NO141565B - Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot klovsyke - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine til forebyggelse og behandling av klovsyke, særlig hos sauer, ved dyrking av Fusiformis nodosus.

Saue-klovsyke er en utbredt og smittsom sykdom som virker på fotens hudved og som forårsakes av den synergistiske virkning av to Gram-negative anaerobe bakterier, Fusiformis nodosus og Fusiformis necrophorus. Sykdommen opptrer bare når begge organismer er tilstede.

F. necrophorus finnes normalt i fordoyelseskanalen,

og skilles ut i avforingen, slik at organismen vanligvis finnes i sauens umiddelbare omgivelser og kan delta i infeksjon-en. F. nodosus kan på den annen side ikke overleve under naturlige forhold i mer enn noen få dager utenfor klovsyke-sårene. Den infiserte klov er bakteriens eneste naturlige habitat og folgelig beskrives F. nodosus ofte som sykdommens spesifikke årsak. Eliminering av F. nodosus fra en saueflokk, hvilket kunne oppnås ved å helbrede alle klovsyke-tilfeller eller ved spesifikt å odelegge organismen, ville utrydde sykdommen siden F. necrophorus ikke kan fremkalle klovsyke i fra-vær av F. nodosus.

I de senere år har klovsyke vært holdt i sjakk ved isolering av infiserte dyr, fulgt av en behandling som bestod av utstrakt avklipping og skjæring av klovenes infiserte om-råder og lokal applisering av desinfeksjonsmidler eller anti-biotika. I det siste har man gjort forsok på å komme sykdommen til livs ved vaksinasjon mot F. nodosus og F. necrophorus, men man har ikke funnet noen praktisk metode for bkonomisk dyrking av F. nodosus i storre målestokk, slik at vaksine kunne fremstilles for storstilet fordeling.

Forsok på å dyrke F., nodosus har stott på vanskeligheter i flere år, og så sent som 1970 stotte forskerne på problemer med å isolere organismen i renkultur (H. Marsh et al., The Cornell Veterinarian, 60, 509-17, april 1970). Beveridge har i 1941 (Bull. Coun. sei. industr. Res. Aust., nr. 140) beskrevet organismens krav til dyrkningsmedium, men hadde lite hell med å dyrke den i flytende media. Han beskrev organismen som en obligat anaerob, og angav at veksten bket i en atmosfære som inneholdt 5 - 10% karbondioksyd, og selv 80% av denne gassen inhiberte ikke veksten.. Med et flytende ekstrakt av oksemuskel og -lever fikk man bare svak vekst eller ingen i det hele tatt, men tilsetning av 10% hesteserum gav mager vekst.

Man oppnådde storre hell ved å benytte flytende medium for isolering og dyrking av F. nodosus ved å benytte en buljong som inneholdt oppmaltet partikler av saueklover og "Difco"-trypsin, under en atmosfære på 10% karbondioksyd. (J.H. Thomas, Aust. vet. J., 34, 411 (1958)). Dette arbeide viste

at man oppnådde vekst med et flytende medium som inneholdt trypsin eller et pankreas-ekstrakt under tilsetning av et hyd-rolysat fra hover eller ull, kjas ein eller proteose-pepton. I dette arbeide benyttet man en atmosfære av nitrogen for å opprettholde anaerobe forhold (J.H. Thomas, Aust. vet. J., 39, 434 (1963)).

Endelig fremstilte man vaksiner fra F. nodosus for feltforsok fra organismer dyrket på fast klov-agar innehol-dende oppmalt horn under en atmosfære på 10% karbondioksyd i hydrogen, og i et tofasig medijum av klov-agar med et overlig-gende sjikt av klov-buljong under anaerobe forhold (J.R. Egerton et al., Aust. vet. J., 46, 517 (november 1970)).

Under forsbkene med å finne en fremgangsmåte for dyrking av F. nodosus i storre målestokk for fremstilling av vaksine, har man funnet at de 'betingelser og fremgangsmåter som hittil har vært benyttet i forbindelse med flytende medium har vært utilfredsstillende. [Faste media som agarplater har flere ulemper, i tillegg til de som er spesielt knyttet til dyrking av F. nodosus, man krever en storre mengde medium,

man stoter på vanskeligheter med sterilisering og inkubering og oppsamling av bakterier fra overflatekulturen og man trenger tusenvis av agarplater som holdes under anaerobe forhold med

dertil horende arbeidsomkostninger. Lignende problemer er knyttet til bruk av tofasig fast/flytende medium.

