DE3841828A1

DE3841828A1 - Verfahren zur stabilisierung von hydrierten, lipidischen, lamellierten phasen, zusammensetzung aus diesen phasen sowie anwendung dieser zusammensetzung in der pharmazie und kosmetologie

Info

Publication number: DE3841828A1
Application number: DE3841828A
Authority: DE
Inventors: Alain Huc; Chantal Buffevant; Daniel Herbage
Original assignee: Bioetica SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 1987-10-22
Filing date: 1988-12-12
Publication date: 1990-06-13
Also published as: GB8829257D0; FR2622104B1; FR2622104A1; GB2226002A; GB2226002B

Description

Die Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Stabilisierung von hydrierten, lipidischen, lamel lierten Phasen, z. B. von Liposomen, ferner eine Zusam mensetzung aus hydrierten, lipidischen, lamellierten Phasen, z. B. Liposomen, die unter Verwendung einer sta bilisierenden Trägersubstanz auf der Basis von Atelo kollagen und Glykosaminoglykanen stabilisiert sind, so wie eine Anwendung dieser Zusammensetzung in der Phar mazie und Kosmetologie.

Seit BANGHAM kennt man die hydrierten, lipidischen, lamellierten (lamellaren) Phasen, deren eine besondere Form durch Lipisome gebildet wird (vgl. BANGHAM et al. Journal of Molecular Biology, 13 : 238; 253/1965, oder auch BANGHAM et al. Chem. Phys. Lipids, 1 : 255/1967). Es sind auch zahlreiche andere Artikel über die Lipo some veröffentlicht worden (vgl. PAPAHADJOPOULOS, Biochim. Biophys. Acta, 135/1967, Seiten 624 bis 638, oder WEISSMANN in Journal of Lipids Research, Volume 9, 1968, Seiten 310 bis 318).

Man weiß, daß die Liposomen, die phospholipidisch (bzw. phospholipophil) sind, in der Kosmetik und Pharmazie mehr und mehr an Bedeutung gewinnen, weil sie den Transport von aktiven Substanzen zu den Zellen ge statten, durch die sie absorbiert werden. Tatsächlich, und dies ist erst seit BANGHAM bekannt, bringt die phospholipidische Natur ihrer Membran, die sich ganz in der Nähe von der der Zellen befindet, eine Fusion zwischen den beiden Umhüllungen mit sich.

Unglücklicherweise haben die Liposomen eine geringe Stabilität, in der Weise, daß ihre Entwicklung in großem Maße abgebremst wird, was ein Hauptproblem bildet. In vielen Fällen zerfallen diese die Liposomen bildenden Behälter (Aufnahmen), bevor sie mit den ins Auge ge faßten Zellen in Berührung treten. Weiterhin ruft ihre Integration in ein Endprodukt verhältnismäßig oft eine Zerstörung der Reservoire hervor. Insbesondere in der Kosmetik ist die Realisierung einer Liposomen enthalten den Emulsion extrem schwierig, und die fettige Phase bringt eine Öffnung der phospholipidischen Membran mit sich. Es sind auch bereits zahlreiche Arbeiten einer Stabilisierung der Liposomen durch Substanzen gewidmet, die außerdem biokompatibel sein sollen.

Man hat bereits verschiedene Lösungen vorgeschlagen, um die Liposomen zu stabilisieren, insbesondere die Ver wendung eines Gels in einem Hydrokolloid (C. A., Volume 97, 1982, 188 156k unter Bezugnahme auf einen Artikel, der im J. Pharm. Pharmacol, 1982, 34, (7, 473-4) er schienen ist; hingewiesen wird auch auf die internatio nale Patentanmeldung WO 85/03 640, in der eine große An zahl von Substanzen beschrieben ist, die als Geliermit tel verwendet werden können, insbesondere die Karbo hydrate wie die Zellulosen, Gummi, insbesondere Lecarra ghenan, Xanthan, Kollagen, Polyacrylamid, Polysiloxane, Polymere der Aminosäuren, z. B. geliertes Albumin, Gelatine (S.13, Zeilen 20 bis 35)).

