PT1023435E - Nova espécie de bactéria láctica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "NOVA ESPÉCIE DE BACTÉRIA LÁCTICA" A presente invenção refere-se a uma nova espécie de bactéria láctica do género Streptococcus.

Estado da técnica A identificação de bactérias lácticas é essencial na indústria do leite e consiste em diferenciar, entre várias espécies, caracteristicas distintivas de ordem morfológica, fisiológica e/ou genética. 0 carácter fisiológico distintivo para uma determinada espécie de bactéria láctica pode ser obtido através de diferentes testes, incluindo, por exemplo, a análise da capacidade de fermentar diferentes açúcares e a análise convencional do perfil de migração de proteínas totais num gel de electroforese do tipo SDS-PAGE (Pot et al., Taxonomy of lactic acid bactéria, Em: Bacteriocins of lactic acid bactéria, Microbiology, Genetics and Applications, Ed. L. De Vuyst, e E. J. Vandamme, Blackie Academic & Professional, London, 1994). 0 perfil de migração das proteínas totais de uma determinada espécie, obtido num gel de electroforese de SDS-PAGE, quando é comparado, com o auxílio de um densitómetro, com outros perfis de outras espécies, permite determinar as relações taxonómicas entre as espécies. A análise numérica dos diferentes perfis, por 1 exemplo com o programa GelCompar® permite, em particular, estabelecer um grau de correlação entre as espécies que é função de diferentes parâmetros, em particular dos algoritmos utilizados (GelCompar, versão 4.0, Applied Maths, Kortrijk, Bélgica; algoritmos: "Pearson Product Moment Correlation

Coefficient, Unweighted pair Group Method using Average

Linkage").

Actualmente, a análise comparativa do perfil das proteínas totais por electroforese em gel de SDS-PAGE provou ser um meio eficaz para distinguir grupos homogéneos e distintos de espécies de bactérias lácticas (Pot et al., Chemical Methods in

Prokaryotic Systematics, Capitulo 14, M. Goodfellow A.G. 0'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1994).

Com este método de SDS-PAGE, as experiências anteriores demonstraram assim que quando se obtém um grau de correlação de Pearson superior a 78 (numa escala de 100) entre duas estirpes de bactérias lácticas, se pode deduzir legitimamente que estas pertencem à mesma espécie (Kersters et al., Classification and

Identification methods for lactic bactéria with emphasis on protein gel electrophoresis, In Acid Lactic Bactéria, Actes du Colloque Lactic'91, 33-40, Adria Normandia, França, 1992: Pot et al. , The potential role of a culture collection for

Identification and maintenance of lactic acid bactéria, Capitulo 15, pp. 81-87, Em: The Lactic Acid Bactéria, E. L. Foo, H. G.

Griffin, R. Mollby, e C. G. Heden, Proceedings of the first lactic Computer conference, Horizon Scientific Press, Norfolk). A titulo de exemplo, o grupo de bactérias lácticas acidófilas pôde, recentemente, ser dividido em 6 espécies distintas por meio desta técnica (Pot et al., J. General 2 esta técnica

Microb., 139/ 513-517, 1993). De igual modo, permitiu estabelecer, em combinação com outras técnicas, a existência de várias espécies novas de Streptococcus, como Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Streptococcus hyovaginalis sp. nov. e Streptococcus thoraltensis sp. nov (Vandamme et al. , Int. J. Syst Bacteriol., 46, 774-781, 1996; Devriese et al., Int. J. Syst Bacteriol, 1997, no prelo). A identificação de espécies novas de bactérias lácticas não pode, no entanto, reduzir-se a uma análise puramente morfológica e/ou fisiológica das bactérias. De facto, duas espécies muito próximas morfológica e/ou fisiologicamente podem estar afastadas do ponto de vista genético. A análise do ARN ribossómico 16S das bactérias lácticas reveste-se, assim, de uma importância crucial para determinar, definitivamente, a pertença de uma bactéria láctica a um género ou uma espécie já conhecidas.

Actualmente, a "Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (DSM, Braunschweig, Alemanha) registou oficialmente cerca de 48 espécies diferentes que pertencem ao género Streptococcus (ver a lista a seguir). Todas estas espécies possuem um ARN ribossómico 16S que é típico do género Streptococcus e podem ser divididas em grupos distintos e homogéneos, por meio da técnica de SDS-PAGE referida acima. A presente invenção refere-se à identificação, por meio de técnicas de identificação mencionadas acima, de uma nova espécie de bactéria láctica que pertence ao género Streptococcus e à sua utilização na indústria de lacticínios em geral. 3

Resumo da invenção

Deste modo, a invenção refere-se a todas as bactérias lácticas, cujo ARN ribossómico 16S é caracteristico do género Streptococcus tendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID N°:1 e, cujo perfil em proteínas totais obtido após cultura da bactéria num meio MRS durante 24 h a 28 °C, extracção das proteínas totais e migração das proteínas num gel de electroforese de SDS -PAGE, apresenta um grau de correlação de Pearson de, pelo menos, 78 em relação ao perfil obtido em condições idênticas com a estirpe de bactéria láctica CNCM 1-1920, mas distinto do das espécies reconhecidas como pertencentes ao género Streptococcus, nomeadamente S. acidominimus, S. agalactiae / s. alactolyticus, S. anginosus , S bovis, S. canis, S. caprinus, S. constellatus, S cricetus, S. cristatus, S difficile, S. downei, S dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp equisimilis, S. equi, S. equi ssp. equi S equi ssp. zooepidemicus, S. equimus, S. ferus, S. gallolyticus, S. gordonii, S. hyointestinalis, S. hyovaginalis, S. iniae, S intermedius, S. intestinalis , S. macacae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis , s. . parauberis, S. phocae, S . pleomorphus, S. pneumoniae, s. porcinus, S. pyogenes ', S. ratti, S. salivarius , s. sanguinis, S shiloi, S. sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis , S. uberis, S. vestibularis, s. vi ridans. 4 A invenção refere-se à utilização de uma estirpe de bactéria láctica de acordo com a invenção, para a preparação de uma composição alimentar, em particular um leite acidificado ou um queijo fresco, por exemplo. A invenção refere-se igualmente à utilização de um polissacárido, susceptivel de ser segregado pela estirpe CNCM 1-1924,constituída exclusivamente por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção respectiva de 3:2:1, para a preparação de uma composição alimentar ou farmacêutica. A invenção tem por objecto uma composição alimentar ou farmacêutica que compreende uma estirpe de bactéria láctica de acordo com a invenção.

