KR101125764B1

KR101125764B1 - 항산균 세포벽골격을 이용한 백신매개체 및 그에 의한 백신의 제조 방법

Info

Publication number: KR101125764B1
Application number: KR1020100007293A
Authority: KR
Inventors: 백태현
Original assignee: 백태현
Priority date: 2010-01-27
Filing date: 2010-01-27
Publication date: 2012-03-27
Also published as: WO2011093594A3; WO2011093594A2; KR20110087727A

Abstract

본 발명은 면역원성이 낮은 아단위 백신인 단백질 또는 펩티드 항원의 면역성을 크게 강화시킬 수 있는 백신매개체 및 그에 의한 백신의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카르복실기를 함유하는 펩티도글리칸을 포함하여, 상기 카르복실기와 펩티드/단백질 항원의 아민기와의 펩티드 결합에 의해 공유결합하는 항산균 세포벽골격인 것을 특징으로 하는 백신매개체 및 그에 의한 백신의 제조 방법에 관한 것에 관한 것이다.
본 발명의 백신매개체에 의하면, 단백질/펩티드 항원과 높은 결합효율로 공유결합을 형성하여 면역원성이 높고 안전한 백신을 제조할 수 있다.

Description

항산균 세포벽골격을 이용한 백신매개체 및 그에 의한 백신의 제조 방법{Vaccine vehicle using mycobacterial cell wall skeleton and preparation method for vaccine thereby}

본 발명은 면역원성이 낮은 아단위 백신인 단백질 또는 펩티드 항원의 면역성을 크게 강화시킬 수 있는 백신매개체 및 그에 의한 백신의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산균(mycobacteria)의 세포벽골격(cell wall skeleton, CWS)을 이용한 백신매개체(vaccine vehicle) 및 그에 의한 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

백신은 사멸되거나 약독화된 병원체 또는 단백질, 합성 펩티드 및 다당류-펩티드 콘쥬게이트와 같은 아단위 백신을 포함하며, 미생물 감염병은 물론 악성 종양(암)과 알레르기 질환을 예방하거나 치료하는데 광범위하게 이용되고 있다.

백신에 의해 강력한 보호 면역반응을 유발하기 위해서는 2가지 유형의 신호를 제공하거나 유도할 것이 요구된다. 첫째, 백신은 T 림프구 및 B 림프구상의 항원-특이 수용체를 자극하는 항원을 전달하여야 한다. 둘째, 항원제시세포(antigen presenting cells; APCs)에 의한 동시자극자(costimulator)와 사이토카인(cytokine)의 발현을 유도하여, 이것이 항원에 의해 자극되는 림프구를 강력하게 활성화시켜야 한다. 살아있는 약독화 병원체를 접종하는 생백신의 경우에는 상기한 두번째 신호를 효과적으로 활성화시킬 수 있지만, 불활성화 백신, 특히 고도로 정제된 아단위 백신이나 펩티드 항원을 사용할 경우에는 이러한 신호가 제공되지 않기 때문에 면역원성이 크게 저하된다. 이러한 두번째 신호를 활성화시킬 수 있는 아쥬반트(adjuvant)를 첨가하거나 백신매개체를 사용하면, 백신의 효과가 향상되어 면역반응을 더욱 강화시킬 수 있다.

아쥬반트(항원보강제 또는 면역촉진제)는 면역계를 자극하여 항원에 대한 면역반응을 증강시키는 물질을 말하며 이러한 아쥬반트는 항원 접종부위에 수지상세포(dendritic cells; DCs)나 큰포식세포(macrophages)와 같은 항원제시세포의 동원과 활성화에 따른 국소염증반응을 촉진시키고 이어서 T 세포의 활성화를 초래하여 항원의 면역원성을 증강시킨다. 아쥬반트는 항원 접종부위에 모여든 항원제시세포에서 T 세포를 활성화시키는 동시자극자(costimulator)와 IL-12와 같은 사이토카인(cytokine)의 발현을 촉진시키며 또한 항원제시세포의 표면에서 펩티드-MHC 복합체의 발현을 증가시킨다. 따라서 항원을 아쥬반트와 함께 접종하면 세포매개면역과 T 세포 의존 항체생산을 촉진시켜 효과적인 면역반응을 유도할 수 있다. 대부분의 강력한 아쥬반트는 세균 자체나 세균의 산물이며 이 중에서도 항산균의 세포벽 성분이 대표적이다.

