CA1330650C - Procede de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple de liposomes, composition de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple des liposomes, stabilisees par un emploi d'un support stabilisant a base d'atelocollagene et de glycosaminoglycannes, et utilisation en pharmacie ou en ... - Google Patents
Procede de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple de liposomes, composition de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple des liposomes, stabilisees par un emploi d'un support stabilisant a base d'atelocollagene et de glycosaminoglycannes, et utilisation en pharmacie ou en ...Info
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Abstract
BREVET D'INVENTION Procédé de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple de liposomes, composition de phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, stabilisées par un emploi d'un support stabilisant à base d'atélocollagène et de glycosaminoglycannes, et utilisation en pharmacie ou en cosmétologie. L'invention concerne un procédé de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple de liposomes Cette composition contient des phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, stabilisées par la présence d'un support stabilisant et est caractérisée en ce que le support stabilisant est sous forme d'une solution contenant un mélange d'atélocollagène et de glycosaminoglycannes. La proportion relative est de préférence de 18 à 25 % en poids de glycosaminoglycannes par rapport à l'atélocollagène. L'utilisation préférée de cette composition est en pharmacie ou en cosmétologie.
Description
Procédé de stabilisation de phases lameLlaires lipidiques hydra-tées, par exemple de liposomes, composition de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple des liposomes, stabilisées par un emploi d'un support stabilisant a base d'atelocollagène et de 05 glycosaminoglycannes, et utilisation en pharmacie ou en cosmétolo-gie.
La presente invention concerne essent;ellement un procédé
de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple de liposomes, une composition et phases lamellaires lipi-diques hydratées, par exemple des liposomes stabilisés par un emploi d'un support stabilisant a base d'atélocollagene et de glycosaminoglycannes ét l'utilisation en pharmacie ou ~cosmétologie On conna;t depuis BANGHAM les phases lamellaires lipi-diques hydratées dont une forme particuliere est constituée par des liposomes (voir BA~GHAM et al. Journal of Molecular Biology, 13 : 238 ; 253 (196~) ou encore BANGHAM et al. Chem. Phys. Lipids.
1 : 255 (1~67)). De nombreux autres articles sur les liposomes ont eté publiés (voir PAPAHADJOPOULOS, ~iochim. ~iophys~ Acta, 135 (1967), pages 624-~3~ ou WEISSMANN dans Journal of Lipids ~esearch, volume 9~ (1968), pages 310 à 318).
On sait que les liposomes, qui sont des capsules phospho-lipidiques, prennent de plus en plus d'importance en cosmetique et en pharmacie car iLs permettent le transport de substances actives vers les cellules par lesquelles ils sont absorbes. En effet, et ceci est connu depuis BANGHAM, la nature phospholipidique de leur membrane, ~tant très proche de celle des cellules, entraîne une fusion entre les deux enveloppes.
Malheureusement, les liposomes ont une faible stabilite, de sorte que leur ~éveloppement s'en trouve grandement freine, ce qui constitue un probleme majeur. Dans bien des cas, ces reservoirs constituant les liposomes, se désintegrent avant d'entrer en contact avec les cellules visees. De plus, leur integration dans un produit fini provoque relativement souvent une destruction des réservoirs. En particulier, en cosmétique, la réalisation d'une émulsion contenant des liposomes est extremement deLicate, la phase ~
grasse entraînant une ouverture de la membrane phospholipidique.
Aussi, de nombreux travaux sont consacrés a la stabilisation des liposomes par des substances qui doivent en outre être biocompa-tibles.
05 ûn a déjà proposé diverses solutions pour stabiliser les liposomes, notamment l'utilisation d'une forme gel, dans un hydro-colloide (C.A., volume 97, 1982, 188 156k en référence a un article paru dans J. Pharm. Pharmacol, 1982, 34, (7, 473-4) ; voir aussi le document WO 85/û364û, dans lequel on décrit un grand nombre de substances pouvant être utilisées comme gélifiant, notamment les carbohydra~es comme les celluloses, des gommes notamment lecarra-ghénane, le xanthane, le collagène, le polyacrylamide, des poly-siloxanes, des polymères d'aminoacides tels que de l'albumine gélifiée, la gélatine (page 13, lignes 20 à 35)).
L'utilisation de gel présente de nombreux inconvénients.
Tout d'abord, il complique sérieusement la préparation des compo-sitions, notamment des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques.
En effet, en raison des propriétés physiques des gels, et notamment de leur caractère non coulable, l'utilisation de gel pose de 2û sérieux problèmes de maniabilité. Enfin, en ce qui concerne plus particulièrement l'utilisation de collagène comme gel support, le collagène pr~sente une certaine antigénicité bien que celle-ci soit faible. Egalement, pour le cas du collagène, on utilise habituel-lement du collagène acido-soluble. Etant donné que la composition doit avoir un pH voisin de la neutralité pour la stabilité des liposomes ainsi que pour être proche du pH physiologique, dans le cas de l'emploi en cosm~tique, dans ces conditions de pH, le collagène acido-soluble précipite, et l'inclusion de liposomes devient impossible. On peut empêcher ce phénomène par des conditions de préparation très compliquées et coûteuses non applicables à l'échelle industrielle, incluant des conditions de température basse voisine de 4C. Ceci ne permet pas d'-envisager une fabrication industrielle à un faible coGt.
La présente invention a donc pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser les phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment les liposomes à l'aide d'un support stabili-sant qui se présente sous forme d'une solution suffisa~ment fluide pour éliminer tous les inconvénients inhérents à l'emploi de 05 supports stabilisants sous forme de gel.
La pr~sente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser les phases ~amellaires lipidiques hydratées, notamment les liposomes, par l'emploi d'un support sta-bilisant suffisamment fluide qui ne présente aucun caractèred'antigénicité et qui, au surplus, ne nécessite que la mise en oeuvre d'un procédé extrêmement simple, applicable industriellement dans des conditions opératoires simples, pouvant être variées relativement largement, permettant donc une reproductibilité prati-quement parfaite.
La présente invention a encore pour but de résoudre lenouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser des phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment des liposomes, par l'emploi d'un support stabilisant compatible avec la formation d'émulsions.
Tous ces problèmes techniques sont résolus pour la pre-mière fois par la présente invention d'une manière satis~aisante, utilisable industriellement.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un procédé de stabilisation de phase lamellaire lipidique hydratée, par exemple des liposomes, comprenant l'intrùduction de ladite phase lamellaire lipidique hydratée dans un support stabi-lisant, caractérisé en ce qu'on prépare ledit support stabilisant de la manière suivante :
a) ùn prépare séparément une solution d'atélocollagène, et une solution de glycosaminoglycannes ; puis b) on mélange ladite solution d'atélocollagène avec la solution de glycosaminoglycannes. ;~
Selon une première variante de réalisation du procédé
selon l'invention, ùn réalise le mélange en introduisant la solu-tion de glycosaminoglycannes dans la solution d'atélocollayène. :
Selon un mode de réalisation particulier, la solution deglycosaminoglycannes est préparée par mise en solution du glycos-aminoglycanne dans une solution aqueuse basique dont le pH est 05 réglé de sorte qu'après mélange avec la solution d'atélocollagène, le pH du mélange constituant le support stabilisant reste légère-ment basique tout en étant proche de la neutralité. De préférence, ce pH final est voisin de 8.
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, cette solution aqueuse basique est une solution aqueuse de soude.
Selon une autre caractéristique avantageuse, la concen-tration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminogly-cannes de 0,5 à 4 %, encore mieux, de û,5 à 2 %, et encore de préférence est voisine de 1 %.
