DE2520407A1

DE2520407A1 - Biologische extrakte und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2520407A1
Application number: DE19752520407
Authority: DE
Inventors: Christopher Adlam; David Eric Reid
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1974-05-08
Filing date: 1975-05-07
Publication date: 1975-11-20
Also published as: AU8091375A; FR2269965A2; DK203375A; JPS50160419A; NL7505398A; SE7505350L; BE828835R; ZA752958B

Description

DR. BERG DTPL.-ING. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR

PATENTANWÄLTE

8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 86 02 45

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapfund Partner, 8 München 86, P.O. Box 860245

Ihr Zeichen
Your ref.

Unser Zeichen 25

Our ref.

8 München so 7 . Mai 1975

Mauerkircherstraße 45

Anwaltsakte-Nr.: 25

THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED London, N.W. 1 / Großbritannien

"Biologische Extrakte und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 24 08 724.9)

Die vorliegende Erfindung betrifft Glykopeptide mit pharmakologischer Wirksamkeit, deren Extraktion aus Bakterienzellen und deren Adaption für medizinische Zwecke.

X/R

(089)988272 987043 983310

Telegramme: BERGSTAPFPATENT München TELEX: 0524560 BERG d

Banken: Bayerische Vereinsbank München 453100 Hypo-Bank München 3892623 Postscheck München 65343-808

Case A 444

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In den schwebenden britischen Patentanmeldungen 91^9/73 und 06759/7^, auf die ausdrücklich Bezug genommen wird, wurde die Extraktion gewisser Glykopeptide mit immunstimulierenden Eigenschaften aus immunstimulierenden Bakterien der Gattungen Actinomycetaceae oder Mycobacteriaceae der Prevot's Klassifikation (Prevot, A-R, & Fredette, V., (1966) "Manual for the Classification and Determination of the Anaerobic Bacteria", Lea & Pebiger, Philadelphia, USA) beschrieben.

In der vorliegenden Anmeldung wird die Anwendung der in den früheren Anmeldungen beschriebenen Verfahren zur Herstellung immunstimulierender Glykopeptide, die einen Teil der Zellwände des Bacteriums von dem man ursprünglich ausging, oder die intakten Zellwände selbst, umfassen, beschrieben. Es werden ferner Verfahren zur Reinigung der extrahierten Glykopeptide zur Steigerung des Anteils an immunstimulierenden Glykopeptiden in dem Endprodukt beschrieben.

Die Glykopeptide der vorliegenden Erfindung können aus den Bakterienzellen durch 2-Phasen-Lösungsmittelextraktion unter Bildung eines unlöslichen Rückstandes extrahiert und der Rückstand wie nachfolgend beschrieben gereinigt werden. Indem man von intakten Zellen ausgeht, ist es möglich, die Glykopeptide als intakte Zellwandungen herzustellen, die nach den nachfolgend beschriebenen Verfahren gereinigt werden.

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Wahlweise können aufgebrochene oder gelöste Zellen eingesetzt und der unlösliche Rückstand wie beschrieben gereinigt werden.

Die 2-Phasen-Lösungsmittelextraktion der aufgebrochenen Zellwände, und/oder der kultivierten, unversehrten Bakterienzellen, und/oder des Lysates davon wird zur Herstellung des Glykopeptids mit wässerigem Arylalkohol durchgeführt und das Glykopeptid aus den nicht in die wässerige Phase extrahierten Zellbestandteilen isoliert. Der hier verwendete Ausdruck "Arylalkohol" bedeutet eine Verbindung, in welcher eine Hydroxygruppe direkt an einen aromatischen Kern gebunden ist, beispielsweise ein gegebenenfalls substituiertes Phenol, wie z.B. Kresol, jedoch besonders bevorzugt nichtsubstituiertes Phenol.

Die 2-Phasen-Extraktion wird durch In-Berührung-bringen mit Wasser und Arylalkohol während einer gewissen Zeit bei einer Temperatur im Bereich von 0° C bis 100° C, vorzugsweise von 15° bis 70° C, üblicherweise unter Rühren, durchgeführt. Ein geeigneter Zeitraum liegt im Bereich von einigen wenigen Minuten bis zu einigen wenigen Stunden, je nach der angewandten Temperatur. In dem Falle, wo Phenol verwendet wird, ist eine besonders geeignete Temperatur 68° C, bei welcher das Rühren 15 Minuten lang durchgeführt werden kann.

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Die Konzentration des Arylalkanols in der Arylalkohol/Wasser-Mischung kann etwas variiert werden, wobei es jedoch erforderlich ist zu berücksichtigen, daß man schließlich ein 2-Phasen-System erhalten muß, worin jede Phase vollständig mit der anderen gesättigt ist. Im Falle von Phenol kann die Phenol-Konzentration in der Phenol/Wasser-Mischung im Bereich von 10 bis 90 % Vol./Vol., jedoch besonders bevorzugt im Bereich von 40 bis 55 % Vol./Vol. liegen.

Die Mischung wird dann 45 bis 15 Minuten lang bei etwa 5000 bis 10 000 g , beispielsweise 30 Minuten lang bei 8000 g zentrifugiert, wodurch man vier Schichten erhält: eine feste kugelige Masse, welche die Zelltrümmer enthält, über dieser der Reihe nach die alkoholische Phase, eine weiße Zwischenphasenregion und eine wässerige Phase. In dem Falle, wo ein Verfahren keine Lysis umfaßt, ist in der Zwischenphasenregion wenig oder gar kein Material enthalten, so daß die Zentrifugierung nur drei Schichten liefert: eine feste kugelige Masse mit unversehrten Zellen, darüber der Reihe nach die alkoholische und die wässerige Phase.

Die wässerige Phase und die alkoholischen Phasen werden verworfen und die 2-Phasen-Lösungsmittelextraktion wünschenswerterweise mit dem verbleibenden Material so lange wiederholt, bis die wässerigen und alkoholischen Phasen nach dem

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Zentrifugieren vorzugsweise farblos sind (oder im Falle eines gefärbten Alkohols im Verlaufe der Extraktion in der Farbe unverändert bleiben). Wahlweise wird lediglich die wässerige Phase verworfen, wobei das verbleibende Material einschließlich der alkoholischen Phase, falls gewünscht, erneut extrahiert werden kann.

Das nach der wässerigen Phase (und, falls gewünscht, der alkoholischen Phase) zurückbleibende Material, das verworfen wurde, wird dann wünschenswerterweise gegen Wasser dialysiert, um den Arylalkohol (bzw. den restlichen Arylalkohol) zu entfernen. Die Dialyse wird mehrere Tage, wünschenswerterweise bei einer Temperatur unterhalb der Raumtemperatur, beispielsweise bei etwa 4° C, durchgeführt.

Nach der Dialyse wird ein Sediment erhalten, das die folgenden Schichten enthält: eine dunkel gefärbte untere Schicht (nicht vorhanden, wenn die alkoholische Phase nach dem Zentrifugieren verworfen wurde), eine braun-cremig gefärbte Schicht (grau/grün, wenn man von ganzen Zellen ausging) mit einer öligen Konsistenz und eine obere Schicht, die eine weiße, fein verteilte Suspension enthält, welche dann gesammelt werden kann, um die immunstimulierenden Glykopeptide der vorliegenden Erfindung zu liefern, die wünschenswerterweise mit destilliertem Wasser oder physiologischer Kochsalz-

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lösung (0,85 Gew./Vol. wässeriges Natriumchlorid) gewaschen werden.

