DE2162013A1 - Verfahren zur herstellung einer tollwut-lebendvaccine - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung einer Tollwut-Lebendvaccine Tollwut-Virus wurde bisher außerhalb lebender Tiere vorwiegend in Suspensionen von-gemischtem Nervengewebe, z.B. in Mäuseembryo-oder Kaninchenembryohirn, gezüchtet. Eine andere Möglichkeit zur Vermehrung von Tollwut-Virus besteht darin, das Virus an befruchtete Hühnereier zu adaptieren. Der sogenannte Flury-Stamm des Tollwut-Virus wird in großem Umfang zur Herstellung von Vaccinen zur Immunisierung von Hunden gegen Tollwut eingesetzt. Dieser Stamm wird auf befruchteten Hühnereiern gezüchtet. Der Flury-Stamm wird isoliert, indem man einen ursprünglichen Straßenvirus auf. Küken passagiert. Nach intracerebraler, aufeinanderfolgender Passage in Küken wird er an befruchtete Hühnereier adaptiert. Dieses an befruchtcte Hühnereier adaptierte Tollwut-Virus kann Hunden ohne Erzeugung der Tollwutsymptome intramuskulär injiziert werden. Es fördert die Bildung von Antikörpern gegen Tollwut im vaccinierten Tier. Der an das befruchtete Hühnerei adaptierte Flury-Stamm niederer Eipassage hat Nachteile, wenn er als Vaccine für Tiere außer Hunden,~z.B. Rinder und Katzen, verwendet wird. Diese Tiere sind gegenüber dem Flury-Stamm der niederen Eipassage wesentlich empfindlicher als Hunde.
• Der ERA-Stamm des Tollwut-Virus ist ein fixier-ter Virusstamm, der ursprünglich aus einem tollwütigen Hund isoliert wurde und seitdem in Mäusehirn und Hamsternierengewebe (Fenje, Can. J. Microbiol., Bd, 6 (1960) S. 479), in befruchteten Hühnereiern und in Schweinenierengewebekulturen tAbelseth, Can. Vet. Jourt., Bd. 5 (1964), S. 84 und 279) gezüchtet wird. Das abgeschwächte Tollwut-Virus, das durch aufeinander folgende Passagen In Schweinenierengewebekulturen gezüchtet wurde, wurde als der ERA-Stamm bezeichnet und als Vaccine für die versc-hiedensten-Tiérarten verwendet; vgl. Abelseth, Can. Vet. Jour., Bd. 5 (1964), S. 279 und Bd. 8 (1967), 5. 221. Handelsübliche Vaccinen-wurden mit dem ERA-Stamm unter Verwendung eines auf Schweinenierengewebekulturen passagierten Virus auf der 34. bis 36. Passage oder weiteren -Passagen auf Schweinenierengewebekulturen z.B. bis zu einer Gesamtzahl von 83 oder 150 Passagen hergestellt. Bei diesen Vaccinen können keine Anzeichen einer signifikanten Änderung der Eigenschaften des ERA-Stammes festgestellt werden. Die Vaccine des ERA-Stammes erzeugen in den verschiedensten Tieren nur einen verhältnismäßig niedrigen Serumtiter von Tollwut-Antikörpern. Der Antikörper-Titer wird z.B.
• durch Serum-Virus-Neutralisationsversuche bestimmt. Für diese Versuche werden Serumverdünnungen zusammen mit einem Standard-Infektionsvirus (CVS) indubiert. Danach wird das Serum-Virus-Gemisch Mäusen intracerebral injiziert und diese höchste Serumverdünnung bestimmt, bei der die Mäuse noch gegen das Infektionsvirus geschützt sind. Bei diesen Ver- -suchen erzeugen zeSn- und hundertfache Verdünnungen der ERA-Tollwut-Vaccine selten höhere Titer als 1 : 25 in Hunden oder Rindern, die 1 bis 2 Monate vorher geimpft wurden.