Selon une autre caractéristique du procédé de l'inven-tion, la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant de préférence une concentration comprise entre 0,5 et 2 % en poids, et encore de préférence voisine de 1 %~
Cette solution d'atélocollagène peut être obtenue selon l'invention par dissolution de fibres d'atélocollagène dans une solution aqueuse légèrement acide.
Selon un mode de réalisation particulier, ces fibres d'atelocollagène sont mises en solution dans de l'acide acétique 0,1 M.
Selon un autre mode de réalisation particulier du procédé
selon l'invention, l'atélocollagène est obtenu par digestion enzy-matique de collagène.
Selon une autre caractéristique particulière du procédé
selon l'invention, les phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, sont introduites dans la solution de support stabilisant selon l'invention, selon des ~olumes sensiblement égaux.
Selon un exemple de réalisation particulier, la propor-- tion des phases lamellaires lipidiques, par exemple des liposomes, représente environ 1 % de la composition finale.
:
Selon un deuxième aspect, la présente invention fournit aussi une composition contenant des phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, stabilisées par la présence 05 d'un support stabilisant, caractérisée en ce que le support stabi-lisant est sous forme d'une solution contenant un mélange d'atélo-collagène et de glycosaminoglycannes.
Selon une variante de réalisation particulière, les glycosaminoglycannes utilisés sont choisis parmi les glycosamino-glycannes de structure, notamment l'acide hyaluronique, le chondro;tine-4 sulfate, le chondroitine-6 sulfate, le dermatane sulfate, l'héparane sulfate, le kératane sulfate ; ou les glycosaminoglycannes de sécrétion, en particulier l'héparine et ses dérivés ainsi que les muco;tines sulfate.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, celle-ci concerne les solutions d'atélocollagène et de glycosaminoglycannes de départ pour la préparation de la solution de mélange dont les caractéristiques ont été précédemment énoncées dans le procédé.
La proportion relative de glycosaminoglycannes vis-à-vis de l'atélocollagène est de préférence de 18 à 25 Y0 en poids de glycosaminoglycanne par rapport à l'atélocollagène.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, la solution de support stabilisant est à un pH légère-ment basique tout en étant voisin de la neutralité, de préférence de l'ordre de 8.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, cette composition est obtenue en mélangeant des volumes sensiblement égaux de solutions de phases lamellaires lipi-diques hydratées, par e~emple des liposomes, et de solutions de support stabilisant.
Une utilisation préférée des compositions selon l'inven~
tion concerne une utilisation en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de compositions pharmaceutiques ou cosmétiques. Pour ce faire, on peut utiliser la composition telle quelle ou bien lui :.,: ::
::
adjoindre divers composants ou excipients appropriés bien connus de l'homme de l'art, sans aucun probleme particulier, sous réserve de vérifier que cette adjonction ne modifie pas la stabilité des phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment des liposomes.
05Grâce a l'invention, on obtient de maniere totalement inattendue une diminution de l'antigénicite du support stabilisant.
On obtient en outre une amélioration marquée de la protection de l'un des composants du support stabilisant, a savoir l'atélocoLlagène vis-a-vis des collagenases entraînant un prolonge-10ment "in vivo" de l'effet retard de l'atélocollagène.
Ce support stabilisant presente une propriet~ hydratante accrue, une action plus marquée de régénération du derme et de l'epiderme par accroissement du developpement cellulaire.
Un autre avantage particulierement inattendu et d'une 15importance capitale pour une exploitation industrielle reside dans Le fait que l'atelocollagène utilise sous forme de solution selon la présente invention est melange de façon extrêmement simple avec les glyrosaminoglycannes, en aboutissant a;nsi à une simplification du procedé de stabilisation et donc au procédé de fabrication des 20compositions, que celles-ci soient à usage thérapeutique ou cos-metique. Ce support est compatible avec la formation d'émulsions.
En outre, l'emploi d'un support stabilisant sous forme de solution permet d'obtenir un caractere coulable très avantageux, comme cela est aisement compréhensible a l'homme du métier.
25On conçoit ainsi que l'invention apporte des ameliora-tions remarquables, déterminantes vis-à-vis de la technique anterieure.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'inven-tion appara;tront egalement clairement à la lumiere de la 30description explicative qui va suivre faite en reference a plusieurs exemples de realisation de composition selon l'invention, mettant en oeuvre le procédé selon l'invention précédemment decrit.
.~
ExempLe 1 Preparation d'une composition de liposome dans un support atélo-collagène-glycosaminoglycanne a) Preparation des grosses vesicules multilamellaires (M.L.V.) 05 La lecithine de soja est mise en solution chloroformique puis deposee sous forme d'un film mince sur les parois d'un ballon de verre par évaporation du solvant sous vide. De l'eau a la tempé-rature de 80C est alors versee dans le ballon et maintenu a cette temperature pendant 10 minutes sous agitation Vortex. La quantité
d'eau utilisée est telle que le mélange final renferme 1 % de lécithine. L'ensemble est alors laisse au repos à temperature ambiante jusqu'a obtenir le refroidissement complet. La solution contient alors 1 Y0 de phospholipide sous forme de liposomes MLV.
Si l'on veut encapsuler une substance hydrosoluble, celle-ci sera dissoute dans l'eau ajoutee au cours de la prépara-tion. Dans le cas d'un produit lipophi(e a introduire dans la membrane, celui-ci devra être incorpore dans la phase chloro-formique renfermant le phospholipide.
b) Préparation du collagene déréticule ou atélocollagene La peau de veau fraîchement abattu est soumise a épila-tion chimique dans un bain contenant 3 % de sulfure de sodium et 4 % de chaux, la proportion etant de 100 g de peau pour 200 cm3 de solution. Le derme est alors isole du reste de la peau par une operation de refendage grâce a une scie tournante à ruban.
Le tissu obtenu est broy~ et extrudé a travers une grille ~;
comportant des trous de 4 mm. Le broyat est alors mis en contact pendant 3 semaines avec un lait de chaux saturé a raison de 1 kg pour 4 l de solution. La peau ainsi traitee est séparee du surna-geant par une centrifugation en continue sous une accélération de 2000 g a l'aide d'une décanteuse tournant à 4000 tr/min. Le culot est ensuite soumis à deux lavages a l'eau courante dans une cuve inox sous agitation lente à raison de 1 kg pour 4 l de bain. Le broyat est alors soumis à deux traitements du tampon phosphate pH 7,~ (21,7 g/l de Na2HP04 et 0,7~ g/l de KH2P04) dans les mêmes conditions que pour le lavage a l'eau. Le culot est alors lavé par ~:, ~: .
deux bains d'eau désionisée et sterile. Le broyat obtenu est place dans une solution d'acide acétique (0,5 g/l, pH 3,4~ a raison de 1 kg pour 20 l de bain. Après 5 minutes d'agitation, Le surnageant est separé du cuLot par décantation en continu selon la technique 05 precedente. Le collagene est alors précipité par le surnageant par addition de chlorure de sodium sec dans une proportion de 10 %
environ par rapport au bain. Aprés decantation par gravité, les fibres obtenues sont dialysees contre de l'eau désionisée et sterile a l'aide de membranes de dialyse, de preférence formees par des boyaux dont le seuil de coupure est compris entre 6000 et 8000 daltons. Après avoir verifié par le nitrate d'argent que les fibres dialysees ne contenaient plus de chlorure de sodium, celles-ci sont mises en solution dans un bain renfermant 6 g/l d'acide acétique de facon a obtenir une concentration finale de 1 %
en protéine. L'ensemble est agite sous agitation lente pendant 24 heures.
c) Préparation du chondroïtine-4 sulfate Des cloisons nasales de veau debarrassées des tissus musculaires et adipeux sont hachées et broyees par extrusion à
travers une grille comportant des trous de 4 mm ; le broyat est place pendant 24 heures à une temperature de 6C dans un tampon de chlorure de potassium (11,8 g/l de KCl, 78,8 mg/l de cystéine, ETDA
180 mg/l) renfermant 1 % de papaïne "MERCK". La proportion etant de 130 9 de broyat pour 1 l de tampon.
