ES2273439T3 - Nueva especie de bacteria lactica. - Google Patents
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Abstract
Cepa de bacteria láctica, - cuyo ARN ribosómico 16S es característico del género Streptococcus y está provisto de una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 y - cuyo perfil de proteínas totales, obtenido después del cultivo de la bacteria en un medio MRS a 28ºC durante 24 h, extracción de las proteínas totales y migración de las proteínas a través de un gel de electroforesis SDS-PAGE, presente un grado de correlación de Pearson por lo menos de 78 con respecto al perfil obtenido en condiciones idénticas con la cepa de bacteria láctica CNCM I-1920, pero distinto de los perfiles de las especies reconocidas pertenecientes al género Streptococcus, a saber: S. acidominimus, S. agalac- tiae, S. alactolyticus, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. caprinus, S. constellatus, S. cricetus, S. cristatus, S. difficile, S. downei, S. dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp. equisimilis, S. equi, S. equi ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus, S. equinus, S. ferus, S. gallo- lyticus, S. gordonii,S. hyointestinalis, S. hyovaginalis, S. iniae, S. intermedius, S. intestinalis, S. macacae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S. parauberis, S. phocae, S. pleomorphus, S. pneumoniae, S. porcinus, S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. sanguinis, S. shiloi, S. sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S. vestibularis, S. viridans.
Description
Nueva especie de bacteria láctica.
La presente invención se refiere a una nueva
especie de bacteria láctica, perteneciente al género
Streptococcus.
La identificación de bacterias lácticas es
esencial en la industria láctica y consiste en diferenciar entre
diversas especies las características distintivas de tipo
morfológico, fisiológico y/o genético.
Los caracteres fisiológicos distintivos de una
especie determinada de bacteria láctica pueden obtenerse mediante
diversos ensayos que incluyen, por ejemplo, el análisis de la
capacidad para fermentar diferentes azúcares y el análisis
estandarizado del perfil de migración de las proteínas totales a
través de un gel de electroforesis del tipo SDS-PAGE
(Pot y col., Taxonomy of lactic acid bacteria, en: Bacteriocins of
lactic acid bacteria, Microbiology, Genetics and Applications,
coordinadores L. De Vuyst y E.J. Vandamme, Blackie Academic &
Professional, Londres, 1994).
El perfil de migración de las proteínas totales
de una especie determinada, obtenido a través de un gel de
electroforesis SDS-PAGE, cuando se compara mediante
un densímetro u otros perfiles procedentes de otras especies,
permite determinar las relaciones taxonómicas entre las especies. El
análisis numérico de los diferentes perfiles, por ejemplo con el
programa informático GelCompar® permite establecer el grado de
correlación entre las especies, que es función de diferentes
parámetros, en particular de los algoritmos empleados (GelCompar,
versión 4.0, Applied Maths, Kortrijk, Bélgica; algoritmos:
"Pearson Product Moment Correlación Coefficient, Unweighted pair
Group Method using Average Linkage").
Actualmente, el análisis comparativo del perfil
de proteínas totales por electroforesis a través de gel
SDS-PAGE ha dado buenos resultados como un medio
eficaz para distinguir grupos homogéneos y distintos de especies de
bacterias lácticas (Pot y col., Chemical Methods in Prokaryotic
Systematics, capítulo 14, coordinadores: M. Goodfellow y A.G.
O'Donnell, John Wiley and Sons Ltd., 1994).
Con este método SDS-PAGE, las
experiencias precedentes han demostrado que cuando se obtiene un
grado de correlación de Pearson de más de 78 (en una escala de 100)
entre dos cepas de bacterias lácticas, se puede deducir con razón
que pertenecen a la misma especie (Kersters y col., Classification
and Identification methods for lactic bacteria with emphasis on
protein gel electrophoresis, en: Acid Lactic Bacteria, actas del
simposio Lactic'91, 33-40, Adria Normandie,
Francia, 1992; Pot y col., The potential role of a culture
collection for identification and maintenance of lactic acid
bacteria, capítulo 15, pp. 81-87, en: The Lactic
Acid Bacteria, E.L. Foo, H.G. Griffin, R. Mollby, y C. G. Heden,
Proceedings of the first lactic computer conference, Horizon
Scientific Press, Norfolk).
A título de ejemplo, el grupo de bacterias
lácticas acidófilas se ha dividido recientemente en 6 especies
distintas gracias a esta técnica (Pot y col., J. General Microb.
139, 513-517, 1993). Además, esta técnica, en
combinación con otras técnicas, ha permitido establecer
recientemente la existencia de varias especies nuevas de
Streptococcus, como son el Streptococcus dysgalactiae
subesp. equisimilis, Streptococcus hyovaginalis esp. nueva y
Streptococcus thoraltensis esp. nueva (Vandamme y col., Int.
J. Syst. Bacteriol. 46, 774-781, 1996;
Devriese y col., Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, en prensa).
Sin embargo, la identificación de nuevas
especies de bacterias lácticas no puede reducirse a un análisis
puramente morfológico y/o fisiológico de las bacterias. En efecto,
dos especies morfológicamente y/o fisiológicamente muy afines
pueden ser muy distantes desde el punto de vista genético. El
análisis del ARN ribosómico 16S de las bacterias lácticas reviste
una importancia capital para determinar definitivamente la
pertenencia de una bacteria láctica a un género o una especie ya
conocidos.
Actualmente, la "Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares S.L." (Deutsche Sammlung Von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, Braunschweig, Alemania)
ha registrado oficialmente unas 48 especies diferentes que
pertenecen al género Streptococcus (véase la lista a
continuación). Todas estas especies tienen un ARN ribosómico 16S
que es típico del género Streptococcus y pueden repartirse
entre grupos distintos y homogéneos gracias a la técnica
SDS-PAGE ya mencionada antes.
La presente invención se refiere a la
identificación mediante técnicas avanzadas de identificación
indicadas a continuación de una nueva especie de bacteria láctica
perteneciente al género Streptococcus y a su utilización en
la industria láctica en general.