Die Verwendung von Gel weist zahlreiche Nachteile auf. Zunächst einmal kompliziert sie ernsthaft die Zuberei tung von Zusammensetzungen, insbesondere von pharmazeu tischen und kosmetischen Zusammensetzungen. Aufgrund der physischen Eigenschaften des Gels und insbesondere ihres nicht gießbaren Charakters bringt die Verwendung von Gel tatsächlich ernsthafte Handhabungsprobleme mit sich. Was schließlich die ganz besondere Verwendung von Kollagen als Gel-Trägersubstanz anbelangt, so weist das Kollagen eine gewissen Antigenizität auf, obwohl diese sehr ge ring ist. Auch verwendet man gewöhnlich als Kollagen säurelösliches Kollagen. Da die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich des Neutralen haben soll, für die Stabilität der Liposome und damit er ganz in der Nähe des physiologischen pH-Werts ist, fällt im Falle der kosmetischen Anwendung bei diesen Bedingungen des pH-Werts das säurelösliche Kollagen aus, und der Ein schluß von Liposomen wird unmöglich. Man kann dieses Phänomen durch sehr komplizierte und kostspielige Zu bereitungsbedingungen verhindern, die im industriellen Maßstab nicht anwendbar sind, einschließlich niedriger Temperaturbedingungen in der Nähe von 4°C. Dies ge stattet es nicht, eine industrielle Herstellung bei geringen Kosten in Betracht zu ziehen.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu grunde, dieses neue technische Problem auf eine Art und Weise zu lösen, die es gestattet, die hydrierten, lipidischen (lipophilen), lamellierten Phasen, insbe sondere die Liposomen, mit Hilfe einer stabilisierenden Trägersubstanz zu stabilisieren, die sich in Form einer ausreichend fluiden (bzw. dünnflüssigen) Lösung präsen tiert, um alle Nachteile zu beseitigen, die mit einer Verwendung von stabilisierenden Trägersubstanzen in Form von Gel verbunden sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es auch, das neue technische Problem in einer Weise zu lösen, die es gestattet, die hydrierten, lipidischen (lipophilen), lamellierten Phasen, insbesondere die Liposomen, durch Verwendung einer ausreichend fluiden (bzw. dünnflüssigen) stabilisierenden Trägersubstanz zu stabilisieren, die keinerlei Antigenizitätseigenschaft aufweist und die darüber hinaus nur die Schaffung eines äußerst simplen Verfahrens erfordert, das unter einfachen Betriebsbe dingungen anwendbar ist, relativ weit variiert werden kann und doch eine praktisch vollkommene Reproduzierbar keit besitzt.

Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, dieses neue technische Problem dadurch zu lösen, daß es er möglicht wird, die hydrierten, lipidischen (lipophilen), lamellierten Phasen, insbesondere die Liposomen, durch Verwendung einer stabilisierenden Trägersubstanz zu stabilisieren, die mit der Bildung von Emulsionen kompa tibel ist.

All diese technischen Probleme werden zunächst einmal durch die vorliegende Erfindung auf zufriedenstellende Weise gelöst, die industriell anwendbar ist.

Gemäß einem ersten Aspekt schafft also die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung der hydrier ten, lipidischen (lipophilen), lamellierten Phase, bei spielsweise von Liposomen, das die Einführung dieser hydrierten, lipidischen, lamellierten Phase in eine stabilisierende Trägersubstanz beinhaltet und das sich dadurch auszeichnet, daß man diese stabilisierende Trägersubstanz auf folgende Weise hergestellt wird:

a) Es werden gesondert eine Atelokollagenlösung und eine Lösung aus Glykosaminoglykanen zubereitet, und dann
b) wird die Atelokollagenlösung mit der Lösung aus Glykosaminoglykanen gemischt.

Gemäß einer ersten Ausführungsvariante dieses erfindungs gemäßen Verfahrens wird die Mischung dadurch erreicht, daß die Lösung aus Glykosaminoglykanen in die Atelo kollagenlösung eingeführt wird.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird die Lösung aus Glykosaminoglykan dadurch hergestellt, daß eine Lösung des Glykosaminoglykan in einer basischen wässri gen Lösung angesetzt wird, deren pH-Wert in der Weise gesteuert wird, daß nach dem Mischen mit der Atelo kollagenlösung der pH-Wert der Mischung, die die sta bilisierende Trägersubstanz bildet, leicht basisch bleibt, dabei ganz in der Nähe der Neutralität liegt. Vorzugsweise liegt dieser pH-Wert am Ende in der Nähe von 8.

Gemäß einem besonders vorteilhaften Merkmal ist die basische wäßrige Lösung eine wässrige Sodalösung.

Gemäß einem anderen vorteilhaften Merkmal liegt die Konzentration an Glykosaminoglykan in der Lösung aus Glykosaminoglykanen bei 0,5 bis 4%, besser noch bei 0,5 bis 2%, und vorzugsweise in der Nähe von 1%.

Nach einem anderen Merkmal des erfindungsgemäßen Ver fahrens ist die Atelokollagenlösung eine wäßrige Lösung aus Atelokollagen, die vorzugsweise eine Konzen tration zwischen 0,5 und 2 Gew.-% und noch weiter bevor zugt in der Nähe von 1% liegt. Diese Atelokollagenlösung kann erfindungsgemäß erreicht werden, durch eine Auf lösung von Atelokollagenfasern in einer leicht sauren wäßrigen Lösung.