백신매개체는 아쥬반트 효과를 나타내는 미생물에서 항원유전자를 발현시키거나 미생물, 미생물 성분 또는 운반분자(carrier)에 항원을 공유결합시켜 면역원성을 효과적으로 향상시키는 물질을 말하며 이러한 백신매개체는 체액성 면역은 물론 세포매개면역을 효과적으로 유도할 수 있다.

20세기 초부터 수많은 아쥬반트가 개발되어 연구되고 있지만 이 중에서도 alum만이 사람에서 사용이 승인된 유일한 아쥬반트이나, 주로 체액성 면역을 증가시키는 한계를 갖고 있다. 따라서 체액성 면역과 세포매개면역을 효과적으로 촉진시킬 수 있는 새로운 아쥬반트 또는 백신매개체의 개발이 필요하며 이를 실용화하기 위해서는 안정성과 유효성이 충분히 검증되어야 한다.

이와 같이 효과적인 아쥬반트의 부재는 백신, 특히 세포매개면역을 요구하는 세포내 병원체에 대한 백신의 성공적인 개발에 상당한 장애가 된다. 특히 강력한 아쥬반트의 첨가를 필요로 하는 단백질 또는 펩티드 항원인 아단위 백신의 경우, 백신 접종에 대한 약한 면역원성 여전히 주요 과제로 남아있다. 따라서, 항원의 면역원성을 개선시키고 강력한 면역반응을 꾸준하게 촉진시킬 수 있으며 안정성이 보장되는 새로운 아쥬반트 및 백신매개체의 개발이 절실히 필요하다.

일반적으로 항산균 세포벽 성분은 국소염증반응을 강력하게 자극하여 육아종 (granuloma) 형성을 유도하고 효과적인 항원제시와 염증성 사이토카인 생성을 높여 면역반응을 크게 증가시킨다. 대표적인 항산균의 일종인 BCG는 결핵예방을 위한 약독화 생백신 균주로 1921년부터 전 세계적으로 30억명 이상에게 접종해 온 안정성이 입증된 백신균주이다. 현재 BCG는 결핵백신으로서 뿐만 아니라 방광암을 포함한 다양한 악성종양의 항암면역치료제로도 많이 연구되어 왔다. 최근에는 항산균 내 외래 유전자의 발현을 위한 백신매개체 시스템이 발전됨에 따라 각종 백신항원의 수송매개체로서 재조합 BCG가 검토되고 있다.

항산균의 세포벽은 건조중량의 60%정도가 복합지질성분으로 구성되어 있으며 펩티도글리칸(peptidoglycan), 아라비노갈락탄(arabinogalactan), 미콜린산(mycolic acid), 리포아라비노만난(lipoarabinomanan, LAM), 표면 지질 및 미코시드가 약 20nm의 두께로 적층된 구조로 이루어져 있다(도 1). 죽은 항산균 자체는 물론 항산균 세포벽 성분 중에서 세포벽골격(CWS), muramyl dipeptide(MDP), trehalose dimyclolate(TDM), methanol extractable reside(MER) 등은 선천면역을 자극시키는 강력한 아쥬반트로 알려져 있다. 이 중에서도 CWS는 펩티도글리칸, 아라비노갈락탄 및 미콜린산의 복합체로 구성된 강력한 면역활성 미립자(immunoactive microparticle)로 면역반응을 촉진시키며 또한 CTL의 증식과 NK 세포의 활성화를 유도하여 항암면역효과도 발휘한다. 항암면역치료제로서 BCG CWS의 임상적 유용성은 1970년대부터 Yamamura 등(Ann N Y Acad Sci 277: 209-227)에 의하여 많이 연구되어 왔다. BCG CWS의 면역활성 매커니즘은 Toll-like receptor(TLR) 2와 TLR4를 통해 유도되는 수지상 세포의 성숙에 부분적으로 기여한다. 최근에는 정제된 BCG CWS가 TLR2 의존적으로 nuclear factor-kB 프로모터를 활성화시키는 것으로 보고되었다. 공개특허 2006-126963호에서는 악성 결핵균 군(Mycobacterium tuberculosis - complex) 유래의 세포벽 단편이 면역 치료에 대한 아쥬반트로 사용될 수 있음이 제시되어 있다.