Das durch die obige Behandlung erhaltene weiße, fein verteilte Material enthält das immunstimulierende Glykopeptid, jedoch ist dieses durch andere, inaktive Substanzen verunreinigt und kann zur Entfernung von Cytoplasma-Protein und Nucleinsäuren einem oder mehreren Reinigungsverfahren unterworfen werden. Zur Entfernung von Spuren an verunreinigenden Lipiden und anderen Cytoplasma-Materialien, die für eine Aktivität unwesentlich sind, kann ferner noch eine zusätzliche Reinigung durchgeführt werden.

Ein geeignetes Reinigungsverfahren kann irgendein beliebiges oder irgendwelche beliebige, dem Fachmann zur Entfernung von Nucleinsäuren und/oder Cytoplasma-Protein bekannte Verfahren umfassen, welche die immunstimulierende Aktivität der Glykopeptide gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nachteilig beeinflussen. Spezifische Reinigungsverfahren, von denen festgestellt wurde, daß sie geeignet sind, werden nachfolgend beschrieben.

Die Entfernung der Nucleinsäuren kann durch Verwendung von Mitteln durchgeführt werden, welche die Nucleinsäuren hydrolysieren. Derartige Mittel umfassen schwache Säuren, wie

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beispielsweise Trichloressigsäure oder Perchlorsäure, verdünnte Alkalien, konzentrierte Salzlösungen, und Enzyme, insbesondere Ribonucleasen und Desoxyribonucleasen. Ein besonderes wertvolles Verfahren zur Entfernung von Nucleinsäuren umfaßt, wie gefunden wurde, eine Behandlung mit Trichloressigsäure, gefolgt von einem enzymatischen Aufschluß mit Ribonuclease.

Die Entfernung von Cytoplasma-Proteinen kann durch Verwendung irgendwelcher proteolytischer Mittel bewirkt werden, welche die immunstimulierenden Eigenschaften der Glykopeptide gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nachteilig beeinflussen. Geeignete proteolytische Mittel umfassen schwache Säuren, wie beispielsweise Trichloressigsäure und Perchlorsäure, Alkalien, konzentrierte Salzlösungen und proteolytische Enzyme. Demzufolge ist ersichtlich, daß hydrolytische Mittel, wie beispielsweise Trichloressigsäure (TCA) zur Entfernung von sowohl Nucleinsäuren, als auch Cytoplasma-Proteinen eingesetzt werden können. Ungeachtet dessen wird wünschenswerterweise ein enzymatischer Aufschluß mit einem proteolytischen Enzym ebenso angewandt, wenn eine TCA-Behandlung verwendet wird, um das Ausmaß der TCA-Behandlung und daher auch irgendeinen möglichen Verlust an immunstimulierender Aktivität der Glykopeptide so niedrig wie möglich zu halten.

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Die Reihenfolge der Extraktions- und Reinigungsverfahren kann ohne zwangsläufige Veränderung der Natur des Endproduktes geändert werden. Demzufolge kann die Trichloressigsäure-Extraktion an dem unversehrten Organismus vor der Extraktion mit dem Alkohol durchgeführt werden, und die Nucleasen können vor oder nach der Trichloressigsäure-Behandlung an dem mit Pronase verdauten Material, oder an dem unversehrten Organismus vor der Extraktion angewandt werden.

Die Behandlung des unlöslichen Rückstands zur Entfernung verunreinigender Proteine kann durch irgendein beliebiges proteolytisches Enzym bewirkt werden, beispielsweise durch Trypsin oder Papain, jedoch vorzugsweise durch Pronase. Der Aufschluß kann als Einzelstufe oder als Vielzahl von wiederholten Stufen während eines Zeitraumes, bestimmt durch die progressive Freisetzung von freien Aminogruppen, durchgeführt werden. So wurde gefunden, daß wiederholte Aufschlüsse zu je 4 Stunden oder ein einzelner Aufschluß von 18 Stunden bei 37° C eine wesentliche Entfernung von verunreinigendem Protein bewirken.

Eine zusätzliche Reinigung zur Entfernung von irgendwelchen restlichen, verunreinigenden Lipiden kann durch Lösungsmittelextraktion unter Verwendung von irgendeinem inerten, dem Fachmann für die Extraktion von Lipiden aus biologischem

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Material bekannten Lösungsmittel bewirkt werden. Bequemerweise können Äthanol, Methanol, Aceton, Chloroform oder Äther, oder Kombinationen dieser Lösungsmittel angewandt werden. Vorzugsweise wird der unlösliche Rückstand mit dem Lösungsmittel oder den Lösungsmitteln am Rückfluß erhitzt, bis kein weiteres Material mehr extrahiert wird.

Die Extraktion mit Trichloressigsaure (TCA) oder Perchlorsäure (PCA) kann bei k bis 80° C unter Anwendung irgendeiner geeigneten Konzentration an dieser Säure durchgeführt werden. Vorzugsweise wird eine Lösung von 5 bis 10 % Gew./Vol. bei 37 C verwendet und dabei gerührt. Die Freisetzung der Nucleinsäuren wird durch Abtast-UV-Spektroskopie bei Wellenlängen zwischen 230 und 300 nm überwacht. Der Peak der Nucleinsäure-Absorption tritt zwischen 250 und 270 nm auf. Die Anzahl der Extraktionen und die für jede Extraktion angewandte Zeit variieren je nach der Konzentration des kugeligen Materials und der Säure, und der Temperatur der Extraktion. Ein Beispiel wären 6 χ 15 Minuten-Extraktionen unter Verwendung von 10 % Gew./Vol. Säure und einer 5 #igen Feuchtgewicht/Volumen-Suspension des Materials bei einer Temperatur von 37° C. Wenn zu viele Extraktionen ausgeführt werden, oder wenn die angewandte Temperatur zu hoch ist, kann die biologische Aktivität verringert sein. Nach jeder Extraktion wird das kugelige Material aus der Säure abzentrifugiert und

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in frischer TCA-Lösung wieder suspendiert.

Nach der Säureextraktion kann das Produkt mit Ribonuclease (RNAse) und Desoxyribonuclease (DNAse) behandelt werden, bis eine Kontrolle der Nucleinsäure durch Abtast-UV-Spektroskopie, wie oben beschrieben, anzeigt, daß ein weiterer Aufschluß nicht mehr notwendig ist.

Stämme von C. parvum und andere Mitglieder der Actinomycetaceae und Mycobacteriaceae mit immunstimulierenden Eigenschaften sind bereits in der Literatur beschrieben, und es befinden sich unter derartigen Organismen, die als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können, die folgenden Stämme:

C. parvum (W.CN. 6134; P.CN. 4685, eingesetzt in den nachfolgenden Beispielen 1 und 5);
C acnes (W.CN. 6280; A.T.CC II828); C acnes (W.CN. 6276);
C diphteroides (W.CN. 6295);
C pyogenes (W.CN. 629I; P.CN. 637~B); C liquefaciens (W.CN. 629O; P.CN. 3044-B); C lymphophilum (W.CN. 6294); und
C granulosum (W.CN. 6292; P.CN. 3024-B). W.CN. steht für die Kulturnummer der Wellcome Research Laboratories, Beckenham, Kent, England; A.T.CC für American

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Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA; und P.C.N. für Pasteur Institut, Paris, Prankreich, Kulturnummer. Diese und andere Stämme sind in dem Artikel von Adlam and Scott, J. Med. Microbiol, 6_, 2β1 (1973) angeführt.