Gemäß einer besonderen Ausführungsart sind diese Atelo kollagenfasern angesetzt in einer Lösung mit Essigsäure von 0,1 M.

Nach einer anderen besonderen Ausführungsart dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Atelokollagen durch eine enzymatische Digestion von Kollagen erhalten.

Gemäß einem weiteren besonderen Merkmal dieses erfin dungsgemäßen Verfahrens werden die hydrierten, lipi dischen, lamellierten Phasen, z. B. Liposomen, erfin dungsgemäß in die Lösung der stabilisierenden Träger substanz eingeführt, nach im wesentlichen gleichen Vo lumen.

Entsprechend einem besonderen Ausführungsbeispiel liegt das Verhältnis der lipidischen, lamellierten Phasen, beispielsweise der Liposomen, etwa bei 1% der fertigen Zusammensetzung.

Gemäß einem zweiten Aspekt wird durch diese Erfindung auch eine Zusammensetzung geschaffen, die hydrierte, lipidische (lipophile), lamellierte Phasen, z. B. Lipo somen, enthält, die durch Gegenwart einer stabilisieren den Trägersubstanz stabilisiert werden, wobei sich diese Zusammensetzung dadurch auszeichnet, daß die stabilisierende Trägersubstanz in der Form einer Lösung ist, die eine Mischung aus Atelokollagen und Glykosami noglykanen enthält.

Gemäß einer besonderen Ausführungsvariante werden die verwendeten Glykosaminoglykane ausgewählt unter den Struktur-Glykosaminoglykanen, insbesondere Hyaluron säure, Chondroitin-4-Sulfat, Chondroitin-6-Sulfat, Der matansulfat, Heparansulfat und Keratansulfat, oder den Sekretions-Glykosaminoglykanen, insbesondere Heparin und seinen Derivaten, sowie den Mucoitinsulfaten.

Nach einem anderen Merkmal der erfindungsgemäßen Zu sammensetzung betrifft diese Lösungen aus Atelokollagen und aus Ausgangs-Glykosaminoglykanen zur Zubereitung der Mischungslösung, deren Eigenschaften vorher beim Verfahren erläutert worden sind.

Das relative Verhältnis der Glykosaminoglykane gegen über dem Atelokollagen beträgt vorzugsweise 18 bis 25 Gew.-% des Glykosaminoglykan gegenüber dem Atelokollagen.

Nach einer anderen Charakteristik der erfindungsgemäßen Zusammensetzung liegt die Lösung der stabilisierenden Trägersubstanz bei einem leicht basischen pH-Wert ganz in der Nähe der Neutralität, vorzugsweise in der Größen ordnung von 8.

Gemäß einer weiteren Eigenschaft der Erfindung wird diese Zusammensetzung dadurch erhalten, daß nahezu gleiche Volumen aus Lösungen der hydrierten, lipidischen, lamellierten Phasen, z. B. Liposomen, und aus Lösungen der stabilisierenden Trägersubstanz gemischt werden.

Eine bevorzugte Anwendung der erfindungsgemäßen Zusam mensetzungen betrifft eine Anwendung in der Pharmazie oder in der Kosmetologie unter der Form von pharmazeu tischen oder kosmetischen Zusammensetzungen. Um dies auszuführen, kann man die Zusammensetzung unverändert benutzen oder aber ihr verschiedene geeignete Komponen ten oder Bindemittel, die dem Fachmann bekannt sind, ohne irgendwelche besonderen Probleme hinzufügen, unter dem Vorbehalt, sich zu vergewissern, daß diese Zugabe die Stabilität der hydrierten, lipidischen, lamellierten Phasen insbesondere der Liposomen, nicht modifiziert.

Dank der Erfindung erhält man auf vollkommen unerwartete Weise eine Verringerung der Antigenizität der stabili sierenden Trägersubstanz.

Man erzielt außerdem eine deutliche Verbesserung für den Schutz der einen Komponente der stabilisierenden Trägersubstanz, nämlich des Atelokollagens gegenüber Kollagenasen, die eine Verlängerung "in vivo" mit sich bringt, die Wirkung verzögert das Atelokollagen.

Diese stabisierende Trägersubstanz besitzt eine ver stärkte wasseranlagernde Eigenschaft, eine besonders ausgeprägte Wirksamkeit für die Regeneration der Leder haut (Dermis) und der Oberhaut (Epidermis) durch Zu nahme der Zellenentwicklung.

Ein weiterer besonders unerwarteter Vorteil und eine Hauptbedeutung für eine industrielle Nutzbarmachung liegt in der Tatsache, daß das Atelokollagen, das in Form der erfindungsgemäßen Lösung benutzt wird, in äußerst einfacher Weise mit den Glykosaminoglykanen vermischt wird, indem es so zu einer Vereinfachung des Stabilisierungsprozesses und daher zu einem Herstellungs verfahren von Zusammensetzungen führt, so daß diese eine therapeutische oder kosmetische Anwendung haben konnen. Diese Trägersubstanz ist kompatibel mit der Bildung von Emulsionen.