Finalmente, a invenção tem também por objecto uma composição alimentar ou farmacêutica compreendendo um polissacárido susceptivel de ser segregado pela estirpe CNCM 1-1294, constituída exclusivamente por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção média respectiva de 3:2:1.

Descrição detalhada da invenção A pertença da nova espécie de acordo com a invenção ao género Streptococcus é de um modo preferido, evidenciada comparando a sequência nucleotídica do ARN ribossómico 16S das bactérias de acordo com a invenção, ou do seu ADN genómico que é transcrito em ARN ribossómico 16S, com a de outros géneros e espécies de bactérias lácticas actualmente conhecidas. 5

Mais em particular, pode-se utilizar o método exposto no exemplo 1 a seguir ou ainda outros métodos conhecidos do especialista na técnica (Schleifer et al., System, Appl. Microb., 18, 461-467, 1995; Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15, 487-501, 1992), por exemplo. A seguência nucleotidica de SEQ ID N°: 1 apresentada na listagem de seguências a seguir é caracteristica desta nova espécie e apresenta semelhanças surpreendentes com as sequências de ARN ribossómico 16S encontradas nas espécies de Streptococcus reconhecidas actualmente. A nova espécie de acordo com a invenção que constitui um novo grupo distinto e homogéneo, pode ser assim diferenciada das outras espécies conhecidas como pertencentes ao género Streptococcus, por meio da técnica de identificação de proteínas totais num gel de electroforese de SDS-PAGE descrito mais acima.

Em particular, esta nova espécie apresenta um perfil de proteínas totais, obtido após cultura da bactéria num meio MRS durante 24 h, a 28 °C, extracção das proteínas totais e migração das proteínas num gel de electroforese de SDS-PAGE, que apresenta um grau de correlação de Pearson de, pelo menos, 78 (numa escala de 100) com o perfil obtido em condições idênticas com a estirpe de bactéria láctica CNCM 1-1920 e isso em relação aos perfis obtidos em condições idênticas com qualquer diferentes espécies de bactérias lácticas, em particular indicadas mais à frente, por exemplo φ

Mais em particular, esta técnica consiste em (1) isolar as proteínas (= proteínas totais) de uma cultura de bactérias lácticas cultivada em condições definidas, (2) separar as proteínas por electroforese em gel de SDS-PAGE, (3) analisar a 6 disposição das diferentes fracções de proteínas separadas com o auxílio de um densitómetro que mede a intensidade e a localização de cada banda, (4) e comparar o perfil de proteínas assim obtido com o de várias outras espécies de Streptococcus que foram, em paralelo ou previamente, obtidos exactamente nas mesmas condições operacionais.

As técnicas de preparação de um perfil de proteínas totais tais como as descritas acima, bem como a análise numérica desses perfis, são bem conhecidos do especialista na técnica. No entanto, os resultados só são fiáveis na medida em que cada etapa do processo seja suficientemente padronizada. Em virtude disso, os processos padronizados são assim regularmente postos à disposição do público pelos seus requerentes. Pode-se referir, em particular, o de Pot et al. apresentado no decurso de um "workshop" organizado pela União Europeia na Universidade de Ghent, na Bélgica, de 12 a 16 de Setembro de 1994 (Fingerprinting techniques for classification and identification of bactéria, SDS-PAGE of whole cell protein). 0 programa utilizado na técnica de identificação em gel de electroforese de SDS-PAGE reveste-se de uma importância determinante, na medida em que o grau de correlação entre as espécies depende dos parâmetros e algoritmos utilizados pelo programa. Sem pretender entrar em detalhes teóricos, a comparação quantitativa das bandas captadas por um densitómetro e normalizadas por um computador é feita, de um modo preferido, com o coeficiente de correlação de Pearson. A matriz de semelhança assim obtida pode ser organizada com o auxílio do algoritmo UPGMA (unweighted pair group method using average linkage) um algoritmo que permite não só reagrupar os perfis mais semelhantes, mas também construir dendogramas (ver Kersters 7 K., Numerical methods in the classification and Identification of bactéria by electrophoresis, Em Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow A.G. 0'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985).

De um modo preferido, as estirpes da nova espécie apresentam um perfil de proteínas totais com um grau de correlação de Pearson de, pelo menos, 85 em relação a uma das estirpes de bactérias da nova espécie. Para os biotipos mencionados a seguir, o grau de correlação de Pearson pode mesmo exceder 90, por exemplo.

Por meio desta técnica de identificação em gel de electroforese de SDS-PAGE, a nova espécie pertencente ao género Streptococcus de acordo com a invenção pode ser distinguida de todas as espécies de Streptococcus reconhecidas actualmente, nomeadamente as espécies S. acidominimus, S. agalactiae, S. alactolyticus, S. anginosus. S . bovis, S. canis, S. caprinus, S. constellatus, S. cricetus, S. cristatus, S. difficile, S. downei, S. dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp. equisimilis, S. equi, S. equi ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus, S. equinus, S. ferus, S. gallolyticus, S. gordonii, S. hyointestinalis, S. hyovaginalis, S. iniae, S. intermedius, S. intestinalis, S. macacae, S. mitis, S. mutans, S. oratis, S. parasanguinis, S. parauberis, s. phocae, S. pleomorphus, S. pneumoniae, S. porcinus, s. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. sanguinis, S. shiloi, s. sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, s. uberis, S. vestibularis, S. viridans. A nova espécie de acordo com a invenção distingue-se, igualmente, por esta técnica das bactérias lácticas que foram anteriormente classificadas erradamente no género Streptococcus, como S. adjacens (nova classificação = Abiotrophia adiacens) , S. casseliflavus (=Enterococcus casseliflavus) , S. cecorum (=Enterococcus cecorum), S. cremoris (=Lactococcus lactis subsp. cremoris), S. defectivus (=Abiotrophia defectiva), S. faecalis (=Enterococcus faecalis), S. faecium (=Enterococcus faecium), S. gallinarum (=Enterococcus gallinarum), S. garvieae (=Lactococcus garvieae), S. hansenii (=Ruminococcus hansenii), S. lactis (=Lactococcus lactis subsp. lactis), S. lactis cremoris (=Lactococcus lactis subsp. cremoris), S. lactis diacetilactis (=Lactococcus lactis subsp. lactis), S. morbillorum (=Gemella morbillorum), S. parvulus (=Atopobium parvulum), S. plantarum (=Lactococcus plantarum), S. raffinolactis (=Lactococcus raffinolactis) e S. saccharolyticus (=Enterococcus saccharolyticus) .