Die Glykopeptide der vorliegenden Erfindung können therapeutisch oder prophylaktisch dazu verwendet werden, Säugetieren und Vögeln eine Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenen Krankheitserregern zu verleihen, wobei sie das Wachstum solcher Tumoren und Krankheitserreger inhibieren und/oder das Ausmaß des Wachstums verringern, wozu man eine wirksame therapeutische oder prophylaktische Dosis der Glykopeptide verabreicht. Zu Tumoren, die in diesem Zusammenhang erwähnt werden können, gehören Leukämien, Hodgkinsche Krankheit, Carcinome der Lunge, Blase und Brust, MeIanome und das Burkitt'sehe Lymphom. Zu bakteriellen Krankheitserregern, die hier erwähnt werden können, gehören Bordetella pertussis und Brucella abortus. Parasitäre Krankheitserreger schließen protozoische Krankheitserreger, wie beispielsweise Malariaerreger, ein.

Der Umfang der therapeutischen oder prophylaktischen Dosierung des Glykopeptids wird selbstverständlich mit der Natur und der Schwere des in Betracht kommenden Tumors oder der pathogenen Infektion, dem jeweiligen Glykopeptid und seinem

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Verabreichungswege variieren. Im allgemeinen liegt die Dosierung im Bereich von 0,0001 bis 20, vorzugsweise von 0,01 bis 10, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1 mg Glykopeptid pro kg Körpergewicht des Säugetieres oder Vogels, an welche das Glykopeptid verabreicht werden soll.

Es kann jede übliche Art der Verabreichung nach Ermessen des behandelnden Arztes und in Abhängigkeit von der Natur und dem Ort des Tumors oder der in Betracht kommenden pathogenen Infektion angewandt werden. So kann die Verabreichung auf oralem oder pulmonarem Wege erfolgen, obwohl man üblicherweise die Verabreichung durch Injektion durchführt, und zwar subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, oder, bevorzugt, intravenös. Falls gewünscht, kann die "Injektion" in Form einer Infusion während längerer Zeitdauer, beispielsweise während mehrerer Stunden, durchgeführt werden.

Die Glykopeptide können zur Verwendung in den oben beschriebenen Behandlungsverfahren oder zur Prophylaxe mittels irgendeines herkömmlichen, pharmazeutischen Verfahrens in Form einer pharmazeutischen Zubereitung formuliert werden, wobei unter anderem das Mischen der Glykopeptide mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern eingeschlossen ist. Die Natur der Zubereitung wird selbstverständlich von dem gewählten Verabreichungswege abhängen. So kann

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für die orale Verabreichung eine Zubereitung eines Glykopeptids der vorliegenden Erfindung als getrennte Einheit, wie beispielsweise als Kapsel, Cachet oder Tablette, von denen jede eine vorherbestimmte Menge an Glykopeptid enthält, als Pulver oder Granulat, oder als Suspension in einer wässerigen Flüssigkeit, einer nicht-wässerigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Wasser-in-öl-Emulsion dargeboten werden. Zur pulmonaren Verabreichung kann eine Zubereitung eines Glykopeptids der vorliegenden Erfindung als Inhalationszubereitung dargeboten werden.

Eine pharmazeutische Zubereitung der vorliegenden Erfindung, die für eine Verabreichung durch Injektion geeignet ist, enthält ein Glykopeptid der vorliegenden Erfindung, das in einem inerten, pharmazeutisch verträglichen, flüssigen Verdünnungsmittel suspendiert ist. Die Zubereitungen für die Injektion müssen selbstverständlich steril und mit dem Blut des Säugetieres oder Vogels, dem sie verabreicht werden sollen, isotonisch sein. Ein geeignetes Verdünnungsmittel ist Wasser und eine geeignete Injektionszubereitung für eine Verwendung in der Humanmedizin ist eine Suspension des Glykopeptids in physiologischer Kochsalzlösung (0,85 % Gew./Vol. wässeriges Natriumchlorid). Vorteilhafterweise wird das Glykopeptid in einem sterilen Verdünnungsmittel unter aseptischen Bedingungen suspendiert. Eine Sterilisation der In-

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jektionszubereitungen kann mittels herkömmlicher Techniken durchgeführt werden, beispielsweise durch die Zugabe von Formalin in einer Konzentration von etwa 0,5 % Vol./Vol. Wünschenswerterweise wird ein Konservierungsmittel, beispielsweise Thiomersalat, geeigneterweise in einer Konzentration von 0,01 % Gew./Vol. den Injektionszubereitungen einverleibt.

Die Injektionszubereitungen der vorliegenden Erfindung können mittels herkömmlicher Verfahren isotonisch gemacht werden, beispielsweise durch Dialyse gegenüber einer Salzlösung, die mit dem Blut des Säugetieres oder des Vogels, in das injiziert werden soll, isotonisch ist. Es kann irgendeine beliebige Salzlösung, die als Injektionsmedium geeignet ist, beispielsweise physiologische Kochsalzlösung (0,85 % Gew./ Vol. wässeriges Natriumchlorid) oder isotonischer Phosphatpuffer, verwendet werden.

Die Injektionszubereitungen können entweder als konzentrierte Injektionszubereitungen zur Verdünnung vor ihrer Anwendung oder als eine Injektionszubereitung, die fertig zum Gebrauch ist, hergestellt werden. Im letzteren Fall liegt die Konzentration des immunstimulierenden Glykopeptids wünschenswerterweise im Bereich von 20 bis 0,1 mg/ml, vorzugsweise jedoch in der Größenordnung von 1 mg/ml. Zweckmäßigerweise können die Injektionszubereitungen gefriergetrocknet

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werden, beispielsweise aus 5 % Gew./Vol. wässerigem Rohrzucker, um unmittelbar vor Verwendung mit Wasser gebrauchsfertig gemacht zu werden.

Eine weitere Verwendung der Glykopeptide der vorliegenden Erfindung ist die eines Adjuvans, oder als Bestandteil in einer Vakzine mit einem anderen aktiven Wirkstoff. Ein Beispiel einer derartigen Verwendung ist die Substitution des Glykopeptids für durch Hitze getötete bakterielle Elemente von Freund*ε Volladjuvans (eine Wasser-in-öl-Emulsion eines aktiven Bestandteils in einem Mineralöl, die ferner noch durch Hitze abgetötete Bakterien enthält), und ein Beispiel einer Vakzine, die das Glykopeptid als Adjuvans enthält, ist eine Vakzine zur Immunisierung gegen Bruceila.

Zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen die nachfolgenden Beispiele, die jedoch den Erfindungsbereich nicht einschränken sollen.

Beispiel 1 Extraktion von ganzen C. parvum-Zellen

Ganze C. parvum-Zellen wurden gefriergetrocknet und zu 20 g Trockengewicht wurde destilliertes Wasser (400 ml) und wässeriges Phenol (90 % Gew./Vol., 400 ml), beide bei 68° C,

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zugegeben. Die Mischung wurde bei 68° C 15 Minuten lang unter konstantem Rühren inkubiert, in einem Eisbad abgekühlt und die Mischung dann bei 8000 g 30 Minuten lang bei 4° C zentrifugiert. Es wurden vier getrennte Schichten in dem Zentrifugenglas beobachtet, eine kugelige, eine untere Phenolphase, eine sehr kleine Menge einer weißen Zwischenphasenschicht und eine obere wässerige Phase. Die wässerige und die phenolische Phase wurde verworfen und die kugelige Schicht und das Zwischenphasenmaterial in einer weiteren Men-

/(400 ml) ge von destilliertem Wasser bei 68 C zusammen mit Phenol (400 ml), ebenfalls bei 68 C , resuspendiert und nochmals wie zuvor extrahiert.