Man har i stor grad benyttet oppmalt klov- eller hovkeratin til forsok på å dyrke F. nodosus, men dessverre har det markedsførte "klov- og horn-"mel vist seg å inhibere organismens vekst. Når man således vil benytte hovkeratin i dyrkningsmedium for organismen, medfbrer dette altså innsamling av tusenvis av saueklover, og selv om dette lykkes, er tilsetning av uopplbselig pulver i flytende medium ubnsket. Når pulveriserte klover tilsettes til et egnet fast agarmedium, er organismens vekst temmelig dårlig selv etter anaerob inkubering i fem dager, og organismer som hostes etter vekst i flytende medium som på forhånd var oppvarmet med klovpulver,

var ikke tilstrekkelig antigent for en påfblgende anvendelse som vaksine.

Man har nå funnet at tilsetning av visse leverstof-

fer i et flytende vekstmedium for dyrking av F. nodosus, og nærvær av en hby konsentrasjon tilgjengelig karbondioksyd, er faktorer som gir en vesentlig bkning både i veksthastigheten og utbyttet under anaerobe forhold. Videre er organismer fremstilt på denne måten antigent tilfredsstillende for vaksinasjon. Når praktisk talt identiske bestanddeler brukes i fast medium, bkes veksten av organismen kraftig, og organismene kan overfores fra fast til flytende medium og omvendt uten å tilpasses det nye miljb, slik at man unngår tap på

grunn av utvalg av en ikke-antigen variant, eller nedsatt kapa-sitet til dyrking og utvikling av det beskyttende antigen.

I norsk patentsøknad 3094/71 beskrives en fremgangsmåte for dyrking av Fusiformis nodosus under anaerobe betingelser i en beholder inneholdende et flytende næringsmedium som i opplbsning inneholder råtrypsin eller et pankreasutkok. Ifblge denne fremgangsmåte anvendes også i opplbsning i nevnte medium et leverutkok, et leverekstrakt eller et leveruttrekk.

Ifblge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt

en fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine ved dyrking av Fusiformis nodosus under de i: den ovenfor angitte fremgangsmåte benyttede betingelser, og foreliggende fremgangs-

måte er kjennetegnet ved at de dyrkede organismer drepes og at de drepte organismer omdannes'til en vaksine som innfores i en beholder som et sterilt vaksinepreparat. Det er foretrukket at organismene separeres fra dyrkningsmediet for omdanningen til vaksine.

Særlig egnede leverstoffer for bruk i foreliggende fremgangsmåte er nedenstående 'preparater, men andre ekviva-lente markedsforte preparater av leverutkok, -uttrekk, eller -ekstrakt kan brukes i stedet:| "Panmede" lever-utkok, leveruttrekk, lever-utkok "L 27".

For maksimalt utbytte av F. nodosus, og for lettvint innhosting generelt, særlig nar det gjelder dyrkningshastig-heten og hostetiden, er den foretrukne konsentrasjon av lever-materiale i flytende dyrkningsmedium mellom 0,5 - 2% (vekt/ volum) (vekten refererer seg til torrvekten av tbrrstoffer av leveropprinnelse), selv om hoyere konsentrasjoner opp til ca. 3% (vekt/volum) kan brukes, mén utbyttet har da tendens til å synke. Virkningen av varierende leverkonsentrasjoner på veksten av F. nodosus er oppfort senere i tabell (I).

Disse markedsforte leverpreparater som fås som fine pulvere som kan opploses i desjtillert vann til en opplosning egnet for tilsetning til det flytende dyrkningsmedium i onsket konsentrasjon. En slik opplosning blir fortrinnsvis klaret for å fjerne partikkelformede bestanddeler, f.eks. ved filtrering, for tilsetning til dyrkningsmediet.