As bactérias lácticas de acordo com a invenção têm uma caracteristica morfológica de Lactococcus lactis, por exemplo, têm a forma de cocos organizados em cadeias.

Os açúcares que podem ser fermentados pela nova espécie são em geral, pelo menos, um dos seguintes, nomeadamente D-galactose, D-glucose, D-frutose, D-manose, N-acetil-(D-)glucosamina, salicina, celobiose, maltose, lactose, sacarose e rafinose.

De entre todas as estirpes da nova espécie que foram isoladas em leitarias na Suiça, 7 foram depositadas sob o tratado de Budapeste, a titulo de exemplo, na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris, a 14 de Outubro de 1997, tendo-lhes 9 sido atribuídos os números de depósito CNCM 1-1920, 1-1921, I- 1922, I-I923, 1-1924, 1-1925 e 1-1926.

As estirpes da nova espécie podem ser utilizadas para preparar um produto alimentar ou farmacêutico, em particular na forma de uma cultura fresca, concentrada ou seca, por exemplo.

Os produtos à base de leite são evidentemente preferidos no âmbito da invenção. Por leite pretende designar-se, por um lado, um leite de origem animal, tal como leite de vaca, de cabra, de ovelha, de búfalo, de zebu, de égua, de burro, de camelo, etc.

Este leite pode ser um leite no estado nativo, um leite reconstituído, um leite desnatado ou um leite adicionado de compostos necessários para o crescimento de bactérias ou para o tratamento subsequente do leite fermentado, como matérias gordas, proteínas de um extracto de levedura, peptona e/ou um tensoactivo, por exemplo. O termo leite aplica-se igualmente ao que habitualmente se designa por leite vegetal, isto é, um extracto de materiais vegetais tratados ou não, tais como as leguminosas (soja, grão de bico, lentilha, etc...) ou oleaginosas (colza, soja, sésamo, algodão, etc...), extracto que contém proteínas em solução ou em suspensão coloidal, que podem ser coaguladas por acção química, por fermentação ácida e/ou pelo calor. Finalmente, a palavra leite designa também misturas de leites animais e leites vegetais.

Os produtos farmacêuticos podem ser qualquer tipo de produtos destinados a ser administrados oralmente, até mesmo de um modo tópico, que compreendem um suporte farmacêutico aceitável sobre o qual, ou no qual se adiciona uma cultura da nova espécie na forma fresca, concentrada ou seca, por exemplo.

Estes produtos farmacêuticos podem apresentar-se na forma de uma 10 suspensão ingerivel, de um gel, de um difusor, de uma cápsula, de uma cápsula de gelatina, de um xarope, ou sob gualquer outra forma galénica conhecida do especialista na técnica.

Adicionalmente, algumas estirpes da nova espécie de acordo com a invenção que representam um novo biotipo desta espécie podem também apresentar a propriedade notável de ser ao mesmo tempo mesófilas e termófilas (biotipo mesófilo/termófilo). As estirpes que pertencem a este biotipo apresentam, de facto, um crescimento óptimo de cerca de 28 °C até cerca de 45 °C. Esta propriedade pode ser facilmente observada (1) preparando várias culturas de um biotipo mesófilo/termófilo, em paralelo, a temperaturas estendo-se de 20 a 50 °C, (2) medindo as absorvências dos meios após 16 h de cultura, por exemplo, e (3) reunindo os resultados na forma de um gráfico que representa a absorvência em função da temperatura (graditherme) . A figura 1 é particularmente representativa dos gráficos que se podem obter com este biotipo mesófilo/termófilo de acordo com a invenção. A título de indicação, de entre as estirpes das novas espécies que apresentam este biotipo particular, as estirpes CNCM 1-1920, 1-1921 e 1-1922 são particularmente representativas, por exemplo. A utilização de um biotipo mesófilo/termófilo na indústria de lacticinios reveste-se de uma importância significativa. De facto, pode-se utilizar esta espécie para preparar iniciadores mesófilos ou termófilos. Podem-se assim produzir industrialmente leites acidificados a 45 °C, para se obter um produto do tipo "iogurte". Podem também produzir-se industrialmente queijos frescos, fermentando um leite na presença de coalho a 28 °C e separando o coalho, assim formado, por centrifugação ou ultrafiltração. Os problemas de engorduramento das máquinas 11 assim sao ligados à utilização de fermentos termófilos eliminados (estes problemas são referidos no pedido de patente EP N°96203683.6) .

Adicionalmente, outras estirpes da nova espécie de acordo com a invenção que representam um outro biotipo novo desta espécie, podem apresentar a propriedade notável de conferir uma viscosidade ao meio de fermentação (biotipo espessador). O carácter viscoso de um leite fermentado por um biotipo espessador de acordo com a invenção pode ser observado e determinado como descrito a seguir. 1. Por observação da estrutura de um leite acidificado por um biotipo espessador em comparação com o do leite acidificado com as culturas não espessadoras. O leite não viscoso adere às paredes de um copo de vidro, enquanto que o leite viscoso é autocoerente. 2. Pode-se efectuar um outro teste com uma pipeta. A pipeta é mergulhada no leite acidificado que é aspirado numa quantidade de cerca de 2 mL, em seguida a pipeta é retirada do leite. O leite viscoso forma um fio entre a pipeta e a superfície liquida, enquanto que o leite não viscoso não origina este fenómeno. Quando o liquido é libertado da pipeta, o leite não viscoso forma gotas distintas de modo semelhante à água, enquanto que o leite viscoso forma gotas que terminam por fios longos que estão ligados ao bico da pipeta. 3. Quando um tubo de ensaio cheio até cerca de um terço da sua altura é agitado com o auxilio de um agitador rotativo, o leite não viscoso sobe sobre a face interior 12 da parede, enquanto que a ascensão do leite viscoso é praticamente nula. 0 carácter viscoso deste biotipo particular pode também ser determinado com o auxílio de um parâmetro reológico que mede a viscosidade. Alguns aparelhos comerciais são capazes de determinar este parâmetro, como o reómetro Bohlin VOR (Bohlin GmbH, Alemanha). Conforme as instruções do fornecedor, a amostra é colocada entre um prato e um cone truncado do mesmo diâmetro (30 mm, ângulo 5,4°, abertura 0,1 mm) em seguida a amostra é submetida a um gradiente de velocidade de corte rotacional contínuo que a força a deformar-se. A amostra, resistindo contra a deformação, desenvolve uma força tangencial designada por tensão de corte (shear stress). Esta tensão que é proporcional à resistência à deformação é medida por meio de uma barra de torsão. A viscosidade da amostra é então determinada, para uma determinada velocidade de corte, pela razão entre a tensão de corte (Pa) e a velocidade de corte (s-1) (ver também "Le Technoscope de Biofutur", Maio 97).