Le surnageant est séparé du culot par centrifugation en continu à l'aide d'une decanteuse tournant a 4000 tr/min. Au surna-geant sont alors ajoutes 40 g/l d'acide trichloracétique. Le precipite est eliminé par centrifugation en continue selon la technique précédente. Le surnageant est neutralise à l'aide de soude en pastille. Le mélange est alors dialyse contre de l'eau désionisée et stérile a l'aide de boyaux dont le seuil de coupure est compris entre 6 et 8000 daltons. La solution dialysee est lyophilisee. Le chondroïtine-4 sulfate est obtenu à l'état sec.
r d) Préparation du méLange ateLocoLLagène-chondro;tine-4 sulfate Le mucopolysaccharide est mis en solution a une concen-trat;on de 1 % dans un bain renfermant de la soude. Cette solution est ajoutee sous agitation Lente a La soLution d'aterocoLlagene 05 contenant 1 % de proteine et dans La proportion de 250 ml pour 1 de solution colLagenique. La quantité de soude est teLLe que Le pH
final est de 8.
e) Préparation de la composition de liposome-atérocoLLagene-chondro;tine-4 suLfate La soLution aqueuse de liposome a 2 % de lécithine de soja est introduite sous agitation lente dans le melange atélo-colLagène chondro;tine-4 sulfate, les volumes de soLution colla-gén;que étant égaux, Le compLexe finaL renferme 1 % de Lécithine.
Exe~ple 2 Preparation d'une composition de liposome dans un support atélo-collagène-glycosaminoglycanne a) Preparation de liposome SUV (petites vesicules unilamellaires) La lecithine d'oeuf est dissoute dans l'éthanoL a une concentration de 30 mmoL/L. La solution alcoolique est aLors ajoutée à une solution de chLorure de potassium 0,15 M. Des vesi-cules unilamellaires se forment alors. La suspension est ensuite dialysee pour éliminer l'alcool résiduel et peut être concentree jusqu'a 2 % par ultrafiLtration.
b) Préparation du collagene déreticule ou atelocollagene Le broyat de peau de veau est obtenu de la même façon que dans l'exemple precédent. Le broyat est alors soumis à deux traite~
ments au tampon phosphate pH 7,8 t21,7 h/L de Na2HP04 et 0,79 g/L
de KH2P04). La concentration en broyat est de 1 kg pour 1 l de bain. Après chaque traitement, le residu est récupéré par centri-gation en continu grace à une décanteuse tournant a 4000 tr/min et donnant une acceleration de 2000 g. Après lavage au tampon phosphate, le broyat est lavé par deux bains d'eau désionisée et stérile dans les mêmes conditions que précedemment.
Le broyat est alors place a raison de 200 gtL dans une solution d'acide chlorhydrique 0,01 N contenant 7,5 % de pepsine par rapport au collagène. L'ensemble est laissé au repos pendant 24 heures à température ambiante. Au bout de ce laps de temps, une quantité complémentaire de pepsine de 7,5 ~ par rapport au collagène est ajoutée au bain et l'ensemble est laissé au repos 05 dans les mê~es conditions que précédemment.
Le surnageant est séparé du culot par centrifugation en continu selon la technique précédente. Dans le surnageant est versé
du chlorure de sodium de façon à obtenir une concentration de lû %.
Par une centrifugation en continu, les fibres sont isolées et placées dans des tubes de dialyse Visking (r~f. 30/32). Après éli-mination totale du chlorure de sodium, les fibres sont mises en solution dans l'acide acétique û,1 M de façon à obtenir une concen-tration de 1 % de collagène.
c) Pr~paration du dermatane sulfate La peau de porc débarrassée de manière classique par refente de la couche cornée et des tissus sous-cutanés est hachée et broyée par extrusion à travers une grille comportant des trous de 4 mm~
Le broyat est ensuite lavé par un mélange chloroforme-méthanol (proportion en volume 2/1). Après évaporation du solvant sous vide, le résidu sec est traité comme le broyat des cloisons nasales dans l'exemple 1, le dermatane sulfate est obtenu à l'état sec.
d) Préparation du mélange atélocollagène-dermatane sulfate Le mucopolysaccharide est mis en solution à une concen-tration de 1 % dans un bain renfermant de la soude. Cette solution est ajoutée sous agition lente à la solution d'atélocollagène contenant 1 % de protéina dans la proportion de 3ûû ml pour 1 l de solution collagénique. La quantité de soude est telle que le pH
final est de 8.
e) Préparation du complexe liposome-atélocollagène-dermatane sulfate La solution aqueuse de liposome à 2 % de lécithine d'oeuf et introduite sous agitation lente dans le mélange atélocollagène-dermatane sulfate. Les volumes des solutions collagénique et lipo-somique étant égaux, le complexe final renferme 1 % de lécithine.
Exemple 3 Essai de contrôle de stabilité des liposomes dans leur support de .. . .
l'invention atélocollagène-glycosaminoglycanne 05 Le contrôle de la présence de la qualité des liposomes est effectue par microscopie électronique. Pour cela, les prépara-tions préparées conformément aux exemples 1 et 2, contenant 1 % de lécithine sont diluées 10 fois. Une goutte de cette dilution est placée sur une grille de microscopie électronique revêtue d'un film lû adéquat, par exemple un film de FormavarR. Immédiatement après, sur la même grille est ajoutée une goutte de solution d'acide phospho-tungstique à 2 % en poids préparée extemporanément et neutralisée à
pH 7. L'ensemble est séché à l'air et examiné par microscopie à
transmission.
Le contrôle à microscopie électronique montre que les liposomes restent bien formés et qu'ils peuvent etre remis en contact avec l'eau sans difficulté. Le passage par la lyophilisation permet d'une part une conservation illimitée du complexe et, d'autre part la préparation de pâtes très concentrées en liposome et en atélocollagène pouvant être injectées dans l'organisme SOU5 un volume réduit.
ûn v~rifie la stabilité des liposomes dans les composi~
tions selon l'invention en soumettant ces compositions à une con-trainte ultrasonique.
Pour cela, on peut agiter la composition avec un homogé-néiseur type "Ultra-Turax" tournant à 22000 tr/min pendant des temps de 1,3 et 5 minutes.
ûn a effectué une comparaison en soumettant une solution aqueuse des mêmes liposomes aux mêmes conditions.
La microscopie électronique des compositions ainsi traitées, à savoir les compositions selon l'invention obtenues aux exemples 1 et 2 et la composition comparative formée par une solu-tion aqueuse des mêmes liposomes, fait ressortir que dans la solution aqueuse les liposomes se désagrègent progressivement donnant naissance a des membranes désorganisées. Au contraire, dans :
12 l 330650 les supports stabilisants selon l'invention, les vésicules de liposome restent bien formées, meme au bout de 5 minutes de trai-tement.
L'invention permet donc de stabiliser les liposomes tout 05 en conservant les avantages inhérents 3 l'emploi d'une solution d'une grande fluidité, comme précédemment énoncé
Exemple 4 Composition pharmaceutique ou cosmétique On peut utiliser une composition obtenue aux exemples et 2 comme composition pharmaceutique ou cosmétique. Naturellement, dans ce cas, il est habituellement nécessaire d'encapsuler dans les liposomes un principe actif, soit dans la membrane du liposome, soit à l'intérieur du liposome en fonction du caractere hydrophobe ou hydrophile de la substance active, selon la procédure qui est d'ailleurs mentionnée à l'exemple 1 à la fin du paragraphe a) et qui est bien connue à l'homme du métier.