전기한 항산균의 CWS 성분 중 peptidoglycan은 N-acetylglucosamine(NAG)과 N-acetylmuramic acid(NAM)로 구성된 이당류가 반복되는 사슬 구조로, muramic acid의 잔기에는 L-alanyl-D-glutaminyl-meso-diaminopimelyl-D-alanine으로 구성된 tetrapeptide가 교차결합되어 있다(도 2). 이들 murein tetrapeptide 내의 glutamic acid와 meso-diaminopimelic acid는 자유 카르복실기(free carboxyl group)를 보유하고 있어서 다양한 단백질이나 펩티드 항원의 자유 아미노기와 결합할 수 있다는 것에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.

1)공개특허 2006-126963호

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 단백질/펩티드 항원의 면역원성을 크게 증가시킬 수 있는 백신매개체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 알레르기성 면역반응을 억제시키는 백신매개체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질/펩티드 항원과 상기 백신매개체 간에 높은 결합효율로 공유결합을 형성하여 면역원성이 우수한 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 카르복실기를 함유하는 펩티도글리칸을 포함하여, 상기 카르복실기와 펩티드/단백질 항원의 일차 아민기와의 펩티드 결합에 의해 공유결합하는 항산균 세포벽골격인 것을 특징으로 하는 백신매개체에 관한 것이다.

항산균 세포벽골격은 면역활성이 높은 펩티도글리칸-아라비노갈락탄-미콜린산의 복합체로, 이 중에서 펩티도글리칸의 이당류 사슬은 tetrapeptide에 교차결합되어 있다. 이들 tetrapeptide를 구성하고 있는 glutamic acid와 meso-diaminopimelic acid는 자유 카르복실기(free carboxyl group)를 갖고 있어서 펩티드/단백질 항원의 자유 아미노기와 공유결합을 형성할 수 있다는 것에 착안하여, 항산균 세포벽골격을 백신매개체로 사용하여 펩티드/단백질 항원을 공유결합시킴으로써 백신을 제조하고 그 면역원성을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 실시예에서는 항산균 중 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis, BCG)의 세포벽골격을 백신매개체로 사용한 것에 대한 실험 결과만을 기재하였으나, BCG이외의 다른 항산균도 동일한 세포벽골격 구조를 갖기 때문에 동일?유사한 효과를 나타낼 수 있음은 당연하다.

CWS는 J. Natl. Cancer. Inst. 52: 95-101(1974), USP 6,593,096) 등 종래 기술의 방법에 의해 분리할 수 있으며, 본 발명은 항산균의 세포벽골격의 제조 방법에 제한을 받는 것이 아니므로 새로이 개발되는 분리 방법을 적용하는 것도 무방하다.

항원분자 내의 아미노기가 세포벽골격의 카르복실기에 공유결합하는 것이므로 펩티드, 단백질 및 당단백질 항원은 어떤 것이라도 본 발명의 백신매개체에 결합할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 항원으로 면역성 검증 시 대표적으로 사용되고 있는 단백질 항원인 OVA(ovalbumin), KLH(keyhole limpet hemocyanin), 및 BSA(bovine serum albumin)와, 펩티드 항원으로 Mart1(T세포에 의해 인식되는 melanoma 연관 항원) 만을 예시하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 자유 아미노기를 가지고 있는 모든 펩티드, 단백질 및 당단백질 항원과 결합하여 사용될 수 있음은 당연하다.

본 발명은 또한 상기 백신매개체를 사용하여 백신을 제조하는 방법에 관한 것으로 (A) 항산균 세포벽골격(이하 CWS) 부유액을 준비하는 준비단계; (B) 상기 항산균 CWS 성분 중 펩티도글리칸의 자유 카르복실기를 활성화시키는 활성화단계; (C) 상기 카르복실기가 활성화된 CWS(활성 전구체)와 펩티드/단백질 항원을 반응시켜 항원과 CWS를 펩티드 공유결합하는 공유결합단계; 및 (D) 반응액으로부터 항원이 결합된 CWS를 분리?정제하는 분리단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 본 발명의 백신매개체를 이용한 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 항원과 CWS의 결합 반응의 재현성과 결합 효율을 높이기 위해서는 반응액 중 CWS가 단일입자로 균질하게 부유되어 있는 것이 바람직하다. 그러나 CWS은 소수성을 나타내기 때문에 수용액 또는 친수성 용액에서 서로 엉기게 되어 덩어리(aggregate)를 형성하기 쉬워 균질한 부유액을 제조하는 데 상당한 어려움이 있다. 이러한 문제를 해소하기 위하여 상기 (A)단계의 CWS 부유액은 CWS를 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올의 C1~C4인 알콜 또는 벤질 알콜에 부유하여 제조하는 것이 바람직하다. 실시예에서는 구체적인 데이터를 제시하지는 않았으나, 사전 실험결과 세포벽골격을 상기 알콜 중 하나에 부유한 결과 CWS의 농도가 10%(건조중량 100mg/ml) 인 경우까지도 -20℃에서 최소한 2년 이상 aggregate를 형성하지 않고 안정한 상태를 유지하였다. 또한, 실시예에는 2-propanol만을 기재하였으나 다른 알콜을 사용한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