A este efecto, la invención se refiere a
cualquier bacteria láctica,
- cuyo ARN ribosómico 16S sea característico del
género Streptococcus provisto de una secuencia de nucleótidos
SEQ ID NO: 1 y
- cuyo perfil de proteínas totales, obtenido
después del cultivo de la bacteria en un medio MRS a 28ºC durante 24
h, extracción de las proteínas totales y migración de las proteínas
a través de un gel de electroforesis SDS-PAGE,
presente un grado de correlación de Pearson por lo menos de 78 con
respecto al perfil obtenido en condiciones idénticas con la cepa de
bacteria láctica CNCM I-1920, pero distinto de los
perfiles de las especies reconocidas pertenecientes al género
Streptococcus, a saber, S. acidominimus, S. agalactiae, S.
alactolyticus, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. caprinus, S.
constellatus, S. cricetus, S. cristatus, S. difficile, S. downei, S.
dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp. equisimilis, S.
equi, S. equi ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus, S. equinus, S.
ferus, S. gallolyticus, S. gordonii, S. hyointestinalis, S.
hyovaginalis, S. iniae, S. intermedius, S. intestinalis, S.
macacae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S.
parauberis, S. phocae, S. pleomorphus, S. pneumoniae, S. porcinus,
S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. sanguinis, S. shiloi, S.
sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S.
vestibularis, S. viridans.
La invención se refiere a la utilización de una
cepa de bacteria láctica según la invención para la fabricación de
una composición alimentaria, en especial una leche acidificada o un
queso fresco, por ejemplo.
La invención se refiere igualmente a la
utilización de un polisacárido, capaz de ser segregado por la cepa
CNCM I-1924, constituido exclusivamente por un
encadenamiento de glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción respectiva de
3:2:1 para la fabricación de una composición alimentaria o
farmacéutica.
La invención tiene por objeto una composición
alimentaria o farmacéutica que contiene una cepa de bacteria láctica
según la invención.
Finalmente, la invención tiene también por
objeto una composición alimentaria o farmacéutica que contiene un
polisacárido, susceptible de ser secretado por la cepa CNCM
I-1924, constituido exclusivamente por un
encadenamiento de glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción media
respectiva de 3:2:1.
La pertenencia de la nueva especie según la
invención al género Streptococcus se pone de manifiesto con
preferencia comparando la secuencia de nucleótidos del ARN
ribosómico 16S de las bacterias según la invención, o de su ADN
genómico que se transcribe al ARN ribosómico 16S, con las de otros
géneros y especies de bacterias lácticas conocidas hasta el
presente.
Más en particular se puede llevar a la práctica
el método expuesto en el siguiente ejemplo 1, o incluso otros
métodos ya conocidos de los expertos en la materia (Schleifer y
col., System. Appl. Microb. 18, 461-467,
1995; Ludwig y col., System. Appl. Microb. 15,
487-501, 1992), por ejemplo. La secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO:1 presentada en la siguiente lista de
secuencias es característica de esta nueva especie y contiene
similitudes sorprendente con las secuencias de ARN ribosómico 16S
encontradas en las especies de Streptococcus reconocidas
hasta el presente.
La nueva especie según la invención, que
constituye un nuevo grupo distinto y homogéneo, puede diferenciarse
también de otras especies conocidas pertenecientes al género
Streptococcus mediante la técnica de identificación de
proteínas totales a través de un gel de electroforesis
SDS-PAGE descrita en páginas anteriores.
En particular, esta nueva especie posee un
perfil en proteínas totales, obtenido después del cultivo de la
bacteria en un medio MRS a 28ºC durante 24 h, extracción de
proteínas totales y migración de proteínas a través de un gel
electroforesis SDS-PAGE, que presenta un grado de
correlación de Pearson por lo menos de 78 (en una escala de 100) con
el perfil obtenido en condiciones idénticas con la cepa de bacteria
láctica CNCM I-1920, y ello con respecto a los
perfiles obtenidos en condiciones idénticas a las de diferentes
especies de bacterias lácticas, en especial a las de las indicadas
a continuación, por ejemplo.
Esta técnica consiste más en particular en (1)
aislar todas las proteínas (= proteínas totales) de un cultivo de
bacteria láctica cultivada en condiciones definidas, (2) separar las
proteínas por electroforesis a través de gel SDSPAGE, (3) analizar
la disposición de las diferentes fracciones de proteínas separadas
mediante densímetro, que mide la intensidad y el emplazamiento de
cada banda, y (4) comparar el perfil de proteínas así obtenido con
el de diversas especies diferentes de Streptococcus que se
han obtenido, en paralelo o previamente, exactamente en las mismas
condiciones operativas.
Las técnicas de obtención de un perfil de
proteínas totales como las descritas anteriormente, así como el
análisis numérico de dichos perfiles, son bien conocidas de los
expertos en la materia. Sin embargo, los resultados solamente son
fiables en la medida, en la que cada etapa del procedimiento se haya
estandarizado de modo suficiente. En lo que respecta a este
requisito, los autores de procedimientos estandarizados ponen
regularmente a disposición del público dichos procedimientos. Cabe
citar en especial en especial el de Pot y col. presentado durante un
"workshop" organizado por la Unión Europea en la universidad de
Gante, Bélgica, del 12 al 16 de setiembre de 1994 (Fingerprinting
techniques for classification and identification of bacteria,
SDS-PAGE of whole cell protein).
El programa informático empleado para la técnica
de identificación a través de gel de electroforesis
SDS-PAGE reviste una importancia determinante en la
medida en la que el grado de correlación entre las especies depende
de los parámetros y algoritmos empleados en dicho programa. Sin
ánimo de entrar en detalles teóricos, la comparación cuantitativa de
las bandas captadas por un densímetro y normalizadas mediante un
calculador se realiza con preferencia con el coeficiente de
correlación de Pearson. La matriz de similitud resultante puede
organizarse mediante el algoritmo UPGMA (unweighted pair group
method using average linkage), un algoritmo que permite no solo
reagrupar los perfiles más similares, sino también construir
dendogramas (ver Kersters K., Numerical methods in the
classification and identification of bateria by electrophoresis, en:
Computer assisted Bacterial Systematics, 337-368, M.
Goodfellow, A.G. O'Donnel (coord.), John Wiley and Sons Ltd.,
1985).
Las cepas de la nueva especie presentan con
preferencia un perfil de proteínas totales que tiene un grado de
correlación de Pearson por lo menos del 85 en lo que respecta a una
de las cepas de bacterias de la nueva especie. Para los biotipos
mencionados a continuación, este grado de correlación de Pearson
puede incluso rebasar el 90, por ejemplo.