Die Extraktionen wurden unter Verwendung von frischem Wasser und Phenol so lange wiederholt, bis die Phenolschicht farblos war. Es war bemerkenswert, daß das Zwischenphasenmaterial mit jedem Extraktionsverfahren in seiner Menge zunahm.

Die endgültigen wässerigen und phenolischen Phasen wurden verworfen und das kugelige und das Zwischenphasenmaterial vereinigt und gegen fließendes Leitungswasser 4 Tage lang, und anschließend gegen destilliertes Wasser bei 4 C weitere 3 Tage lang zur Entfernung des Phenols dialysiert.

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Nach der Dialyse war in dem Dialysierrohr ein Sediment mit zwei Schichten vorhanden. Eine untere grau/grüne, ölige Schicht besaß wenig oder keine immunstimulierende Aktivität, während die obere weiße Schicht die Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung besaß.

Die obere weiße Schicht wurde gesammelt, nachdem das Wasser aus dem Dialysierrohr entfernt worden war und lieferte die Glykopeptide. Die Aktivität des Produktes wird in der Tabelle II gezeigt.

Beispiel 2 Reinigung des Glykopeptids

(a) Das Produkt der weißen Schicht des Beispiels 1 wurde gefriergetrocknet und 10 g des Materials in einen Soxhlet-Apparat eingebracht. Dieses Material wurde mit jedem der folgenden Lösungsmittel 90 Minuten lang am Rückfluß gekocht: Äthanol, Methanol, Aceton, Chloroform und Äther. Die Entfernung der verunreinigenden Lipide wurde durch Verdampfen bis zur Trockene und Auswiegen des Rückstandes kontrolliert. Die Extraktionen wurden so lange durchgeführt, bis weiter keine Lipide mit den Lösungsmitteln extrahiert wurden. Nach der Endstufe wurden Spuren von Äther durch Durchblasen eines sauerstoffreien Stickstoffstromes über dem festen Rückstand

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entfernt. Die Aktivität des Rückstandes ist in Tabelle II angegeben.

(b) Das erhaltene Lipid-extrahierte Material ist ein trockenes, weißes Pulver, das in einem Mörser mit dem Pistill gemahlen und dann in einem 0,05-molaren Phosphatpuffer bei einem p_H~Wert von 7,4 (10 g in 100 ml Puffer) suspendiert wurde. Hierzu wurde Pronase in einer Konzentration von 1 mg Trockengewicht pro ml zugegeben. Der Aufschluß wurde dann während 18 Stunden bei 37° C unter Durchmischen durchgeführt. Der Ablauf des enzymatischen Aufschlusses wurde durch optische Messung der während der enzymatischen Hydrolyse in die Lösung freigesetzten freien Aminogruppen unter Verblendung von 2,4-Dinitrofluorbenzol (Ghuysen et al, Methods in Enzymology, 8__s 685, 1966) verfolgt. Proben des aufzuschließenden Materials wurden in Intervallen zentrifugiert (2500 g 5000g; 30 Minuten bis 1 Stunde; 4° C) und die überstehende Lösung kolorimetrisch nach dem Verfahren bei 420 nm in einem Pye Unicam SP 500-Spektrophotometer untersucht. Ein weiterer Aufschluß von 4 Stunden zeigte eine vernachlässigbare Freisetzung von Aminogruppen, wie dies in Tabelle I unten angegeben ist.

Nach dem Pronase-Aufschluß wurde das aktive Material aus der Suspension abzentrifugiert (2500 g - 5OOO g; 30 Minuten

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bis 1 Stunde; 4° C), die überstehende Lösung verworfen und das kugelige Material dreimal mit sterilem, destilliertem Wasser bei 4 C gewaschen. 1 g des Materials gab die Ergebnisse in Tabelle I unten. Die Aktivität des Produktes wird in der Tabelle II gezeigt.

(c) Der proteolytische Aufschluß wurde mit einem neuen Ansatz von Lipid-extrahierten Material unter Anwendung von drei wiederholten 4-Stunden-Extraktionen wiederholt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle I angegeben.

(d) Das kugelige Produkt von Beispiel 2(b) wurde dann einer Reihe von TCA-Extraktionen zur Entfernung der Nucleinsäuren und anderer Cytoplasma-Gehalte unterworfen, wobei man 6 χ Minuten-Extraktionen unter Verwendung von 10 % TCA und einer 5 /Sigen Feuchtgewicht /Volumensuspension von Material bei einer Temperatur von 37° C anwandte. Die Nucleinsäure-Freisetzung wurde durch Abtast-UV-Spektroskopie bei Wellenlängen zwischen 230 und 300 nm kontrolliert, wobei der Peak der Nucleinsäure-Absorption bei zwischen 250 und 270 nm auftrat. Nach jeder Extraktion wurde das kugelige Material aus TCA herauszentrifugiert (2500 - 500 g; 30 Minuten bis 1 Stunde; 4 C) und in frischer TCA-Lösung wieder suspendiert. Wenn die maximale Freisetzung von Nucleinsäure spektrophotometrisch bemerkt wurde, wurde das endgültige TCA/kugeliges

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Material-Suspension wiederum zentrifugiert, das kugelige Material zurückbehalten, in destilliertem Wasser wieder suspendiert und gegen fließendes Leitungswasser dialysiert, bis die überstehende Lösung frei von TCA war, wie dies durch einen neutralen p_o-Wert angezeigt und gemessen wurde. Die Er-

ri

gebnisse werden in den Tabellen I und II gezeigt.

Beispiel 3-

(a) Das obige, mit Pronase aufgeschlossene Material aus Beispiel 2(b) wurde ebenfalls einer weiteren Reinigung wie folgt unterworfen:

(i) RNAse-Extraktion (einfach);
(ii) RNAse-Extraktion (zwei), gefolgt von einer DNAse-Ex-

traktion (eine);

(iii) RNAse-Extraktion (eine), gefolgt von TCA (10 %; 10° C; 15 Minuten), drei Extraktionen).

Die TCA-Extraktion wurde nach dem vorstehend geschilderten Verfahren in Beispiel 2(d) durchgeführt. Die DNAse~ und RNAse-Extraktionen wurden wie folgt, ausgeführt.

(b) Das Material aus Beispiel 2(b) wurde in 0,05-molarem Phosphatpuffer mit einem p„-Wert von 7,4 in einer Konzentration von 10 % zusammen mit 1 mg/ml Ribonuclease B (Sigma; Ochsenpankreas, Typ IIIB; Aktivität 100 Kunitz-Einheiten/mg)

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suspendiert und bei 37° C unter Mischen während 4 bis 20 Stunden inkubiert. Bruchstückartige Produkte des enzymatischen Aufschlusses wurden mittels eines Abtast-Spektrophotometers zwischen Wellenlängen von 230 bis 300 nm kontrolliert.

(c) Nach dem RNAse-AufSchluß wurde die erhaltene kugelige Masse zweimal mit 0,05-molarem Phosphatpuffer bei einem Ρττ-Wert von 7,4 vor dem Wiedersuspendieren als 10 #ige Suspension in frischem 0,05-molaren Phosphatpuffer bei einem P_H-Wert von 7>4, enthaltend 0,003 Mol Magnesiumchlorid, gewaschen. Desoxyribonuclease I (Sigma; Rinderpankreas; Aktivität 2100 Kunitz-Einheiten/mg) wurde dann bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt und die Mischung bei 37° C unter Mischen 4 bis 20 Stunden lang inkubiert. Bruchstückartige Produkte des enzymatischen Aufschlusses wurden wiederum optisch wie bei dem RNAse-AufSchluß zwischen Wellenlängen von 230 bis 300 nm kontrolliert.