상기 (B) 활성화 단계는 CWS의 자유 카르복실기를 일차 아민에 대한 반응성이 높은 유도체로 활성화하는 단계이다. 이는 카르복실산과 일차 아민간의 펩티드 결합 형성을 위한 통상의 유기화학적 방법들을 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride) / NHS(N-hydroxysuccinimide)와 CWS를 반응시키는 것에 의해 NHS-에스터를 제조하여 카르복실기를 활성화하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 3은 본 발명의 실시예에 의한 상기 CWS를 백신매개체로 이용한 백신의 제작 과정에 수반되는 화학반응을 보여주는 순서도이다. 도 3에 도시한 바와 같이 CWS 내의 자유 카르복실산 반응기는 EDC/NHS와 반응하여 NHS-ester로 활성화되며, 이후 항원의 자유 아미노기와 반응하여 펩티드 결합을 형성한다.

백신의 제조에서 항원의 결합효율을 정량적으로 평가하고, 백신에 의해 효과적인 면역반응을 유도하기 위해서는 항원이 결합된 항산균 CWS를 aggreagte가 아닌 단일 입자로 균질하게 부유하는 것이 좋다. 그러나 항원이 결합된 CWS은 수용액 또는 친수성 용액에서 CWS과 마찬가지로 aggregate를 형성하기 쉽다. 따라서, (D) 단계에서 제조된 항원이 결합된 CWS은 에탄올, 이소프로판올 또는 벤질알콜을 1~10%(v/v) 함유하는 완충용액에 부유하는 것이 바람직하다. 상기 완충용액은 일반적으로 백신의 부유액으로 사용하는 것이라면 무관하며, 본 실시예에서는 1% 에탄올을 함유하는 0.02% Tween 80-1% ethanol-PBS를 부유액으로 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용액을 부유액으로 사용하면 항원이 결합된 CWS를 단일 입자수준의 균질한 부유액으로 제조할 수 있었다.

본 발명의 실시예에서는 단백질 항원으로 OVA(ovalbumin), KLH(keyhole limpet hemocyanin), BSA(bovine serum albumin) 및 펩티드 항원으로 Mart1 만을 예시하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시예에서 확인할 수 있듯이 상기 항원들은 CWS에 고효율로 공유결합되었으며, 항원의 농도를 증가시킴에 따라 CWS에 결합되는 항원의 양도 점차적으로 증가하였다. 이는 다른 여러 매개체에 단백질을 결합시키려는 다른 연구결과들에 비해 유사하거나 우월한 결합효율을 나타내었다〔Bioconjug. Chem. 19(7): 2485-1490, Immunology 107(4): 523-529〕, 더욱이, 펩티드 또는 단백질 항원과 CWS의 반응 시, 반응액의 농도, 반응시간, 반응온도 등을 변경하면서 반응조건을 최적화하는 것에 의해 더욱 높은 결합효율로 항원을 본 발명의 백신매개체에 결합시킬 수 있음은 당연하다.