Mediante esta técnica de identificación a través
de gel de electroforesis SDS-PAGE, la nueva especie
perteneciente al género Streptococcus según la invención
puede distinguirse de todas las especies de Streptococcus
reconocidas hasta el presente, a saber las especies S.
acidominimus, S. agalactiae, S. alactolyticus, S. anginosus, S.
bovis, S. canis, S. caprinus, S. constellatus, S. cricetus, S.
cristatus, S. difficile, S. downei, S. dysgalactiae ssp.
dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp. equisimilis, S. equi, S. equi
ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus, S. equinus, S. ferus, S.
gallolyticus, S. gordonii, S. hyointestinalis, S. hyovaginalis, S.
iniae, S. intermedius, S. intestinalis, S. macacae, S. mitis, S.
mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S. parauberis, S. phocae, S.
pleomorphus, S. pneumoniae, S. porcinus, S. pyogenes, S. ratti, S.
salivarius, S. sanguinis, S. shiloi, S. sobrinus, S. suis, S.
thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S. vestibularis, S.
viridans.
La nueva especie según la invención se distingue
igualmente mediante esta técnica de las bacterias lácticas se habían
clasificada anteriormente por error en el género de los
Streptococcus como son el S. adjacens (nueva
clasificación = Abiotrophia adiacens), S.
casseliflavus (= Enterococcus casseliflavus), S.
cecorum (= Enterococcus cecorum), S. cremoris (=
Lactococcus lactis subsp. cremoris), S. defectivus (=
Abiotrophia defectiva), S. faecalis (= Enterococcus
faecalis), S. faecium (= Enterococcus faecium),
S. gallinarum (= Enterococcus gallinarum), S.
garvieae (= Lactococcus garvieae), S. hansenii (=
Ruminococcus hansenii), S. lactis (= Lactococcus
lactis subsp. lactis), S. lactis cremoris (=
Lactococcus lactis subsp. cremoris), S. lactis
diacetilactis (= Lactococcus lactis subsp. lactis), S.
morbillorum (= Gemella morbillorum), S. parvulus
(= Atopobium parvulum), S. plantarum (= Lactococcus
plantarum), S. raffinolactis (= Lactococcus
raffinolactis) y S. saccharolyticus (= Enterococcus
saccharolyticus).
Las bacterias lácticas según la invención tienen
una morfología característica del Lactococcus lactis, por
ejemplo, es decir, tienen la forma de cocos unidos formando
cadenas.
Los azúcares fermentables por acción de la nueva
especie son por lo general por lo menos uno de los siguientes, a
saber, la D-galactosa, la D-glucosa,
la D-fructosa, la D-manosa, la
N-acetil-(D)-glucosamina, la
salicina, la celobiosa, la maltosa, la lactosa, la sacarosa y la
rafinosa.
Entre todas las cepas de la nueva especie que se
han aislado en las industrias lácticas de Suiza, 7 se han depositado
con arreglo al Tratado de Budapest, a título de ejemplo, en la
Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), 25 rue du
docteur Roux, 75724 París, con fecha 14 de octubre de 1997, en la
que se les han atribuido los siguientes números de depósito: CNCM
I-1920, I-1921,
I-1922, I-1923,
I-I924, I-1925 e
I-1926.
Les cepas de la nueva especie pueden utilizarse
para fabricar un producto alimentario o farmacéutico, en especial en
forma de cultivo fresco, concentrado o desecado, por ejemplo.
Los productos de base láctica son preferidos,
evidentemente, en el marco de esta invención. Sin embargo se
entiende por leche por un lado la leche de origen animal, por
ejemplo la leche de vaca, de cabra, de oveja, de búfala, de cebú,
de yegua, de burra, de camella, etc. Esta leche puede ser una leche
en estado nativo, una leche reconstituida, una leche descremada o
una leche a la que se han añadido los compuestos necesarios para el
cultivo de bacterias o para el posterior tratamiento de la leche
fermentada, como son materias grasas, proteínas de extracto de
levadura, peptonas y/o un tensioactivo, por ejemplo. El término
leche se aplica igualmente a lo que se llama habitualmente leche
vegetal, es decir, un extracto de materias vegetales, tratadas o no,
como son las leguminosas (soja, garbanzo, lenteja, etc.) u
oleaginosas (colza, soja, sésamo, algodón, etc.), extracto que
contiene proteínas en solución o en suspensión coloidal, coagulables
por acción química, por fermentación en medio ácido y/o por calor.
Finalmente, el término leche designa también las mezclas de leches
animales y de leches vegetales.
Los productos farmacéuticos pueden ser cualquier
tipo de productos destinados a administrarse por vía oral, o incluso
de manera tópica, que contienen un soporte farmacéutico aceptable,
sobre el que o al que se incorpora un cultivo de la nueva especie
en forma fresca, concentrada o desecada, por ejemplo. Estos
productos farmacéuticos pueden presentarse en forma de suspensión
ingerible, de un gel, de un difusor, de una cápsula, de una
pastilla, de un jarabe o en cualquier otra forma galénica, ya
conocida de los expertos en la materia.
Por otro lado, ciertas cepas de la nueva especie
según la invención, que representan un nuevo biotipo de esta
especie, pueden poseer además la propiedad notable de ser a la vez
mesófilas y termófilas (biotipo mesófilo/termófilo). Las cepas
pertenecientes a este biotipo presentan, en efecto, un crecimiento
óptimo entre 28ºC y 45ºC. Esta propiedad puede observarse fácilmente
(1) preparando diversos cultivos de un biotipo mesófilo/termófilo en
paralelo, a temperaturas escalonadas entre 20 y 50ºC, (2) midiendo
las absorbancias de los medios al cabo de 16 h de cultivo, por
ejemplo, y (3) reuniendo los resultados en forma de gráfica que
represente la absorbancia en función de la temperatura
(graditérmica). La figura 1 es particularmente representativa de las
gráficas que se pueden obtener con este biotipo mesófilo/termófilo
según la invención. A título de indicación, entre las cepas de las
nuevas especies que presentan este biotipo particular, son
particularmente representativas por ejemplo las cepas CNCM
I-1920, I-1921 e
I-1922.
La utilización de un biotipo mesófilo/termófilo
en la industria láctica reviste una importancia nada despreciable.
En efecto, se puede utilizar esta especie para la fabricación de
iniciadores (starter) mesófilos o termófilos. Se pueden fabricar
además industrialmente leches acidificadas a 45ºC para obtener un
producto de tipo "yoghourt". Se pueden producir además
industrialmente quesos frescos por fermentación de leche en
presencia de presión a 28ºC y separando el cuajo formado por
centrifugación o ultrafiltración. De este modo se eliminan los
problemas de ensuciamiento por incrustación de las máquinas
asociados con la utilización de fermentos termófilos (estos
problemas se describen en la solicitud de patente EP nº
96203683.6).