On peut également ajouter divers excipients ou d'autres composants actifs comme cela est souhaité, à condition qu'ils ne détruisent pas l'effet de stabilisation du support selon l'inven-tion, comme cela est bien compréhensible .
,. . . /
~` ~
Exemple de composition sous forme émulsionnée Cette composition présente à l'état brute la formula-tion suivante, les pourcentages étant exprimés en poids:
% en poids Poplyoxypropylène 15 (POP) - Alcool stéarylique 4 St~aroyle-2-lactylate de sodium 4 Ester d'acide gras polyoxy ethyléné 3 Stéarate de glycérol 3 Dioctonate de propylène glycol 2 Parabenzoate de m~thyle 0,3 Propylène glycol 2 Allantoine 0,2 Carboner 940 ~ 0,2 Triéthanolamine 0,5 "Complexe" de liposomes dans le support Stabilisant atélocollagene-glycosaminoglycanne selon l'invention .................................... 30 Eau purifiée 50,8 100 %
La préparation de cette composition sous forme émulsionnée est réalisée de la manière suivante.
Tout d'abord, on prépare une émulsion dans l'eau purifiée de tous les composants autres que le "complexe" de liposomes dans le support stabilisant atélocollagène~
glycosaminoglycanne, selon l'invention, de manière classique.
Une fois que cette émulsion est formée, on ajoute le "complexe" de liposomes dans le support stabilisant atélocol- ;
lagène-glycosaminoglycanne selon l'invention, tel que préparé -~:
selon l'exemple 1 ou 2, sous agitation qui est maintenue pendant ..
une heure, la température devant ~tre maintenue inf~rieure à
30C.
On obtient ainsi une composition sous forme émulsionnée dans laquelle les liposomes sont stables.
~.~.d.~
:':' : ' . .. : ,' . ". . :.' .. . , . : : ' . : ' ,! ' ' .'. " ' ' ' ' ' : ' :
14 l 330650 Cette stabilité a été contrôlée par microscopie électronique, ce qui constitue un résultat remarquable de l'invention.
Naturellement, la présente in~ention comprend tous les 05 moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs diverses combinaisons. Par exemple, il est bien clair que le terme "glycosaminoglycanne" ne doit pas être inter-prété strictement et qu'il inclut de manière équi~alPnte les muco-polysaccharides étant donné que les glycosaminoglycannes sont des polymères constitués d'unités disaccharidiques disposées de façon linéaire formées en général d'un acide uronique et d'une hexos-amine. Ainsi, les mucopolysaccharides sont inclus dans la défini-tion des glycosaminoglycannes.
De même, l'atélocollagène doit être entendu comme étant du collagène débarrassé de ses télopeptides, ce qui constitue un collagène déréticulé bien précis pour 1'homme de 1'art.
Il est à observer enfin que la combinaison selon l'in~en-tion de glycosaminoglycannes avec de l'atélocollagène permet de préparer un support stabilisant sous forme de solution à un pH
voisin de la neutralité sans qu'une précipitation de l'atélocolla-gène ne puisse se produire. En outre, le support selon l'invention permet de préparer sans problème des émulsions ; ce qui constitue un des a~antages techniques déterminants de l'in~ention, De plus, les glycosaminoglycannes suppriment pratiquement totalement l'antigénicité résiduelle de l'atélocollagène.
Il est à noter encore que la composition complète obtenue selon l'in~ention peut être lyophilisée, ce qui constitue un ' a~antage 1ndustriel déterminant.
o~
La presente invention concerne essent;ellement un procédé
de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple de liposomes, une composition et phases lamellaires lipi-diques hydratées, par exemple des liposomes stabilisés par un emploi d'un support stabilisant a base d'atélocollagene et de glycosaminoglycannes ét l'utilisation en pharmacie ou ~cosmétologie On conna;t depuis BANGHAM les phases lamellaires lipi-diques hydratées dont une forme particuliere est constituée par des liposomes (voir BA~GHAM et al. Journal of Molecular Biology, 13 : 238 ; 253 (196~) ou encore BANGHAM et al. Chem. Phys. Lipids.
1 : 255 (1~67)). De nombreux autres articles sur les liposomes ont eté publiés (voir PAPAHADJOPOULOS, ~iochim. ~iophys~ Acta, 135 (1967), pages 624-~3~ ou WEISSMANN dans Journal of Lipids ~esearch, volume 9~ (1968), pages 310 à 318).
On sait que les liposomes, qui sont des capsules phospho-lipidiques, prennent de plus en plus d'importance en cosmetique et en pharmacie car iLs permettent le transport de substances actives vers les cellules par lesquelles ils sont absorbes. En effet, et ceci est connu depuis BANGHAM, la nature phospholipidique de leur membrane, ~tant très proche de celle des cellules, entraîne une fusion entre les deux enveloppes.
Malheureusement, les liposomes ont une faible stabilite, de sorte que leur ~éveloppement s'en trouve grandement freine, ce qui constitue un probleme majeur. Dans bien des cas, ces reservoirs constituant les liposomes, se désintegrent avant d'entrer en contact avec les cellules visees. De plus, leur integration dans un produit fini provoque relativement souvent une destruction des réservoirs. En particulier, en cosmétique, la réalisation d'une émulsion contenant des liposomes est extremement deLicate, la phase ~
grasse entraînant une ouverture de la membrane phospholipidique.
Aussi, de nombreux travaux sont consacrés a la stabilisation des liposomes par des substances qui doivent en outre être biocompa-tibles.
05 ûn a déjà proposé diverses solutions pour stabiliser les liposomes, notamment l'utilisation d'une forme gel, dans un hydro-colloide (C.A., volume 97, 1982, 188 156k en référence a un article paru dans J. Pharm. Pharmacol, 1982, 34, (7, 473-4) ; voir aussi le document WO 85/û364û, dans lequel on décrit un grand nombre de substances pouvant être utilisées comme gélifiant, notamment les carbohydra~es comme les celluloses, des gommes notamment lecarra-ghénane, le xanthane, le collagène, le polyacrylamide, des poly-siloxanes, des polymères d'aminoacides tels que de l'albumine gélifiée, la gélatine (page 13, lignes 20 à 35)).
L'utilisation de gel présente de nombreux inconvénients.
Tout d'abord, il complique sérieusement la préparation des compo-sitions, notamment des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques.
En effet, en raison des propriétés physiques des gels, et notamment de leur caractère non coulable, l'utilisation de gel pose de 2û sérieux problèmes de maniabilité. Enfin, en ce qui concerne plus particulièrement l'utilisation de collagène comme gel support, le collagène pr~sente une certaine antigénicité bien que celle-ci soit faible. Egalement, pour le cas du collagène, on utilise habituel-lement du collagène acido-soluble. Etant donné que la composition doit avoir un pH voisin de la neutralité pour la stabilité des liposomes ainsi que pour être proche du pH physiologique, dans le cas de l'emploi en cosm~tique, dans ces conditions de pH, le collagène acido-soluble précipite, et l'inclusion de liposomes devient impossible. On peut empêcher ce phénomène par des conditions de préparation très compliquées et coûteuses non applicables à l'échelle industrielle, incluant des conditions de température basse voisine de 4C. Ceci ne permet pas d'-envisager une fabrication industrielle à un faible coGt.
La présente invention a donc pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser les phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment les liposomes à l'aide d'un support stabili-sant qui se présente sous forme d'une solution suffisa~ment fluide pour éliminer tous les inconvénients inhérents à l'emploi de 05 supports stabilisants sous forme de gel.