Nach dem DNAse-AufSchluß wurde die kugelige Masse 3 bis 5mal in sterilem, destilliertem Wasser, das 0,01 % Thiomersal als Konservierungsmittel enthielt, gewaschen, und die überstehenden Lösungen aus diesen Wäschen bei 280 nm zur Sicherstellung der vollständigen Entfernung von nichtumgesetzten Enzym optisch kontrolliert. Die Ergebnisse werden in den Tabellen I und II gezeigt.

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Beispiel 4 Pharmazeutische3 für Injektionen geeignete Zubereitung

Das Glykopeptid aus Beispiel 2(d) (70 mg) wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung (0,85 % Gew./Vol. wässeriges Natriumchlorid, 10 ml), die 0,01 % Gew./VoI Thiomersalat enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde durch Zusatz von 0,01 % Gew./Vol. Formalin 24 Stunden lang sterilisiert, worauf das Formalin durch 30 Minuten langes Zentrifugieren bei 38 000 g entfernt wurde. Nach zweimaligem Waschen in physiologischer Kochsalzlösung wurde das Glykopeptid anschliessend in physiologischer Kochsalzlösung (10 ml), welche 0,01 % Gew./Vol. Thiomersalat enthielt, wiederum suspendiert und auf Glasampullen von 1 ml Fassungsvermögen aufgeteilt, die dann verschlossen wurden.

Tabelle I Freisetzung von Aminogruppen durch Pronase-Aufschluß

Durch enzymatische Hydrolyse freigesetzte Aminogruppen wurden optisch,wie beschrieben, bestimmt. Freie NH_p-Gruppen wurden unter Verwendung einer Alanin-Kalibrierung bestimmt. 1 g Material ergab die folgenden Ergebnisse.

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Anzahl der yMol frei-

Pronase-Ex- Zeit/Extraktion gesetztes traktionen NH„

Beispiel 2(c)	1	4 Std	3250
	2	4 Std	1000
	3	4 Std	500
			Gesamt 4750

Beispiel 2(b)	1	16-18 Std	3750
	2	4 Std	vernachläs sigbar
		Nucleinsäure-Basen durch	TCA - Beispiel 2 (d)
Entfernung von

Diese wurde optisch bei 260 nm, wie früher beschrieben, bestimmt.

Anzahl der TCA-Extraktionen

(jede 15 Min.) O.D. (260 nm)

1 0,04

2 0,07

3 0,14

509847/1195

- 24 - 25204Q?

Tabelle I (Fortsetzung)

Anzahl der TCA-Extraktionen

(jede 15 Min.) O.D. (260 nm)

4 0,12

5 0,16

6 0,12

Entfernung von Nucleinsäure-Basen durch RNAse und DNAse -Beispiel 3

Dies wurde optisch bei 260 nm,wie oben beschrieben, bestimmt, Die Ergebnisse sind die von 10 % Feuchtgewicht/Volumen-Suspensionen von Material, das bereits schon mit Phenol und Pronase behandelt worden war. Die überstehenden Lösungen wurden in variierenden Zeiträumen 1/25 verdünnt, bevor die optischen Ablesungen durchgeführt wurden.

Beispiel Nr. Aufschlußzeit O.D.

Voraufschluß-Kontrolle	0,55
0,5 Std.	0,69
1,5 Std.	= 0,86

- 25 -

B098A7/119B

- ²⁵ - 252040?

Tabelle I (Fortsetzung)

Beispiel Nr. Aufschlußzeit O.D.

3 Std. = 0,92

4 Std. = 1,02 20 Std. = 1,04

3(a)(ii) 0 = 0,04

2 Std. = 0,055

3 Std. = 0,06 3(a)(iii) Extraktion 1 0,2

Extraktion 2 0,1

Extraktion 3 0,08

Anstieg in Milz- und Lebergewicht durch gereinigtes Glykopeptid bei verschiedenen Stufen des ExtraktionsVerfahrens

Gruppen von 10 weiblichen W-Swiss-Mausen erhielten 1,4 mg Trockengewicht an Glykopeptid-Produkt intravenös in 0,2 ml Thiomersal-(0,01 %)Salzlösung. 14 Tage später wurden Milz und Leber herausgeschnitten und gewogen. Die Gewichte der Organe werden als mg/20 g Maus angegeben und sind der Durchschnittswert der Ergebnisse an 10 Tieren, wie dies in Tabelle II angegeben ist.

S09847/119S

Tabelle

Produkt aus

Milzgewicht Lebergewicht (mg) (mg)

Beispiel 1
Beispiel 2(a)

Beispiel 2(b)

Beispiel 2(d)
Beispiel 3(a)(i)

Beispiel 3(a)(ii)

Beispiel 3(a)(iii)

Thiomersal-Salzlösung

Gefriergetrockneter ganzer Organismus

Phenol extrahierter Rückstand

Lipid-Lösungsmit-

tel-extrahierter

Rückstand

Pronase-aufgeschlossener Rückstand

TCA-Extraktion (6 χ 15 Minuten)

RNAse-aufgeschlos-

sen, einmal

(1,6 mg injiziert)

RNAse-aufgeschlossen, zweimal, gefolgt von DNAse, einmal

RNAse-aufgeschlossen, zweimal, gefolgt von TCA (10 %; 60° C; 15 Min.), 3 Extraktionen

120

439

581
436

521

500
700

537

434

1111 2381

3043 2601

2679

2303 3155

2866

2255

- 27 -

609847/1195

- 27 - 252040?

Jedes der Produkte aus den Beispielen I₃ 2(a), 2(b), 2(d), 3(a)(i), 3(a)(ii) und 3(a)(iii) war im wesentlichen unlöslich in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Aceton und Äther; und jedes Produkt erhöht das Gewicht der Leber und der Milz bei der Maus und erhöht die Lebenserwartung der Maus hinsichtlich Tumoren.

Beispiel 5 Extraktion von ganzen C. parvum-Zellen

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde exakt wiederholt, mit der Ausnahme, daß in diesem Falle die erste Phenol-Wasser-Extraktion eine Dauer von 15 Minuten hatte und auf diese zwei weitere Phenol-Wasser-Extraktionen von jeweils 15 Minuten Dauer folgten,' wobei jede der drei Extraktionen bei einer Temperatur von 68° C durchgeführt wurde.

Beispiel 6 Reinigung von Glykopeptid

(a) Das Verfahren von Beispiel 2(a) wurde wiederholt, jedoch unter Anwendung eines jeden der folgenden Lösungsmittel für 90 Minuten in der angegebenen Reihenfolge: Äthanol, Aceton, Chloroform und Äther.

- 28 5 0 9 8 4 7 / 1 1 9 P

- 28 - 252040?

(b) Das Verfahren von Beispiel 2(b) wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der erste Pronase-Aufschluß eine Dauer von 20 Stunden hatte. Der zweite Aufschluß erstreckte sich über 4 Stunden wie zuvor.

(c) Das aus Beispiel 6(b) erhaltene Material wurde anschliessend einem RNAse-AufSchluß, wie im Beispiel 3(b) beschrieben, unterworfen, mit der Ausnahme, daß einem ersten RNAse-Aufschluß von 16 Stunden Dauer ein zweiter Aufschluß von 4 Stunden Dauer folgte, wobei die RNAse-Konzentration, die in jedem Fall angewandt wurde, 1 mg/ml betrug.

(d) Das aus Beispiel 6(c) erhaltene Material wurde dann einer TCA-Extraktion, wie im Beispiel 2(d) beschrieben, unterworfen, wobei jedoch 3 Extraktionen, die jede eine Dauer von 15 Minuten hatten, angewandt wurden.