Por otro lado, otras cepas de la nueva especie
según la invención, que representan un nuevo biotipo de esta
especie, pueden poseer la propiedad notable de conferir viscosidad
al medio de fermentación (biotipo texturador). El carácter viscoso
de la leche fermentada con un biotipo texturador según la invención
puede observarse y determinarse del modo descrito a
continuación.
1. Por observación de la estructura de la leche
acidificada con un biotipo texturador, comparándola con la de una
leche acidificada con cultivos no texturadores. La leche no viscosa
se adhiere a las paredes del vaso de vidrio, mientras que la leche
viscosa es coherente consigo misma.
2. Otro ensayo puede realizarse con la pipeta.
Se sumerge la pipeta en leche acidificada que se aspira en una
cantidad de unos 2 ml, después se saca la pipeta de la leche. La
leche viscosa forma un hilo entre la pipeta y la superficie del
líquido, mientras que la leche no viscosa no produce este fenómeno.
Cuando se deja el líquido en la pipeta, la leche no viscosa forma
gotas distintas, como si fueran de agua, mientras que la leche
viscosa forma gotas que terminan en largos hilos que llegan hasta el
mismo pico de la pipeta.
3. Cuando se llena un tubo de ensayo hasta un
tercio de su altura y se agita con un agitador rotatorio, la leche
no viscosa asciende por la cara interior de la pared, mientras que
la ascensión de la leche viscosa es prácticamente
nula.
nula.
El carácter viscoso de este biotipo particular
puede determinarse además a través de un parámetro reológico,
midiendo la viscosidad. Existen aparatos comerciales capaces de
determinar este parámetro, por ejemplo el viscosímetro Bohlin VOR
(Bohlin GmbH, Alemania). Siguiendo las instrucciones del fabricante
se coloca la muestra entre la meseta y el cono truncado del mismo
diámetro (30 mm, ángulo de 5,4º, holgura de 0,1 mm), después se
somete la muestra a un gradiente de velocidad de cizallamiento
rotatorio continuo, que la obliga a fluir. La muestra, que se
resiste a esta deformación, desarrolla una fuerza tangencial llamada
resistencia al cizallamiento (shear stress). Esta resistencia,
proporcional a la resistencia a fluir, se mide mediante una barra de
torsión. La viscosidad de la muestra se determina entonces a partir
de la velocidad de cizallamiento determinada, en relación con la
resistencia al cizallamiento (Pa) y la velocidad de cizallamiento
(s^{-1}) (véase también "Le Technoscope de Biofutur", mayo de
97).
Los ensayos de medición reológica del carácter
texturador de este biotipo han conducido a la definición siguiente.
Una bacteria láctica perteneciente al biotipo texturador según la
invención es una bacteria que, cuando fermenta una leche
semidesnatada a 38ºC hasta pH 5,2, da una viscosidad al medio que es
superior a 100 mPa.s para una velocidad de cizallamiento del orden
de 293 s^{-1}, por ejemplo. A título ilustrativo, las cepas CNCM
I-1922, I-1923,
I-1924, I-1925 e
I-1926 son particularmente representativas de este
biotipo texturador, por ejemplo.
Este biotipo texturador reviste igualmente una
importancia nada despreciable para la industria láctica, porque su
capacidad de dar viscosidad a un producto lácteo es excepcionalmente
elevada cuando se la compara con las de otras especias de bacterias
lácticas texturantes, en particular con las cepas de
Lactobacillus helveticus CNCM I-1449,
Streptococcus thermophilus CNCM I-1351,
Streptococcus thermophilus CNCM I-1879,
Streptococcus thermophilus CNCM I-1590,
Lactobacillus bulgaricus CNCM I-800 y
Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris CNCM
I-1692, a los que se refieren las solicitudes de
patente EP699689, EP638642, EP97111379.0, EP750043, EP367918 y
EP97201628.1, respectivamente.
Cabe subrayar además que la producción de una
viscosidad puede efectuarse para ciertas cepas en una gama de
temperaturas muy amplia, que abarca desde las temperaturas mesófilas
(25-30ºC) hasta la temperaturas termófilas
(40-45ºC). Esta peculiaridad constituye una ventaja
tecnológica evidente.
Por otro lado, ciertas cepas pertenecientes a
este nuevo biotipo texturador producen un exceso de un
exopolisacárido (EPS) de peso molecular elevado, cuya composición de
azúcar es similar a la que se encuentra en los oligosacáridos de la
leche materna humana. Este EPS está constituido de hecho por un
encadenamiento de glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción de 3:2:1
respectivamente (A. Kobata, en: The Glycoconjugates, vol. 1, "Milk
glycoproteins and oligosaccharides", p. 423-440,
coord. I. Horowitz y W. Pigman, Ac. Press, N.Y., 1977). A título
indicativo, las cepas CNCM I-1923,
I-1924, I-1925 e
I-1926 producen este polisacárido.
Este exopolisacárido, en forma nativa o
hidrolizada, podría satisfacer además ventajosamente una dieta
infantil completa.
Para ello puede prepararse una dieta para niños
y/o bebés que contenga leche que se ha acidificado con una cepa de
bacteria láctica productora de un EPS constituido por un
encadenamiento de glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción de 3:2:1,
respectivamente, en especial con las cepas CNCM
I-1924, I-1925 o
I-1926, por ejemplo.
Además se puede aislar previamente este EPS de
un medio de cultivo de este biotipo y utilizarlo, en forma nativa o
hidrolizada, como ingrediente de una dieta infantil, por
ejemplo.
El aislamiento del EPS consiste por lo general
en retirar las proteínas y las bacterias del medio de cultivo y en
aislar la fracción purificada del EPS. Se puede realizar la
extracción de las proteínas y de las bacterias por precipitación
con un alcohol o con ácido tricloroacético y posterior
centrifugación, mientras que se puede purificar el EPS por
precipitación en un disolvente del tipo acetona y posterior
centrifugación, por ejemplo. Si fuera necesario, el EPS puede
purificarse por cromatografía de filtración a través de gel o
cromatografía de afinidad, por ejemplo.
En el contexto de la presente invención, el
aislamiento del EPS abarca igualmente todos los métodos de
producción de un EPS por fermentación seguida por la concentración
del medio de cultivo por secado o ultrafiltración, por ejemplo. La
concentración puede realizarse por cualquier método ya conocido de
los expertos en la materia, y en particular por los métodos de
liofilización o de atomización en un flujo de aire caliente, por
ejemplo. Al efecto se incorporan como referencia a la descripción
de la presente invención los métodos descritos en
US-3985901, EP-298605 y
EP-63438.