Os testes de medição reológica do carácter espessador deste biotipo levaram à definição seguinte. Uma bactéria láctica que pertence ao biotipo espessador de acordo com a invenção é uma bactéria que, quando fermenta um leite semi-desnatado a 38 °C a pH 5,2, dá uma viscosidade ao meio que é superior a 100 mPa.s a uma velocidade de corte da ordem dos 2 93 s”1, por exemplo. A título indicativo, as estirpes CNCM 1-1922, 1-1923, 1-1924, 1-1925 e 1-1926 são particularmente representativas deste biotipo espessador, por exemplo.

Este biotipo espessador reveste-se igualmente de uma uma vez importância significativa na indústria de lacticínios, 13 que a sua capacidade de conferir viscosidade a um produto lácteo é excepcionalmente elevada, quando comparada com a de outras espécies de bactérias lácticas espessadoras, em particular com as estirpes Lactobacillus helveticus CNCM 1-1449, Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351, Streptococcus thermophilus CNCM 1-1879, Streptococcus thermophilus CNCM 1-1590, Lactobacillus bulgaricus CNCM 1-800 e Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris CNCM 1-1692, que foram mencionadas respectivamente nos pedidos de patente EP699689, EP638642, EP97111379.0, EP750043, EP367918 e EP97201628.1.

Pode-se também referir que a produção de uma viscosidade pode ser realizada, por algumas estirpes, numa gama de temperaturas muito alargada, que se estende de temperaturas mesófilas (25-30 °C) a temperaturas termófilas (40-45 °C) . Esta particularidade representa uma vantagem tecnológica evidente.

Além disso, algumas estirpes que pertencem a este novo biotipo espessador produzem também um exopolissacárido (EPS) de elevado peso molecular cuja composição em glicidos é semelhante à encontrada nos oligossacáridos do leite materno humano. Este EPS é de facto constituído por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção de 3:2:1, respectivamente (A. Kobata, In the Glycoconjugates, vol. 1, "Milk glycoproteins and oligosaccharides", p.423-440, Ed. I. Horowitz e W. Pigman, Ac. Press, Nova Iorque, 1977). A título indicativo, as estirpes CNCM 1-1923, 1-1924, 1-1925 e 1-1926 produzem este polissacárido.

Este exopolissacárido, na forma nativa ou hidrolisada, poderá assim satisfazer com vantagem uma dieta infantil completa. 14

Para isso, pode-se preparar uma dieta para as crianças e/ou lactentes que compreende um leite que foi acidificado com pelo menos uma estirpe de bactéria láctica produtora de um EPS constituído por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção de 3:2:1, respectivamente, em particular com as estirpes CNCM 1-1924, 1-1925 ou 1-1926, por exemplo.

Pode-se também isolar previamente este EPS de um meio de cultura deste biotipo e utilizá-lo, na forma nativa ou hidrolisada, como ingrediente numa dieta infantil, por exemplo. 0 isolamento do EPS consiste geralmente em retirar as proteínas e as bactérias do meio de cultura e isolar uma fracção purificada de EPS. Pode-se realizar a extracção das proteínas e das bactérias por precipitação com um álcool ou ácido tricloroacético, seguido de uma centrifugação, podendo-se entretanto purificar o EPS por precipitação num solvente como acetona seguido de uma centrifugação, por exemplo. Se necessário, o EPS pode ser ainda purificado por meio de uma cromatografia por filtração em gel ou por afinidade, por exemplo.

No contexto da presente invenção, o isolamento de um EPS abrange igualmente todos os métodos de produção de um EPS por fermentação seguida de uma concentração do meio de cultura por secagem ou ultrafiltração, por exemplo. A concentração pode ser realizada por todos os métodos conhecidos do especialista na técnica e em particular pelos métodos de liofilização ou de pulverização sob um fluxo de ar quente, por exemplo. Assim, os métodos descritos nos documentos US3985901, EP298605 e EP63438 15 são incorporados como referência na descrição da presente invenção.

Na medida em que os oligossacáridos maternos são de pequena dimensão, pode ser vantajoso realizar previamente uma hidrólise parcial do EPS de acordo com a invenção. De um modo preferido, as condições de hidrólise são escolhidas de modo a obter oligossacáridos com 3 a 10 unidades de glicido, ou seja portanto oligossacáridos com um peso molecular da ordem de 600 a 2000 Dalton, por exemplo.

Mais em particular, pode-se hidrolisar o EPS de acordo com a invenção numa solução de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,5 N durante 30-90 min e a 100 °C, e em seguida evaporar o TFA e recuperar os oligossacáridos.

Um produto infantil preferido compreende material proteico hidrolisado de soro de leite, a partir do qual os alergénios escolhidos de entre um grupo de alergénios constituído por a-lactalbumina, β-lactoglobina, albumina de soro e imunoglobulinas não foram eliminados e no qual o material proteico hidrolisado, incluindo os alergénios hidrolisados se apresenta na forma de resíduos de hidrólise com um peso molecular não superior a cerca de 10.000 Dalton, de modo que o material hidrolisado é sensivelmente isento de proteínas alergénicas e de alergénios de origem proteica (= produto hipoalergénico conforme a directiva Europeia 96/4/EC; Fritsche et al. , Int. Arch. Aller and Appl. Imm., !93, 289-293, 1990).

Pode-se misturar o EPS de acordo com a invenção, na forma nativa ou parcialmente hidrolisada, com este material proteico hidrolisado de soro de leite e incorporar assim esta mistura, na 16 forma seca ou não, em várias preparações alimentares para uso dietético, em particular em alimentos para lactentes, ou em alimentos facilmente absorvíveis, destinados prioritariamente a pessoas que sofrem de alergias, por exemplo. A presente invenção é descrita em maior detalhe pelos exemplos apresentados a seguir, que são precedidos por uma breve descrição das figuras. Deve entender-se, no entanto, que estes exemplos são dados a titulo de ilustração do objecto da invenção, não constituindo portanto, em nenhum modo, uma limitação. As percentagens são dadas em peso, salvo indicação em contrário. A figura 1 representa uma fotografia dos perfis de migração das proteínas totais de várias estirpes da nova espécie, num gel de electroforese de SDS-PAGE, em comparação com os obtidos com as estirpes de Streptococcus thermophilus. 0 grau de parentesco das estirpes é indicado com o auxílio da escala de correlação de Pearson e por meio da árvore relativa aos perfis das proteínas (estão representados os graus de correlação de Pearson de 55 a 100). A figura 2 representa o gráfico graditherme da estirpe CNCM 1-1920.