Weiterhin gestattet die Verwendung einer stabilisieren den Trägersubstanz in Lösungsform, eine sehr vorteil hafte gießbare Eigenschaft zu erzielen, was dem Fach mann leicht verständlich ist.

Es versteht sich auf diese Weise, daß die Erfindung be trächtliche Verbesserungen mit sich bringt, die gegen über der früheren Technik ausschlaggebend sind.

Weitere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden auch durch die nachfolgende Erläuterung verdeut licht, und zwar unter Bezugnahme auf mehrere Ausführungs beispiele der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die durch das zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird.

Beispiel 1

Zubereitung einer Liposom-Zusammensetzung in einer Atelokollagen-Glykosaminoglykan-Trägersubstanz:

a) Zubereitung von großen mehrfachlamellierten Bläschen bzw. Vesikeln (MLV).

Sojalecithin wird in einer Chloroformlösung ange setzt und dann in Form eines dünnen Filmes auf den Wänden als Glasballons durch Verdampfung des Lösungs mittels unter Vakuum abgelagert (niedergeschlagen). Wasser mit einer Temperatur von 80°C wird dann in den Ballon gegossen und bei dieser Temperatur wäh rend 10 Minuten unter Wirbelrührung gehalten. Die Menge des verwendeten Wassers ist so wie die fertige Mischung, sie schließt 1% Lecithin ein. Diese Zu sammenordnung wird dann bei Umgebungstemperatur in Ruhe gelassen, bis eine vollkommene Abkühlung er reicht ist. Die Lösung enthält dann 1% Phospholipid in Form von Liposomen MLV.

Wenn man eine wasserlösliche Substanz einkapseln will, dann wird diese in Wasser aufgelöst, das während der Zubereitung hinzugefügt wird. Im Falle eines lipophilen Produktes, das in die Membran ein zuführen ist, wird dieses in die Chloroformphase eingearbeitet, die das Phospholipid einschließt.

b) Zubereitung von entnetztem Kollagen oder Atelokolla gen.

Die Haut eines frisch geschlachteten Kalbs wird einer chemischen Enthaarung in einem Bad unterworfen, das 3% Natriumsulfid und 4% Kalk enthält, wobei das Verhältnis 100 g Haut zu 200 cm³ Lösung beträgt. Die Lederhaut (Dermis) wird dann vom Rest der Haut durch einen Spaltvorgang mittels einer drehenden Bandsäge abgetrennt.

Das erhaltene Gewebe wird zerkleinert und durch einen Rost mit Löchern von 4 mm extrudiert. Das Zerkleinerungsprodukt wird dann während drei Wochen mit einer Kalkmilch in Kontakt gebracht, die im Verhältnis von 1 kg auf 4 l Lösung gesättigt ist. Die so behandelte Haut wird dann abgetrennt vom Obenschwimmenden durch eine kontinuierliche Zentri fugierung bei einer Beschleunigung von 2000 g mit Hilfe einer Dekantiermaschine, die mit 4000 U/min läuft. Der Rückstand wird danach zwei Waschungen mit fließendem Wasser in einem Edelstahlbottich unter langsamer Bewegung (Rührung) unterworfen, in einem Verhältnis von 1 kg auf 4 l Bad (bzw. Badflüssigkeit). Das Zerkleinerungsprodukt wird dann zwei Behandlungen mit einem Phosphattampon mit einem pH-Wert von 7,8 (21,7 g/l Na₂HPO₄ und 0,78 g/l KH₂PO₄) bei denselben Bedingungen wie bei der Waschung mit Wasser unter worfen. Der Rückstand wird dann in zwei Bädern mit entionisiertem und sterilem Wasser gewaschen. Das erhaltene Zerkleinerungsprodukt wird in eine Essig säurelösung (0,5 g/l, pH-Wert 3,4) mit einem Verhält nis von 1 kg auf 20 l Bad (Badflüssigkeit) eingegeben. Nach 5 Minuten Rührung wird das Obenschwimmende vom Rückstand abgetrennt durch eine kontinuierliche De kantierung entsprechend der vorhergehenden Technik. Das Kollagen wird dann vom Obenschwimmenden abge trennt, durch Zugaben von trockenem Natriumchlorid in einem Verhältnis von ungefähr 10% gegenüber einem Bad. Nach dem Dekantieren durch Schwerkraft sind die erhaltenen Fasern gegenüber dem entionisierten und sterilen Wasser mit Hilfe von Dialysemembranen dia lysiert, die vorzugsweise durch Schläuche gebildet sind, deren Trennstufe zwischen 6000 und 8000 Dalton liegt. Nachdem durch Silbernitrat geprüft worden ist, daß die dialysierten Fasern kein Natriumchlorid mehr enthalten, werden sie in einer Lösung in einem Bad angesetzt, das 6 g/l Essigsäure enthält, in der Weise, daß eine fertige Konzentration von 1% Protein erhal ten wird. Das ganze wird dann während 24 Stunden einer langsamen Rührung unterworfen.

c) Zubereitung von Chondroitin-4-Sulfat.