For å oppnå virkelig; hoye utbytter bor et flytende dyrkningsmedium inneholde et utkok av pankreas, i tillegg til leverstoffene, og vanlige næringsbestanddeler i kulturmedia som gjærekstrakt, pepton eller et utkok av heste- og oksemuskel og natriumklorid. Fortrinnsvis inneholder det flytende medium og-så L-cysteinhydroklorid. j

Nevnte pankreasstoffer er fortrinnsvis et pankreasautoutkok, som kan fremstillesj på kjente måter, men fortrinnsvis etter nedenstående metode. Findelt pankreas, f.eks. okse-eller sauepankreas, settes tiL vann i en mengde på ca. 0,5 - 1,5 kg pr. liter vann, og pH okes til mellom 8 og 9 ved f.eks. å tilsette natriumhydroksyd. Blandingen omrores ved en temperatur mellom 35 og 40°C i 1 - 2,5 timer, mens pankreaskjertel-en nedbrytes av sitt eget trypsin, og deretter senkes pH til mellom 3 og 5 med f.eks. saltsyre. Deretter kokes den kort opp, og pH innstilles på nytt mellom 7 og 7,8 for preparatet fil-treres og filtratet oppsamles.

Pankreaskomponenten i det flytende medium kan er-stattes av rå trypsinpreparater (men ikke av rent trypsin),

som f.eks. "Difco" 1:250 trypsin, i konsentrasjoner på ca.

0,5 - 2% (vekt/volum).

Cystein er fortrinnsvis tilstede i et flytende vekstmedium i konsentrasjoner på 0,005 - 0, 2% vekt/volum, fortrinnsvis i mengder på under 0,1%, men den optimale konsentrasjon varierer i omvendt forhold til kulturvolumet, f.eks. 0,1% (vekt/volum) cystein for et mediumvolum på 5 ml og 0,02%

(vekt/volum) cystein for et volum på 500 ml. Pankreasekstrak-tet finnes fortrinnsvis i kulturmediet i konsentrasjoner på mellom 1,2 og 3,6% (vekt/volum), idet vekten refererer seg til opploste faste stoffer av pankreasopprinnelse.

De konsentrasjoner som er angitt ovenfor gjelder både det ferdige flytende dyrkningsmedium for teknisk dyrkning av organismen og de flytende media som brukes til forkultur og fremstilling av inokulum for kulturen i stor målestokk. Med unntak av cysteinkomponenten, kan de samme stoffer med samme konsentrasjoner tilsettes et fast medium, f.eks. agar, for å isolere organismen til å begynne med fra infisert materiale.

Det flytende dyrkningsmedium fremstilles best ved

å opplose bestanddelene i destillert vann for sterilisering (f.eks. ved autoklavering), og deretter å tilsette alt eller en del av cysteinet, siden dette stoff er ustabilt. Mediets pH reguleres fortrinnsvis til 7,0 - 7,8 og temperaturen til mellom 35 og -39°C.

Med fordel bor levermaterialet holdes atskilt fra

de andre bestanddeler under all opplosning, oppvarming og klar-ing som går forut for autoklavering, for å fremstille det ferdige sterile medium som deretter kan inokuleres med bak-teriekultur. Det resulterende medium er en fortrinnsvis homo-gen opplosning av bestanddeler i alt vesentlig fri for uopp-løselige stoffer i suspensjon.

Under dyrking av organismen må man opprettholde anaerobe forhold, og det er fordelaktig å tilveiebringe dette ved hjelp av en 100%ig karbondioksydatmosfære som kan fås ved enkelt å fortrenge luften over det flytende medium med steril karbondioksyd. Nærvær av denne gassen i atmosfæren over kulturmediet inneholdende F. nodosus har vist seg å være viktig for å påskynde veksten hos i det minste enkelte arter av organismen, men den noyaktige virkning har vist seg å variere med den anvendte art, prosentvis mengde karbondioksyd, organismens kultur-historie og forholdet imellom gassvolum og væskefase. Generelt har man imidlertid funnet at jo hoyere konsentrasjonen av karbondioksyd er, jo hurtigere er veksten av F. nodosus. God vekst hos organismen har man oppnådd med konsentrasjoner på 60, 80, 90, 95 og 100% karbondioksyd ved standard trykk, idet resten av atmosfæren eventuelt bestod av i det vesent-lige kjemisk inert gass som nitrogen, argon eller helium.