Exemplo 1 Identificação de uma nova espécie de Streptococcus Várias estirpes de bactérias lácticas isoladas em diferentes leitarias na Suiça foram objecto de uma identificação genética e fisiológica, como se segue. Os métodos utilizados, bem como os reaultados obtidos, apresentados a seguir, mostram que estas 17 estirpes fazem parte de um novo grupo de Streptococcus que é suficientemente distinto e homogéneo para que se possa dizer que reagrupa uma nova espécie de bactéria láctica. A titulo de exemplo, algumas estirpes que pertencem a esta nova espécie foram depositadas sob o tratado de Budapeste na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), 25 rue due docteur Roux, 75724 Paris, a 14 de Outubro de 1997, tendo-lhes sido atribuídos os números de identificação CNCM 1-1920, 1-1921, 1-1922, 1-1923, 1-1924, 1-1925 e 1-1926. 1. Morfologia das estirpes isoladas: observa-se ao microscópio uma morfologia característica de Lactococcus lactis, isto é uma forma de cocos organizados em cadeias. 2. Perfil de fermentação dos glícidos das estirpes isoladas: os glícidos fermentáveis pelas estirpes isoladas são geralmente a D-galactose, a D-glucose, a D-frutose, a D-manose, a N-acetil-(D)glucosamina, a salicina, a celobiose, a maltose, a lactose, a sacarose e a rafinose. Este perfil de fermentação é semelhante ao que se obtém com a espécie Lactococcus lactis. 3. ARN ribossómico 16S das estirpes isoladas

Cultivam-se as estirpes isoladas em 40 mL de meio HJL a 37 °C durante 24 h, recolhem-se as bactérias por centrifugação, põe-se novamente em suspensão cada sedimento bacteriano em 2,5 mL de tampão TE (Tris a 10 mM pH 8, EDTA a 0,1 mM) contendo lisozima a 10 mg/mL e incuba-se a totalidade a 37 °C durante 1 h. Adicionam-se em seguida 100 yL de uma solução contendo de 18 proteinase K a 10 mg/mL, 250 pL de uma solução contendo EDTA a 500 mM pH 8,0 e 500 pL de uma solução contendo SDS a 10%. Incuba-se a totalidade a 60 °C durante lh de modo a assegurar uma lise completa das bactérias. Após arrefecer as misturas, adicionam-se 2,5 mL de fenol/clorofórmio, centrifuga-se durante 10 min numa centrifugadora Heraeus de modo a separar 2 fases e elimina-se a fase superior. Precipita-se o ADN cromossómico presente na fase inferior por adição de 2,5 mL de uma solução que contém etanol a 96% e agita-se cuidadosamente até à formação de um precipitado. Retira-se o ADN precipitado com o auxilio de um palito de madeira e deposita-se num tubo Eppendorf de 2 mL contendo 1 mL de um tampão Tris (Tris HC1 a 10 mM pH 8,0, EDTA a 10 mM e ARNase A a 10 pg/mL) e incuba-se a 56 °C durante lh. Após arrefecimento, extraem-se as diferentes suspensões de ADN com 1 mL de fenol/clorofórmio, como descrito em cima, e precipitam-se os ADN cromossómicos com etanol. Os ADN são re-suspensos num tubo Eppendorf contendo uma quantidade de tampão TE tal que a quantidade final de ADN para cada estirpe isolada é da ordem de 250 pg/mL.

Amplifica-se por PCR uma alíquota de 1 pL do ADN de cada estirpe isolada com as sondas tendo as sequências nucleotídicas respectivas SEQ ID N°:2 e SEQ ID N°:3 (ver a listagem de sequências a seguir), durante 30 ciclos (95 °C/30 seg, 40 °C/30 seg e 72 °C/2 min) utilizando a polimerase Pwo da Boehringer. Purificam-se os produtos de PCR com o auxilio de um kit QIAGEN QIAquick e eluem-se os produtos em 50 pL de tampão TE. Digere-se uma amostra de 20 pL de cada produto com as enzimas de restrição BamRI e Sal I, separam-se os fragmentos de 1,6 kb num gel de agarose (1%), purificam-se com o auxilio do kit QIAGEN QIAquick, em seguida faz-se a sua clonagem no vector E. coli pK19 (Pridmore R.D., Gene 5_6, 309-312, 1987) previamente digerido com 19

BamHI e SalI e desfosforilado e transformam-se as células competentes E. coli estirpe BZ234 (colecção da Universidade de Bâle, Suiça) com cada produto de ligação. Seleccionam-se os transformantes a 37 °C em meio LB compreendendo canamicina a 50 yg/mL, X-gal a 30 ng/mL e IPTG a 10 ng/mL. Cultivam-se as colónias brancas contendo a inserção durante 10 h em meio LB compreendendo canamicina a 50 yg/mL e isolam-se os ADN plasmidicos com o auxilio do kit QIAprep8 da QIAGEN.

Misturam-se 4 yL de amostra de cada plasmideo (1 pmol/yL: proveniente de cada estirpe isolada) com 4 yL de sondas marcadas com IRD-14 (sondas de sequenciação: MWG Biotech) e 17 yL de H2O. Para cada estirpe isolada, dispensam-se 4 aliquotas de 6 yL em 4 poços de 200 yL e adicionam-se 2 yL de uma mistura reaccional (Amersham; RPN2536). Amplificam-se as misturas por PCR no sistema Hybaid Omn-E por 1 ciclo de 95 °C durante 2 min, seguido de 25 ciclos de 95 °C/30 seg, 50 °C/30 seg e 72 °C/1 min. Separam-se em seguida de um modo convencional os produtos de reacção num gel de poliacrilamida e lê-se a sequência de ADN para cada estirpe isolada. Os fragmentos de ADN assim sequenciados representam a parte genómica do ARN ribossómico 16S.