또한 본 발명은 백신 제조를 위한 전구체로서, 항산균의 CWS와 EDC 〔1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride) / NHS(N-hydroxysuccinimide〕와의 반응에 의해 생성되는 것을 특징으로 전술한 방법에 의한 백신 제조를 위한 전구체에 관한 것이다. 본 전구체는 매우 안정하여 1년 이상 보관 시에도 항원결합효율에 거의 영향을 미치지 않으므로, 백신제조를 위한 전구체로서 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 의해 제조된 OVA-CWS, KLH-CWS 및 BSA-CWS 백신의 면역원성 검증을 위한 동물실험 결과, 상기 모든 백신에 대해 항원의 단독 투여 또는 아쥬반트로서 alum을 사용하여 면역 접종한 경우와 비교하여 1~2㎍ 수준의 아주 적은 항원량에서도 현저히 우수한 면역원성을 타내었다. 또한, 아쥬반트로서 20㎍의 항원과 동일한 양의 CWS을 사용한 경우를 비교할 때에, 본 발명에 의한 항원-CWS 백신은 1/8~1/2의 적은 항원량에서 대등한 면역원성을 나타내어 본 발명의 백신매개체가 항원의 면역원성을 크게 증강시키는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이, 본 발명의 백신매개체는 항원의 접종량을 크게 낮출 수 있기 때문에 백신의 안전성을 크게 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

뿐만 아니라, 대표적인 알레르기 유발 항원인 OVA 항원의 면역접종이 단독 접종이나 아쥬반트로서 alum 또는 BCG CWS을 병용 접종한 경우 모두 Th2 면역반응이 주를 이룬 것에 반해, 본 발명의 백신의 형태로 면역 접종한 경우, Th2 항원인 OVA의 면역반응이 Th1 면역반응으로 강력하게 전환되었다. 이로부터 알레르기를 일으킬 수 있는 Th2 항원을 CWS에 공유결합한 본 발명의 백신은 알레르기 질환의 예방 및 치료에 활용할 수 있음을 시사하였다.

이상과 같이 본 발명의 백신매개체 및 백신의 제조방법에 의하면, 세포벽 골격에 특정 항원이 고효율로 공유결합되어 면역원성이 높고 안전한 백신을 제조하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 항산균의 세포벽 구조를 나타내는 모식도.
도 2는 CWS을 이루는 펩티도글리칸의 상세구조를 보여주는 모식도.
도 3은 본 발명의 CWS을 백신매개체로 이용한 백신의 제작 과정에 수반되는 화학반응을 보여주는 순서도.
도 4는 면역접종 후 마우스 혈청 내 OVA 특이 IgG 항체의 양을 나타낸 그래프.
도 5는 OVA 항원에 의한 림프구 증식 효과를 보여주는 그래프.
도 6은 OVA 항원에 의한 IL-2 생성에 미치는 면역반응의 효과를 보여주는 그래프.
도 7은 OVA 항원에 의한 IL-12p40 생성에 미치는 면역반응의 효과를 보여주는 그래프.
도 8은 OVA 항원에 의한 IFN-γ 생성에 미치는 면역반응의 효과를 보여주는 그래프.
도 9는 면역접종 후 마우스 혈청 내 KLH 특이 IgG 항체의 양을 나타낸 그래프.
도 10은 KLH 항원에 의한 림프구 증식 효과를 보여주는 그래프.
도 11은 KLH 항원에 의한 IL-2 생성에 미치는 면역반응의 효과를 보여주는 그래프.
도 12는 KLH 항원에 의한 IL-12p40 생성에 미치는 면역반응의 효과를 보여주는 그래프.
도 13은 KLH 항원에 의한 IFN-γ 생성에 미치는 면역반응의 효과를 보여주는 그래프.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : BCG CWS 의 제조와 단백질 또는 펩티드 항원의 컨쥬게이션

BCG CWS는 종래 문헌(J. Natl. Cancer. Inst. 52: 95-101(1974) 또는 USP 6,593,096)에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 제조된 BCG CWS는 건조중량 50mg/ml 농도로 2-propanol에서 부유시킨 후에 -20℃에서 보관하며 사용하였다.

항원으로는 OVA(ovalbumin, Pierce, Rockford, Ill., USA), KLH(keyhole limpet hemocyanin, Pierce) 및 BSA(bovine serum albumin, Pierce)의 단백질 항원과 Mart 1(Peptron, Daejeon, Korea) 펩티드 항원을 사용하였다. 단백질 항원은 0.1M PBS, 펩티드 항원은 DMSO에 1, 2, 4 또는 8mg/ml의 농도로 녹여 표적 항원액으로 사용하였다.