Selv om hydrogen har vært brukt som restgass ved eksperiment-er i mindre målestokk, er dette naturligvis upraktisk for bruk i storre målestokk, og betegnelsen "inert gass" i denne mening omfatter her ikke hydrogen og gasser som kan gå i kjemisk reaksjon med kulturmediet eller kan være skadelig overfor organismene.

Forholdét gass/væske har også vist seg å ha innvirk-ning på organismens veksthastighet i flytende medium, og generelt bor volumet karbondioksyd ved atmosfæretrykk ikke over-stige 30% av det flytende mediums volum, fortrinnsvis utgjor karbondioksydets volum 10% av | væskevolumet, bor ikke over-stige 20% og helst ikke være under 5%.

Karbondioksydet i gassen over det flytende medium vil naturligvis fore til at en del av gassen opploses i mediet og senker pH fra den opprinnelige. Dette vil også fore til et delvis vakuum avhengig av de ellers rådende forhold, og dyrkningskaret kan lukkes hermetisk eller knyttes til en kilde for inert gass, for å erstatte den opploste karbondioksyd. Anaerobe betingelser oppnås som et alternativ ved å sorge for en tilstrekkelig dybde av i den flytende kultur i dyrknings-beholderen slik at organismene i mediet blir upåvirket av nær-været av oksygen i ethvert gassområde over mediets overflate.

Det er onskelig at sluttkulturen av F. nodosus-organismer som skal bearbeides til vaksine, inneholder en maksimal andel levende livskraftige organismer. Dette krever at den endelige kultur bor dyrkes på minimal tid, som igjen krev-

i

er storst mulig mengde inokulum for sluttkulturen. Likeledes bor startorganismene i inokulumet inneholde en stor mengde re-produserbare organismer. Det er således onskelig progressivt å oke antall organismer fra det opprinnelige startmateriale ved en kulturserie.

For å oppnå dette kan organismen forst isoleres ved

å dyrke under anaerobe forhold egnet infeksjonsmateriale på et fast medium som inneholder leverutkok, -uttrekk eller -ekstrakt. Forkulturer fra denne forste kultur dyrkes med fordel videre inntil man får organismen som renkultur. Dette oppnår man vanligvis etter én eller to forkulturer på fast medium under vesentlig samme forhold som beskrevet ovenfor i forbindelse med flytende medium.

Det faste medium består fortrinnsvis av agarplater som inneholder pankreasutkok eller "Difco"-trypsin 1 : 250, pepton, natriumklorid og agar, i tillegg til levermaterialet omtalt ovenfor, ved pH 7,0 - 7,8. Man kan f.eks. fremstille en suspensjon av infeksjonsmateriale fra sårene på sauens' klover i en 0,1 - 0,4 m sukroseopplbsning, som inkuberes på agarplater ved en temperatur mellom 35 og 39°C i en atmos-

fære av karbondioksyd og nitrogen i flere dager.

Når man har fått en ren F. nodosus-kultur fra fast medium, kan dette brukes som inokulum for anaerob væske-kultur av organismen f. eks. under karbondioksydatmosfære, som fort-settes som fortløpende forkulturer inntil man har oppnådd tilstrekkelig antall organismer til et sluttinokulum for en pro-duksjons-sats, som av økonomiske grunner utgjor et stort volum flytende medium på omkring 500 liter, i alle tilfeller over 5 liter. De fortløpende forkulturer i flytende media dyrkes fortrinnsvis under de samme betingelser som nedenfor er beskrevet for produksjon i stc5rre målestokk og media som har iden-tisk sammensetning.