Nasewände vom Kalk, die von Muskel- und Fettgeweben befreit sind, werden zerhackt und zerkleinert durch Extrusion durch einen Rost mit Löchern von 4 mm; das Zerkleinerungsprodukt wird während 24 Stunden bei einer Temperatur von 6°C in einem Tampon (Bausch) mit Kaliumchlorid (11,8 g/l KCl, 78,8 mg/l Cystein, ETDA 180 mg/l) plaziert, das 1% Papain ("MERCK") einschließt. Das Verhältnis beträgt 130 g Zerkleine rungsprodukt für 1 l Tampon.

Das Obenschwimmende wird vom Rückstand getrennt durch kontinuierliches Zentrifugieren mit Hilfe einer Dekantiermaschine, die mit 4000 U/min dreht. Dem Obenschwimmenden werden dann 40 g/l Trichlorazetat säure zugegeben. Der Niederschlag wird durch konti nuierliches Zentrifugieren entsprechend der vorher gehenden Technik eliminiert. Das Obenschwimmende wird mit Hilfe von Sodatabletten neutralisiert. Die Mischung wird dann gegenüber dem entionisierten und sterilisierten Wasser mit Hilfe eines Schlauchs (oder von Schläuchen) dialysiert, deren Trennstufe zwischen 6000 und 8000 Dalton liegt. Die dialysier te Lösung wird lyophilisiert (gefriergetrocknet). Das Chondroitin-4-Sulfat wird in einem trockenen Zustand erhalten.

d) Zubereitung der Atelokollagen-Chondroitin-4-Sulfat- Mischung.

Mucopolysaccharid wird in einer Lösung mit einer Konzentration von 1% in einem Bad angesetzt, das Soda mit einschließt. Diese Lösung wird unter lang samem Rühren der Lösung aus Atelokollagen, die 1% Protein enthält, in einem Verhältnis von 250 ml pro 1 l Kollagenlösung zugegeben. Die Sodamenge ist so, daß der fertige pH-Wert 8 beträgt.

e) Zubereitung der Zusammensetzung aus Liposom-Atelo kollagen-Chondroitin-4-Sulfat.

Die wäßrige Lösung aus Liposom mit 2% Sojalecithin wird unter langsamem Rühren in die Atelokollagen- Chondroitin-4-Sulfat-Mischung eingegeben, wobei die Volumen der Kollagenlösung gleich sind; der fertige Komplex enthält 1% Lecithin.

Beispiel 2

Zubereitung einer Liposomzusanmensetzung in einer Atelo kollagen-Glykosaminoglykan-Trägersubstanz:

a) Zubereitung von Liposom SUV (kleine einschichtige Bläschen) :

Eilecithin wird gelöst in Ethanol mit einer Konzen tration von 30 mmol/l. Die alkoholische Lösung wird dann einer Lösung aus Kaliumchlorid mit 0,15 M zuge geben. Dann bilden sich die einschichtigen Bläschen (unilamellaren Vesikeln). Die Suspension wird danach dialysiert, um den Restalkohol zu entfernen und kann durch Ultrafiltration auf 2% konzentriert werden.

b) Zubereitung von entnetztem Kollagen oder Atelokolla gen.

Das Zerkleinerungsprodukt von Kalbshaut wird auf gleiche Weise erhalten wie im vorhergehenden Beispiel. Das Zerkleinerungsprodukt wird dann zwei Behandlungen im Phosphattampon mit einem pH-Wert von 7,8 (21,7 h/l Na₂HPO₄ und 0,79 g/l KH₂PO₄) unterworfen. Die Konzen tration an Zerkleinerungsprodukt beträgt 1 kg je 1 l Badflüssigkeit. Nach jeder Behandlung wird der Rückstand durch kontinuierliche Zentrifugierung mit Hilfe einer Dekantiermaschine wiedergewonnen, die mit 4000 U/min läuft und bei einer Beschleunigung von 200 g. Nach dem Waschen im Phosphattampon wird das Zerkleinerungsprodukt durch zwei Bäder mit entioni siertem und sterilem Wasser unter denselben Be dingungen wie zuvor gewaschen.