La pr~sente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser les phases ~amellaires lipidiques hydratées, notamment les liposomes, par l'emploi d'un support sta-bilisant suffisamment fluide qui ne présente aucun caractèred'antigénicité et qui, au surplus, ne nécessite que la mise en oeuvre d'un procédé extrêmement simple, applicable industriellement dans des conditions opératoires simples, pouvant être variées relativement largement, permettant donc une reproductibilité prati-quement parfaite.
La présente invention a encore pour but de résoudre lenouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser des phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment des liposomes, par l'emploi d'un support stabilisant compatible avec la formation d'émulsions.
Tous ces problèmes techniques sont résolus pour la pre-mière fois par la présente invention d'une manière satis~aisante, utilisable industriellement.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un procédé de stabilisation de phase lamellaire lipidique hydratée, par exemple des liposomes, comprenant l'intrùduction de ladite phase lamellaire lipidique hydratée dans un support stabi-lisant, caractérisé en ce qu'on prépare ledit support stabilisant de la manière suivante :
a) ùn prépare séparément une solution d'atélocollagène, et une solution de glycosaminoglycannes ; puis b) on mélange ladite solution d'atélocollagène avec la solution de glycosaminoglycannes. ;~
Selon une première variante de réalisation du procédé
selon l'invention, ùn réalise le mélange en introduisant la solu-tion de glycosaminoglycannes dans la solution d'atélocollayène. :
Selon un mode de réalisation particulier, la solution deglycosaminoglycannes est préparée par mise en solution du glycos-aminoglycanne dans une solution aqueuse basique dont le pH est 05 réglé de sorte qu'après mélange avec la solution d'atélocollagène, le pH du mélange constituant le support stabilisant reste légère-ment basique tout en étant proche de la neutralité. De préférence, ce pH final est voisin de 8.
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, cette solution aqueuse basique est une solution aqueuse de soude.
Selon une autre caractéristique avantageuse, la concen-tration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminogly-cannes de 0,5 à 4 %, encore mieux, de û,5 à 2 %, et encore de préférence est voisine de 1 %.
Selon une autre caractéristique du procédé de l'inven-tion, la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant de préférence une concentration comprise entre 0,5 et 2 % en poids, et encore de préférence voisine de 1 %~
Cette solution d'atélocollagène peut être obtenue selon l'invention par dissolution de fibres d'atélocollagène dans une solution aqueuse légèrement acide.
Selon un mode de réalisation particulier, ces fibres d'atelocollagène sont mises en solution dans de l'acide acétique 0,1 M.
Selon un autre mode de réalisation particulier du procédé
selon l'invention, l'atélocollagène est obtenu par digestion enzy-matique de collagène.
Selon une autre caractéristique particulière du procédé
selon l'invention, les phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, sont introduites dans la solution de support stabilisant selon l'invention, selon des ~olumes sensiblement égaux.
Selon un exemple de réalisation particulier, la propor-- tion des phases lamellaires lipidiques, par exemple des liposomes, représente environ 1 % de la composition finale.
:
Selon un deuxième aspect, la présente invention fournit aussi une composition contenant des phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, stabilisées par la présence 05 d'un support stabilisant, caractérisée en ce que le support stabi-lisant est sous forme d'une solution contenant un mélange d'atélo-collagène et de glycosaminoglycannes.
Selon une variante de réalisation particulière, les glycosaminoglycannes utilisés sont choisis parmi les glycosamino-glycannes de structure, notamment l'acide hyaluronique, le chondro;tine-4 sulfate, le chondroitine-6 sulfate, le dermatane sulfate, l'héparane sulfate, le kératane sulfate ; ou les glycosaminoglycannes de sécrétion, en particulier l'héparine et ses dérivés ainsi que les muco;tines sulfate.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, celle-ci concerne les solutions d'atélocollagène et de glycosaminoglycannes de départ pour la préparation de la solution de mélange dont les caractéristiques ont été précédemment énoncées dans le procédé.
La proportion relative de glycosaminoglycannes vis-à-vis de l'atélocollagène est de préférence de 18 à 25 Y0 en poids de glycosaminoglycanne par rapport à l'atélocollagène.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, la solution de support stabilisant est à un pH légère-ment basique tout en étant voisin de la neutralité, de préférence de l'ordre de 8.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, cette composition est obtenue en mélangeant des volumes sensiblement égaux de solutions de phases lamellaires lipi-diques hydratées, par e~emple des liposomes, et de solutions de support stabilisant.
Une utilisation préférée des compositions selon l'inven~
tion concerne une utilisation en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de compositions pharmaceutiques ou cosmétiques. Pour ce faire, on peut utiliser la composition telle quelle ou bien lui :.,: ::
::
adjoindre divers composants ou excipients appropriés bien connus de l'homme de l'art, sans aucun probleme particulier, sous réserve de vérifier que cette adjonction ne modifie pas la stabilité des phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment des liposomes.
05Grâce a l'invention, on obtient de maniere totalement inattendue une diminution de l'antigénicite du support stabilisant.
On obtient en outre une amélioration marquée de la protection de l'un des composants du support stabilisant, a savoir l'atélocoLlagène vis-a-vis des collagenases entraînant un prolonge-10ment "in vivo" de l'effet retard de l'atélocollagène.
Ce support stabilisant presente une propriet~ hydratante accrue, une action plus marquée de régénération du derme et de l'epiderme par accroissement du developpement cellulaire.
Un autre avantage particulierement inattendu et d'une 15importance capitale pour une exploitation industrielle reside dans Le fait que l'atelocollagène utilise sous forme de solution selon la présente invention est melange de façon extrêmement simple avec les glyrosaminoglycannes, en aboutissant a;nsi à une simplification du procedé de stabilisation et donc au procédé de fabrication des 20compositions, que celles-ci soient à usage thérapeutique ou cos-metique. Ce support est compatible avec la formation d'émulsions.
En outre, l'emploi d'un support stabilisant sous forme de solution permet d'obtenir un caractere coulable très avantageux, comme cela est aisement compréhensible a l'homme du métier.
25On conçoit ainsi que l'invention apporte des ameliora-tions remarquables, déterminantes vis-à-vis de la technique anterieure.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'inven-tion appara;tront egalement clairement à la lumiere de la 30description explicative qui va suivre faite en reference a plusieurs exemples de realisation de composition selon l'invention, mettant en oeuvre le procédé selon l'invention précédemment decrit.
.~
ExempLe 1 Preparation d'une composition de liposome dans un support atélo-collagène-glycosaminoglycanne a) Preparation des grosses vesicules multilamellaires (M.L.V.) 05 La lecithine de soja est mise en solution chloroformique puis deposee sous forme d'un film mince sur les parois d'un ballon de verre par évaporation du solvant sous vide. De l'eau a la tempé-rature de 80C est alors versee dans le ballon et maintenu a cette temperature pendant 10 minutes sous agitation Vortex. La quantité
d'eau utilisée est telle que le mélange final renferme 1 % de lécithine. L'ensemble est alors laisse au repos à temperature ambiante jusqu'a obtenir le refroidissement complet. La solution contient alors 1 Y0 de phospholipide sous forme de liposomes MLV.
Si l'on veut encapsuler une substance hydrosoluble, celle-ci sera dissoute dans l'eau ajoutee au cours de la prépara-tion. Dans le cas d'un produit lipophi(e a introduire dans la membrane, celui-ci devra être incorpore dans la phase chloro-formique renfermant le phospholipide.
b) Préparation du collagene déréticule ou atélocollagene La peau de veau fraîchement abattu est soumise a épila-tion chimique dans un bain contenant 3 % de sulfure de sodium et 4 % de chaux, la proportion etant de 100 g de peau pour 200 cm3 de solution. Le derme est alors isole du reste de la peau par une operation de refendage grâce a une scie tournante à ruban.