-20℃에서 보관하던 BCG CWS 부유액(건조중량 50mg/ml)을 0.5ml를 취하여 2.0ml 마이크로튜브에 분주하고 2-propanol 1ml를 가하여 bead beater로 진탕혼합한 후 14,000g에서 5분간 원심분리하여 BCG CWS 펠렛을 취하였다. 상기 BCG CWS 펠렛에 2-propanol에 용해시킨 20mM EDC/50mM NHS 활성액 1ml를 가하고 bead-beater로 진탕혼합한 후 실온에서 30분간 반응하고 2-propanol로 총 3회 세척하였다.

세척이 완료되면, 상기에서 준비한 표적 항원액 0.5ml를 가하고 4℃에서 18시간 동안 microtube rotator(5 rpm)에서 혼합반응하였다.

반응 후 14,000 × g에서 5분간 원심분리하여 항원이 공유결합에 의해 컨쥬게이션된 BCG CWS(항원-CWS) 펠렛을 취하였다. 상기 펠렛에 0.02% Tween 80/1% EtOH/PBS를 가하고 bead beater로 진탕혼합시켜 항원-CWS 부유액을 만든 후 BCG CWS에 컨쥬게이션된 단백질 또는 펩티드 항원의 농도를 bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit(Pierce)로 측정하였다.

BCG CWS에 결합된 단백질 또는 펩티드 항원의 결합효율을 하기 수식에 의하여 계산하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

결합효율 = BCG CWS에 컨쥬게이션된 항원량/컨쥬게이션 반응에 사용한 항원 총량 × 100

표 1에서 확인할 수 있듯이 BCG CWS에 대하여 단백질 항원은 1mg/ml의 표준액을 사용하였을 때 90% 이상의 높은 결합효율을 나타내었으며, 펩티드 항원인 Mart1은 54%의 결합효율을 나타내었다. 표적 항원액의 농도를 증가시킴에 따라 결합효율은 다소 낮아졌으나, BCG CWS에 컨쥬게이션되는 항원의 양은 점차적으로 증가하였다. 특히 OVA 항원의 경우 가장 높은 결합효율과 컨쥬게이션된 항원량을 나타내었다.

실시예 2 : OVA - CWS 의 면역원성 검증

BCG CWS에 컨쥬게이션된 단백질 항원의 면역원성을 검증하기 위하여 상기 실시예 1의 8.0 mg/ml의 OVA 표준 항원액을 사용하여 제조한 OVA 항원이 결합된 BCG 세포벽골격(OVA-CWS) 백신으로 마우스에 접종하여 면역원성을 검증하였다.

보다 구체적으로, 6주령 BALB/c 마우스를 5마리씩 하기 표 2와 같이 10개 군으로 나누어 2주 간격으로 3회 피하주사를 통해 면역반응을 일으켰다.

면역 접종 후 2주 간격으로 혈청을 취하여 OVA-특이 IgG를 ELISA 방법으로 정량하고 표 2 및 도 4에 나타내었다. 표 2 및 도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 의한 OVA-CWS 백신인 제9군은 OVA 량을 기준으로 하였을 때 2.6㎍에 불과함에도 OVA 20㎍을 단독으로 또는 아쥬반트로 alum와 함께 병용한 제1군 및 제2군과 거의 유사한 IgG 항체가를 나타내었다. 뿐만 아니라, OVA 20㎍과 BCG CWS를 아쥬반트로 병용한 제3군~제6군과 비교하였을 때, 제7군 내지 제10군의 항원량은 제3군~제6군의 약 1/10~1/2에 불과함에도 불구하고 거의 유사한 IgG 항체가를 나타내어 BCG CWS를 백신매개체로 제조한 본 발명에 의한 백신이 매우 강력한 면역원성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 대표적인 알레르기 유발 항원인 OVA 항원에 대한 각 군별 면역반응의 특성을 확인하기 위하여, Th2 항체인 OVA-특이 IgG1과 Th1 항체인 OVA-특이 IgG2a를 각각 ELISA 방법으로 정량하고 그 결과를 표 3에 나타내었다.

OVA 항원의 특성에서 예측한 것과 같이 OVA를 단독 또는 아주반트로서 alum 또는 BCG CWS를 병용한 제1군~제6군은 모두 Th2 항체인 IgG1이 Th1 항체인 IgG2a에 비해 상대적으로 매우 높게 유도된 것을 표 3에서 확인할 수 있다. 이에 반해, 본 발명에 의한 OVA-CWS를 면역 접종한 제7군~제10군은 Th1 항체 반응으로 강력하게 전환(switch)되어 제1군~제6군에 비하여 IgG2a 항체 생성이 상대적으로 매우 높게 유도되었다.