En el supuesto de que los oligosacáridos
maternos sean de pequeño tamaño, podrá ser ventajoso de realizar
previamente una hidrólisis parcial del EPS según la invención. Las
condiciones de hidrólisis se eligen con preferencia con el fin de
obtener oligosacáridos que tengan de 3 a 10 unidades de azúcar, es
decir, oligosacáridos que tengan un peso molecular comprendido entre
600 y 2000 daltones, por ejemplo.
Más en particular se puede hidrolizar el EPS
según la invención en una solución de ácido trifluoracético (TFA)
0,5 N a 100ºC durante 30-90 min y después evaporar
el TFA y recuperar los oligosacáridos.
Un producto infantil preferido contiene material
proteico hidrolizado de crema de leche, del que no se han eliminado
los alergenos elegidos entre el grupo formado por la
\alpha-lactoalbúmina, la
\beta-lactoglobulina, la seroalbúmina y las
inmunoglobulina, incluidos los alergenos hidrolizados, se presenta
en forma de residuos de hidrólisis que tienen un peso molecular no
superior a unos 10 000 daltones, de manera que el material
hidrolizado está sensiblemente exento de proteínas alergénicas y de
alergenos de origen proteico (= producto hipoalergénico según la
directiva europea 96/4/EC; Fritsche y col., Int. Arch. Aller. and
Appl. Imm. 93, 289-293, 1990).
Se pueden mezclar el EPS de la invención, en
forma nativa o parcialmente hidrolizada, y este material proteico
hidrolizado de la crema de leche y después agregar esta mezcla, en
forma desecada o no, a numerosas preparaciones de uso dietético, en
particular a alimentos para bebés o a alimentos de absorción fácil,
destinados ante todo a personas que sufren alergias, por
ejemplo.
La presente invención se describe con mayor
detalle mediante los ejemplos que siguen, a los que antecede una
breve descripción de las figuras. Se de por supuesto, obviamente,
que estos ejemplos se facilitan a título meramente ilustrativo del
objeto de la invención, del que en modo alguno pretenden ser una
limitación. Los porcentajes se refieren al peso, salvo indicación en
contra.
- En la figura 1 se representa una fotografía de
los perfiles de migración de las proteínas totales de diversas cepas
de la nueva especie a través del gel de electroforesis
SDS-PAGE, por comparación con los obtenidos con
cepas de Streptococcus thermophilus. El grado de filiación de
las cepas se indica mediante la escala de correlación de Pearson y
mediante la arborescencia relativa a los perfiles de proteínas (se
representan los grados de correlación de Pearson de 55 a 100).
- En la figura 2 se representa la gráfica
graditérmica de la cepa CNCM I-1920.
\vskip1.000000\baselineskip
Diversas cepas de bacterias lácticas aisladas en
diferentes industrias lácticas de Suiza han sido objeto de
identificación genética y fisiológica del modo siguiente. Los
métodos practicados y los resultados obtenidos, presentados a
continuación, ponen de manifiesto que estas cepas forman parte de un
nuevo grupo de Streptococcus, que es lo suficientemente
distinto y homogéneo para que se lo pueda designar como agrupador de
una nueva especie de bacteria láctica. A título de ejemplo, ciertas
cepas pertenecientes a esta nueva especie han sido depositadas con
arreglo al Tratado de Budapest en la Collection Nationale de Culture
de Microorganismes (CNCM), 25 rue due docteur Roux, 75724 París,
con fecha 14 de octubre de 1997, y han recibido los siguientes
números de identificación: CNCM I-1920,
I-1921, I-1922,
I-1923, I-1924,
I-1925 e I-1926.
Se observa en el microscopio una morfología
característica del Lactococcus lactis, es decir, una forma de
cocos unidos formando cadenas.
Los azúcares fermentables por las cepas aisladas
son en general la D-galactosa, la
D-glucosa, la D-fructosa, la
D-manosa, la
N-acetil-(D)glucosamina, la salicina, la
celobiosa, la maltosa, la lactosa, la sacarosa y la rafinosa. El
perfil de fermentación es similar al obtenido con la especie
Lactococcus lactis.
Se cultivan las cepas aisladas en 40 ml de medio
HJL a 37ºC durante 24 h, se recogen las bacterias por
centrifugación, se prepara una nueva suspensión con cada culote
bacteriano en 2,5 ml de tampón TE (10 mM Tris, pH = 8, 0,1 mM EDTA)
que contiene 10 mg/ml de lisozima y se incuba el conjunto a 37ºC
durante 1 h. Se añade enseguida 100 \mul de una solución que
contiene 10 mg/ml de proteinasa K, 250 \mul de una solución que
contiene 500 mM EDTA, pH = 8,0, y 500 \mul de una solución que
contiene 10% de SDS. Se incuba el conjunto a 60ºC durante 1 h de
manera que se asegure la lisis completa de las bacterias. Después
de enfriar las mezclas se les añaden 2,5 ml de fenol/cloroformo, se
centrifugan durante 10 min en una centrífuga Heraeus de manera que
se separen 2 fases y se elimina la fase superior. Se precipita el
ADN cromosómico de la fase inferior por adición de 2,5 ml de una
solución que contiene etanol del 96% y se agita suavemente hasta la
formación de un precipitado. Se retira el ADN precipitado mediante
un palillo de madera, se deposita en un tubo eppendorf de 2 ml que
contiene 1 ml de tampón Tris (10 mM de Tris-HCl, pH
8,0, 10 mM de EDTA y 10 \mug/ml de RNasa A), y se incuba a 56ºC
durante 1 h. Después se enfriar, se extraen las diferentes
suspensiones de ADN con 1 ml de fenol/ cloroformo del modo recién
descrito y se precipitan los ADN cromosómicos con etanol. Se prepara
una nueva suspensión de los ADN en un tubo eppendorf que contiene
una cantidad de tampón TE tal, que la cantidad final de ADN de cada
cepa sea del orden de 250 \mug/ml.
