinen Elisa. II-TT-rokotteelle kehitetyn kaniinin seerumin spesifisyys määritettiin kompetitiivisella ELISA:lla käyttäen homologisia (tyyppi II) ja heterolo-gisia (tyypit Ia ja III) polysakkarideja inhibiittoreina. Rokotteella indusoidun kootun kaniinin seerumin epitooppispesifisyys (saatiin päivänä 70) tutkittiin käyttäen natii-via ja desialyloitua tyypin II polysakkaridia ja B-Ö-metyyligalaktopyranoosia vasta-20 aineen sitoutumisen inhibiittoreina. Natiivi tyypin II polysakkaridi desialyloitiin käsittelemällä 6-prosenttisella etikkahapolla 80 °C:ssa 2 tuntia. Polysakkaridi-inhibiittoreista tehtiin 4-kertaiset sarjalaimennokset ja sekoitettiin vastaavaan tilavuusmää-rään (75 μΐ) kaniinin seerumipoolia(laimennettuna 10000-kertaisesti),jokasaatiin päivänä 70 II-TT-rokotteella rokottamisen jälkeen. Tämä seos (100 μΐ) lisättiin sitten 25 tyypin II polysakkaridilla päällystettyihin ELISA-levyihin. Alkaliseen fosfataasiin konjugoitua anti-kaniini-IgG:tä käytettiin sekundaarisena vasta-aineena 1/3 000 laimennoksena. Tulokset ilmoitetaan seuraavasti: inhibitio-% = [(A405 ilman inhibiittoria - A405 inhibiittorin kanssa)/A405 ilman inhibiittoria] x 100.

30 GBS V-TT-kaniinin-antiseerumin serotyyppispesifisyys määritettiin käyttäen GBS-tyyppispesifisiä polysakkarideja Ia, Ib, II, III, V ja VI. ELISA-kuopat päällystettiin . 100 ng:lla/kuoppa GBS-tyypin V polysakkaridia, joka oli sidottu poly-L-lysiiniin.

Kaniinin antiseerumia V-TT-rokotteelle, laimennettuna 1 /6 000, inkuboitiin kunkin polysakkaridi-inhibiittorin kanssa. Inkuboidut antiseerumit lisättiin ELISA-kuoppiin 35 ja levy käsiteltiin vuohen anti-kaniini-IgG-alkalinen fosfataasikonjugaatilla (laimennettuna 1 /3 000) ja substraatilla, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti kuvattu (28).

110993 10 GBS:n vasta-ainevälitteinen tappaminen in vitro. Rokotteella indusoitujen kaniinin vasta-aineiden kyky opsonisoida GBS-soluja sen jälkeen tapahtuvaa ihmisen perifeerisen veren leukosyyteillä tappamista varten määritettiin in vitro opsonofa-gosytoosimäärityksellä (7, 8).

5

Reaktiokoe GBS tyypin V reaktiivisten vasta-aineiden opsonofagosyyttisen aktiivi- n suuden määrittämiseksi toteutettiin inkuboimalla 1,5 x 10 valkoisia verisoluja (WBC) 300 pissa puskuria; 3 x 106 CFU tyypin V GBS-kantaa CJB 111 50 pissa; ihmisen komplementtia (absorboitu GBS-tyypin V kannan soluilla) (50 pl); vasta-10 aine-anti-V-TT-lämmöllä inaktivoituna (50 pl); muunnettua Eagle's Medium -elatusainetta (50 pl). Seosta inkuboitiin samalla sekoittaen 60 minuuttia 37 °C:ssa. Ero GBS-pesäkkeitä muodostavissa yksiköissä (CFU) määritettiin 37 °C:ssa 1 tunnin inkuboinnin jälkeen standardin mukaisella levylaskentamenetelmällä.

15 Hiirien passiivinen suojaus rokotteella indusoiduilla kaniinin vasta-aineilla.

10 Swiss-Webster-risteytettyyn naarashiireen (Taconic Farms, Germantown, N.Y.), joista kukin painoi 18 - 20 g, ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 0,2 ml kaniineista, jotka oli rokotettu joko tyypin II polysakkaridilla tai II-TT-rokotteella, (päivänä 70) koottua seerumia. Seerumipoolin, joka saatiin päivänä 70 tyypin II polysakkaridilla 20 immunisoiduista kaniineista, tiitteri oli 100 ja II-TT-rokotteella immunisoitujen kaniinien seerumin tiitteri oli 12 800. Viiden hiiren verrokkiryhmä sai koottua esi-immunisoitua kaniinin seerumia tai koottua konjugoimattomalle TT:lle kehitettyä antiseerumia (27). Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin hiiriin tartutettiin tyypin 11 kanta 18RS21 (1,5 x 105 CFU/hiiri) 1,0 min kokonaistilavuudessa Todd-Hewitt-25 lihalientä. Altistusannos oli kustakin kannasta aikaisemmin määritetty kohtalokkaaksi >90 %:lle samanpainoisista ja -ikäisistä hiiristä. Elossa olevat hiiret laskettiin 1 päivittäin kolmena peräkkäisenä päivänä.

Tilastollinen analyysi. Fisherin eksaktia koetta käytettiin verrattaessa eri kaniinin 30 seerumien kykyä suojata passiivisesti hiiriä kuolemaan johtavalta GBS-infektiolta.