Das Zerkleinerungsprodukt wird dann in einem Verhält nis von 200 g/l in eine Salzsäurelösung mit 0,01 N eingebracht, die 7,5% Pepsin im Verhältnis zum Kollagen enthält. Das ganze wird während 24 Stunden bei Umgebungstemperatur (Raumtemperatur) ruhen ge lassen. Am Ende dieses Zeitablaufs wird eine komple mentäre Menge Pepsin von 7,5% im Verhältnis zu Kollagen dem Bad zugegeben, und das ganze läßt man unter denselben Bedingungen wie zuvor ruhen.

Das Obenschwimmende wird vom Rückstand durch konti nuierliches Zentrifugieren gemäß der vorhergehenden Technik abgetrennt. In das Obenschwimmende wird Natriumchlorid eingegossen, um dadurch eine 10%ige Konzentration zu erhalten. Durch kontinuierliches Zentrifugieren werden die Fasern abgetrennt und in Visking-Dialyserohre (Referenz 30/32) eingebracht. Nach der vollkommenen Beseitigung von Natriumchlorid werden die Fasern in einer Lösung in Essigsäure 0,1 M in der Weise angesetzt, daß eine Konzentration von 1% Kollagen erhalten wird.

c) Zubereitung von Dermatansulfat.

Schweinehaut, die auf klassische Weise durch Ab spalten von der Lederhaut (Koriumschicht) sowie von unter der Haut liegenden Geweben befreit worden ist, wird feingehackt und zerkleinert, durch eine Extru sion durch einen Rost mit Löchern von 4 mm.

Das Zerkleinerungsprodukt wird danach mit einer Chloroformmethanolmischung (Volumenverhältnis 2/1) gewaschen. Nach Verdampfung des Lösungsmittels unter Vakuum wird der trockene Rückstand behandelt wie das Zerkleinerungsprodukt der Nasenwände im Beispiel 1; das Dermatansulfat wird im trockenen Zustand er halten.

d) Zubereitung der Atelokollagen-Dermatansulfat-Mischung.

Mucopolysaccharid wird in einer Lösung mit einer Konzentration von 1% in einem Bad angesetzt, das Soda enthält. Diese Lösung wird unter langsamem Rühren der Atelokollagenlösung zugegeben, die 1% Protein enthält in einem Verhältnis von 300 ml je 1 l Kollagenlösung. Die Sodamenge ist derart, daß der End-pH-Wert 8 beträgt.

e) Zubereitung des Liposom-Atelokollagen-Dermatansulfat- Komplex.

Die wäßrige Liposomlösung mit 2% Eilecithin wird unter langsamem Rühren in die Mischung aus Atelo kollagen und Dermatansulfat eingeführt. Die Volumen der Kollagen- und Liposomlösungen sind gleich. Der fertige Komplex enthält 1% Lecithin.

Beispiel 3

Stabilitätskontrollversuch der Liposomen in ihrer er findungsgemäßen Atelokollagen-Glykosaminglykan-Träger substanz.

Die Kontrolle vom Vorhandensein der Qualität der Lipo some wird durch Elektronenmikroskopie durchgeführt. Hierfür werden die Präparate, die in Übereinstimmung mit den Beispielen 1 und 2 vorbereitet worden sind und 1% Lecithin enthalten, zehnfach verdünnt. Ein Tropfen dieser Verdünnung wird auf ein Gitter des Elektronen mikroskops plaziert und mit einem angemessenen Film überdeckt, z. B. mit einem Film aus Formavar^R. Unmittel bar danach wird auf dasselbe Gitter ein Tropfen einer Phosphorwolframatsäure-Lösung mit 2 Gew.-% aufgebracht, die sofort angefertigt und aufgebracht und auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert ist. Das Ganze wird mit Luft getrocknet und durch Transmissionsmikroskopie ge prüft.

Die Kontrolle mit der Elektronenmikroskopie zeigt, daß die Liposomen gut geformt verbleiben und daß sie ohne Schwierigkeiten wieder mit Wasser in Berührung gebracht werden können. Das Passieren einer Gefrier trocknung gestattet einerseits eine unbegrenzte Kon servierung des Komplexes und andererseits von sehr konzentrierten Pasten von Liposom und Atelokollagen, die unter einem reduzierten Volumen in den Organismus injiziert werden können.

Man kontrolliert die Stabilität der Liposomen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, indem diese Zu sammensetzungen einer Ultraschallbeanspruchung unter worfen werden.

Hierzu kann man die Zusammensetzung mit einer Homogeni siereinrichtung vom Typ "Ultra-Turax" rühren, die während einer Zeit von 1, 3 und 5 Minuten mit 22 000 U/min dreht.

Man führt einen Vergleich durch, indem eine wäßrige Lösung derselben Liposomen bei denselben Bedingungen unterworfen wird.