또한 최종 면역 접종 2주 후에 비장세포(splenocytes)를 얻어 fetal bovine serum(Gibco-BRL, Rockville, NY, USA)이 들어있는 RPMI 완전배지에서 배양하면서 5㎍/㎖ Concanavalin A(Con-A; Fluka, Milwaukee, WI, USA), 5㎍/㎖ lipopolysaccharide (LPS; Fluka) 또는 20㎍/㎖ OVA(Pierce)를 각각 첨가하고 48시간 동안 37℃, CO₂ 세포배양기에서 배양한 후 Cell counting kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 세포증식분석을 실시하고 그 결과를 도 5에 도시하였다. 또한 BD OptEIA set(BD Biosciences, San Diego, CA)를 이용하여 상층액으로부터 IL-2, IL-4, IL-10, IL-12p40 및 IFN-γ의 생성량을 측정하고, IL-2, IL-12p40 및 IFN-γ에 대한 결과를 도 6 내지 도 8에 각각 도시하였다. OVA 자극에 대한 IL-4와 IL-10의 발현량은 대체로 낮은 수준이어서 서로 비교 분석이 어려웠다. 하기 도에서 ** 및 ***는 alum을 아쥬반트로 사용한 제2군에 대하여 각각 P<0.01 및 P<0.001로 유의한 차이가 있음을 나타낸다.

도 5에 의하면, 전체 실험군 중 본 발명에 의한 OVA-CWS로 면역 접종한 제7군과 제8군만이 OVA의 자극에 대하여 alum을 아쥬반트로 병용한 제2군에 비하여 림프구가 매우 유의하게 증가되어, 강력한 림프구 증식능을 나타내었다.

도 6 내지 도 8의 OVA 자극에 대한 IL-2, IL-12p40 및 IFN-γ의 발현량은 서로 유사한 경향을 나타내어, OVA 항원에 BCG CWS와 혼합하여 면역접종하거나, 공유결합시켜 OVA-CWS의 형태로 면역접종한 경우 제2군을 비롯한 다른 실험군에 비하여 IL-2, IL-12p40 및 IFN-γ의 발현이 유의하게 증가하였다. 특히 OVA-CWS는 IL-2, IL-12p40 및 IFN-γ의 발현을 크게 증가시켰으며, 그 중에서도 IFN-γ의 경우 제2군(OVA-Alum)에 비해 240배 이상 높은 수준의 IFN-γ 생성능을 나타내었다.

이러한 결과로부터, 본 발명에 의해 OVA 항원은 BCG CWS에 공유결합된 상태로 면역접종될 때 항원의 자극에 대하여 보다 효과적으로 림프구를 증식시키며 IL-2, IL-12p40과 같은 사이토카인의 발현을 촉진시킴을 확인할 수 있었다. 또한, Th2 항원인 OVA 항원은 BCG CWS에 공유결합된 상태로 면역접종될 경우에만 선천면역을 효과적으로 자극하여 IFN-γ의 발현을 강력하게 유도함으로써 면역반응을 Th1 반응으로 전환시키는 것으로 사료된다.

실시예 3 : KLH - CWS 의 면역원성 검증

상기 실시예 1의 8.0 mg/ml KLH 표준 항원액을 사용하여 제조한 KLH-CWS 백신으로 마우스에 접종하여 KLH-CWS 백신의 면역원성을 검증하였다.

보다 구체적으로, 6주령 BALB/c 마우스를 5마리씩 하기 표 4와 같이 8개 군으로 나누어 2주 간격으로 3회 피하주사를 통해 면역반응을 일으켰다. 면역접종 후 실시예 2와 동일한 방법에 의해 KLH-특이 IgG 발현량 및 KLH 자극에 대한 림프구 증식능, IL-2, IL-12p40 및 IFN-γ의 생성량을 측정하고 그 결과를 표 4, 도 9 내지 13에 각각 도시하였다.