Tulokset II-TT-rokotteen ja V-TT-rokotteen valmistus ja koostumus. GBS II-TT-rokote ja GBS V-TT-rokote valmistettiin menetelmillä, joita on aikaisemmin kuvattu GBS 35 tyypin III konjugaattirokotteen valmistamisen yhteydessä (33). Tyypin II GBS-poly-sakkaridin hallitun periodaattihapetuksen tuloksena 7 % polysakkaridin siaalihappo-tähteistä muuttui kaasukromatografia-maasaspektrometrialla määritettynä. Mono-meerinen TT sidottiin kovalenttisesti muunnettuihin siaalihappokohtiin tyypin II po- 110993 11 lysakkaridilla pelkistävän aminoinnin avulla. Puhdistettu Π-ΤΤ-rokote sisälsi 32 % (paino/paino) proteiinia ja 68 % (paino/paino) hiilihydraattia. II-TT-rokotteen lopullinen saanto oli 7,8 mg eli 39 %.

5 Tyypin V GBS-polysakkaridin hallitun periodaattihapetuksen tuloksena noin 8 %, 25 % ja 50 % siaalihappotähteistä polysakkaridissa muuttui. Monomeerinen TT liitettiin kovalenttisesti muunnettuihin siaalihappotähteisiin tyypin V polysakkaridilla pelkistävän aminoinnin avulla. Polysakkaridit, jotka hapettuivat niin, että noin 8 % niiden siaalihappotähteistä muuttui, tuottivat konjugaatteja, joissa polysakkari- 10 di/proteiinimoolisuhde oli alhainen. Polysakkaridit, joissa 25 tai 50 % terminaalisista siaalihappotähteistä muuttui, tuottivat konjugaattimolekyylejä, joissa oli suositeltavampi polysakkaridin ja proteiinin moolisuhde. Erästä GBS-tyypin V polysakkaridia, jossa 25 % siaalihappotähteistää muuttui, käytettiin konjugaattirokotteiden, joilla on taulukossa 1 esitetyt biokemialliset ominaisuudet, valmistukseen.

15

Taulukko 1 GBS-twpin V-TT-rokotteen koostumus 20 _

Polysakkaridin koko (Mr) 200 000

Hapettuneita siaalihappotähteitä (%) 25

Rokotteen määrä tetanustoksoidina (kuivapaino-%) 3 8

Rokotteen määrä hiilihydraattina (kuivapaino-%) 62 25 Mooli hiilihydraattia/mooli proteiinia2 0,56 a Tetanustoksoidimonomeerin määritetty Mr oli 150 000.

30 II-TT-rokotteen ja V-TT-rokotteen immunogeenisyys kaniineissa. II-TT-rokotteen ja natiivin tyypin II polysakkaridin immunogeenisyyttä vertailtiin kaniineissa. , II-TT-rokotteen ensiannoksen jälkeen todettiin tyypille II spesifisten vasta-aineiden - ’ *' lisääntyminen (taulukko 2). Tehosteannos rokotetta vahvisti edelleen vasta-aine- vastetta. Vasta-ainetasot pysyivät muuttumattomina tai nousivat hieman toisen tehos-. 3 5 teannoksen jälkeen, joka annettiin päivänä 41, ja pysyivät ennallaan tutkimuksen loppuajan (taulukko 2). Päinvastoin kuin II-TT-rokote konjugoimaton natiivi GBS-tyypin II polysakkaridi ei pystynyt tuomaan esiin spesifistä vasta-ainevastetta (taulukko 2). Eläimet, jotka rokotettiin II-TT-rokotteella, kehittivät myös vasta- 110993 12 aineita TT:lle päästen noin 3-log10 nousuun yli esi-immunisointitasojen.

Taulukko 2. GBS-tyypin II polysakkaridispesifiset vasta-ainet litter it 5 kaniineissa, jotka rokotettiin natiivilla tyypin II

polysakkaridilla tai II-TT-rokotteella

Vasta-ainetiitteri ELISA:ssa päivänä3:

Rokote ja kaniini 10 0 20b 34 41b 55 70

Natiivi tyypin II polysakkaridi 1 100 100 100 200 100 100 15 2 100 100 100 100 100 100 3 200 100 100 100 100 100

II-TT

1 100 400 3200 3200 6400 12800 2 100 1600 3200 6400 6400 25600 20 3 100 6400 12800 25600 12800 12800 3 Arvo 100 tarkoittaa vasta-ainetiitteeriä <100. Arvot ovat kahden määrityksen keskiarvoja. Kaniinit rokotettiin subkutaanisesti 50 pg:lla rokotetta Joka oli emulgoitu Freundin täydelliseen adjuvanttiin, päivänä 0.

25 b Annettiin tehosteannokset Freundin epätäydellisessä adjuvantissa.

V-TT-rokotteen (polysakkaridi hapetettu 25 %:iin) immunogeenisyyttä mitattiin myös kaniineissa. Vasta-ainetasot (IgG) nousivat tyypin V-TT-rokotteen ensimmäi-30 sen ja toisen annoksen jälkeen ja pysyivät sellaisina tutkimuksen ajan (taulukko 3).

i • · ' 110993 13

Taulukko 3. GBS-twpin V polysakkaridille spesifisen IgG:n tiitteri 5 _

IgG-tiitteri määritettynä ELISA.lla päivänä3:

Rokote 0 35 56 91

V25%ox-TT

10 Kaniini la 100 800 1600 1600 3 Tämä eläin sai kolme 50 gg:n annosta rokotetta sekoitettuna alunaan 3 viikon välein alkaen päivästä 0.