Le tissu obtenu est broy~ et extrudé a travers une grille ~;
comportant des trous de 4 mm. Le broyat est alors mis en contact pendant 3 semaines avec un lait de chaux saturé a raison de 1 kg pour 4 l de solution. La peau ainsi traitee est séparee du surna-geant par une centrifugation en continue sous une accélération de 2000 g a l'aide d'une décanteuse tournant à 4000 tr/min. Le culot est ensuite soumis à deux lavages a l'eau courante dans une cuve inox sous agitation lente à raison de 1 kg pour 4 l de bain. Le broyat est alors soumis à deux traitements du tampon phosphate pH 7,~ (21,7 g/l de Na2HP04 et 0,7~ g/l de KH2P04) dans les mêmes conditions que pour le lavage a l'eau. Le culot est alors lavé par ~:, ~: .
deux bains d'eau désionisée et sterile. Le broyat obtenu est place dans une solution d'acide acétique (0,5 g/l, pH 3,4~ a raison de 1 kg pour 20 l de bain. Après 5 minutes d'agitation, Le surnageant est separé du cuLot par décantation en continu selon la technique 05 precedente. Le collagene est alors précipité par le surnageant par addition de chlorure de sodium sec dans une proportion de 10 %
environ par rapport au bain. Aprés decantation par gravité, les fibres obtenues sont dialysees contre de l'eau désionisée et sterile a l'aide de membranes de dialyse, de preférence formees par des boyaux dont le seuil de coupure est compris entre 6000 et 8000 daltons. Après avoir verifié par le nitrate d'argent que les fibres dialysees ne contenaient plus de chlorure de sodium, celles-ci sont mises en solution dans un bain renfermant 6 g/l d'acide acétique de facon a obtenir une concentration finale de 1 %
en protéine. L'ensemble est agite sous agitation lente pendant 24 heures.
c) Préparation du chondroïtine-4 sulfate Des cloisons nasales de veau debarrassées des tissus musculaires et adipeux sont hachées et broyees par extrusion à
travers une grille comportant des trous de 4 mm ; le broyat est place pendant 24 heures à une temperature de 6C dans un tampon de chlorure de potassium (11,8 g/l de KCl, 78,8 mg/l de cystéine, ETDA
180 mg/l) renfermant 1 % de papaïne "MERCK". La proportion etant de 130 9 de broyat pour 1 l de tampon.
Le surnageant est séparé du culot par centrifugation en continu à l'aide d'une decanteuse tournant a 4000 tr/min. Au surna-geant sont alors ajoutes 40 g/l d'acide trichloracétique. Le precipite est eliminé par centrifugation en continue selon la technique précédente. Le surnageant est neutralise à l'aide de soude en pastille. Le mélange est alors dialyse contre de l'eau désionisée et stérile a l'aide de boyaux dont le seuil de coupure est compris entre 6 et 8000 daltons. La solution dialysee est lyophilisee. Le chondroïtine-4 sulfate est obtenu à l'état sec.
r d) Préparation du méLange ateLocoLLagène-chondro;tine-4 sulfate Le mucopolysaccharide est mis en solution a une concen-trat;on de 1 % dans un bain renfermant de la soude. Cette solution est ajoutee sous agitation Lente a La soLution d'aterocoLlagene 05 contenant 1 % de proteine et dans La proportion de 250 ml pour 1 de solution colLagenique. La quantité de soude est teLLe que Le pH
final est de 8.
e) Préparation de la composition de liposome-atérocoLLagene-chondro;tine-4 suLfate La soLution aqueuse de liposome a 2 % de lécithine de soja est introduite sous agitation lente dans le melange atélo-colLagène chondro;tine-4 sulfate, les volumes de soLution colla-gén;que étant égaux, Le compLexe finaL renferme 1 % de Lécithine.
Exe~ple 2 Preparation d'une composition de liposome dans un support atélo-collagène-glycosaminoglycanne a) Preparation de liposome SUV (petites vesicules unilamellaires) La lecithine d'oeuf est dissoute dans l'éthanoL a une concentration de 30 mmoL/L. La solution alcoolique est aLors ajoutée à une solution de chLorure de potassium 0,15 M. Des vesi-cules unilamellaires se forment alors. La suspension est ensuite dialysee pour éliminer l'alcool résiduel et peut être concentree jusqu'a 2 % par ultrafiLtration.
b) Préparation du collagene déreticule ou atelocollagene Le broyat de peau de veau est obtenu de la même façon que dans l'exemple precédent. Le broyat est alors soumis à deux traite~
ments au tampon phosphate pH 7,8 t21,7 h/L de Na2HP04 et 0,79 g/L
de KH2P04). La concentration en broyat est de 1 kg pour 1 l de bain. Après chaque traitement, le residu est récupéré par centri-gation en continu grace à une décanteuse tournant a 4000 tr/min et donnant une acceleration de 2000 g. Après lavage au tampon phosphate, le broyat est lavé par deux bains d'eau désionisée et stérile dans les mêmes conditions que précedemment.
Le broyat est alors place a raison de 200 gtL dans une solution d'acide chlorhydrique 0,01 N contenant 7,5 % de pepsine par rapport au collagène. L'ensemble est laissé au repos pendant 24 heures à température ambiante. Au bout de ce laps de temps, une quantité complémentaire de pepsine de 7,5 ~ par rapport au collagène est ajoutée au bain et l'ensemble est laissé au repos 05 dans les mê~es conditions que précédemment.
Le surnageant est séparé du culot par centrifugation en continu selon la technique précédente. Dans le surnageant est versé
du chlorure de sodium de façon à obtenir une concentration de lû %.
Par une centrifugation en continu, les fibres sont isolées et placées dans des tubes de dialyse Visking (r~f. 30/32). Après éli-mination totale du chlorure de sodium, les fibres sont mises en solution dans l'acide acétique û,1 M de façon à obtenir une concen-tration de 1 % de collagène.
c) Pr~paration du dermatane sulfate La peau de porc débarrassée de manière classique par refente de la couche cornée et des tissus sous-cutanés est hachée et broyée par extrusion à travers une grille comportant des trous de 4 mm~
Le broyat est ensuite lavé par un mélange chloroforme-méthanol (proportion en volume 2/1). Après évaporation du solvant sous vide, le résidu sec est traité comme le broyat des cloisons nasales dans l'exemple 1, le dermatane sulfate est obtenu à l'état sec.
d) Préparation du mélange atélocollagène-dermatane sulfate Le mucopolysaccharide est mis en solution à une concen-tration de 1 % dans un bain renfermant de la soude. Cette solution est ajoutée sous agition lente à la solution d'atélocollagène contenant 1 % de protéina dans la proportion de 3ûû ml pour 1 l de solution collagénique. La quantité de soude est telle que le pH
final est de 8.
e) Préparation du complexe liposome-atélocollagène-dermatane sulfate La solution aqueuse de liposome à 2 % de lécithine d'oeuf et introduite sous agitation lente dans le mélange atélocollagène-dermatane sulfate. Les volumes des solutions collagénique et lipo-somique étant égaux, le complexe final renferme 1 % de lécithine.