Det ferdige medium brukes på nedenstående måte for produksjon av storre mengder organismer for vaksinefremstil-lingen. Det flytende medium inneholdende ovenstående bestanddeler fylles fortrinnsvis i stors glassbeholdere eller rust-frie ståltanker..Et inokulum (fortrinnsvis en flytende kultur av F. nodosus fremstilt som ovenfor beskrevet) med et volum på 5 - 10% av tankvolumet tilsettes. Med fordel fortrenges luften over mediet helt med steril karbondioksyd, og den luk-kede beholder inkuberes i 12 - 30 timer, hvoretter bakterie-tettheten er tilstrekkelig stor til vaksinefremstilling, en tetthet på ca. 10 8 - 10 10 organismer pr. ml, som er mest fordelaktig. Under optimale vekstforhold kan en tilfredsstillende host fås etter 12 timer, men den optimale periode avhenger naturligvis av organismearten.og de anvendte betingelser. Kulturen kontrolleres med hensyn'til renhet ved mikroskopunder-sokelse, og kultur-egenskapene beskrives nedenfor i eksempel 1.

Hvis man onsker å fremstille en renkultur av F. nodosus, oppnås dette fortrinnsvis ved gjentatt kulturover-foring på fast agar, siden veksten er langsommere på fast medium og således organismens levetid lenger. Eventuelt kan organismen tas fra et fast medium, suspenderes i sukroseopplbsning, frysetbrkes og oppbevares under vakuum. Ved behov kan de torre organismer blandes på nytt med næringsbuljong og dyrkes opp under anaerobe forhold på fast medium inneholdende leverutkok, -uttrekk eller -ekstrakt. På denne måten kan man ha et forråd av F. nodosus-organismer til bnskede formål.

De dyrkningsbetingelser som er angitt ovenfor har vist seg særlig verdifulle for dyrking av to stammer av F. nodosus, stammen nr. 183 og 198 fra McMaster Laboratory of the Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation, Sydney, Australia.

En produksjonssats av organismer fremstilt som beskrevet kan opparbeides til vaksine ved forst å drepe organismene. Dette kan gjore på enhver kjent måte, f.eks. ved hjelp av formalin, 0,2 - 1% (v/v). I De drepte organismer kan deretter blandes med et hjelpemiddel ("adjuvant") for å oke im-munresponsen overfor organismen. Hele den drepte kultur eller de enkelte drepte hostede organismer kan danne vaksinens antigene materiale. Egnede hjelpemidler er beskrevet i britisk patent 1.143.545 og kan også brukes som hjelpemidler til vaksiner av F. nodosus-kulturer fremstilt som beskrevet.

i

Med fordel blandes kulturen med en ikke-ionisk hydrofil emulgator, f.eks. polyoksyetylensorbitanmonooleat, og emulgeres i en mineralolje inneholdende e|n ikke-ionisk lipofil emulgator som mannid-monooleat, og gjores steril under dannelse av en

f

vann-i-olje-emulsjon av organismene dispergert i vandig fase.

Det er imidlertid foretrukket å benytte et aluminiumhjelpemiddel for å oke antigenets immunogenitet, og kalium-alun har vist seg særlig gunstig, selv om andre aluminium-salter, av den type som vanligvis brukes i vaksiner, også kan brukes. Vaksinen inneholder fortrinnsvis en bakteriostat av den type som vanligvis brukes i bakterievaksiner inneholdende drepte bakterier, og 0,01% (vekt/volum) tiomersal (natrium-etylmerkuritiosalicylat) kan tilsettes for dette formål.

Den ifblge oppfinnelsen fremstilte vaksine gis fortrinnsvis til dyrene ved subkutan eller intramuskulær injeksjon. Man antar at det er fordelaktig å gi aluminiumhjelpemiddel-tilsatt vaksine subkutant, og å gi en emulsjonshjelpemiddel-tilsatt vaksine enten intraperitonealt eller på et sted på dyret hvor lokal reaksjon ved subkutan administrasjon ikke er til ulempe for bonden. Det foretrukne doseringsområde for en emulsjonshjelpemiddel-tilsatt vaksine ligger på 10^ 10 10 drepte organismer pr. dose, spesielt mellom 5 x 10 8 og