• Die Madin-Darby-Rindernierenzellenlinie ist eine anerkannte Zellenlinie, die mehrere Jahre vermehrt wurde; vgl. Madin and Darby jr., Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 98 (1958), S. 574; Nelson-Rees, J. National Cancer Inst., Bd. 43 (1964), S. 347; Nelson-Rees, et al., Chromosom Berlin, Bd. 18 (1966), S. 70. Die Madin-Darby-Rindernierenzellenlinie kann längere Zeit gelagert werden, z.B. durch Einfrieren mit flüssigem Stickstoff. Zellen für die Virus züchtung können nach bekannten Methoden vermehrt und gelagert und sie können in bekannten Erhaltungsmedien vermehrt werden, wie Eagle's Medium, Medium 199, Earle's Lactalbumin. Diese Erhaltungsmedien können durch Tierserum, wie- fötales Rinder serum ergänzt werden. Die Zellenlinle kann auch mit Antiblotica, wie Streptomycin, Aureomycin, Kanamycin, Polymyxin B oder Amphotericin B oder mit anderen Substanzen behandelt werden, um ihre Verunreinigung mit-Begleitstoffen zu verhindern; Vgl. Johnson et al., Applied Microbiol., Bd. 15 (1967), S. 209; Gori et al., Proc. Soc.
• Exptl. Biol. and Med., ta. 117 (1964), S. 918; Polloch et al., Proc. Soc. Exptl. Microbiol. and Med., Bd. 112 (1963), S. 176; Hayflick, Texas Reports-Biol. and Med., Bd. 23 (1965), S. 285.
• Aufgabe der Erfindung ist est-eine modifizierte abgeschwächte Tollwut-Lebendvaccine und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen. - Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer Tollwut-Lebendvaccine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den abgeschwächten ERA-Stamm des Tollwut-Virus, das zum Wachsen an Schweinenierengewebe adaptiert worden ist, in Madin-Darby-Gewebekulturen von nicht-primärer Rindernierenzellen einer solchen Anzahi von Passagen unterwirft, bis die Antigenität ausreichend erhöht ist. Die nicht-primären Rindernierenzellen sind Zellen einer kontinuierlichen Zellenlinie, die ihrer Geschichte nach aus primärem Rindernierengewehe stammen. Diese Zellenlinie wurden vitro durch eine oder mehrere aufeinander -olgende Passagen vermehrt, so daß die verwendeten Zellen eine oder mehrere Passagen von den Primärzellen entfernt sind. Gewebekultur aus der Madin-Darby-kontinuierliche Rindernierenzellenlinie ist ine derartige nicht primäre Gewebekultur.
• Die erfindungsgemäß hergestellte Tollwut-Lebendvaccine hat eine hohe Antigenität bei Hunden, Rindern und Katzen. Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß man nicht mit einer prl:-mären tierischen Gewebekultur arbeiten muß, sondern eine Gewebekultur einer kontinuierlichen Zellenlinie verwenden kann.
• Hierdurch werden die Gefahren vermieden, die bei Verwendung primärer Gewebekulturen auftreten können, nämlich daß äußere Verunreinigungen eingeschleppt werden. Die erfindungsgemäß hergestellte Lebendvaccine ist praktisch frei von pathoqenen Effekten.
• In der Praxis wid das erfindungsgemäFeVerfahren so durchgeführt, daß man Tollwut-Lebendvirus, das zum Wachsen in Schweinenierenzellengewebe adaptiert worden ist, in einer Gewebekultur von Rindernierenzellen einer kontinuierlichen Zellenlinie vermehrt. Der verwendete ERA-Stamm wurde durch Passagen in Mäusehirn, primären Hamsternierenzellen, befruchteten Hühnereiern und in primären Schweinenierenzellen abgeschwächt. Vorzugsweise wird ein Inoculum des ERA-Stammes verwendet, der einer genügenden Anzahl von Passagen in primärem Schweinenierengewebe unterworfen wurde, um das Virus åhzuschwächen, d.h. das Virus so zu modifizieren, daß eine gute Antik8rperreaktion ohne nennenswerte Nebenreaktionen oder Erzeugen der Krankheit erreicht wird.