Se amplifica por PCR una parte alícuota de 1
\mul de ADN de cada cepa aislada con los cebos que tienen las
secuencias de nucleótidos correspondientes a SEQ ID NO:2 y SEQ ID
NO:3 (ver la lista de secuencias más abajo), durante 30 ciclos
(95ºC/30 s, 40ºC/30 s y 72ºC/2 min), empleando para ello la
polimerasa Pwo de Boehringer. Se purifican los productos de la PCR
con un kit QIAGEN QIAquick y se eluyen los productos en 50 \mul de
tampón TE. Se digiere una muestra de 20 \mul de cada producto con
las enzimas de restricción BamHI y SalI, se separan los fragmentos
de 1,6 kb a través de un gel de agarosa (1%), se purifican con un
kit QIAGEN QIAquick, se clonan seguidamente en un vector E.
coli pK19 (Pridmore R.D., Gene 56,
309-312, 1987) digerido anteriormente por BamHI y
SalI y desfosforilado y se transforman las células competentes de la
cepa BZ234 de E. coli (colección de la universidad de
Basilea, Suiza) con cada producto de ligación. Se seleccionan los
transformantes a 37ºC en un medio LB que contiene 50 \mug/ml de
canamicina, 30 ng/ml de X-gal y 10 ng/ml de IPTG. Se
cultivan las colonias blancas que contienen el inserto durante 10 h
en un medio LB que contiene 50 \mug/ml de canamicina y se aíslan
los ADN plasmídicos con un kit QIAGEN QIAprep8.
Se mezclan 4 \mul de muestra de cada plásmido
(1 pmol/\mul: procedente de cada cepa aislada) con 4 \mul de
cebos marcados IRD-41 (cebos de secuenciación: MWG
Biotech) y 17 \mul de H_{2}O. Para cada cepa aislada se
dispensan 4 partes alícuotas de 6 \mul a 4 hoyos de 200 \mul y
se les añaden 2 \mul de una mezcla de reacción (Amersham;
RPN2536). Se amplifican las mezclas por PCR en un sistema Hybaid
Omn-E mediante 1 ciclo de 95ºC durante 2 min,
seguido por 25 ciclos de 95ºC/30 s, 50ºC/30 s y 72ºC/1 min. Se
separa seguidamente de forma clásica los productos de reacción a
través de un gel de poliacrilamida y se lee la secuencia de ADN de
cada cepa aislada. Los fragmentos de ADN así secuenciados
representan la parte genómica del ARN ribosómico 16S.
Los resultados indican que todas las cepas
aisladas contienen una secuencia similar de nucleótidos, a saber,
idéntica a la SEQ ID NO:1 que se recoge en la siguiente lista de
secuencias. Estas secuencias poseen numerosas homologías con las
secuencias ARN 16S encontradas en las especies de bacterias lácticas
pertenecientes al género Streptococcus, lo cual permite
clasificar estas cepas dentro del genero Streptococcus.
Se efectúan los ensayos con arreglo a las
instrucciones de Pot y col., presentadas durante un "workshop"
organizado por la Unión Europea, en la universidad de Gante,
Bélgica, del 12 al 16 de setiembre de 1994 (Fingerprinting
techniques for classification and identification of bacteria,
SDS-PAGE of whole cell protein).
En resumen para cultivar las bacterias lácticas
se siembran 10 ml de medio MRS (de Man. Rogosa et Sharpe) con un
precultivo de MRS de cada cepa de la nueva especie de bacteria
láctica, además de cada cepa de referencia que abarca la mayor
parte de especies posibles de Streptococcus. Se incuban los
medios a 28ºC durante 24 h, se extienden sobre una cápsula petri que
contiene un medio fresco MRS-agar y se incuban en
cajas a 28ºC durante 24 h.
Para obtener el extracto que contiene las
proteínas de las bacterias se recupera el medio
MRS-agar de un tampón de pH 7,3, que contiene 0,008
M de Na_{2}HOPO_{4}.12H_{2}O, 0,002 M de
Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O y un 8% de NaCl. Se recuperan las
bacterias rascando la superficie del medio gelificado, se filtra la
suspensión a través de una gasa de poliamida, se centrifugan a 9000
rpm durante 10 min con un rotor GSA, se recupera el culote que se
suspende de nuevo en 1 ml del tampón precedente. Se lava el culote
repitiendo el procedimiento de
centrifugación-lavado, se recuperan finalmente unos
50 mg de células a las que se añade un volumen de tampón STB de pH
6,8 (por 1000 ml: 0,75 g de Tris, 5 ml de C_{2}H_{6}OS, 5 g de
glicerina), se rompen las células con ultrasonidos (Labsonic 2000),
se centrifugan los residuos celulares y se conserva el líquido
sobrenadante que contiene las proteínas totales.
Se prepara a continuación del modo clásico un
gel de poliacrilamida SDS-PAGE de 1,5 mm de grosor
(Biorad-Protean o Hoefer SE600), reticulado con un
12% de acrilamida en el caso de gel de separación (12,6 cm de
altura) y 5% de acrilamida en el caso de gel de concentración (1,4
cm de altura). Para ello, se realiza en especial la polimerización
de dos partes de gel en un baño termostatado a 19ºC durante 24 h y 1
h, respectivamente, de manera que se reduzcan al mínimo las
imperfecciones del gel y se obtenga un máximo de reproducibilidad en
los ensayos.
Entonces se separan las proteínas de cada
extracto a través de gel de electroforesis SDS-PAGE.
Para ello se aplica 6 mA a cada placa que contiene 20 pistas hasta
que el colorante alcance una distancia de 9,5 cm con respecto a la
parte alta del gel de separación. Se fijan a continuación las
proteínas en el gel, se las colorea, se seca el gel sobre celofán,
se cuantifica el gel mediante un densímetro (LKB Ultroscan Laser
Densimeter, Suecia) conectado a un ordenador y se comparan los
perfiles entre ellos mediante el programa informático GelCompar®,
versión 4.0, Applied Maths, Kortrijk, Bélgica. En la medida en la
que los ensayos están bien estandarizados, los perfiles de las
diferentes especies de Streptococcus contenidas en el banco
de datos se han utilizado también en el curso de la
comparación
numérica.
numérica.
Los resultados indican entonces que todas las
cepas ensayadas, pertenecientes a la nueva especie, se distinguen
de las especies siguientes: S. acidominimus, S. adjacens, S.
agalactiae, S. alactolyticus, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S.
caprinus, S. casseliflavus, S. cecorum, S. constellatus, S.
cremoris, S. cricetus, S. cristatus, S. defectivus, S. difficile, S.
downei, S. dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp.
equisimilis, S. equi, S. equi ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus,
S. equinus, S. faecalis, S. faecium, S. ferus, S. gallinarum, S.
gallolyticus, S. garvieae, S. gordonii, S. hansenii, S.
hyointestinalis, S. hyovaginalis, S. iniae, S. intermedius, S.
intestinalis, S. lactis, S. lactis cremoris, S. lactis
diacetilactis, S. macacae, S. mitis, S. morbillorum, S. mutans, S.
oralis, S. parasanguinis, S. parauberis. S. parvulus, S. phocae, S.
plantarum, S. pleomorphus, S. pneumoniae, S. porcinus, S. pyogenes,
S. raffinolactis, S. ratti, S. saccharolyticus, S. salivarius, S.
sanguinis, S. shiloi, S. sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S.
thoraltensis, S. uberis, S. vestibularis y S.
viridans.