Q

5 x 10 pr. dose, mens det mest foretrukne område for en aluminiumhjelpemiddel-tilsatt vaksine er mellom 5 x 10 8 og 1 x 1011 drepte organismer pr. dose, spesielt 1 x 10 9 og 5 x 10 10 pr. dose, hvor dosen er den totale mengde antigent materiale som gis til et dyr, f.eks. en sau, i en egnet væskemengde, f.eks. 1 - 2 ml for en emulsjonshjelpemiddel-tilsatt vaksine og 4 ml for en aluminiumhjelpemiddel-tilsatt vaksine. Dosen kan gis til dyret som en enhet eller som flere doser, sistnevnte kan da gis i lbpet av et tidsrom som bestemmes, eller ved samtidige injeksjoner på forskjellige steder på dyret. Et egnet immuni-seringsskjema for en emulsjonshjelpemiddel-tilsatt vaksine består av en enkelt doseinjeksjon, en deldose etter 14 dager, fulgt av en annen deldose eller to injeksjoner som hver består av en deldose, som samtidig gis på forskjellige steder på dyret. Optimal dosering avhenger naturligvis av den organisme som velges som vaksinebasis, det totale antall organismer som anvendes, hjelpemidlets natur og administrasjonsveien. Det har vist seg gunstig å gi en aluminiumhjelpemiddel-tilsatt vaksine inneholdende 2,5 x 10^ organismer pr. ml i en enkelt 4 ml dose subkutant, fulgt av en sekundær injeksjon av samme mengde og ad samme adminstrasjonsvei ved et intervall på minst 6 uker.

Hvis man onsker lengre tids beskyttelse, kan man gi doser med

6 måneders mellomrom.

I tillegg til innholdet av antigenmateriale avledet fra F. nodosus, kan en vaksine fremstilt ifolge foreliggende oppfinnelse også inneholde antigenmateriale som stammer fra andre bakterier som frembringer sykdommer hos f.eks. sau, særlig F. necrophorus, eller Clostridium. En særlig foretrukket kombinasjon er en flerkomponentvaksine som inneholder en vann-i-olje-emulsjon eller et kalialun-fortynnet preparat av ett eller flere Clostridium-antigener beskrevet i britisk patent 1.1A-3.5A-5, kombinert med et F. nodosus-antigent preparat fremstilt som beskrevet ovenforJ

Virkningen av tilsetning av lever-materialet på veksten av F. nodosus i flytende'medium fremgår av nedenstående tabell. To kulturserier, for hver av stammene 183 og 198 ble dyrket ved 37°C under en atmosfære på 5% CC^ i nitrogen i flytende medium med sammensetning 2% (v/v) pepton-utkok og 0, 3%

(w/v) natriumklorid, med tilsetning av lever- og eller pankreas-utkok i en mengde som fremgår av tabellen. Organismene ble dyrket over natten og den optiske tetthet for mediet målt med spektrofotometer som målte verdiene for optisk tetthet. Av

tabellen ser man at den maksimale vekst for stamme 183 ble oppnådd med 1 w/v % lever og' 30 v/v % pankreas, mens maksimal vekst for stamme 198 fant sted med 2 w/v % lever og 20 v/v % pankreas.

Folgende eksempler^ illustrerer foreliggende frem-

gangsmåte.

Eksempel 1

a) Isolering av organismen

Infeksjonsmateriale ble oppsamlet fra sårene på saueklover, suspendert i en 0,25 M vandig sukroseopplosning og umiddelbart helt på agarplater med folgende sammensetning:

K ekvivalent til ca. 1,2% w/v opploste faste stoffer av pankreasopprinnelse.

Det faste næringsmediets pH var 7,4. Platene ble inkubert ved 37°C i en atmosfære av 5% karbondioksyd i nitrogen i 4 dager.

Etter inkuberingen hadde agarplatene små, flate, ut-bredende kolonier, typiske for P. nodosus. I prbver av kolo-niene undersokt mikroskopisk fant man en Gram-negativ basill med en karakteristisk manualform til F. nodosus.