Beispiel 7 Eigenschaften des gereinigten Glykopeptids aus Beispiel 6

(a) Mikroanalyse des Glykopeptids ergab die folgende Zusammensetzung, wobei die angegebenen Mengen Gewichtsprozentsätze bedeuten: Kohlenstoff 38,67; Wasserstoff 6,6; Stickstoff 8,32; Phosphor 0,4; Schwefel < 0,2 und Sauerstoff, durch Differenzbildung, in der Größenordnung von 46. Kohlen-

- 29 5 0 9 8 4 7/1196

stoff, Wasserstoff und Stickstoff wurden in einem halbautomatischen Perkin-Elmer 240-Analysengerät bestimmt.

(b) Das Glykopeptid war im wesentlichen unlöslich in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Aceton und Äther.

(c) Infrarot-Analyse des in einer Standard-Kaliumchlorid-Scheibe von 16 mm Durchmesser dispergierten Glykopeptids lieferte die folgenden Ergebnisse:

Frequenz (cm"¹)	min	max	A	% Abs.	A⁰
860	max	min	0,13	26
1060	infl	max	0,23	41,5	0,66
1155	min	min	0,17	32
1188	1385)Doublette	Basis	0,15	29
1405)	max max	0,21	38	0,59
1478	max	0,20
1545	0,18	34
1590	0,27	46	0,77
1900	0,23	41,5
(2930 (3410	0,035	8
1655	0,28 0,48	48 67	0,80) Ansteigen der Hin- 1,38) tergrund *
0,35	55	1,00

- 30 -

509847/1195

mm =	minimum	der Absorption
max =	maximum	relativ zur Peptid-Bande bei
infl =	Beugung
A =	Extinktion
% Abs. =	Prozentsatz
A⁰	Extinktion
	1655 cm"¹

* Eine ansteigende Hintergrund-Absorption wurde im höheren Prquenzbereich des Spektrums notiert und dies führte bei
dem angegebenen Peak dazu, daß die Absorptionsv/ellen höher waren als sie in Abwesenheit eines derartigen ansteigenden Hintergrundes von den C-M-gestreckten Schwingungen gewesen wären. Aus diesem Grunde ist es nicht möglich, die Absorption

Strekung
aus den Schwingungen der C-H-/ für die betreffende Probe

mit Sicherheit zu bestimmen.

(d) Die chromatographische Fraktionierung eines Hydrolysates des gereinigten Glykopeptids ergab die Anwesenheit von Galactose, Glucose, Mannose, Galactoamin, Glucosamin, Muraminsäure (2-Amino-3-0-(l-carboxyäthyl)-2-deoxy-D-glucose) und Spuren von Arabinose. Die Hydrolyse wurde in 2n-Salzsäure \ in verschlossenen Ampullen in einem Zeitraum von 3 Stunden bei 100° C durchgeführt, der Rückstand in Pyridin gelöst
und an Whatman-3 mm-Papier 18 bis 2k Stunden unter Verwendung eines Lösungsmittels, bestehend aus Butanol (60 ml),

509847/1195 -31-

Pyridin (40 ml) und Wasser (30 ml) absteigend chromatographiert und anschließend mit einem Anilin-Oxalat-Sprühreagens für Zucker (P. Novotry, J. Med. Microbiol. £ 8l (1969)) entwickelt.

Beispiel 8

Biologische Eigenschaften von gereinigtem Glykopeptid aus Beispiel 6
A. Lymphoreticular-stimulierende Aktivität

10 Olac-Mäuse (wahllos gezüchtet, W-Swiss, weiblich, mit einem Körpergewicht von 16 bis 20 g) erhielten jeweils eine einzige intravenöse Injektion, die das Glykopeptid aus Beispiel 6 in 0,85 % Gew./Vol. wässerigem Natriumchlorid (0,2 ml) enthielt. Nach 10 Tagen wurden die Mäuse getötet und deren Milz und Leber entnommen und gewogen. 10 ähnliche Mäuse erhielten als Kontrolltiere eine einzige intravenöse Injektion von wässerigem Natriumchlorid (0,85 % Gew./Vol.) und wurden nach 10 Tagen getötet und deren Milz und Leber ebenfalls entnommen und gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 als mittleres Organgewicht in mg, korrigiert für ein Mäuse-Körpergewicht von 20 g, angegeben.

Tabelle 1

Wirkung von Glykopeptid auf die Erhöhung der Gewichte von Milz und Leber bei der Maus

- 32 509847/1 195

2520A07

	Dosis (mg/Maus)	Milzgewicht (mg)	Lebergewicht (mg)
Kontroll versuche	-	83	1025
	( 1,4	508	2482
Versuchs mäuse	( 0,43 ( 0,143	341 204	1860 1644

B. Antitumor-Aktivität - (Bomford R. & Olivotto M. Int.

J. Cancer, 14, 226 (1974))

Gruppen von 5 männlichen CBA-Mäusen wurden durch eine intra-

h
venöse Injektion von 5 ^x 10 syngeneischen T3-Fibrosarcom-Zellen pro Maus herausgefordert, 1 oder 4 Tage nachdem die Mäuse 350 yg des gereinigten Glykopeptids oder von ganzen Zellen des Bacteriums, von dem das Glykopeptid erhalten worden war, intravenös injiziert erhalten hatten. Die Kontroll-Mäuse erhielten lediglich die anfängliche Injektion von Tumorzellen. 14 Tage nach der Herausforderung wurden die Lungen der Mäuse auf Tumorknötchen untersucht.

- 33 -

509847/1195

Behandlung Anzahl der entdeckten Lungentumorknötchen

Anzahl der Tage zwischen der Injektion der Tumorzellen und der Behandlung

Keine

(Kontrollversuche)

Ganze Zellen (nicht-extrahiert)

Gereinigtes Glykopeptid

26, 13, 40, 34, 39

3, 18, 5, 17, 10 0, 2, 4, 6, 2

1, I₉ 2, 1, 4 1, 0, 7> 2, 1

C. Wirkung des gereinigten Glykopeptids auf die Histamin-Sensibilisierung an der Maus (Adlam C, J. Med. Microbiol., 6, 527 (1973)).

Gruppen von 10 NIH-Mäusen (erwachsene weibliche Tiere, die jedes von 16 bis 20 g Körpergewicht aufweisen) erhielten Injektionen von wässerigem Natriumchlorid (0,85 % Gew./Vol.) mit einem Gehalt von 0 (Kontrolltiere); 0,43 oder 1,4 mg gereinigtes Glykopeptid. Nach 7 Tagen wurden alle Gruppen mit Histamin-Phosphat herausgefordert und die Todesfälle über 24 Stunden aufgezeichnet.

- 34 -

Dosis an gereinig tem Glykopeptid (mg/Maus)	Dosis an Histamin- base (mg/Maus)	Anzahl der überlebenden Mäuse nach 24 Stdn.
1,4	0,5	0
	0,25	3
	0,125	1
0,43	1	0
	0,25	7
	0,125	6
0	10	10
(Kontrolltiere)	5	10
	1	9
	0,5	10
D. Toxizitätsdaten des	gereinigten Glykopeptids

An dem gereinigten Glykopeptid wurden die folgenden Untersuchungen des U.S. Dept. of Health, Education and Weifare Public Service, Regulations for the Manufacture of Biological Products Title 42, Part 73, Division of Biologies standards, N.I.H. Bethesda, Maryland, U.S.A. durchgeführt. 1. Maus-Gewichtsverlust

Gruppen von 10 männlichen Mäusen (14 bis 16 g) erhielten intraperitoneale Injektionen (0,2 ml Volumen) von variierenden Verdünnungen der ganzen Zellen von C. parvum (Ausgangs-

- 35 -

material für die Herstellung des Glykopeptids); des durch Phenol- und Wasser-Extraktion erhaltenen Glykopeptids; und Salzlösung. Die Mäuse wurden täglich 7 Tage lang gewogen und der Gewichtsverlust als Prozentsatz des Ausgangsgewichtes angegeben.