표 4 및 도 9에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 의한 KLH-CWS 백신은 접종한 항원량이 1.34㎍으로 제1군~제5군 KLH 항원량의 6%에 불과한 제8군의 경우에도 단독 투여시에 비해 강력한 면역원성을 나타내었다. 또한 KLH-CWS의 1차 접종 시의 IgG 항체가는 alum이나 CWS를 아쥬반트로 사용하여 20㎍의 항원을 면역 접종한 제2군~제5군에 비해 낮았으나, 접종을 반복함에 따라 급격히 증가하여 3차 면역접종 후에는 모든 군이 alum을 아쥬반트로 사용한 제2군보다 높은 IgG 항체가를 나타내었다. 동량의 CWS를 아쥬반트로 사용한 경우에도 항원의 접종량이 1.34㎍인 제8군에서조차 유사한 IgG 항체가가 측정되어, OVA 뿐 아니라 KLH 항원 역시 본 발명의 백신매개체를 사용하여 백신으로 제조하면 면역원성이 크게 강화되는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.

도 10에 의하면, 전체 실험군 중 본 발명에 의한 KLH-CWS로 면역 접종한 제6군과 BCG CWS를 아쥬반트로 병용한 제4군과 제5군 만이 KLH의 자극에 대하여 alum을 아쥬반트로 병용한 제2군에 비하여 림프구가 유의하게 증가하였다.

도 11 내지 도 13의 KLH 자극에 대한 IL-2, IL-12p40 및 IFN-γ의 발현양은 실시예 2의 OVA-CWS 백신과 유사한 경향을 나타내었다.

KLH 자극에 대한 IL-4와 IL-10의 발현량 역시 OVA 항원에 대한 실시예 2와 마찬가지로 대체로 낮은 수준이어서 서로 비교 분석이 어려웠다.

실시예 4 : BSA - CWS 의 면역원성 검증

상기 실시예 1의 8.0 mg/ml BSA 표준 항원액을 사용하여 제조한 BSA-CWS 백신으로 마우스에 접종하여 BSA-CWS 백신의 면역원성을 검증하였다.

보다 구체적으로, 6주령 BALB/c 마우스를 5마리씩 하기 표 5와 같이 4개 군으로 나누어 2주 간격으로 3회 피하주사를 통해 면역반응을 일으켰다. 면역 접종 후 실시예 2와 동일한 방법에 의해 BSA-특이 IgG 발현양을 측정하고 그 결과를 표 5에 나타내었다.

표 5에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 의한 BSA-CWS를 접종한 제4군은 제1~제3군의 항원량의 12.5% 수준인 2.51㎍을 면역 접종하였음에도 불구하고, BSA 항원만을 단독 투여한 제1군이나 아쥬반트로 alum을 사용한 제2군에 비해 현저히 우수한 면역원성을 나타냈다. 아쥬반트로 BCG CWS를 병용한 제2군은 본 발명의 백신과 유사한 수준의 IgG 항체가를 나타내었다.

Claims

카르복실기를 함유하는 펩티도글리칸을 포함하는 항산균 세포벽골격을 이용한 백신매개체로서,
펩티드 또는 단백질 항원의 아민기와 상기 카르복실기 간의 펩티드 결합에 의해 항산균 세포벽골격과 상기 항원이 공유결합되는 것을 특징으로 하는 백신매개체.
제 1 항에 있어서,
상기 항산균은 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis, BCG)인 것을 특징으로 하는 백신매개체.
(A) 항산균 세포벽골격 부유액을 준비하는 준비단계;
(B) 상기 항산균 세포벽골격 성분 중 펩티도글리칸의 자유 카르복실기를 활성화시키는 활성화단계;
(C) 상기 카르복실기가 활성화된 세포벽골격과 펩티드 또는 단백질 항원을 반응시켜 항원과 세포벽골격을 펩티드 공유결합하는 공유결합단계; 및
(D) 반응액으로부터 항원이 결합된 세포벽골격을 분리?정제하는 분리단계;
를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격을 백신매개체로 이용한 백신의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 (A)단계의 세포벽골격 부유액은 세포벽골격을 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 벤질알콜에 부유하여 제조하는 것을 특징으로 하는 백신의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 (B) 활성화 단계는 세포벽골격을 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride) / NHS(N-hydroxysuccinimide)와 반응시키는 것에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,
(D) 단계에서 제조된 항원이 결합된 CWS은 에탄올, 이소프로판올 또는 벤질알콜을 1~10%(v/v) 함유하는 완충용액에 부유하는 것을 특징으로 하는 백신의 제조 방법.
항산균 세포벽골격과 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)와의 반응에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 제 5 항의 백신 제조방법에 의한 백신 전구체.