Bakterier dyrket på agarplatene ble overfort til andre agarplater med samme sammensetning, som ble inkubert under samme forhold i 3 dager for undersøkelse. Bakterieveksten på platene ble gransket med hensyn på identifikasjon av organismen, kolonienes utseende, organismenes utseende i Gram-fargede prover og lukten, som minnet om pattedyrsed, som utgjorde karakteristiske trekk hos F. nodosus. Identiteten til F. nodosus ble bestyrket ved den manglende evne til å vokse på agar under aerobe forhold eller på vanlig næringsagar, dens evne til å vokse på agar inneholdende 5 - 10% hesteblod, men ikke saueblod, og dens evne til å forårsake klovsyke når den ble anbragt i klovspalten hos sauer hvor klovene var knust og utsatt for avfbrings-infeksjon med F. necrophorus. Organismen ble overfort gjentagne ganger på agar som beskrevet.

Organismene fra den andre overforingskultur ble fjernet fra agaren, suspendert i 0,25 M vandig sukroseopplosning og frysetbrket og oppbevart lukket under vakuum. Inku-beringsmaterialet ble lagret inntil det var behov for det til

vaksineproduksjon.

b) Overforing av organismen og fremstilling av inokulum i flytende media

Man startet dyrkingen av F. nodosus for vaksinefremstilling ved å suspendere de tørkede organismer fremstilt som ovenfor i 0,25 M vandig sukroseopplosning, overfore dem til agarplater og overfore bakterieveksten på disse til et vandig flytende medium med folgende sammensetning:

Mediets pH for autoklavering var 7,4. Organismene ble inkubert i et lite volum medium ved 37°C i 24 timer, den resulterende kultur ble innfort i en storre mengde væske, f.eks. på eksperimentbasia 500 ml av samme medium (bortsett fra at konsentrasjonen av cystein var 0,02% (w/v), og konsentrasjonen av pankreasautoutkok 20% (v/v), dvs. ca. 2,4% (w/v) opploste faste stoffer av pankreasopprinnelse i en halvliters glass-kolbe. Man gjennomførte en annen inkubering under samme forhold og i hvert tilfelle ble karbondioksydgass innfort til for-trengning av luften over mediet gjennom en steril bomullsplugg. Med et volum over væsken i kolben på ca. 50 ml, inn-forte man f.eks. karbondioksydgass i ca. 15 sekunder gjennom en 2 ml steril pipette med bomullsplugg. Kulturen ble under-søkt mikroskopisk med hensyn på renhet, dvs. for å finne even-tuelle mikroorganismer av andre typer enn F. nodosus.

c) Dyrkning av organismen i stor skala

Innholdet i en halvliters kolbe ble inokulert i 12,5

liter flytende medium med samme sammensetning (bortsett fra at konsentrasjonen av cystein var 0,01% (w/v) og pankreas-auto-utkok utgjorde 2,4% (w/v), dvs. 20% (v/v) i en 15 liters behol-

der av glass.

Luften i beholderen ble helt fortrengt med karbondioksydgass innfort gjennom et sterilt filter, og karet ble hermetisk lukket og inkubert ved 37°C i 20 timer, hvoretter veks-9 ten var tilstrekkelig tett, dvs. at kulturen inneholdt 2 x 10 organismer pr. ml. Man tok ut prover av kulturen og undersokte dem mikroskopisk med hensyn på utseende og kultur-egenskaper hos organismene som beskrevet i forbindelse med undersøkelsen av organismer dyrket på agarplater.

Eksempel 2

Ved å folge den generelle prosedyre i eksempel 1, ble organismer av Fusiformis nodosus, art 198, dyrket i et flytende medium med folgende sammensetning:

ekvivalent ca. 1, 2% vekt-volum av opploste faststoffer av pankreasopprinnelse).

pH-verdien i mediet for autoklavering ble justert til 7,4.

Dyrkingen ble gjennomfort under et av de folgende sett betingelser med henblikk på gassrom over det flytende kulturmedium. (A) Kulturbeholderen var helt fylt med væskemedium og deretter forseglet for å eliminere ethvert gassrom i beholderen og for å forhindre kontakt mellom medium og atmosfære . (B) Et gassrom i beholderen ble fylt med steril luft. (C) Et gassrom i beholderen ble evakuert og dette

vakuum ble opprettholdt under dyrkningsperioden.

I alle tilfellene ble dyrkingen gjennomfort ved 37°C i 22 timer. Ved slutten av dette tidsrommet ble den optiske densitet for hver kultur målt ved bruk av en bblgelengde på 800 yum, og celletellingen ble ekstrapolert. Resultatene er som vist nedenfor.