El conjunto de resultados ponen de manifiesto
que el grado de correlación de Pearson entre les cepas depositadas
es por lo menos de 85. A título ilustrativo, en la figura 1 se
representa una fotografía de uno de los geles de electroforesis, la
filiación en forma arborescente y el grado de correlación de Pearson
(indicada en la escala superior izquierda). Las cepas LAB 1550, LAB
1551 y LAB 1553 son referencias específicas de las cepas CNCM
I-1921, I-1922 e
I-1925. Las cepas LMG 15061 y LAB 1607 no se han
depositado en la CNCM, pero es obvio que forman parte de esta nueva
especie.
En definitiva, todas las cepas aisladas forman
parte claramente de un grupo homogéneo, que es distinto de otras
especies pertenecientes al género Streptococcus.
\vskip1.000000\baselineskip
Ciertas cepas aisladas en el ejemplo 1
representan un nuevo biotipo particular en la medida en que
presentan la propiedad notable de ser a la vez mesófilas y
termófilas.
Esta propiedad se observa fácilmente (1)
preparando en paralelo diversos cultivos de un biotipo
mesófilo/termófilo en un medio M17-lactosa a
temperaturas escalonadas entre 20 y 50ºC, (2) midiendo las
absorbancias de los medios a 540 nm después de 16 h de cultivo y (3)
reuniendo los resultados en forma de un gráfico que represente la
absorbancia en función de la temperatura (graditérmico).
En la figura 1 se representa un gráfico
graditérmico de la cepa CNCM I-1920. Todas las demás
cepas aisladas, pertenecientes a este biotipo particular, en
especial las cepas CNCM I-1921 e
I-1922, dan lugar igualmente a gráficos
graditérmicos comparables.
\vskip1.000000\baselineskip
Diversas cepas aisladas en el ejemplo 1 poseen
la propiedad notable de ser extremadamente texturantes. Esta
propiedad puede observarse mediante un parámetro reológico de
viscosidad, medido en el viscosímetro rotativo Bohlin VOR (Bohlin
GmbH, Alemania).
Para ello se cultivan ciertas cepas aisladas de
una leche semidescremada a 38ºC hasta un pH de 5,2. Siguiendo las
instrucciones del fabricante se coloca la muestra entre la meseta y
el cono truncado del mismo diámetro (30 mm, ángulo de 5,4º, holgura
de 0,1 mm), después se somete la muestra a un gradiente de velocidad
de cizallamiento rotatorio continuo, que la obliga a fluir.
Entonces se determina la viscosidad de la muestra para una velocidad
de cizallamiento de 293 s^{-1}. Los resultados de los ensayos
reológicos realizados con ciertas cepas aisladas ponen de manifiesto
que los medios de cultivo así fermentados presentan una viscosidad
superior a 100 mPa\cdots, incluso una viscosidad superior a 200
mPa\cdots en el caso de las cepas CNCM I-1922,
I-1923, I-1924,
I-1925 e I-1926.
Para comparación, en las mismas condiciones
operativas se obtienen del orden de 54, 94, 104, 158 y 165 mPa.s,
respectivamente, con las cepas Lactobacillus helveticus CNCM
1-1449, Streptococcus thermophilus CNCM
I-1351, Streptococcus thermophilus CNCM
I-1879, Streptococcus thermophilus CNCM
I-1590, Lactobacillus bulgaricus CNCM
I-800 y Leuconostoc mesenteroides ssp.
cremoris CNCM I-1692, que se mencionan en
las solicitudes de patente EP-699689,
EP-638642, EP-97111379.0,
EP-750043, EP-367918 y
EP-97201628.1, respectivamente. (Les cepas CNCM
I-800 e I-1692 se considera que son
cepas muy texturantes).
\vskip1.000000\baselineskip
Ciertas cepas aisladas en el ejemplo 1,
pertenecientes al biotipo texturador, en especial las cepas CNCM
I-1923, I-1924,
I-1925 y I-1926, producen un EPS de
alto peso molecular, cuya composición de azúcar es similar a las
encontradas en ciertos oligosacáridos de leche materna humana. El
análisis de los azúcares que componen un polisacárido se efectúa del
modo siguiente.
Se cultivan las cepas de la nueva especie en una
leche descremada reconstituida del 10%, con agitación, a 30ºC
durante 24 h, el pH se mantiene a 5,5 por adición de una solución 2N
de NaOH. Se eliminan las células bacterianas y las proteínas del
medio de cultivo por precipitación en un volumen igual de una
solución de un 25% en peso de ácido tricloroacético y posterior
centrifugación (10000 g, 1 h). Se precipitan los EPS por adición de
un volumen equivalente de acetona y posterior decantación a 4ºC
durante 20 h. Se recuperan los EPS por centrifugación, se suspende
de nuevo el culote en una solución 0,1 M de NH_{4}HCO_{3}, pH
7, y se dializa la suspensión con agua durante 24 h. Entonces se
eliminan los materiales insolubles por ultracentrifugación y se
liofiliza el residuo que contiene el EPS purificado. La cantidad de
EPS purificado, expresada en mg de equivalentes de glucosa, es del
orden de 40 mg por litro de
cultivo.
cultivo.
Se determina el peso molecular del EPS por
cromatografía de filtración a través de gel en una columna de
Superose-6 conectada a un sistema FPLC (Pharmacia),
del modo descrito por Stingele y col., J. Bacteriol. 178,
1680-1690, 1996. Los resultados ponen de manifiesto
que todas las cepas CNCM I-1923,
I-1924, I-1925 e
I-1926 producen un EPS, cuyo tamaño es superior a 2
x 10^{6} Da.