• Als Rindernierengewebekultur wird die Madin-Darby- Rindernierenzellerllinie verwendet. Die Madin-Darby-Rindernierenzellen werden nachstehend abgekürzt mit MDBK-Zellen bezeichnet. Die MDBK-Zellen werden durch Passagen aus derkontinuierlichen'Zellenlinie erzeugt und sind zahlreiche Passagen von den primären Zellen entfernt. Für die Virus-Saatkulturen werden vorzugsweise MDBK-Zellen verwendet, die praktisch frei von äußeren Verunreinigungen sind, wie Mikroorganismen, Wildviren, begleitenden Eiweißstoffen und dergl., wie sie normalerweise bei der Herstellung primärer Zellgewebekulturen angetroffen werden. Die MD3K-Zellen wurden von Verunreinigungen nach geeigneten Reinigungsverfahren befreit, die an vorhergehenden Gewebepassagen in: der Geschichte der Zellenlinie durc-hgeführt wurden. Die Verwendung einer Zellenlinie anstelle primärer Zellen gestattet die Vermehrung von Tollwut-Virus in einer Gewebekultur von Zellen, die ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen sind. Der Ausdruck "frei von Verunreinigungen" bezieht sich auf die Reinigung der Zellenlinie nach üblichen Verfahren, wie Behandlung mit Antibiotica oder Antikörpern oder Clonen auf frühen Passagestufen der Geschichte der Zellenlinie, die vor der Herstelwerden.
• lung der Gewebekulturen für die Vaccineproduktion durchgeführt/ Bei der Vermehrung von Tollwut-Virus in Gewebekulturen, die ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen sind, ist die Gefahr des Einschleppens von Verunreinigungen mit der Zellenkultur wesentlich geringer- als bei der Herstellung von primärem Gewebe. Die in derartigen Zellen erzeugte Tollwut-Vaccine kann in Nährmedien gebildet werden, die nur geringe Mengen oder keine Antibiotica oder ähnliche Stoffe enthalten. Die nach diesem Verfahren hergestellte Vaccine ist somit praktisch frei von äußeren Verunreinigungen. Die zur Züchtung von Tollwut-Virus verwendeten MDBK-Zellen müssen ihrer Geschichte nach nicht frei von Verunreinigungen sein. Während der Produktion der Vaccine können um jedoch geeignete übliche Maßnahmen durchgeführt werden, um Verunreinigungen abzutrennen. Beispielsweise kb'nnen Antibiotica enthaltende Nährmedien verwendet werden, um Mikroorganismen auszuschalten.
• Die Vermehrung des Tollwut-Virus in Rindernierengewebekulturen ist nicht von einer beobachtbaren cytopatischen Wirkung auf die Gewebezellen begleitet. Das Wachstum des Virus wird durch herkömmliche Methoden nachgewiesen, bei denen ReihenverdKnnungen der Flüssigkeit aus den Gewebekulturen, die mit dem Virus bebrütet worden sind, Mäusen intracerebral injiziert werden. Der Identitätsnachweis des Virus als Tollwut-Virus wird ebenfalls nach herkömmlichen Methoden geführt, bei denen Reihenverdünnungen der Kulturflüssigkeit mitToliwut-Antikörpern oder-Antiserum inkubiert wurden, die gegen einen bekannten Tollwut-Virus fixe Stamm hergestellt wurden. Die Gemische von Virus mit Antiserum oder Antikörpern werden Mäusen intracerebral injiziert.. Im einer bevorzugten Ausführungsform werden die MDHK-GewebekuPturen dadurch hergestellt, daß man MD3K-Zellen in einem Nährmedium dispergiert und die erhaltene Diapersion auf eine bestimmte Konzentre-oder mehr tion verdünnt, z.B. auf einen Wert von 50 000 bis 100 000 / Zellen pro ml. Zum Verdünnen Wird ebenfalls Nährmedium verwendet. Die verdünnte Zellendispersion wird hierauf steril in Glasflaschen oder Röhrchen abgefüllt und bei Temperaturen von etwa 30 bis 37°C solange bebrütet, bis sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellrasen,auf der Oberfläche des Behälters ausgebildet hat. Sobald dies der Fall istf kann' das Nährmedium dekantiert werden. Die Zellen werden hierauf mit dem Tollwut-Virus infiziert. Zur Vermehrung des Tollwut-Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Nährmedium verwendet, welches das Wachstum der Rindernierenzellen fördert und die Vermehrung des Virus nicht hemmt. Das zum Wachstum der Zellen für die Saatkultur sowie zur Virusvermehrung verwendete Nährmedium kann ein Medium des chemisch definierten-Typs sein, das essentielle Aminosäuren, Purine, Kohlenhydrate, Vitamine und anorganische Salze enthält. Es können als chemisch definierte Nährmedien z.B. Bagle's Basalmedium, Medium 199 (Morgan et al., Proc.
• Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 73 (1950), S. 1) oder Parker and Healy's Synthetic Medium No. 858, oder andere Nährmedi.en, wie Earle's Lactalbumin -Hydroly-sat - ergänzt mit 2 bis 10 Prozent tierischem Serum, wie fötalem Rinderserum oder fötalem Lämmerserum - verwendet werden. Ausserdem kann das Nährmedium mit Salzpräparaten ergänzt sein, wie Hank's Salzen oder Earle's Salzen, oder mit kleinen Mengen1 Antibiotica, wie Tennioillin, Streptomycin, Kanamycin. oder Neomycin.
• Im allgemeinen wachsen die MDBK-Zellen innerhalb etwa 5 bis 7 Tagen nach dem Bebrüten zu einem zusammenfließendeß einschichtigen Zellenrasen zusammen.
• Zur Infektion der MDBK-Zellen mit dem ERA-Stamm zur Vermehrung des Virus wird der erhaltene Zellenrasen von der Oberfläche des Kulturgefäßes nach üblichen Methoden abgelost, z.B durch Behandlung mit einem Enzym, wie Trypsin, oder durch Behandlung mit einem Komplexbildner, wÄe Äthylendiamintetraessigsäure. Die erhaltenen dispergierten Saatzellen werden dann mit einem Nährmedium auf eine bestimmte Konzentration verdünnt, vorzugsweise auf 50 000 bis 100 000 oder mehr Zellen pro ml. Die Zellen werden in einem Wachstumsmedium, z.Bo der vorstehend bescchriebenen Art, bebrütet und bei Temperaturen von etwa 32 bis 370C wachsen gelassen, bis sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellenrasen ausgebildet hat. Danach wird die Nährflüssigkelt von den Zellen dekantiert, und der Zellenrasen wird mit dem Tollwut-Virus infiziert. Hierauf werden die infizierten Zellen- zur Vermehrung des Virus bebrütet.