15

Rokotteella indusoitujen kaniinin seerumien antigeeniset ominaisuudet. Polysakkaridin konjugoiminen proteiinikantajaan ei saisi muuttaa tärkeitä antigeenisiä epitooppeja, joita tavataan polysakkaridilla sen natiivimuodossa. Testasimme II-TT-rokotteella indusoitujen vasta-aineiden spesifisyyden kompetitiivisella ELlSA:lla 20 käyttäen homologisia ja heterologisia GBS-polysakkarideja inhibiittoreina. Natiivi tyypin II polysakkaridi inhiboi 450 ng/ml konsentraationa 50-prosenttisesti II-TT-rokotteelle nostettujen kaniinin vasta-aineiden sitoutumista (kuvio 2). GBS tyypin Ia ja tyypin III polysakkaridit eivät estäneet Π-ΤΤ-rokotteeIle nostetun seerumin sitou-mista edes niinkään suurena konsentraationa kuin 500 pg/ml (kuvio 2). Nämä tulok-25 set todentavat II-TT-rokotteella indusoitujen vasta-aineiden serotyyppispesifisyyden kohdeantigeeneja kohtaan ja osoittavat konjugaattirokotteen polysakkaridiosan anti-: geenisten epitooppien säilyneen.

Sen määrittämiseksi, säilyikö epitooppi, johon siaalihappo vaikutti, II-TT-rokotteen 30 valmistuksen aikana, käytimme kompetitiivisessa ELISA:ssa natiivia ja desialyloitua tyypin II polysakkaridia II-TT-rokotteelle kehitettyjen kaniinin vasta-aineiden sitoutumisen inhibiittoreina. Polysakkaridi desialyloitiin käsittelemällä 6-prosenttisella etikkahapolla 80 °C:ssa 2 tuntia. Siaalihappotähteiden kvantitatiivinen poistuminen vahvistettiin tiobarbituurihappokokeella (32) käyttäen N-asetyylineuramiinihappoa . 35 (Sigma) standardina. Natiivin tyypin Π polysakkaridin Kav oli ennen happokäsittelyä 0,49, kun hapolla käsitellyn polysakkaridin Kav oli 0,52 Superose 6 FPLC -kolonnissa (LKB-Pharmacia, Ruotsi), osoittaen polysakkaridin molekyylikoon vähäistä pienenemistä sivuketjun siaalihappotähteiden poistumisen vuoksi, ne kun kattavat jopa 14 11Q993 20 % natiivipolysakkaridin painosta. Jopa 200 pg desialyloitua GBS tyypin II polysakkaridia per ml esti 33 %:lla II-TT-rokotteen vasta-aineiden sitoutumisen natii-viin tyypin II polysakkaridiin (kuvio 3). Sen että II-TT-rokotteen antiseerumi tunnisti suhteellisen heikosti desialyloidun eli tyypin II ydinpolysakkaridin, vahvistetiin im-5 munoelektroforeesigeeleillä, jotka osoittivat presipitiinisidoksen muodostuvan natii-vin, mutta ei tyypin II ydinpolysakkaridin kanssa (ei esitetty). II-TT-rokotteen anti-seerumien sitoutumista natiiviin tyypin II polysakkaridiin ei voitu estää β-0-metyyli-galaktopyranoosilla, jota käytettiin konsentraationa 0,01-10 mg/ml (ei esitetty).

10 GBS tyypin V-TT-rokotteella indusoitujen vasta-aineiden spesifisyys testattiin kom-petitiivisella ELISA.lla käyttäen homologisia ja heterologisia GBS-polysakkarideja inhibiittoreina. Natiivi tyypin V polysakkaridi esti tehokkaasti tyypin V-TT-rokot-teelle kehitettyjen kaniinin vasta-aineiden sitoutumisen (kuvio 5). GBS tyyppi Ia, tyyppi Ib, tyyppi II, tyyppi Uija tyyppi VI eivät inhiboineet tyypin V-TT-rokotteelle 15 kehitetyn seerumin sitoutumista (kuvio 5). Nämä tulokset osoittavat tyypin V-TT-rokotteella indusoitujen vasta-aineiden spesifisyyden kohdeantigeenia kohtaan.

GBS-rokotteella indusoitujen vasta-aineiden aktiivisuus in vitro. Immuuniseerumin kyky opsonisoida GBS, jotta ihmisen perifeerisen veren leukosyytit voivat 20 tappaa sen in vitro, korreloi suojatehon kanssa GBS:a vastaan eläinten suojausko-keissa (27, 33). Vasta-aineet, joita kehittyi kolmessa II-TT-rokotteella rokotetussa kaniinissa, vahvisti GBS tyypin II kannan 18RS21 heikentymistä arvolla >1,8 logio (taulukko 4). Esi-immunisoitujen kaniinien seerumi eli seerumi, joka saatiin kaniineista, jotka oli rokotettu natiivilla GBS tyypin II polysakkaridilla tai konjugoimat-25 tomalla TT:11a, ei voimistanut GBS:n tuhoutumista in vitro (taulukko 4). Rokotteella indusoidut kaniinin vasta-aineet edistivät kahden GBS tyypin II kliinisten isolaattien * • (kannat S16 ja S20) tuhoutumista ihmisen veren leukosyyttien vaikutuksesta arvolla >1,8 logio. Kaniinin tyypin II-TT-rokotteelle kehitetyn seerumin määritettiin olevan serotyyppispesifinen, koska se ei edistänyt heterologisten (tyyppien Ia ja III) GBS- 30 kantojen tuhoutumista in vitro (taulukko 5).