Exemple 3 Essai de contrôle de stabilité des liposomes dans leur support de .. . .
l'invention atélocollagène-glycosaminoglycanne 05 Le contrôle de la présence de la qualité des liposomes est effectue par microscopie électronique. Pour cela, les prépara-tions préparées conformément aux exemples 1 et 2, contenant 1 % de lécithine sont diluées 10 fois. Une goutte de cette dilution est placée sur une grille de microscopie électronique revêtue d'un film lû adéquat, par exemple un film de FormavarR. Immédiatement après, sur la même grille est ajoutée une goutte de solution d'acide phospho-tungstique à 2 % en poids préparée extemporanément et neutralisée à
pH 7. L'ensemble est séché à l'air et examiné par microscopie à
transmission.
Le contrôle à microscopie électronique montre que les liposomes restent bien formés et qu'ils peuvent etre remis en contact avec l'eau sans difficulté. Le passage par la lyophilisation permet d'une part une conservation illimitée du complexe et, d'autre part la préparation de pâtes très concentrées en liposome et en atélocollagène pouvant être injectées dans l'organisme SOU5 un volume réduit.
ûn v~rifie la stabilité des liposomes dans les composi~
tions selon l'invention en soumettant ces compositions à une con-trainte ultrasonique.
Pour cela, on peut agiter la composition avec un homogé-néiseur type "Ultra-Turax" tournant à 22000 tr/min pendant des temps de 1,3 et 5 minutes.
ûn a effectué une comparaison en soumettant une solution aqueuse des mêmes liposomes aux mêmes conditions.
La microscopie électronique des compositions ainsi traitées, à savoir les compositions selon l'invention obtenues aux exemples 1 et 2 et la composition comparative formée par une solu-tion aqueuse des mêmes liposomes, fait ressortir que dans la solution aqueuse les liposomes se désagrègent progressivement donnant naissance a des membranes désorganisées. Au contraire, dans :
12 l 330650 les supports stabilisants selon l'invention, les vésicules de liposome restent bien formées, meme au bout de 5 minutes de trai-tement.
L'invention permet donc de stabiliser les liposomes tout 05 en conservant les avantages inhérents 3 l'emploi d'une solution d'une grande fluidité, comme précédemment énoncé
Exemple 4 Composition pharmaceutique ou cosmétique On peut utiliser une composition obtenue aux exemples et 2 comme composition pharmaceutique ou cosmétique. Naturellement, dans ce cas, il est habituellement nécessaire d'encapsuler dans les liposomes un principe actif, soit dans la membrane du liposome, soit à l'intérieur du liposome en fonction du caractere hydrophobe ou hydrophile de la substance active, selon la procédure qui est d'ailleurs mentionnée à l'exemple 1 à la fin du paragraphe a) et qui est bien connue à l'homme du métier.
On peut également ajouter divers excipients ou d'autres composants actifs comme cela est souhaité, à condition qu'ils ne détruisent pas l'effet de stabilisation du support selon l'inven-tion, comme cela est bien compréhensible .
,. . . /
~` ~
Exemple de composition sous forme émulsionnée Cette composition présente à l'état brute la formula-tion suivante, les pourcentages étant exprimés en poids:
% en poids Poplyoxypropylène 15 (POP) - Alcool stéarylique 4 St~aroyle-2-lactylate de sodium 4 Ester d'acide gras polyoxy ethyléné 3 Stéarate de glycérol 3 Dioctonate de propylène glycol 2 Parabenzoate de m~thyle 0,3 Propylène glycol 2 Allantoine 0,2 Carboner 940 ~ 0,2 Triéthanolamine 0,5 "Complexe" de liposomes dans le support Stabilisant atélocollagene-glycosaminoglycanne selon l'invention .................................... 30 Eau purifiée 50,8 100 %
La préparation de cette composition sous forme émulsionnée est réalisée de la manière suivante.
Tout d'abord, on prépare une émulsion dans l'eau purifiée de tous les composants autres que le "complexe" de liposomes dans le support stabilisant atélocollagène~
glycosaminoglycanne, selon l'invention, de manière classique.
Une fois que cette émulsion est formée, on ajoute le "complexe" de liposomes dans le support stabilisant atélocol- ;
lagène-glycosaminoglycanne selon l'invention, tel que préparé -~:
selon l'exemple 1 ou 2, sous agitation qui est maintenue pendant ..
une heure, la température devant ~tre maintenue inf~rieure à
30C.
On obtient ainsi une composition sous forme émulsionnée dans laquelle les liposomes sont stables.
~.~.d.~
:':' : ' . .. : ,' . ". . :.' .. . , . : : ' . : ' ,! ' ' .'. " ' ' ' ' ' : ' :
14 l 330650 Cette stabilité a été contrôlée par microscopie électronique, ce qui constitue un résultat remarquable de l'invention.
Naturellement, la présente in~ention comprend tous les 05 moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs diverses combinaisons. Par exemple, il est bien clair que le terme "glycosaminoglycanne" ne doit pas être inter-prété strictement et qu'il inclut de manière équi~alPnte les muco-polysaccharides étant donné que les glycosaminoglycannes sont des polymères constitués d'unités disaccharidiques disposées de façon linéaire formées en général d'un acide uronique et d'une hexos-amine. Ainsi, les mucopolysaccharides sont inclus dans la défini-tion des glycosaminoglycannes.
De même, l'atélocollagène doit être entendu comme étant du collagène débarrassé de ses télopeptides, ce qui constitue un collagène déréticulé bien précis pour 1'homme de 1'art.
Il est à observer enfin que la combinaison selon l'in~en-tion de glycosaminoglycannes avec de l'atélocollagène permet de préparer un support stabilisant sous forme de solution à un pH
voisin de la neutralité sans qu'une précipitation de l'atélocolla-gène ne puisse se produire. En outre, le support selon l'invention permet de préparer sans problème des émulsions ; ce qui constitue un des a~antages techniques déterminants de l'in~ention, De plus, les glycosaminoglycannes suppriment pratiquement totalement l'antigénicité résiduelle de l'atélocollagène.
Il est à noter encore que la composition complète obtenue selon l'in~ention peut être lyophilisée, ce qui constitue un ' a~antage 1ndustriel déterminant.
o~
Claims (54)
1. Procédé de stabilisation d'une phase lamellaire lipidique hydratée, comprenant l'introduction de ladite phase lamellaire lipidique hydratée dans un support stabilisant, caractérisé en ce qu'on prépare ledit support stabilisant de la manière suivante:
(a) on prépare séparément une solution d'atélocollagène, et une solution de glycosaminoglycanne; puis (b) on mélange ladite solution d'atélocollagène avec la solution de glycosaminoglycanne.
(a) on prépare séparément une solution d'atélocollagène, et une solution de glycosaminoglycanne; puis (b) on mélange ladite solution d'atélocollagène avec la solution de glycosaminoglycanne.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise le mélange en introduisant la solution de glycosaminoglycanne dans la solution d'atélocollagène.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de glycosaminoglycanne est préparée par mise en solution du glycosaminoglycanne dans une solution aqueuse basique dont le pH est réglé de sorte qu'après mélange avecla solution d'atélocollagène, le pH du mélange constituant le support stabilisant reste légèrement basique tout en étant proche de la neutralité.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution de glycosaminoglycanne est préparée par mise en solution du glycosaminoglycanne dans une solution aqueuse basique dont le pH est réglé de sorte qu'après mélange avecla solution d'atélocollagène, le pH du mélange constituant le support stabilisant reste légèrement basique tout en étant proche de la neutralité.
5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le pH final est voisin de 8.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le pH final est voisin de 8.
7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que cette solution aqueuse basique est une solution aqueuse de soude.
8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que cette solution aqueuse basique est une solution aqueuse de soude.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminoglycanne est de 0,5 à 4% en poids.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la concentration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminoglycanne est de 0,5 à 2% en poids.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la concentration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminoglycanne est voisine de 1% enpoids.