• Zur Infektion der Zellen mit dem Virus wird der Zellenrasen mit einer Suspension des ERA-S-tammes in einem Nährmedium überschichtet. Bei diesem Verfahren kann der Zellenrasen mit Suspension des Saatvirus angefeuchtet und in stationärer Stellung eine genügende Zeit gehalten werden, um die Absorption des Virus durch die Zellen -zu fördern, bevor ein synthetisches Erhaltungsmedium zugegeben wird, das gegebenenfalls zusätzlich Serum enthält. In einer bevorzugten Auführungsform wird der Zellenrasen zunächst mit einem synthetischen Nährmedium, wie Eagle's Medium oder Medium 199, gegebenenfalls mit etwa l.bis 2 Prozent Rinderserum ergänzt, bedeckt. Hierauf wird das Saatvirus in die Kulturbehälter in Form einer wässrigen Suspension gegeben Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform zum Infizieren der sewebekultur mit dem Saatvirus wird eine Suspension des ERA-Stammes in die MDBK-Gewebekulturen ge£'eben-, bevor diese einen Zellen rasen ausgebildet haben. Bei diesem Verfahren kann die Suspensiom des: Saatvirus mit dem Zellwachstumsmedium vermischt werden, oder eine geringe Menge einer Suspension des Saatvirus kann die Kulturgefäße gegeben werden, unmittelbar nachdem die Gefäße mit MDBK-Saatzellen versetzt wurden. Bei diesem Verfahren werden die Kulturbehälter dann bei Temperaturen von etwa 32 bis 3700 so lange bebrütet, bis sich der Zellrasen in Gegenwart des Virus ausgebildet hat. Zur.Gewinnung des Virus und der Vaccine kann das durch Passage auf MDBK-Rindernierengewebekulta ren vermehrte Virus nach üblichen Methoden geerntet werden. Dies ist im allgemeimen etwa 3 bis etwa 14 Tage nach der Einsaat des Virus möglich. Nach. einer bevorzugten AusfUhrungaform wird das Nährmedium, das einen Teil des erzeugten Virus enthält, etwä. 3 bis 7 Tage nach der Infektion der Ge-Webekultur mit dem Virus von der Gewebekultur dekantiert.
• Das Nährmedium kann hierauf durch frisches Nährmedium ersetzt und eine weitere Bebrütung kann eine kurze Zeit durchgeführt werden.. Schließlicji wird das Virus aus der MDBK-Gewebekultur etwa 7 bis 14 Tage, vorzugsweise etwa 7 bis 11 Tage nach der Beimpfung mit dem Virus durch ein übliches Einfrier--Auftau-Verfahren geerntet. Bei diesem Ernteverfahren wird der Inhalt der Kulturgefäße eingefroren und anschließend aufgetaut. Hierdurch reißen die Zollwände, und das Virus wird in Freiheit gesetzt. Die erhaltene Flüssigkeit kann mit anderen Ernteflüssigkeiten vereinigt und anschließend zentrifugiert oder filtriert werden, um die Zelltrümmer abzutrennen. Die erhaltene Tollwut-Lebendvaccine kann mit üblichen Stabilisatoren, wie Kaseinhydrolysaten, Aminosäure-Zucker-Gemischen oder gepuffer-Zucker ten Lösungen versetzt werden. Zur Bestimmung der Aktivität kann die Vaccine titriert und zur Bestimmung der Reinheit üblichen serologischen Verfahren unterworfen werden. -Gegebenenfalls kann man die Vaccine bei niedrigen Temperaturen lagern. # Sie wird beispielsweise simgefrorem oder gefriergetrocknet und in verschlossenen Behältern aufbewahrt Vorzugsweise wird die erfindungsgemäß hergestellte Lebendvaccine mit einem Stabilisator versetzt, um einen Abfall des Virustiters bei der Gefriertrocknung und der Lagerung zu verhindern. Danach wird das Gemisch gefriergetrocknet. Man erhält eine feste Vaccine, die besser aufbewahrt werden kann als eine gefrorene Flüssigkeit, und die var der Verwendung wieder mit sterile destilliertem Wasser oder einer anderen geeigneten Flüssigkeit angemacht werden kann. Die erfindumgsgemäß hergestellte Vaccine kann natürlich auch als Saatvirus für eitere MDBK-Gewebekultur Passagen verwendet werden. Im allgemeinen erhält man im erfindungsgemäßen Verfahren eine ausgezeichnete Tollwut-Lebendvaccine bereits nach einer einzigen Passage des BRA-Stammes in -MDPK-Riiidernierengewebekulturen. Weitere Passagen des Virus in dieser Gewebekultur können ebenfalls durchgeführt werden.
• Die Beispiele erläutern die Erfindung.
• Beispiel 1 Als Saatvirus wird Lebendvirus des ERA-Stammes verwendet.