Die Elektronenmikroskopie der so behandelten Zusammen setzungen, d. h. der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die nach den Beispielen 1 und 2 erhalten wurden, und die Vergleichszusammensetzung, die durch eine wäßrige Lösung derselben Liposomen gebildet ist, ergibt, daß in der wäßrigen Lösung die Liposomen zunehmend zer fallen und zerstörte Membranen verursachen. Demgegenüber bleiben in den erfindungsgemäßen stabilisierenden Träger substanzen die Liposombläschen (-vesikeln) selbst am Ende der 5minütigen Behandlung gut geformt.

Die Erfindung ermöglicht es daher, die Liposomen zu stabilisieren, indem die innewohnenden Vorteile bei der Verwendung einer Lösung mit großer Fluidität bzw. Dünnflüssigkeit ganz beibehalten werden, wie es weiter oben erläutert worden ist.

Beispiel 4

Pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung.

Man kann eine nach den Beispielen 1 und 2 erhaltene Zusammensetzung als pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung verwenden. Selbstverständlich ist es in diesem Falle gewöhnlich notwendig, in die Liposomen einen aktiven (Grund-)Bestandteil, sei es in der Liposom membrane, sei es im Innern des Liposoms, in Abhängig keit von der hydrophoben oder hydrophilen Eigenschaft der aktiven Substanz einzukapseln, gemäß einem Vorgehen, das außerdem im Beispiel 1 am Ende des Abschnittes a) erwähnt und das dem Fachmann gut bekannt ist.

Man kann ebenfalls verschiedene Bindemittel und andere aktive Komponenten hinzufügen, wie es gewünscht wird, unter der Bedingung, daß die Stabilisierungswirkung der erfindungsgemäßen Trägersubstanz nicht zerstört wird, was gut verständlich ist.

Beispiel für eine Zusammensetzung in emulgierter Form

Diese Zusammensetzung weist im Rohzustand folgende Rezeptur auf, wobei die Prozentangaben in Gewichts prozent ausgedrückt sind:


Gew.-%
Polyoxypropylen 15 (POP) - Stearylalkohol	4
Natriumstearoyl-2-Lactylat	4
fetter Polyoxyethylensäureester	3
Glyzerolstearat	3
Propylenglykoldioctonat	2
Methylparabenzoat	0,3
Propylenglykol	2
Allantoin	0,2
Carboner 940®	0,2
Triethanolamin	0,5
Liposomen-"Komplexe" in der erfindungsgemäßen stabilisierenden Atelokollagen-Glykosaminoglykan-Trägersubstanz	30
reines Wasser	50,8
	100%

Die Zubereitung dieser Zusammensetzung in emulgierter Form wird in folgender Weise hergestellt.

Ganz zuerst präpariert man auf herkömmliche Weise eine Emulsion in dem reinen Wasser aus allen Komponenten außer den Liposomen-"Komplexen" in der stabilisierenden Trägersubstanz aus Atelokollagen-Glykosaminoglykan, gemäß der Erfindung.

Wenn diese Emulsion einmal gebildet ist, gibt man die Liposomen-"Komplexe" in die erfindungsgemäße stabili sierende Trägersubstanz aus Atelokollagen-Glykosamino glykan, so wie sie nach dem Beispiel 1 oder 2 zubereitet ist, unter Rühren hinzu, was während einer Stunde bei behalten wird, wobei die Temperatur auf unterhalb 30°C gehalten werden muß.

Man erhält auf diese Weise eine Zusammensetzung in emul gierter Form, in der die Liposomen stabil sind.

Diese Stabilität wurde durch Elektronenmikroskopie kontrolliert, was ein bemerkenswertes Resultat dieser Erfindung darstellt.

Selbstverständlich enthält die vorliegende Erfindung alle Mittel, die äquivalente Techniken der beschriebe nen Mittel sowie ihrer diversen Kombinationen bilden. Beispielsweise ist es gut verständlich, daß der Ausdruck "Glykosaminoglykan" nicht vollkommen streng (eng) ge sehen werden darf und daß er in äquivalenter Weise die Mucopolysaccharide einschließt, weil die Glykosamino glykane Polymere sind, die von Disaccharideinheiten ge bildet sind, welche in linearer Form angeordnet sind, gebildet im allgemeinen aus einer Uronsäure und einem Hexosamin. Auf diese Weise sind die Mukopolysaccharide in der Definition der Glykosaminoglykane eingeschlossen.

Ebenso muß Atelokollagen verstanden werden als Kollagen, das von seinen Telopeptiden befreit ist, was für den Fachmann ganz genau ein entnetztes Kollagen bildet.