Os resultados mostram que todas as estirpes isoladas contêm uma sequência nucleotidica semelhante, até mesmo idêntica à sequência SEQ ID N°: 1 que é apresentada na listagem de sequências a seguir. Estas sequências apresentam várias homologias com as sequências de ARN 16S encontradas em espécies de bactérias lácticas pertencentes ao género Streptococcus o que leva a classificar as estirpes no género Streptococcus. 20

4. Identificação por electroforese em gel de SDS-PAGE

Os testes foram realizados de acordo com as instruções fornecidas por Pot et al. apresentadas no decorrer de um "workshop" organizado pela União Europeia, na Universidade de Ghent, Bélgica, de 12 a 16 de Setembro de 1994 (Fingerprinting techniques for classification and Identification of bactéria, SDS-PAGE of whole cell protein).

Em resumo, para cultivar as bactérias lácticas, semeiam-se 10 mL de meio MRS (de Man, Rogosa e Sharpe) com uma pré-cultura MRS de cada estirpe da nova espécie de bactéria láctica, bem como de cada estirpe de referência que abrange o maior número possível de espécies de Streptococcus. Incubam-se os meios durante 24 h a 28 °C, espalham-se em placas de Petri compreendendo um meio fresco MRS-agar e incubam-se as placas durante 24 h a 28 °C.

Para preparar o extracto que contém as proteínas das bactérias cobre-se o meio MRS-agar com um tampão a pH 7,3 contendo Na2HP04.12H20 a 0, 008 M, Na2HP04.2H20 a 0,002M e NaCl a 8%. Recuperam-se as bactérias raspando a superfície do meio gelificado, filtra-se a suspensão através de uma gaze de nylon, centrifuga-se durante 10 min a 9000 rpm com um rotor GSA, recupera-se o sedimento que é retomado em 1 mL do tampão anterior. Lava-se o sedimento repetindo o processo de centrifugação-lavagem, recuperam-se finalmente cerca de 50 mg de células às quais se adiciona um volume de tampão STB pH 6, 8 (para 1000 mL: 0,75 g de Tris, 5 mL de C2H6OS, 5 g de glicerol) , rompem-se as células por ultra sons (Labsonic 2000), centrifuga-se os restos celulares e conserva-se o sobrenadante que contém as proteínas totais. 21

Prepara-se em seguida, de modo convencional, um gel de poliacrilamida de SDS-PAGE de 1,5 mm de espessura (Biorad-Protean ou Hoefer SE600) reticulado com acrilamida a 12%, no caso do gel de separação (12,6 cm de altura) e de acrilamida a 5%, no caso do gel de concentração (1,4 cm de altura). Para isso, realiza-se em particular a polimerização das duas partes de gel num banho termostatizado a 19 °C, durante 24 h e 1 h, respectivamente, de modo a reduzir ao máximo as imperfeições do gel e a maximizar a reprodutibilidade dos testes.

Separam-se em seguida as proteínas de cada extracto no gel de electroforese de SDS-PAGE. Para isso, aplicam-se 6 mA por cada placa contendo 20 pistas, até que o corante atinja 9,5 cm de distância depois do topo do gel de separação. Fixam-se em seguida as proteínas no gel, coram-se, seca-se o gel em celofane, numera-se o gel por meio de um densitómetro (Densitómetro Ultroscan Laser LKB, Suécia) ligado a um computador e comparam-se os perfis entre eles por meio do programa GelCompar®, versão 4.0, Applied Maths, Kortrijk, Bélgica. Na medida em que os ensaios estão suficientemente bem padronizados, os perfis de diferentes espécies de Streptococcus contidos num banco de dados foram também utilizados durante a comparação numérica.

Os resultados mostram assim que todas as estirpes testadas pertencentes à nova espécie se distinguem de todas as espécies seguintes: S. acidominímus, S. adjacens, S. agalactiae, S. alactolyticus. S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. caprinus, S. casseliflavus, S. cecorum. S. constellatus, S. cremoris, S. cricetus, S. cristatus, S. defectivus, S. difficile, S. downei, S. S. dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp. 22 equisimilis, S. equi, S. equi ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus. S. equinus, S. faecalis, S. faecium, S. ferus, S. gallinarum, S. gallolyticus, S. garvieae, S. gordonii, S. hansenii, S. hyointestinalis, S. hyovaginalis. S. iniae, S. intermedius, S. intestinalis, S. lactis, S. lactis cremoris, S. lactis diacetilactis, S. macacae. S. mitis, S. morbillorum, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S. parauberis. S. parvulus, S. phocae, S. plantarum, S. pleomorphus, S. pneumoniae, S. porcinus, S. pyogenes, S. raffinolactis, S. ratti, S. saccharolyticus, S. salivarius. S. sanguinis, S. shiloi, S. sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S. vestibularis e S. viridans. 0 conjunto dos resultados mostra que o grau de correlação de Pearson entre as estirpes depositadas é de, pelo menos, 85. A título de indicação, a figura 1 representa uma fotografia de um dos geles de electroforese, o parentesco sob a forma de uma árvore, bem como o grau de correlação de Pearson (indicado na escala superior à esquerda). As estirpes LAB 1550, LAB 1551 e LAB 1553 referem-se especificamente às estirpes CNCM 1-1921, I 1922 e 1-1925. As estirpes LMG15061 e LAB 1607 não foram depositadas na CNCM, mas fazem manifestamente parte desta nova espécie.

Em conclusão, todas as estirpes isoladas fazem claramente parte de um grupo homogéneo que é distinto das outras espécies pertencentes ao género Streptococcus. 23

Exemplo 2: Biotipo mesófilo/termófilo

Algumas estirpes isoladas no exemplo 1 representam um novo biotipo particular na medida em que elas apresentam a propriedade notável de ser ao mesmo tempo mesófilas e termófilas.

Esta propriedade é facilmente observada (1) preparando em paralelo várias culturas de um biotipo mesófilo/termófilo num meio M17-lactose a temperaturas graduais de 20 a 50 °C, (2) medindo as absorvências dos meios a 540 nm após 16 h de cultura e (3) reunindo os resultados na forma de um gráfico que representa a absorvência em função da temperatura (graditherme). A figura 1 representa o gráfico graditherme obtido com a estirpe CNCM 1-1920. Todas as outras estirpes isoladas pertencentes a este biotipo particular, em especial as estirpes CNCM 1-1921 e 1-1922, originam igualmente gráficos graditherme comparáveis.

Exemplo 3 Biotipo espessador Várias estirpes isoladas no exemplo 1 apresentam a propriedade notável de ser extremamente espessadoras. Esta propriedade pode ser observada com o auxilio do parâmetro reológico de viscosidade medido com o reómetro rotacional Bohlin VOR (Bohlin GmbH, Alemanha).