» * * · 15 110993

Taulukko 4. GBS tyypin II kannan 18RS21 tuhoutuminen in vitro natiiville tyypin II polysakkaridille, II-TT-rokotteelle tai TT:lle vastaan kehitetyn kaniinin antiseerumin vaikutuksesta 5 Seeruminlähde CFU ajassa3: GBS tuhottu (kokoamispäivä) 0 min 60 min (logio)

Tyypin II polysakkaridi (70)b 4,3 xl O6 6,6 xl O6 -0,19 II-TT-rokote (0) 6,0 x 106 6,4 x 106 -0,03 10 II-TT-rokote (70)

Kaniini 1 4,0 xl O6 5,7 xl O4 1,85

Kaniini 2 4,3 x 106 2,7 x 104 2,20

Kaniini 3 3,9 xl 06 4,3 xl 04 1,96 TT (70) 4,2 xl O6 6,9 xl 06 -0,21 15 Ei mitään 3,9 xl O6 7,1 x 106 -0,26 3 Reaktioseos sisälsi kokeiltavaa seerumia (1 %:n lopullisena koepitoisuutena), tyypin II GBS-absorboitua ihmisen seerumia komplementinlähteenä, ihmisen perifeerisen veren leukosyyttejä ja tyypin II GBS 18RS21. Arvot ovat kahden 20 määrityksen keskiarvoja.

b Kaniinin seerumi koottiin ensimmäisen annoksen jälkeen natiivia tyypin Π polysakkaridia täydellisessä Freundin adjuvantissa.

t » « . » i « 110993 16

Taulukko 5. GBS-kantoien tuhoutuminen in vitro onsonofagoswttisesti esi-immunisoinnin ia II-TT-rokottelle kehitetyn immuunin kaniinin seerumin vaikutuksesta 5 _ GBS tapettu (logio)3 GBS-tyyppi ja -kanta

Esi-immunisointi Immuuni II-TT-rokote

10 II

18RS21 -0,36 1,98 S16 0,96 2,78 S20 -0,01 1,84

Ia 090 ND -0,51 15 IIIM781 ND -0,54 a CFU (logio) ajassa 60 min - CFU (log10) ajassa 0 min. Reaktioseos sisälsi testattavaa seerumia, tyypin II GBS-absorboitua ihmisen seerumia komplementinlähteenä, ihmisen perifeerisen veren leukosyyttejä ja tyypin II GBS 18RS21. Arvot ovat kahden määrityksen kes-20 kiarvoja. ND = ei tehty.

Proteiini A-affiniteettipuhdistettu IgG ja IgM saatiin kootusta seerumista, joka oli kehitetty II-TT-rokotetta vastaan (28). Kunkin Ig-fraktion spesifisyys vahvistettiin 25 ELISA:11a luokkaspesifisellä sekundaarisella vasta-aineella. IgM- ja IgG-ffaktioiden (laimennettu 1/100) A^S-arvot olivat 0,384 ja 0,009, vastaavassa järjestyksessä, μ-: ketjuspesifisellä konjugaatilla 0,086 ja 2,367, vastaavassa järjestyksessä, vuohen an- ti-kaniini-IgG:llä (f-ja kevytketjuspesifinen). Eristettyjen IgM.n ja IgG:n kyky vahvistaa tyypin II GBS:n opsonista tuhoutumista ihmisen veren leukosyyttien vaikutuk-30 sesta testattiin. Fraktioimattomat tyypin II-TT-rokotteelle kehitetyt seerumit laimennettuina 1:100 ja vastaava IgG-fraktion 1:100 laimennos samoista seerumeista edistivät tyypin II GBS :n tappamista arvolla 1,65 ± 0,22 ja 0,95 ± 0,09 logio, vastaavassa t •' ’· järjestyksessä. Sitävastoin tyypin II GBS ei kuollut, vaan kasvoi, kun läsnä oli esi- immunisointiseerumia (-0,39 ± 0,13 logio) ja IgM-rikastettua fraktiota tyypin II-TT-35 rokotteelle kehitetystä seerumista (-0,28 ± 0,09 logio) opsonofagosyyttisessä kokeessa.

GBS-tyypin V-TT-rokotteella indusoitujen kaniinin antiseerumien kyky edistää 110993 17 GBS-tyypin V kannan (CJB 111) tuhoutumista ihmisen veren leukosyyttien vaikutuksesta määritettiin myös in vitro opsonofagosyyttisellä kokeella (8). Kuten kuviossa 6 esitettään GBS-tyypin V-TT-antiseerumit 10 %:n konsentraationa tehokkaasti optimoivat GBS tyypin V kannan CJB 111 verrokkeihin verrattuna. Vertailureaktioi-5 den olosuhteet olivat: komplementti (10 %) ilman antiseerumeja; antiseerumi (10 %) ilman komplementtia; antiseerumi (1 %) ja komplementti.

Hiiren suojauskoe. Rokotteella indusoitujen vasta-aineiden suojauskyvyn testaamiseksi in vivo hiiriä immunisoitiin passiivisesti kootuilla II-TT-rokoteseerumeilla 10 (päivä 70) 24 tuntia ennen kuin niihin istutettiin tyypin II GBS 18RS21. Aikaisemmin istutusannos oli määritetty tappavaksi 90- 100 %:lle koehiiristä. Täydellisen suojan (100 %) saivat hiiriryhmät, jotka saivat GBS II-TT-rokotteelle kehitettyä seerumia, kun taas ainoastaan yksi viidestä hiirestä, jotka saivat esirokotusseerumia, jäi henkiin (taulukko 6). Yksikään ei jäänyt henkiin hiiristä, jotka saivat seerumia, joka 15 oli peräisin kaniineista, jotka oli rokotettu joko konjugoimattomalla tyypin II polysakkaridilla tai konjugoimattomalla TT:11a (taulukko 6).