Ergebnisse

Die mittleren Gewichte der Mäuse während des Versuchszeitraums sind in der Tabelle 2 angegeben, aus der entnommen werden kann, daß

(a) während des VersuchsZeitraums keine Todesfälle aufgezeichnet wurden;

(b) daß in allen Fällen die Ausgangsgewichte innerhalb der geforderten 3 Tage wiedererhalten wurden und die Ausgangsgewichte tatsächlich innerhalb von 2 Tagen ab Injektion des zu untersuchenden Materials, in allen Fällen wiedererhalten worden sind; und

(c) keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Wiedererlangung des verlorenen Gewichtes zwischen den Gruppen, denen man das bekannte ganzzellige C. parvum-Material injiziert hatte, und den Gruppen, die das neue Glykopeptid der vorliegenden Erfindung injiziert erhielten.

2. Pyrogenizität

Gruppen von 2 Kaninchen erhielten intravenöse Injektionen

- 36 509847/1195

Tabelle 2 Körpergewichte von Mäusen aus dem Maus-Gewichtsverlust-Test für ganze Zellen C. parvum und für Glykopeptid der vorliegenden Erfindung

O CO CO

Material

Dosis (mg/Maus) Gewichte als Prozentsatz des Ausgangsgewichts Tage nach der Injektion

01 2 3 4 5 6

Gereinigtes Glykopeptid

1,4

0,43 0,143

100	97	107	119	124	131	137	145
100	101	110	120	129	139	143	152
100	106	114	126	131	141	143	152
100	91	88	94	116	119	127	137
100	93	107	102	121	130	134	141
100	105	115	125	129	140	143	152

C. parvum ganze " " Zellen

Il It

0,43 0,143

Salzlösung

110

117

126

135

142

145

(0,4 ml Volumen) mit ganzen Zellen von C. parvum (bekanntes Material, das auch als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Glykopeptids verwendet wird) in variierenden Verdünnungen; des durch Phenol- und Wasser-Extraktion erhaltenen Glykopeptids; und Salzlösung. Der Anstieg der Rektaltemperatur wurde durch ein Thermoelement über 5 Stunden gemessen.

Ergebnisse

Die mittleren rektalen Temperaturen der Kaninchen über den Versuchszeitraum sind in Tabelle 3 angegeben, aus welcher man entnehmen kann, daß der Temperaturanstieg bei denjenigen Kaninchen, denen man das Glykopeptid injiziert hatte, niedriger war als bei denen, denen man das bekannte ganzzellige C. parvum-Material injiziert hatte, und zwar bei allen untersuchten Dosen.

Tabelle 3

Rektaltemperatur aus Pyrogenizitäts-Untersuchungen an Kaninchen für gereinigtes Glykopeptid der vorliegenden Erfindung

Injiziertes Dosis Mittlerer Temperaturan-Material (mg/Kaninchen) stieg

( ⁰C)

Salzlösung - 0,15

- 38 509847/1195

Tabelle 3 (Fortsetzung)

	Dosis (mg/Kaninchen)	Mittlerer Temperaturan stieg ( °C)
Injiziertes Material	2,8 0,93 0,31	1,45 1,1 0,8
Gereinigtes Glykopeptid	2,8 0,93 0,31	1,55 1,45 1,2
C. parvum (ganze Zellen)

Durch die vorliegende Erfindung werden folgende Gegenstände umfaßt, ohne daß die Erfindung jedoch darauf beschränkt wird:

(a) Die hier beschriebenen immunstimulierenden Produkte der Extraktions- und Reinigungsverfahren, und pharmazeutische Zubereitungen davon.

(b) Die hier beschriebenen Extraktions- und Reinigungsverfahren.

(c) Die Verwendung der immunstimulierenden Produkte für die Therapie oder Prophylaxe bei Säugetieren oder Vögeln durch Verleihung einer Resistenz gegenüber Tumoren und Krankheitserregern.

- 39 -

509847/1135

(d) Ein immunstimulierendes Glykopeptid, geeignet für eine Verwendung zur Verleihung von Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenen Krankheitserregern bei Säugetieren oder Vögeln, wobei das Glykopeptid aus den Zellwänden eines immunstimulierenden Bacteriums, das zu den Actinomycetaceae- oder Mycobacteriaceae-Gattungen der Prevot'sehen Klassifizierung gehört, erhältlich ist. Das Glykopeptid hat folgende Eigenschaften:

Es ist im wesentlichen unlöslich in Wasser, physiologischer Salzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid, Diäthylenglykol und Hexan;

es ist im wesentlichen frei von Nucleinsäuren;

es hat eine Absorption im Infrarot-Spektrum bei 1550 und 1660 cm , die mit der Anwesenheit von Peptid verträglich ist;

es hat eine Absorption im Infrarot-Spektrum zwischen 950 und 1100 cm mit einer maximalen Absorption bei 1050 bis 1070 , was mit der Anwesenheit von Carbohydrat verträglich ist;

es hat eine geringe oder keine Lipid-Absorption im Infrarot-

- 40 509847/1195

Spektrum bei 285O bis 2950 cm"¹; das Glykopeptid erhöht nach intravenöser Verabreichung das Gewicht von Leber und Milz bei der Maus und erhöht die Lebenserwartung der Mäuse bei Tumoren.

509847/119S

Claims

Patentansprüche

l.J Verfahren zur Reinigung eines immunstimulierenden Glykopeptids, erhältlich aus der Zellwand eines immunstimulierenden Bacteriums der Actinomycetaceae- oder Mycobaeteriaceae-Gattungen der Prevot'sehen Klassifikation, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykopeptid zumindest einem Reinigungsverfahren (wie vorstehend hier definiert) zur Entfernung von Nucleinsäure und Cytoplasma-Protein unterwirft, um auf diese Weise ein gereinigtes, immunstimulierendes Glykopeptid zu erhalten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet , daß man ein immunstimulierendes Glykopeptid, erhalten durch 2-Phasen-Lösungsmittelextraktion, unter Verwendung einer Phase, enthaltend Wasser und einer zweiten Phase, enthaltend einen Arylalkohol (wie vorstehend definiert), von ganzen kultivierten Bakterienzellen eines immunstimulierenden Bacteriums der Actinomycetaceae- oder Mycobacteriaceae-Gattungen der Prevot'sehen Klassifikation, reinigt.
3. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten, immunstimulierenden Glykopeptids, geeignet für eine Verwendung zum Verleihen einer Resistenz gegenüber Tumoren und verschieden-

509847/119S

artigen Krankheitserregern bei Säugetieren oder Vögeln, wobei das Glykopeptid aus der Zellwand eines immunstimulierenden Bacteriums der Actinomycetaceae- oder Mycobaeteriaceae-Gattungen der Prevot'sehen Klassifikation erhältlich ist, und das Glykopeptid im wesentlichen in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid, Diäthylenglykol und Hexan unlöslich ist, eine Absorption im Infrarot-Spektrum bei 1550 und l66O cm besitzt, die mit Anwesenheit von Peptid vereinbar ist, eine Absorption im Infrarot-Spektrum zwischen 950 und 1100 cm aufweist, mit einer maximalen Absorption bei