Para isso, cultivam-se algumas das estirpes isoladas num leite semi-desnatado a 38 °C até um pH de 5,2. Conforme as instruções do fornecedor, uma amostra de cada meio de cultura é 24 em seguida colocada entre um prato e um cone truncado do mesmo diâmetro (30 mm, ângulo de 5,4°, abertura de 0,1 mm) em seguida a amostra é submetida a um gradiente de velocidade de corte rotacional continua que a força a deformar-se. Determina-se assim a viscosidade da amostra à velocidade de corte de 293 s”1. Os resultados dos testes reológicos efectuados com algumas das estirpes isoladas mostram que os meios de cultura assim fermentados apresentam uma viscosidade superior a 100 mPa.s, ou mesmo uma viscosidade superior a 200 mPa.s no caso das estirpes CNCM 1-1922, 1-1923, 1-1924, 1-1925 e 1-1926.

Por comparação, obtém-se, nas mesmas condições operacionais, viscosidades da ordem de 54, 94, 104, 158 e 165 mPa.s com, respectivamente, as estirpes Lactobacillus helveticus CNCM 1-1449, Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351, Streptococcus thermophilus CNCM 1-1879, Streptococcus thermophilus CNCM 1-1590, Lactobacillus bulgaricus CNCM 1-800 e Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris CNCM 1-1692, que foram referidas, respectivamente, nos pedidos de patente EP699689, EP638642, EP97111379.0, EP750043, EP367918 e EP97201628.1 (as estirpes CNCM 1-800 e 1-1692 são conhecidas como estirpes muito espessadoras).

Exemplo 4 Novo exopolissacárido

Algumas estirpes isoladas no exemplo 1 pertencem ao biotipo espessador, em particular as estirpes CNCM 1-1923, 1-1924, 1-1925 e 1-1926, produzem um EPS de peso molecular elevado cuja composição em glicidos é semelhante à encontrada em certos oligossacáridos do leite materno humano. A análise dos glicidos que compõem este polissacárido é efectuada do modo seguinte. 25

Cultivam-se as estirpes da nova espécie num leite desnatado reconstituído a 10%, com agitação, durante 24 h a 30 °C, sendo o pH mantido a 5,5 por adição de uma solução de NaOH a 2N. Eliminam-se as células bacterianas e as proteínas do meio de cultura por meio de uma precipitação num volume igual de uma solução de 25% em peso de ácido tricloroacético seguido de uma centrifugação (10000 g, lh) . Precipitam-se os EPS por adição de um volume equivalente de acetona, seguido de uma decantação durante 20 h a 4 °C. Recuperam-se os EPS por centrifugação, retoma-se o sedimento numa solução de NH4HCO3 a 0,1 M pH7, e dializa-se a suspensão contra água durante 24 h. Eliminam-se então os materiais insolúveis por ultracentrifugação e liofiliza-se o retentado contendo o EPS purificado. A quantidade de EPS purificado, expressa em mg de equivalentes de glucose, é da ordem de 40 mg por litro de cultura.

Determina-se o peso molecular do EPS por meio de uma cromatografia por filtração em gel com o auxílio de uma coluna de Superose-6 ligada a um sistema de FPLC (Pharmacia) como descrito por Stingele et al., J. bacteriol., 17 8, 1680-1690, 1996. Os resultados mostram que todas as estirpes CNCM 1-1923, 1-1924, 1-1925 e 1-1926 produzem um EPS com um tamanho superior a 2 x 106 Da. 100 mg de equivalente de glucose de EPS purificado são hidrolisados em TFA 4N a 125 °C durante 1 h, antes de serem derivatizados e analisados por cromatografia GLC de acordo com o método descrito por Neeser et al. (Anal. Biochem., 142, 58-67, 1984) . Os resultados mostram que as estirpes produzem um EPS constituído por glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção média de 3:2:1, respectivamente. 26

Exemplo 5 Produto infantil

Prepara-se um soro de leite hidrolisado a 18% por tripsina, seguindo as recomendações do documento US5039532, seca-se de forma convencional por pulverização sob um fluxo de ar quente e incorpora-se entre 0,1 e 10% do EPS purificado seco descrito no exemplo 4. Este produto pode ser rapidamente reconstituído em água. Ele é útil particularmente numa dieta para crianças ou lactentes devido às suas propriedades hipoalergénicas e tolerogénicas ao leite de vaca e por ser completo do ponto de vista da composição glicídica.

Exemplo 6 Produto infantil

Hidrolisa-se o EPS purificado seco do exemplo 4 numa solução de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,5 N durante 30-90 min e a 100 °C, evapora-se o TFA, suspende-se o hidrolisado em água e separam-se os oligossacáridos que têm 3 a 10 unidades de glícidos (600 a 2000 Dalton) por ultrafiltração.

Prepara-se um soro de leite hidrolisado a 18% por tripsina seguindo as recomendações do documento US5039532, seca-se tradicionalmente por pulverização num fluxo de ar quente e incorpora-se entre 0,1 e 10% dos oligossacáridos purificados descritos acima. Este produto pode ser rapidamente reconstituído em água. Ele é particularmente útil para uma dieta para crianças ou lactentes devido às suas propriedades hipoalergénicas e tolerogénicas ao leite de vaca e por ser completo de um ponto de vista da composição glucídica. 27

Exemplo 7 Produto farmacêutico

Prepara-se uma composição farmacêutica sob a forma de uma cápsula fabricada à base de gelatina e água e que contém 5 a 50 mg de EPS purificado do exemplo 4, ou oligossacáridos purificados do exemplo 6.