Es sei schließlich beachtet, daß die erfindungsgemäße Kombination von Glykosaminoglykanen mit dem Atelokolla gen es gestattet, eine stabilisierende Trägersubstanz in Form einer Lösung mit einem pH-Wert zu präparieren, der in der Nähe der Neutralität liegt, ohne daß sich ein Niederschlag des Atelokollagen erzeugen kann. Außer dem gestattet es die erfindungsgemäße Trägersubstanz, Emulsionen ohne Probleme zuzubereiten, was einen der technischen Vorteile bildet, die für die Erfindung aus schlaggebend sind.

Ferner unterdrücken die Glykosaminoglykane praktisch vollkommen die restliche Antigenizität des Atelokolla gens.

Ferner bleibt noch festzustellen, daß die erfindungs gemäß erhaltene vollkommene Zusammenstellung gefrier getrocknet werden kann, was zu einem ausschlaggebenden industriellen Vorteil führt.

Claims

1. Verfahren zur Stabilisierung von hydrierten, lipi dischen, lamellierten Phasen, beispielsweise Lipi somen, das die Einführung dieser hydrierten, lipi dischen, lamellierten Phase in eine stabilisierende Trägersubstanz beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Trägersubstanz auf folgende Weise zubereitet wird:.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung hergestellt wird, indem die Lösung aus Glykosaminoglykanen in die Atelokollagenlösung eingeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Lösung aus Glykosaminoglykanen dadurch hergestellt wird, daß eine Glykosaminoglykan lösung in einer basischen wäßrigen Lösung angesetzt wird, deren pH-Wert in der Weise gesteuert wird, daß nach dem Mischen mit der Atelokollagenlösung der pH-Wert der die stabilisierende Trägersubstanz bil denden Mischung leicht basisch bleibt, wobei er ganz in der Nähe der Neutralität liegt und dieser End-pH- Wert vorzugsweise in der Nähe von 8 liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese basische wäßrige Lösung eine wäßrige Sodalösung ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Glykosamino glykan in der Glykosaminoglykanlösung 0,5 bis 4%, besser 0,5 bis 2% und besonders bevorzugt im Bereich von 1% liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Atelokollagenlösung eine wäßrige Atelokollagenlösung ist, die vorzugsweise eine Konzentration zwischen 0,5 und 2 Gew.-% und vorzugsweise im Bereich von 1 Gew.-% besitzt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Atelokollagenlösung durch eine Auflösung von Atelokollagenfasern in einer leicht sauren wäßrigen Lösung erhalten wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Atelokollagenfasern in einer Lösung mit Essigsäure von 0,1 M angesetzt werden.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß das Kollagen durch eine enzymati sche Kollagendigestion erhalten wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrierten, lipidischen, lamellierten Phasen, beispielsweise Liposomen, in die zubereitete Lösung der stabilisierenden Träger substanz eingeführt wird, wobei die Volumen etwa gleich sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der lipidischen lamellierten Phasen, beispielsweise Liposomen, etwa 1% der ferti gen Zusammensetzung darstellt.

12. Zusammensetzung, die hydrierte, lipidische, lamellier te Phasen, beispielsweise Liposomen, enthält, die durch Gegenwart einer stabilisierenden Trägersubstanz stabilisiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Trägersubstanz in Form einer Lösung ist, die eine Mischung aus Atelokollagen und Glyko saminoglykanen enthält.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekenn zeichnet, daß die verwendeten Glykosaminoglykane ausgewählt sind unter den Struktur-Glykosaminoglyka nen, insbesondere Hyaluronsäure, Chondroitin-4-Sulfat, Chondroitin-6-Sulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Keratansulfat, oder den Sekretions-Glykosaminoglyka nen, insbesondere Heparin und seinen Derivaten, sowie den Mucoitinsulfaten.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das relative Verhältnis von Glykosaminoglykan gegenüber Atelokollagen 18 bis 25 Gew.-% von Glykosaminoglykanen gegenüber Atelokolla gen beträgt.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung der stabili sierenden Trägersubstanz einen leicht basischen pH-Wert besitzt, wobei er nahe der Neutralität, vor zugsweise in der Größenordnung von 8 liegt.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Zusammensetzung dadurch erhalten wird, daß im wesentlichen gleiche Volumen von Lösungen der hydrierten, lipidischen, lamellierten Phasen, beispielsweise Liposomen, und von Lösungen der stabilisierenden Trägersubstanz gemischt werden.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß diese Zusammensetzung in gefriergetrockneter (lyophilisiert) Form ist.

18. Anwendung der Zusammensetzung, wie sie in einem der Ansprüche 12 bis 17 definiert oder durch das Ver fahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 erhalten wird, in der Pharmazie oder Kosmetologie, in Form einer pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammen setzung.

19. Anwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung unverändert verwendet wird oder auch verschiedene geeignete Komponenten oder Bindemittel enthält.