Se hidrolizan 100 mg de equivalentes de glucosa
del EPS purificado en TFA 4N a 125ºC durante 1 h, después se
derivatizan y se analizan por cromatografía GLC según el método
descrito por Neeser y col. (Anal. Biochem. 142,
58-67, 1984). Los resultados ponen de manifiesto que
las cepas producen un EPS constituido por glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción media de
3:2:1, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una crema de leche hidrolizada del
18% con tripsina, siguiendo las recomendaciones del documento
US-5039532, se seca del modo tradicional, por
pulverización en un chorro de aire caliente y se le incorpora del
0,1 al 10% de EPS purificado y seco, descrito en el ejemplo 4. Este
producto puede reconstituirse rápidamente en agua. Es conveniente
en particular para una diete de niños o bebés, por el hecho de que
sus propiedades hipoalérgicas y el tolerógeno a la leche de vaca y
de que es completo desde el punto de vista de la composición de
glúcidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hidroliza el EPS purificado y seco del
ejemplo 4 en una solución 0,5 N de ácido trifluoracético (TFA) a
100ºC durante 30-90 min, se evapora el TFA, se
suspende el hidrolizado en agua y se separan los oligosacáridos que
tienen de 3 a 10 unidades de azúcar (de 600 a 2000 daltones) por
ultrafiltración.
Se prepara una crema de leche hidrolizada del
18% con tripsina siguiendo las recomendaciones del documento
US5039532, se seca del modo tradicional por pulverización en un
chorro de aire caliente y se le agregan del 0,1 al 10% de
oligosacáridos purificados, descritos anteriormente. Este producto
puede reconstituirse rápidamente. Es conveniente en particular para
una dieta de niños o bebés, por el hecho de tener propiedades
hipoalérgicas y un tolerógeno de la leche de vaca y de que es
completo desde el punto de vista de la composición de glúcidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una composición farmacéutica en forma
de cápsula fabricada con gelatina y agua, que contiene de 5 a 50 mg
de EPS purificado del ejemplo 4 o bien oligosacáridos purificados
del ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fabrican pastillas constituidas por un
cultivo de la cepa CNCM I-1924 liofilizada y después
comprimida con un agente aglutinante apropiado. Estas pastillas son
especialmente indicadas para restaurar la flora intestinal con
bacterias lácticas y para satisfacer una dieta equilibrada en
glúcidos y complejos esenciales.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SOCIÉTÉ DES PRODUITS NESTLÉ
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Av. NESTLE 55
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: VEVEY
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO O PROVINCIA: VAUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: SUIZA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 1500
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nueva especie de bacteria láctica
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE CON ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE DE SUPPORT: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible DOS/MS-
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1522 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "cebo"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATCCGTTT TTTCGACAGA GTTYGATYCT GGCT
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "cebo"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATCCGGAT CCTACGGYTA CCTTGTTACG ACT
\hfill33
Claims (14)
1. Cepa de bacteria láctica,
- cuyo ARN ribosómico 16S es característico del
género Streptococcus y está provisto de una secuencia de nucleótidos
SEQ ID NO: 1 y
- cuyo perfil de proteínas totales, obtenido
después del cultivo de la bacteria en un medio MRS a 28ºC durante 24
h, extracción de las proteínas totales y migración de las proteínas
a través de un gel de electroforesis SDS-PAGE,
presente un grado de correlación de Pearson por lo menos de 78 con
respecto al perfil obtenido en condiciones idénticas con la cepa de
bacteria láctica CNCM I-1920, pero distinto de los
perfiles de las especies reconocidas pertenecientes al género
Streptococcus, a saber: S. acidominimus, S. agalactiae, S.
alactolyticus, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. caprinus, S.
constellatus, S. cricetus, S. cristatus, S. difficile, S. downei, S.
dysgalactiae ssp. dysgalactiae, S. dysgalactiae ssp. equisimilis, S.
equi, S. equi ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus, S. equinus, S.
ferus, S. gallolyticus, S. gordonii, S. hyointestinalis, S.
hyovaginalis, S. iniae, S. intermedius, S. intestinalis, S.
macacae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S.
parauberis, S. phocae, S. pleomorphus, S. pneumoniae, S. porcinus,
S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. sanguinis, S. shiloi, S.
sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S.
vestibularis, S. viridans.
2. Cepa de bacteria láctica según la
reivindicación 1, capaz de fermentar la D-glucosa,
la D-manosa, la N-fructosa, la
D-acetil-(D-)glucosamina, la salicina, la celobiosa,
la maltosa, la lactosa, la sacarosa y la rafinosa.
3. Cepa de bacteria láctica según la
reivindicación 1, elegida entre las cepas CNCM
I-1920, I-1921,
I-1922, I-1923,
I-1924, I-1925 e
I-1926.
4. Cepa de bacteria láctica según la
reivindicación 1, caracterizada porque presenta un
crecimiento óptimo entre 28ºC y 45ºC.
5. Cepa de bacteria láctica según la
reivindicación 1, que, cuando fermenta una leche semidescremada a
38ºC hasta pH 5,2, da una viscosidad al medio que es superior a 100
mPa.s para una velocidad de cizallamiento del orden de 293
s-1.
6. Cepa de bacteria láctica según la
reivindicación 1, caracterizada porque produce un
exopolisacárido constituido exclusivamente por un encadenamiento de
glucosa, galactosa y N-acetilglucosamina en una
proporción media de 3:2:1, respectivamente.
7. Utilización de una cepa de bacteria láctica
según una de las reivindicaciones de 1 a 6 para la fabricación de
una composición alimentaria, en especial de una leche
acidificada.
8. Utilización de un polisacárido, susceptible
de se secretado por la cepa CNCM I-1924, constituido
exclusivamente por un encadenamiento de glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción media
respectiva de 3 : 2 : 1, para la fabricación de una composición
alimentaria.
9. Utilización según la reivindicación 8, para
la fabricación de una composición destinada a satisfacer una dieta
infantil completa.
10. Composición alimentaria o farmacéutica que
contiene una cepa de bacteria láctica según una de las
reivindicaciones de 1 a 6.
11. Composición alimentaria o farmacéutica que
contiene un polisacárido, susceptible de ser secretado por la cepa
CNCM I-1924, constituido exclusivamente por un
encadenamiento de glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción media
respectiva de 3:2:1.
12. Composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque se trata de una composición
infantil.
13. Composición según la reivindicación 12,
caracterizada porque se trata de una composición infantil
hipoalérgica.
14. Polisacárido, susceptible de ser secretado
por la cepa CNCM I-1924, constituido exclusivamente
por un encadenamiento de glucosa, galactosa y
N-acetilglucosamina en una proporción media
respectiva de 3:2:1.
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