• Dieses Virus wurde aus dem ursprünglich isolierten Virus durch eine genügende Anzahl aufeinanderfolgender Passagen in Mäusehirn, primärem Hamsternierengewebe, befruchteten Hühnereiern und primärem Schweinenierengewebe modifiziert, bis dieser tRA-Stamm Hunde gegen Tollwut immunisiere kann, ohne pathologische Effekte in größerem Ausmaß zu erzeugen.
• Der Saatvirus erzeugt einen Infektionstiter an Mäusen von etwa 10-3,4 pro 0,03 ml, wenn er nach dem Verfahren von Abelseth Can.Vet. Jour., Bd. 5 (1964), 5. 27 in primärem Schweinenierengewebe vermehrt worden ist. Jeweils 1 ml einer Suspension-von MDBK-Zellen in Bagle's Medium, das mit 10 Prozent fötalem Kälberserum ergänzt ist, wird steril in Gewebekulturrohrchen. abgefüllti ie Suspensi-on enthält etwa 100 000'.
• Zellen pro ml. Die MDBK-Zellen sind ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen und werden der 203. Passage der MDEK-Zellenmedien entnommen, Die Gewebekulturröhrchen werden mit 0,2 ml des auf Schweinenierengewebe vermehrten ERA-Stammes mit einem Titer von etwa 10-3,4 pro 0,03 ml unmittelbar nadi der Einsaat der Zellensuspension beimpft. Die Kulturröhrchen werden in stationärer Stellung drei Tage bei 35 0C bebrütet, bis sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellenrasen ausgebildet hat. Dann wird das Nährmedium dekantiert und durch ein Erhaltungemedium ersetzt, das aus Eagle's Basalmedium mit-2 Prozent fötalem Kälberserum besteht. Die KulturrQhrchen werden hierauf in einer Rollertrommel langsam weitere vier wange bei 35°O erollt. Am siebten Tage nach der Beimpfung der Eewebekultur mit dem Virus wird die Kulturbrühe eingefroren und auftauen gelassen. Hierdurch werden die Zellwände zerstört und das intrazelluläre Virus in Freiheit gesetzt. Das erhaltene Gemisch wird von den Zelltrümmern durch Zentrifugieren befreit. in Teil des Überstands des zentrifugierten Gemisches wird als lnoculum für weitere frische Kulturröhrchen mit MDBK-Zellen verwendet. Ein weiterer Teil der überstehenden Flüssigkeit wird titriert, indem man ihn Mäusen intracerebral injiziert. Der Titer ist größer als 10-4,5 pro 0,03 ml.
• Beispiel 2 Das Verfahren von Beispiel 1 wird für eine Reihe von aufeine anderfolgenden Passagen in der MDBK-Gewebekultur unter Verwendung von 0,2 ml der geernteten flüssigen Virussuspensiom der vorhergehenden Passagen als Inoculum für die nachfolgende Passage wiederholt. In jeder dieser Passagen läßt man die MDBK-Zellen wachsen, bis sie einen zusammenfließenden einschichtigen.Zellenrasen gebildet haben, bevor.sie mit dem Saatvirus infiziert werden. Bei diesem Verfahren wird das Nährmedium dekantiert, sobald sich der Zell rasen gebildet hat, und jedem Kulturröhrchen werden etwa 2 ml des Erhaltungsmediums aus Eagle's Basalmedium, ergänzt mit 2 Prozent fötalem Kälberserum, unmittelbar vor der Zugabe von 0,2 ml des Virusinoculums zugegeben. Die beimpften Röhrchen werden hierauf in der Rollertrommel bei 35°C bebrütet. in Zeitabständen von 7 bis 11 Tagen nach der Beimpfung wird das Virus geerntet.-Bei diesen Verfahren werden Virustiter von me-hr als pro 0,03 ml bei jeder Passage erhalten. Nach drei derartigen zusätzlichen MDBK-Gewebepassagen hat die geerntete Flüssigkeit einen Titer von mehr als 10-6,4 sie besitzt einen Neutralisationsindex von 6 300, bestimmt durch intracerebrale 1njektion in mäuse unter Verwendung von Tollwut-Antiserum vom Kaninchen, das.gegen den stamm 980 des fixierten Tollwut-virus hergestellt wurde, Nach sechs weiteren derartigen passagen oder insgesamt sieben Passagen in MDBK-Gewebekulturen hat die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe nach dem Einfrieren und Auftauen und Abtrennen der Zelltrümmer einen liter vom 10-5,4 pro 0,03 ml. Diese Passagezahl stellt einen Verdünnungsfaktor von 10-12,4 des ursprünglich eingesetzten ERA-Stammes dar.