Taulukko 6. Swiss-Webster-risteytettyjen hiirien passiivinen suojaus 20 GBS tyypin II kantaa 18RS21 vastaan seerumeilla, jotka oli saatu kaniineista, jotka oli rokotettu natiivilla tyypin II polysakkaridilla, II-TT-rokotteellatai TT:llaa 25 Kaniinin seerumib Eloonjääneiden lukumäärä/ Eloonjäämis-% (kokoamispäivä) hiirien kokonaismäärä® f II-TT-rokote (70) 10/10 100d II-TT-rokote (0) 1/5 20 30 Tyypin II polysakkaridi (70) 0/10 0 TT (70) 0/5 0 i a Hiirille annettiin 90 % tappava annos (1,5x105 CFU/hiiri) GBS:a.

Koottiin seeruminäytteet kolmelta kaniinilta.

* 35 c Eloon jääminen määritettiin 72 tuntia tartuttamisen jälkeen.

d P = 0,0037 verrattuna esi-immunisointiarvoihin (päivä 0).

110993 18

Liittämisstrategiaa, jota käytettiin GBS-tyypin III polysakkaridiin ja joka ensiksi kehitettiin meningokokkipolysakkaridille (18), voidaan käyttää kaikkiin GBS-kapselipolysakkaridiantigeeneihin, koska ne kaikki sisältävät siaalihappoa. Toisin kuin muilla GBS-polysakkarideilla,joilla on siaalihappo di- tai trisakkaridisivuketju-5 jen terminaalisena sakkaridina, GBS-tyypin II polysakkaridilla on kuitenkin toistuva yksikkö, joka kantaa siaalihappoa ainoana sokerina toisessa kahdesta monosakkari-disivuketjustaan (9,20). Konstruoidessamme GBS-tyypin II konjugaattirokotetta hapetimme 7 % tyypin II polysakkaridissa olevista siaalihappotähteistä ja käytimme niitä kohtina, joista liitimme polysakkaridin TT:iin. Puhdistettu II-TT-rokote eluoitui 10 Superose 6 -kolonnin tyhjään tilaan (yhteensopiva > 106 moolimassan kanssa) ja se muodostui 68 %:sta (paino/paino) hiilihydraattia ja 32 %:sta (paino/paino) proteiinia.

Adjuvantilla emulgoitu tyypin II-TT-rokote oli immunogeeninen kaniineissa päinvastoin kuin konjugoimaton natiivi tyypin II polysakkaridi, joka ei pystynyt tuomaan 15 esiin tyypin II polysakkaridille spesifistä vasta-ainetta. Kahdessa kolmesta immunisoidusta kaniinista esiintyi voimakas vaste 3 viikkoa II-TT-rokotteen yhden annoksen jälkeen. Optimaaliseen tyyppispesifiseen vasta-aineeseen päästiin kaikissa kolmessa kaniinissa 3 viikkoa II-TT-rokotteen tehosteannoksen jälkeen. Lisänousua tyypille II spesifisen vasta-aineen tiitterissä ei todettu kolmannen Il-TT-rokoteannok-20 sen jälkeen. In vitro ja in vivo-kokeista saadut tulokset osoittivat, että II-TT-rokotteelle kehitetyt vasta-aineet olivat funktionaalisesti aktiivisia tyypin II GBS:a vastaan. Seerumi, joka oli koottu kaikista kolmesta kaniinista, jotka oli rokotettu II-TT-rokot-teella, auttoi ihmisen perifeerisen veren leukosyyttejä tappamaan in vitro tyypin II GBS:a ja antoi jalostetuille hiirille täydellisen suojan (100 %) tyypin II GBS:n tappa-25 vaa annosta vastaan. II-TT-rokotteen antiseerumi oli opsonisesti aktiivinen homologisia GBS-kantoja (18RS21, S16 ja S20) vastaan, mutta ei testattuja heterologisia GBS-serotyyppejä (tyypit Ia ja III) vastaan.