Exemplo 8 Produto farmacêutico

Preparam-se pastilhas constituídas por uma cultura da estirpe CNCM 1-1924 liofilizada, em seguida comprimida com um agente ligante adequado. Estas pastilhas são particularmente indicadas para restaurar uma flora intestinal em bactérias lácticas e para satisfazer uma dieta equilibrada em glucidos complexos essenciais. 28

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) REQUERENTE:

(A) NOME: SOCIETE DES PRODUITS NESTLE (B) RUA: Av NESTLE 55

(C) CIDADE: VEVEY

(D) ESTADO OU PROVÍNCIA: VAUD

(E) PAÍS: SUIÇA (F) CÓDIGO POSTAL: 1500 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Nova espécie de bactéria láctica (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão # 1.30 (OEB) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1522 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 29

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.l: GTCGACAGAG TTCGATCCTG GCTCAGGACG AACGCTGGCG GCGTGCCTAA TACATGCAAG 60 TAGAACGCTG AAGACTTTAG CTTGCTAGAG TTGGAAGAGT TGCGAACGGG TGAGTAACGC 12 0 GTAGGTAACC TGCCTATTAG TGGGGGATAA CTATTGGAAA CGATAGCTAA TACCGCATAA 18 0 TAGTGTTTAA CACATGTTAG AGACTTAAAA GATGCAATTG CATCACTAGT AGATGGACCT 240 GCGTTGTATT AGCTAGTTGG TGGGGTAACG GCCTACCAAG GCGACGATAC ATAGCCGACC 300 TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC 360 AGTAGGGAAT CTTCGGCAAT GGGGGCAACC TGACCGAGCA ACGCCGCGTG AGTGAAGAAG 420 GTTTTCGGAT CGTAAAGCTC TGTTGTAAGA GAAGAACGTG TGTGAGAGTG GAAAGTTCAC 480 ACAGTGACGG TAACTTACCA GAAAGGGACG GCTAACTACG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA 540 CGTAGGTCCC GAGCGTTGTC CGGATTTATT GGGCGTAAAG CGAGCGCAGG CGGTTTAATA 600 AGTCTGAAGT TAAAGGCAGT GGCTTAACCA TTGTTCGCTT TGGAAACTGT TAAACTTGAG 660 TGCAGAAGGG GAGAGTGGAA TTCCATGTGT AGCGGTGAAA TGCGTAGATA TATGGAGGAA 72 0 CACCGGTGGC GAAAGCGGCT CTCTGGTCTG TAACTGACGC TGAGGCTCGA AAGCGTGGGG 780 AGCAAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CGATGAGTGC TAGGTGTTAG 84 0 GCCCTTTCCG GGGCTTAGTG CCGCAGCTAA CGCATTAAGC ACTCCGCCTG GGGAGTACGA 900 CCGCAAGGTT GAAACTCAAA GGAATTGÁCG GGGGCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGGTT 960 TAATTCGAAG CAACGCGAAG AACTTACCAG GTCTTGACAT CCCGATGCTA TTTCTAGAGA 102 0 TAGAAAGTTT CTTCGGAACA TCGGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG 1080 TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCCTA TTGTTAGTTG CCATCATTCA 114 0 GTTGGGCACT CTAGCGAGAC TGCCGGTGAT AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA 1200 TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGTTGGTA CAACGAGTCG 1260 CAAGCCGGTG ACGGCAAGCA AATCTCTTAA AGCCAATCTC AGTTCGGATT GTAGGCTGCA 132 0 ACTCGCCTAC ATGAAGTCGG AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCACGCCG CGGTGAATAC 1380 GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGTCG 144 0 GTGAGGTAAC CTTTTAGGAN CCAGCCGCCT AAGGTGGGAC AGATGATTGG GGTGAAGTCG 1500 TAACAAGGTA ACCGTAGGAT CC 1522 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 30 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc="sonda" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2: ATATCCGTTT TTTCGACAGA GTTYGATYCT GGCT 34 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc="sonda" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3: ATATCCGGAT CCTACGGYTA CCTTGTTACG ACT 33

Lisboa, 6 de Dezembro de 2006 31

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Espécie de bactéria láctica, cujo ARN ribossómico 16S é caracteristico do género Streptococcus, tendo uma sequência nucleotidica SEQ ID N°: 1 e - cujo perfil de proteínas totais, obtido após cultura da bactéria num meio MRS durante 24 h a 28 °C, extracção das proteínas totais e migração das proteínas num gel de electroforese de SDS-PAGE, apresenta um grau de correlação de Pearson de, pelo menos, 78 em relação ao perfil obtido em condições idênticas com a estirpe de bactéria láctica CNCM 1-1920, mas distinto do das espécies reconhecidas como pertencentes ao género Streptococcus, nomeadamente 5. acídominimus, S. agalactiae / s. alactolyticus, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. caprinus, S. constellatus, S. cricetus, S. cristatus, S. difficile, S. downei, S. dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp. equisimilis, S. equi, S. equi ssp. equi, S. equi ssp, . zooepidemicus, S. equinus, S. ferus, S. gallolyticus, S. gordonii, S. hyointestinalis, S. hyovaginalis, S. iniae, S. intermedius, S. intestinalis , S. macacae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S . parauberis, S. phocae, S . pleomorphus, S. pneumoniae, S, . porcinus, S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. sanguinis, S. shiloi, S. sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S. vestibularis, S. viridans. 1
2. 2. Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 1, capaz de fermentar a D-galactose, a D-glucose, a D-frutose, a D-manose, a N-acetil-(D-)glucosamina, a salicina, a celobiose, a maltose, a lactose, a sacarose e a rafinose.
3. 3. Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 1 seleccionada de entre as estirpes CNCM 1-1920, 1-1921, 1-1922, 1-1923, 1-1924, 1-1925, 1-1926.
4. 4. Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por apresentar um crescimento óptimo de cerca de 28 °C a cerca de 45 °C.
5. 5. Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 1 que quando fermenta um leite semi-desnatado a 38 °C a pH 5,2, confere uma viscosidade ao meio que é superior a 100 mPa.s a uma velocidade de corte da ordem de 293 s-1.
6. 6. Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por produzir um exopolissacárido constituído exclusivamente por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção média de 3:2:1, respectivamente.
7. 7. Utilização de uma estirpe de bactéria láctica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para a preparação de uma composição alimentar, em particular de um leite acidificado.
8. 8. Utilização de um polissacárido susceptível de ser segregado pela estirpe CNCMI-1924, constituído exclusivamente por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa 2 proporção média respectiva de 3:2:1 para a preparação de uma composição alimentar.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, para a preparação de uma composição destinada a satisfazer uma dieta infantil completa.
10. 10. Composição alimentar ou farmacêutica compreendendo uma estirpe de bactéria láctica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
11. 11. Composição alimentar ou farmacêutica compreendendo um polissacárido susceptível de ser segregado pela estirpe CNCM-1924, constituido exclusivamente por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção média respectiva de 3:2:1.
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por se tratar de uma composição infantil.
13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por se tratar de uma composição infantil hipoalergénica.
14. 14. Polissacárido susceptível de ser segregado pela estirpe CNCM 1-1924, constituído exclusivamente por uma cadeia de glucose, galactose e N-acetilglucosamina numa proporção média respectiva de 3:2:1. Lisboa, 6 de Dezembro de 2006 3