• Beispiel 3 Der ERA-Stamm des Tollwut-Virus wird -auf die in Beispiel 1 und 2 besohriebene weise in MDBK-Zellgewebekultu'r insgesamt vier aufeinander folgenden Passagen unterworfen. Die Kulturflüs--sigkeit aus der vierten Passage mit einem Virustiter von 10-6,4 wird als Saatvirus zur Herstellung eimer Vaccine verwendet. Für dieses Verfahren werden als Saatzellen MDBK-Zellen verwendet, die ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen sind und der 210. Passage der MDBK-Zellenlinie entstammen. Die MDBK-Zellen werden gemäß Beispiel 1 eingesät. Die Zellen werden in 1 Liter fassende Glasflaschen eingesät und fünf Tacfe bei 350C bebrütet. Dann hat sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellenrasen gebildet. Das Erhaltungsmedium wird dekantiert und die Saatvirusflüssigkeit zehn fach mit dem Erhaltungsmedium verdünnt und auf den Zellenrasen in einer Menge von 10 ml pro Flasche gegeben. Bei diesem Beimpfungsverfahren wird die Saatvirusverdünnung über den Zellenrasen gegossen, und die Kulturflasche wird in stationärer Stellung etwa 1 bit 2 Stunden bei einer Temperatur von 32 bis 370C gehalten, damit das Inoculum den Zelirasen bedeckt. Nach Beendigung dieser Adsorpeitonsperiode wird jede Flasche mit 90 ml Eagle's Basalmedium versetzt, das mit 2 Prozent fötalem KAlberserum ergänzt ist. Die Flaschen werden bei 350C bebrütet Während dieser Zeit werden die Flaschen stationär so gehalten, so daß das Nährmedium den Zellenrasen bedeckt.
• Am zehnten Tag nach der Bebrütung wird die Kulturbrühe eingefroren und auftauen gelassen. Zelltrümmer werden abzentrifugiert.
• Die überstehende Kulturflüssigkeit wird vereinigt und mit einem Lactose-Glutamat-Stabilisator versetzt. Der Stabilisator enthAlt 10 Gewichtsteile Lactose und 1 Gewichtsteil Monokaliumglutamat in 100 Gewichtsteilen Phosphatpuffer. Die ErnteflUssigkeit und der Stabilisator werden in einem Volumverhältnis von 5 Volumteilen Stabilisator zu 95 Volumteilen Erntefitssigkeit vereinigt.- Die erhaltene Vaccine wird durch intraöerebrale Injektion in Mäuse titriert. Der Titer beträgt etwa 10 5'3 pro 0,03 ml. Getrennte Anteile der erhaltenen Vaccine werden auf Temperaturen von -700C oder darunter eingefroren.
• Andere Anteile werden gefriergetrocknet und in sterilen Behältern aufbewahrt. Weitere-Anteile werden unmittelbar als Vaccine verwendet.