Kun natiivi tyypin II polysakkaridi esti II-TT-rokotteen antiseerumin sitoutumisen 30 tyypin II polysakkaridilla päällystettyihin ELISA-kuoppiin, <40 %:n inhibitio saatiin desialoidulla tyypin II polysakkaridilla, silloinkin kun sitä käytettiin konsentraationa 200 pg/ml. Tämä antaa aiheen ajatella, että tyypin II polysakkaridin jokin tärkeä antigeeninen determinantti on riippuvainen siaalihappotähteiden läsnäolosta. Tämä tulos vahvisti niitä tuloksia, jotka saatiin tyypin II koko-organismeille kehitetyillä 35 kaniinin antiseerumeilla (21). ELISA-inhibitiokokeet, joissa käytettiin B-O- metyyligalakto-pyranoosia inhibiittorina, osoittivat, että II-TT-rokotteelle kehitetyt kaniinin antiseerumit eivät sisältäneet galaktoosispesifisiä vasta-aineita. Tyypin II natiiville polysakkaridille kehitetyn II-TT-rokoteantiseerumin sitoutumisen estoa ei 110993 19 saatu aikaan edes β-0-metyyligalaktopyranoosin konsentraatiolla 10 mg/ml. Niinpä sivuketjun galaktoosi ei näytä olevan tyypin II polysakkaridin immunodominantti epitooppi, kun polysakkaridi on liitetty TT:iin. Nämä tulokset ovat päinvastaisia kuin immunokemiallisten tutkimusten Joita suoritettiin tyypin II GBS-kokonaisorgänis-5 mille kehitetyillä kaniinin seerumeilla (12,21) ja joissa galaktoosisivuketju näytti olevan toinen tyypin II polysakkaridin kahdesta immunodominantista kohdasta siaa-r lihaposta riippuvaisen epitoopin ohella. Tyypin II GBS-kokosoluissa, joita aikai semmissa tutkimuksissa käytettiin (12,21) ja joita ei viljelty pH-säädellyissä olosuhteissa, saattaa olla polysakkarideja, joista jossakin määrin puuttuu siaalihappo. Näis-10 sä olosuhteissa sivuketjun galaktoosi saattaisi olla tärkein antigeeninen epitooppi. Tyypin II polysakkaridin lähde, jota käytettiin II-TT-rokotteen syntetisoimiseen, oli tyypin II GBS-viljely, jota pidettiin pH 7,0:ssa; loppuanalyysi vahvisti, että siaalihappo muodosti ~20 % (paino/paino) polysakkaridista. Emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että tyypin II polysakkaridin liittäminen TT: iin muutti polysakkaridin 15 konformaatiota, jolloin isännän immuunijäijestelmä ei enää voinut tunnistaa galak-toosiepitooppia. Vaikka II-TT-rokotteella indusoidusta kaniinin antiseerumista puuttui galaktoosispesifisiä vasta-aineita, se oli täysin toimintakelpoinen in vitro ja in vivo tyypin GBS-organismia vastaan. Sen enempää joidenkin siaalihappotähteiden kemiallinen modifioiminen kuin sen jälkeen tapahtunut TT:n sitominen näihin koh-20 tiin ei muuttanut kriittisiä antigeenisiä epitooppeja, jotka tarvitaan funktionaalisen tyypille II spesifisen vasta-aineen saamiseksi esiin. Se että II-TT-rokotteelle kehitetyistä kaniinin seerumeista saatu puhdistettu IgG edisti in vitro tyypin II GBS.n tappamista ihmisen leukosyyteillä antaa aiheen ajatella, että ei ainoastaan tyypin II polysakkaridin immunogeenisyys lisääntynyt, kun se konjugoitiin, vaan että myös 25 funktionaalisia IgG-vasta-aineita tuli esiin.

(

Tyypin V GBS-kapselipolysakkaridilla on toistuvien yksikköjen rakenne Joka muodostuu trisakkaridirangasta, joka sisältää kaksi erillistä sivuketjua vierekkäisissä so-keritähteissä. (Viitejulkaisu 35; kuvio 4). Eräässä GBS-tyypin V-TT-konjugaatti-30 rokotevalmisteessa 25 % pitemmässä sivuketjussa olevista siaalihappotähteistä (so. kolme sokeritähdettä) tyypin V polysakkaridissa hapettui. Hapettuneita siaalihappo-tähteitä käytettiin kohtina, joista tyypin V polysakkaridi sidottiin TT:iin. Puhdistettu tyypin V-TT-rokote muodostui 38 %:sta (paino/paino) TT.a ja 62 %:sta (paino/paino) hiilihydraattia. Alunaan sekoitettu V-TT-rokote osoittautui immunogeeniseksi 35 kaniineissa. Tyypin V-TT-rokotteen ensimmäisen annoksen ja tehosteannoksen jälkeen todettiin voimakas vaste. Toinen tehosteannos nosti edelleen tyypin V polysak-karidi-IgG-tiitteriä. Tyypin V-TT:llä indusoitujen kokeiden serospesifisyys osoitettiin kompetitiivisella ELISA:lla. Kaniinin antiseerumi, joka kehitettiin V-TT-rokotetta 110993 20 vastaan, on funktionaalisesti aktiivinen, minkä osoitti sen kyky tappaa tyypin V GBS in vitro ihmisen valkosolujen ja komplementin läsnäollessa.

Kuten IIl-TT-rokote, niin myös II-TT-rokote oli immunogeenisempi kaniineissa kuin 5 aktiivinen polysakkaridi ja se toi esiin opsonisesti aktiivista IgG:tä kaniineissa huolimatta polysakkaridin rakenteen eroavuudesta, siaalihapon asemasta, johon TT liitettiin, polysakkaridissa j a rokotteen koostumuksesta. Tyypin V-TT-rokote osoittautui samoin immunogeeniseksi kaniineissa ja kykeneväksi indusoimaan funktionaali-sesti vasta-aineita in vivo. Ennakoimme, että tällä tavoin rakennetut GBS-polysakka-10 ridi-proteiinikonjugaatit tulevat myöhemmin olemaan komponentteina multivalenssi-sessa GBS-rokotteessa, joka pystyy antamaan suojan GBS-serotyyppejä vastaan, jotka useimmiten assosioituvat ihmisissä esiintyvään tautiin.

Lisäksi ennakoimme, että tämän keksinnön mukaisista konjugaattimolekyyleistä voi-15 daan valmistaa rokotteita lisäämällä konjugaattimolekyylejä johonkin farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. On suositeltavaa, että silloitusastetta tämän keksinnön mukaisissa antigeenisissä molekyyleissä säädellään riittävästi, jotta saadaan rokotteita, jotka voidaan steriloida suodattamalla 0,2 mikronin suodattimen läpi. Sellaiset rokotteet ovat mieluiten liukoisia. Immunisointi voidaan suorittaa rokottamalla 20 saajanisäkäs rokotteella kerran ja sen jälkeen tarpeen vaatiessa tehosteruiskeilla. Riittävä annos annettavaa rokotetta voi perustua läsnä olevan polysakkaridin määrään: konjugaattirokotteen polysakkaridikomponenttia voidaan antaa 3-80 pg.