12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant une concentration comprise entre 0,5 et 2% en poids.
13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant une concentration voisine de 1% en poids.
14. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la concentration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminoglycanne est de 0,5 à 4% en poids et caractérisé en ce que la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant une concentration comprise entre 0,5 et 2% en poids.
15. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution d'atélocollagène est obtenue par dissolution de fibres d'atélocollagène dans une solution aqueuselégèrement acide.
16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les fibres d'atélocollagène sont mises en solution dans de l'acide acétique 0,1 M.
17. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'atélocollagène est obtenu par digestion enzymatique de collagène.
18. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'atélocollagène est obtenu par digestion enzymatique de collagène.
19. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une solution de phaselamellaire lipidique hydratées est introduite dans une solution de support stabilisant selon des volumes sensiblement égaux.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la proportion de ladite phase lamellaire lipidique représente environ 1% en poids de la composition finale.
21. Procédé de stabilisation des liposomes comprenant l'introduction des liposomes dans un support stabilisant, caractérisé en ce qu'on prépare ledit support stabilisant de la manière suivante:
(a) on prépare séparément une solution d'atélocollagène et une solution de glycosaminoglycanne; puis (b) on mélange ladite solution d'atélocollagène avec la solution de glycosaminoglycanne en introduisant la solution de glycosaminoglycanne dans la solution d'atélocollagène.
(a) on prépare séparément une solution d'atélocollagène et une solution de glycosaminoglycanne; puis (b) on mélange ladite solution d'atélocollagène avec la solution de glycosaminoglycanne en introduisant la solution de glycosaminoglycanne dans la solution d'atélocollagène.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la concentration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminoglycanne est de 0,5 à 4% en poids et caractérisé en ce que la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant une concentration comprise entre 0,5 et 2% en poids.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la solution de glycosaminoglycanne est préparée par mise en solution du glycosaminoglycanne dans une solution aqueuse basique dont le pH est réglé de sorte qu'après mélange avecla solution d'atélocollagène, le pH du mélange constituant le support stabilisant reste légèrement basique tout en étant proche de la neutralité.
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le pH final est voisin de 8.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que cette solution aqueuse basique est une solution aqueuse de soude.
26. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant une concentration voisine de 1% en poids et en ce que la solution de glycosaminoglycanne est une solution aqueuse de glycosaminoglycanne ayant une concentration voisine de 1% en poids.
27. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la solution d'atélocollagène est obtenue par dissolution de fibres d'atélocollagène dans une solution aqueuselégèrement acide.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que les fibres d'atélocollagène sont mises en solution dans de l'acide acétique 0,1 M.
29. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'atélocollagène est obtenu par digestion enzymatique de collagène.
30. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que la proportion desdits liposomes représente environ 1% de la composition finale.
31. Composition contenant une phase lamellaire lipidique hydratée stabilisée par la présence d'un support stabilisant, caractérisée en ce que le support stabilisant est sous forme d'une solution contenant un mélange d'atélocollagène et de glycosaminoglycanne.
32. Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce qu'on utilise un glycosaminoglycanne choisi parmi le groupe de glycosaminoglycannes renfermant l'acide hyaluronique, le chondroïtine-4 sulfate, le chondroïtine-6 sulfate, le dermatane sulfate, l'héparane sulfate, le kératane sulfate, l'héparine et ses dérivés ainsi que les mucoïtines sulfate.
33. Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce que la proportion relative de glycosaminoglycanne vis-â-vis de l'atélocollagène est de 18 à 25% en poids deglycosaminoglycannes par rapport à l'atélocollagène.
34. Composition selon la revendication 32, caractérisée en ce que la proportion relative de glycosaminoglycanne vis-â-vis de l'atélocollagène est de 18 à 25% en poids deglycosaminoglycannes par rapport à l'atélocollagène.
35. Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce que la solution de support stabilisant est à un pH légèrement basique tout en étant voisin de la neutralité.
36. Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce que la solution de stabilisant est à un pH de l'ordre de 8.
37. Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce que cette composition est obtenue en mélangeant des volumes sensiblement égaux de solution de phase lamellaire lipidique hydratée et de solution de support stabilisant.
38. Composition selon la revendication 31, caractérisée en que ladite composition est sous forme lypophilisée.
39. Composition contenant des liposomes stabilisés par la présence d'un support stabilisant, caractérisée en ce que le support stabilisant est sous forme d'une solution contenant un mélange d'atélocollagène et de glycosaminoglycanne.
40. Composition selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'on utilise un glycosaminoglycanne choisi parmi le groupe de glycosaminoglycannes renfermant l'acide hyaluronique, le chondroïtine-4 sulfate, le chondroïtine-6 sulfate, le dermatane sulfate, l'héparane sulfate, le kératane sulfate, l'héparine et ses dérivés ainsi que les mucoïtines sulfate.
41. Composition selon la revendication 39, caractérisée en ce que la proportion relative de glycosaminoglycanne vis-â-vis de l'atélocollagène est de 18 à 25% en poids deglycosaminoglycannes par rapport à l'atélocollagène.
42. Composition selon la revendication 40, caractérisée en ce que la proportion relative de glycosaminoglycanne vis-â-vis de l'atélocollagène est de 18 à 25% en poids deglycosaminoglycannes par rapport à l'atélocollagène.
43. Composition selon la revendication 39, caractérisée en ce que la solution de support stabilisant est à un pH légèrement basique tout en étant voisin de la neutralité.
44. Composition selon la revendication 39, caractérisée en ce que la solution de stabilisant est à un pH de l'ordre de 8.
45. Composition selon la revendication 39, caractérisée en ce que cette composition est obtenue en mélangeant des volumes sensiblement égaux de solution de phase lamellaire lipidique hydratée et de solution de support stabilisant.
46. Composition selon la revendication 39, caractérisée en que ladite composition est sous forme lyophilisée.
47. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 31, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la revendication 1, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique.
48. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 31, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la revendication 1, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique et caractérisée en ce que la composition est utilisée telle quelle ou bien contient en outre divers composants ou excipients appropriés.
49. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 39, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la revendication 21, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique.
50. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 39, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la-revendication 21, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique et caractérisée en ce que la composition est utilisée telle quelle ou bien contient en outre divers composants ou excipients appropriés.
51. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 31, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la revendication 1, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique, ladite composition étant sous forme lyophilisée ou sous forme d'émulsion.
52. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 31, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la revendication 1, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique et caractérisée en ce que la composition est utilisée telle quelle ou bien contient en outre divers composants ou excipients appropriés, ladite composition étant sous forme lyophilisée ou sous forme d'émulsion.
53. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 39, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la revendication 21, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique, ladite composition étant sous forme lyophilisée ou sous forme d'émulsion
54. Utilisation de la composition telle que définie selon la revendication 39, ou telle qu'obtenue par le procédé selon la revendication 21, en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de composition pharmaceutique ou cosmétique et caractérisée en ce que la composition est utilisée telle quelle ou bien contient en outre divers composants ou excipients appropriés, ladite composition étant sous forme lyophilisée ou sous forme d'émulsion
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| CA000584886A CA1330650C (fr) | 1987-10-22 | 1988-12-02 | Procede de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple de liposomes, composition de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple des liposomes, stabilisees par un emploi d'un support stabilisant a base d'atelocollagene et de glycosaminoglycannes, et utilisation en pharmacie ou en ... |
| DE3841828A DE3841828A1 (de) | 1987-10-22 | 1988-12-12 | Verfahren zur stabilisierung von hydrierten, lipidischen, lamellierten phasen, zusammensetzung aus diesen phasen sowie anwendung dieser zusammensetzung in der pharmazie und kosmetologie |
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