— "1

1050 bis 1070 cm , die mit der Anwesenheit von Carbohydrat verträglich ist, wenig oder keine Lipid-Absorption im Infrarot-Spektrum bei 285O bis 2950 cm zeigt, und nach intravenöser Verabreichung das Gewicht von Leber und Milz bei Mäusen erhöht und die Lebenserwartung von Mäusen mit Tumoren vergrößert, dadurch gekennzeichnet, daß man immunstimulierende Actinomycetaceae- oder Mycobacteriaceae-Bakterienzellen kultiviert, aus der Kultur gebildete Bakterienzellen gewinnt, die gebildeten Bakterienzellen einer 2-Phasen-Lösungsmittelextraktion unterwirft, wobei man eine Phase, enthaltend Wasser und eine zweite Phase, enthaltend einen Arylalkohol (wie vorstehend definiert) verwendet, um so einen unlöslichen Rückstand zu erhalten, und man den Rückstand zumindest einem Reinigungsverfahren (wie vorstehend

- 43 509847/113 S

2520A07

definiert) zur Entfernung von Nucleinsäuren und Cytoplasma-Protein unterwirft.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3₅ dadurch gekennzeichnet _s daß man ein oder mehrere Reinigungsverfahren verwendet j die aus den nachfolgenden Verfahren ausgewählt sind:

Aufschluß mit einem proteolytischen Enzym zur Entfernung von

Cytoplasma-Protein;

Aufschluß mit einem Nucleinsäure-hydrolysierenden Enzym zur

Entfernung von Nucleinsäuren; und

Behandlung mit einem Nucleinsäure- und/oder Protein-hydrolysierenden Mittel zur Entfernung von Nucleinsäuren-und/oder Cytoplasma-Protein, wobei das Mittel eine geringe oder keine Wirkung auf die immunstimulierende Aktivität des Glykopeptids

ausübt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die 2-Phasen-Lösungsmittelextraktion das In-Berührung-bringen der Bakterienzellen mit einer Wasser- und-Phenol-Mischung, welche von 40 bis 55 Vol.-JS Phenol enthält, bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 75° C, umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch

- 44 -509847/1195

gekennzeichnet , daß das verwendete immunstimulierende Bacterium ein Mitglied der Corynebacterium-Familie ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß das verwendete immunstimulierende Bacterium ein Mitglied der Corynebacterium parvum-Spezies ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet , daß das verwendete immunstimulierende Bacterium zu dem Stamm gehört, der die Kulturnummer W.C.N. 6134 und P.C.N. 4685» wie vorstehend definiert, besitzt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß das gereinigte Glykopeptid von 30 bis 45 Gew.-% Carbohydrat enthält.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Glykopeptid von 38 bis 43 Gew.-% Kohlenstoff, von 7 bis 10 Gew.-% Stickstoff und von 5 bis 7 Gew.-% Wasserstoff enthält.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Reinigungsverfahren zur Entfernung von Cytoplasma-Protein und/oder

- 45 -509847/1195

2520A07

Nucleinsäure die Behandlung mit einer Säure, ausgewählt aus Trichloressigsäure und Perchlorsäure, umfaßt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuren durch Aufschluß mit einer Ribonuclease entfernt werden.
13· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch ein zusätzliches Reinigungsverfahren, das die Extraktion mit zumindest einem inerten Lösungsmittel für die Extraktion von Lipid aus biologischen Materialien umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß das Lösungsmittel aus Äthanol, Methanol, Aceton, Chloroform und Äther ausgewählt ist.
15· Verfahren zur Herstellung von immunstimulierenden GIykopeptiden, geeignet für eine Verwendung zum Verleihen einer Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenartigen Krankheitserregern bei Säugetieren, wobei das Glykopeptid aus der Zellwand eines immunstimulierenden Bacteriums der Actinomycetaceae- oder Mycobacteriaceae-Gattungen der Prevot¹-schen Klassifikation erhältlich ist, es ferner in Wasser,

- 46 50S847/119S

physiologischer Kochsalzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid, Diäthylenglykol und Hexan unlöslich und im wesentlichen Lipid-frei ist, es eine chemische Zusammensetzung von etwa 39 Gew.-% Kohlenstoff, etwa 6 Gew.-% Wasserstoff, etwa 8 Gew.-% Stickstoff, unterhalb 0,5 Gew.-% Phosphor, etwa 5 Gew.-% Asche und einer vernachlässigbaren Menge Schwefel hat, es ferner eine Infrarot-Analyse des festen Materials mit einer Extinktion bei I55O und I66O cm , verträglich mit der Anwesenheit von Peptid, eine Extinktion bei IO5O bis IO7O cm , verträglich mit der Anwesenheit von Carbohydrat und eine geringe oder keine Lipid-Extinktion bei 285O bis 2950 cm liefert, es ferner die Fähigkeit besitzt, das Gewicht von Milz und Leber bei der Maus zu erhöhen und die Lebenserwartung von Mäusen mit Tumoren zu vergrößern, dadurch gekennzeichnet , daß man immunstimulierende Actinomycetaceae- oder Mycobacteriaceae-Zellen kultiviert, die gebildeten Bakterienzellen aus der Kultur gewinnt, die kultivierten Bakterienzellen einer 2-Phasen-Lösungsmittelextraktion unter Verwendung einer Phase, enthaltend Wasser und einer zweiten Phase, enthaltend einen Arylalkohol (wie vorstehend definiert), unterwirft, um so einen unlöslichen Rückstand zu erhalten, und man den unlöslichen Rückstand den folgenden Reinigungsverfahren unterwirft: Aufschluß mit Pronase, Ribonuclease und Desoxyribonuclease;

509847/113S

Extraktion mit zumindest einem Lösungsmittel, ausgewählt aus Äthanol, Methanol, Aceton, Chloroform und Äther; und Extraktion mit TriChloressigsäure.
16. Gereinigtes Glykopeptid, dadurch gekennzeichnet , daß es nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 hergestellt worden ist.
17· Verfahren zur Reinigung eines immunstimulierenden Glykopeptids, im wesentlichen wie hier unter besonderer Bezugnahme auf die Beispiele 2, 3 und 6, beschrieben.
18. Gereinigtes Glykopeptid, im wesentlichen wie hier beschrieben, unter besonderer Bezugnahme auf die Beispiele 7 und 8.
19. Immunstimulierendes Glykopeptid, geeignet für eine Verwendung zur Verleihung einer Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenartigen Krankheitserregern an Säugetiere oder Vögel, das aus der Zellwand eines immunstimulierenden Bacteriums der Actinomycetaceae- oder Mycobacteriaceae-Gattungen der Prevot'sehen Klassifikation erhältlich ist, wobei dieses Glykopeptid

im wesentlichen unlöslich in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Dioxan,

- 48 -

509847/119 5

Pyridin, Dimethylformamid, Diäthylenglykol und Hexan ist;

es im wesentlichen frei von Nucleinsäuren ist;

es eine Absorption im Infrarot-Spektrum bei 1550 und 166O cm aufweist, die mit der Anwesenheit von Peptid verträglich

es eine Absorption im Infrarot-Spektrum zwischen 950 und

-1 -1

1100 cm mit einer maximalen Absorption bei 1050 cm bis

_-l

1070 cm , verträglich mit der Anwesenheit von Carbohydrat, besitzt, es eine geringe oder keine Lipid-Absorption im Infrarot-Spektrum bei 285O bis 2950 cm zeigt, und das nach intravenöser Verabreichung das Gewicht von Leber und Milz bei der Maus erhöht und die Lebenserwartung der Mäuse mit Tumoren vergrößert.

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