Viiteiulkaisut: 25 1. Adams, W.G., J. Kinney, A. Schuchat, C. Collier, C. Papasian, H. Kilbride, F.

Riedoja C. Broome, 1991, Program Abstr. 31st Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemoter., abstr. 1056.

2. Avery, O.T. ja W.F. Goebel, 1931. Chemoimmunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. V. The immunological specificity of an antigen prepared by 30 combining the capsular polysaccharide of type III pneumococcus with foreign protein. J. Exp. Med. 54:437-447.

. 3. Baker, C.J. ja M S. Edwards, 1990, Group B streptococcal infections, s. 742-811, julkaisussa J.S. Remington ja JO. Klein (toim.), Infectious diseases of the fetus and newborn infant. The W.B. Saunders Co., Philadelphia.

35 4. Baker, C.J., MS. Edwards ja D.L. Kasper, 1981, Role of antibody to native type III polysaccharide of group B Streptococcus in infant infection, Pediatrics 68:544-549.

5. Baker. C.J. ja D.L. Kasper, 1976. Correlation of material antibody deficiency 110993 21 with susceptibility to neonatal group B streptococcal infection, N. Engl. J. Med. 294:753-756.

6. Baker, C.J. ja D.L. Kasper, 1985. Group B streptococcal vaccines. Rev. Infect. Dis. 7:458-467.

5 7. Baker, C.J., M. A. Rench, M.S. Edwards, R.J. Carpenter, B.M. Hays ja D.L. Kas per, 1988. Immunization of pregnant women with a polysaccharide vaccine of group ‘ B Streptococcus. N. Engl. J. Med., 319:1180-1220.

8. Baltimore, R.S., D.L. Kasper, C.J. Baker ja D.K. Goroff, 1977. Antigenic specifi-ty of opsonophagocytic antibodies in rabbit anti-sera to group B streptococci. J. Im- 10 munol. 118:673-678.

9. De Cueninck, B.J., T.F. Grebar, T.K. Eisenstein, R.M. Swenson ja G.D. Schockman, 1983. Isolation, chemical composition, and molecular size of extracellular type II and type la polysaccharides of group B. streptococci. Infect. Immun.

41:527-534.

15 10. Dillon, H.C., S. Khare ja B.M. Gray, 1987. Group B streptococcal carriage and disease: a six-year retrospective study. J. Pediatr. 110:31-36.

11. Dubois, M., K. A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebars ja F. Smith, 1956. Color-metric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350-356.

20 12. Freimer, E.H. 1967. Type-specific polysaccharide antigens of group B strepto cocci. J. Exp. Med. 125:381-392.

13. Gelfand, H.M., J.P. Fox, D.R. LeBlanc ja L. Elveback, 1960. Studies on the development of natural immunity to poliomyelitis in Louisiana. V. Passive transfer of polioantibody from mother to fetus, and natural decline and disapprearance of anti- 25 body in the infant. J. Immunol. 85:46-55.

14. Goebel, W.F. ja O.T. Avery, 1931. Chemo-Immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. IV. The synthesis of the p-aminobenzyl ether of the soluble specific substance of type III pneumococcus and its coupling with protein. J. Exp. Med. 54:431-436.

30 15. Gray, B.M. 1979. ELISA methodology for polysaccharide antigens: protein coupling of polysaccharides for adsorption to plastic tubes. J. Immunol. Methods 28:187-192.

* ' 16. Hobbs, J.R. ja J.A. Davis, 1967. Serum gamma-G globulin levels and gestatio nal age in premature babies. Lancet 493:757-759.

. 35 17. Insel, R.A. ja P. W. Anderson, 1986. Oligosaccharide-protein conjugate vacci nes induce and prime for oligoclonal IgG antibody responses to the Haemophilus Influenzae b capsular polysaccharide in human infants. J. Exp. Med. 163:262-269.

18. Jennings, H.J. ja C. Lugowski, 1981. Immunochemistry of groups A, B, and C

η ”°Μ3 meningococcal polysaccharide tetanus toxoid conjugates. J. Immunol. 127:1011:1018.

19. Jennings, H.C., C. Lugowski ja F.E. Ashton, 1984. Conjugation of meningococcal lipopolysaccharide R-type oligosaccharides to tetanus toxoid as a route to a po- 5 tential vaccine against group B Neisseria meningitidis. Infect. Immun. 43:407-412.

20. Jennings, H.J., K.G. Rosell, E. Katzenellenbogen ja D.L. Kasper. 1983. Structural determination of the capsular polysaccharide antigen of type II group B Streptococcus. J. Biol. Chem. 258:1793-1798.

21. Kasper, D.L., C.J. Baker, B. Galdes, E. Katzenellenbogen ja H.J. Jennings.

10 1983. Immunochemical analysis and immunogenicity of the type II group B strepto coccal capsular polysaccharide. J. Clin. Invest, 72:260-269.

22. Lagergard, T., J. Shiloach, J.B. Robbins ja R. Schneerson. 1990. Synthesis and immunological properties of conjugates composed of group B Streptococcus type III capsular polysaccharide covalently bound to tetanus toxoid. Infect. Immun. 58:687- 15 694.