(A) Optisk densitet: 0,106

Celletelling : 4,54 x IO<8> celler/ml

(B) Optisk.densitet: [ 0,161

Celletelling : 6,88 x IO<8> celler/ml

(C) Optisk densitet: 0,095

Celletelling : 4,07 x IO<8> celler/ml

I et parallellforsok ble organismen dyrket som beskrevet ovenfor, men med et gassrom over væskemediet fylt med 100% karbondioksyd. Det ble oppnådd folgende resultater:

I

Optisk densitet: 0,110

Celletelling : 4,84 x IO<8> celler/ml

De ovenfor angitte i resultater viser at veksten av organismen oket i rekkefølgen (a) vakuum over mediet, (b) intet gassrom over mediet, (c) 100% karbondioksyd over mediet, (d) steril luft over mediet.

Eksempel 5 t

Fremstilling av F. nodosus- vaksine

En flytende kultur!av F. nodosus ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (c). |Cellenes antigene evne ble under-sbkt ved på et objektglass å blande en dråpe av kulturen med en dråpe antiserum til F. nodosus fremkalt hos kanin. Organismene klumpet seg straks sammen og var således tilstrekkelig antigene for vaksineproduksjon. Man tilsatte formalin (0,6% v/v) til hele kulturen og kulturen ble hensatt ved rom-temperatur i 3 dager, hvoretter man tilsatte tiomersal (0,01% w/v). Det inaktiverte materiale ble deretter Idget til en

i

vaksine, sorbitanmonooleat ble opplost i kulturen ved en konsentrasjon på 5% (v/v) og 3 <y>olumdeler av den resulterende suspensjon ble emulgert i 7 deler oljeblanding inneholdende 10% (v/v) mannidmonooleat i lavtkokende paraffinolje "Bayol F". Vaksinen ble anbragt i egnede beholdere under sterile forhold og beholderne lukket. Produktet ble lagret inntil bruk.

Vaksinens virkningsgrad ble bestemt ved å injisere to 1 ml doser av den ufortynhede vaksine i 4 kaniner med 2 ukers mellomrom. Kaninene ble blodtappet 2 uker etter den andre dosen og deres blodserum undersokt i fortynninger på 2.500, 5.000, 10.000 etc. opp til 320.000, hver av serumprbvene ble underkastet en agglutineringsprbve med en suspensjon av F. nodosus i 0,85% (w/v) natriumkloridopplbsning under en tetthet som tilsvarte ror 1 på Brown-opasitetsskalaen. Vaksinen induserte en midlere agglutinerings-styrke på 48.000, og var tilstrekkelig potent for folgende vaksinasjon av sauer.

Eksempel 4

Fremstilling av F. nodosusvaksine

F. nodosus stamme nr. 183 og 198 ble dyrket på den måten som er angitt i eksempel 1 (c), og organismene inakti-vert med formalin som beskrevet i eksempel 3. Like volumer av anaerobkulturen av hver stamme ble blandet sammen, og van-dige opplosninger av kaliumaluminiumsulfat og tiomersal tilsatt i konsentrasjoner på 2% w/v og 0,01% w/v. Vaksinen ble sterilisert og fylt på ampuller som inneholdt 4 ml vaksine

Q

med 2,5 x 10 organismer pr. ml. Vaksinen var egnet for immu-niser ing av sauer i henhold til et doseringsskjema som omfat-tet en enkelt subkutan injeksjon på 4 ml, fulgt av samme dose subkutant 4-8 uker senere.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine ved dyrking av Fusiformis nodosus under anaerobe betingelser i en beholder som inneholder et flytende næringsmedium inneholdende i opplosning råtrypsin eller et pankreas-utkok, og også inneholdende i opplosning et leverutkok, -ekstrakt eller -uttrekk, karakterisert ved at de dyrkede organismer drepes og at de drepte organismer omdannes til en vaksine som innfores i en beholder som et sterilt vaksinepreparat.

2. Fremgangsmåte ifblge krav 1, karakterisert ved at organismene separeres fra dyrkningsmediet for omdanningen til vaksine.