23. Lancefield, R.C. 1972. Cellular antigens of group B streptococci, s. 57-65. Julkaisussa L.W. Wannamaker ja J.M. Matson (toim.), Streptococci and streptococcal diseases: recognition, understanding, and management. Academic Press, Inc., New York.

20 24. Lancefield, R.C., M. McCarty ja W.N. Everly. 1975. Multiple mouse-protective antibodies directed against group B streptococci. J. Exp. Med. 142:165-179.

25. Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr ja R.J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

26. Michon, F., E. Katzenellenbogen, D.L. Kasper ja H.L. Jennings. 1987. Structu-25 re of the complex group-specific polysaccharide of group B Streptococcus. Biochemistry 26:476-486.

27. Paoletti, L.C., D.L. Kasper, F. Michon., J. DiFabio, K. Holme, H.J. Jennings ja M.R. Wessels. 1990. An oligosaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Biol. Chem. 265:18278-18283.

30 28. Paoletti, L.C., D.L. Kasper, F. Michon., H.J. Jennings. T.D. Tosteson ja M R.

Wessels. 1992. Effects of chain length on the immunogenicity in rabbits of group B . Streptococcus type III oligosaccharide-tetanus toxoid conjugates. J. Clin. Invest.

89:203-209.

29. Schneerson, R., O. Barrera, A. Sutton ja J.B. Robbins. 1980. Preparation, cha-35 racterization and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide- protein conjugates. J. Exp. Med. 152:361-376.

30. Svenson, S.B. ja A. A. Lindberg, 1979. Coupling of acid-labile Salmonella specific oligosaccharides to macromolecular carriers. J. Immunol. Methods 25:323-335.

23 110993 31. Walsh, J.A. ja S. Hutchins. 1989. Group B streptococcal disease: its importance in the developing world and prospect for prevention with vaccines. Pediatr. Infect. Dis. 1 8:271-276.

32. Warren, L. 1959. The tiobartituric acid assay of sialic acids. J. Biol. Chem.

5 234:1971-1975.

33. Wessels, M.R., L.C. Paoletti, D.L. Kasper. J.L. DiFabio, F. Michon, K. Holme ' ja H. J. Jennings. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein con jugate vaccine against type III group B Streptococcus, J. Clin. Invest. 86:1428-1433, 34. Zigterman, J.W.J., J.E.G van Dam, H. Snippe, F.T.M. Rottsveel, M. Jansze, 10 J.M.N. Willers, J.P. Kamerling ja J.F.G. Vliegenthart. 1985. Immunogenic properties of octasaccharide-protein conjugates derived from Klebsiella serotype II capsular polysaccharide. Infect. Immun. 47:421428.

35. Wessels. M.R., J.L.D. DiFabio, VJ. Benedi, D.L. Kasper, F. Michon, J-R. Bris-son, J. Jelinkovaja H.J. Jennings 1991. Structural Determination and Immunochemi- 15 cal Characterization of the Type V Group B Streptococcus Capsular Polysaccharide. Journal of Biological Chemistry 266:8714-8719.

Kun olemme edellä kuvanneet monia tämän keksinnön toteutusmuotoja, on selvää, että perusrakenteita voidaan muuttaa muiden toteutusmuotojen aikaansaamiseksi, 20 joissa käytetään tämän keksinnön mukaisia menetelmiä. Niinpä on ymmärrettävä, että tämän keksinnön alan määrittävät liitteenä olevat patenttivaatimukset eivätkä niinkään erityissuoritusmuodot, jotka on edellä esitetty esimerkinomaisesti.

♦ « «

Claims (6)

110993

1. Menetelmä B-ryhmän streptokokin tyypin II tai tyypin V kapselipolysakkaridin ja proteiinin antigeenisen konjugaattimolekyylin valmistamiseksi, tunnettu siitä, 5 että (a) B-ryhmän streptokokin tyypin II tai tyypin V kapselipolysakkaridi hapetetaan perjodaatilla riittävästi aldehydiryhmän muodostamiseksi kahteen tai useampaan polysakkaridin rankaan liittyvään terminaaliseen siaalihappotähteeseen; (b) liitetään hapetettu B-ryhmän streptokokin tyypin II tai tyypin V kapselipoly-10 sakkaridi johonkin proteiiniin pelkistävän aminoinnin kautta sekundaarisen amiinisi- doksen aikaansaamiseksi kapselipolysakkaridin ja proteiinin väliin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin 5-50 %, edullisesti noin 5-35 %, edullisimmin noin 5-10 %, kunkin polysakkaridin siaalihap- 15 potähteistä hapetetaan aldehydiryhmien, jotka kykenevät liittymään proteiiniin, muodostamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridi on GBS tyyppi II ja että noin 7 % kunkin polysakkaridin siaalihappotähteistä hape- 20 tetaan aldehydiryhmien, jotka kykenevät liittymään proteiiniin, muodostamiseksi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin 5-50 %, edullisesti noin 5-25 %, edullisimmin noin 5-10 %, kunkin polysakkaridin siaalihappotähteistä sidotaan kovalenttisesti proteiiniin. 25

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridi on GBS tyyppi II ja että noin 5 % kunkin polysakkaridin siaalihappotähteistä sidotaan kovalenttisesti proteiiniin.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridi on GBS tyyppi V ja että noin 25 % kunkin polysakkaridin terminaalisista siaalihappotähteistä sidotaan kovalenttisesti proteiiniin. 110993