• Beispiel 4 Die gemäß Beispiel 3 hergestellte Lebendvaccine wird einer Gruppe von Katzen vetabfolgt, die vor der Vaccinierung durch herkömmliche serologische Methoden sich als frei von Tollwut-Antikörpern erwiesen haben. Bei der Vaccinierung wird das Produkt von Beispiel 3 in einer Dosis von 1 ml jeder Katze intramuskulär injiziert. Zwei Wochen nach der Vaccinierung haben die vaccinierten Katzen einen Tollwut-Antikörpertiter entwickelt, der wesentlich größer ist als die Titer von denen es bekannt ist, daß sie die Tiere gegen eine Infektion des Straßenvirus schützen. Der geometrische Mittelwert des Antikörpertiters, der bei den Katzen z-wei.Wochen nach der Vaccinierung beobachtet wird, ist größer als i : 121. Ähnlich hohe antikörperspiegel sind noch fünf Monate nach der Vaccinierung vorhanden. Dies zeigt e-ine ausgezeichnete Konversionsrate. Die Ronversionsrate bedeutet den Prozentsatz der-Tiere, die aufgrund der Vaccination Antikörper gebildet haben.
• Beispiel 5 Mehrere Gruppen von sechs Monate alten Kälbern, A, 13, C und D werden durch Serumncutralisationsverfahren auf die Anwesenheit von Antik-örpern gegen Tollwut untersucht, Sie hesitzen keine erkennbaren Antikörper. Danach werden die Kälber mit der Lehendvaccine von Beispiel 3 oder einer Verdünnung dieser Vaccine in einer-einzigen Dosis von 2 ml intramuskulä injiziert£- Kälber der Gruppe A erhalten die unverdünnte Vaccine, Kälber der Gruppe B eine zehnfache Verdünnung, der Gruppe C- eine llundertfache Verdünnung und der Gruppe D eine tausendfache Verdünnung. Zwei Wochen nach der Vaccinierung wird von den Kälbern Serum geazon--nen und in Mäusen zur Bestimmung der Antikörpertiter titriert.
• Die Kälber der Gruppe A, B und C haben Antikörper von mehr als 1 : 200, 1 : 140 bzw. 1 : 170, während die Kälber der Gruppe D Antikörpertiter von 1 : 67 aufweisen. Vier Wochen nach der Vaccinierung wird nochmals Serum gewonnen. Zu dieser Zeit beträgt der geometrische mittlere Antikörpertiter jeder Gruppe mehr als 1 : 120. Die Kälber der Gruppe C haben einen Antikörpertiter von mehr als 1 : 230. Keines der Kälber zeigte unerwünschte Reaktionen nach der Vaccinierung. Eine fortwährende Beobachtung über einen Zeitraum von vier Monaten zeigt, daß bei allen Kälbern der Antikörperspiegel weit über dem-lfert liegt, der zum Schutz der Kälber gegen einen virulenten Straßenvirus notwendig ist. Bei allen Kälbern traten keine ungünstigen Nebenwirkungen auf.
• Beispiel 6 Weitere Versuche mit der erfindungsgemäß hergestellten Lebendvaccine werden an Hunden durc-hgeführt. Bei diesen Versuchen werden vier Gruppen von Hunden A, B, C und D verwendet, bei denen duch Serumneutralisationsverfahren an Mäusen festgestellt.
• wurde, daß sie keine erkennbaren Antikörper gegen Tollwut besitzen. Hierauf werden die Herde intramuskulär mit 1 ml der Vaccine des Beispiels 3 oder einer Verdünnung dieser Vaccine vacciniert. Die Hunde der Gruppe A erhalten die unverdünnte Vaccine, der Gruppe B eine zehnfache Verdünnung, der Gruppe C eine hundertfache Verdünnung und'der Gruppe D eine tausendfache Verdünnung. Zwei Wochen nach der Vaccinierung wird den Hunden blut entnommen und der Antikörperspiegel im Serum bestimmt.
• Der bei jedem Hund beobachtete Antikörperspiegel ist vergleichbar oder größer als der Spiegel, der ausreicht, um Hunde gegen das Straßenvirus zu schützen. Der geometrische mittlere'Antikörpertiter in den Hunden der Gruppe A und in den Hunden der Gruppe D ist größer als 1 : 200. Vier Wochen nach der Vaccinierung wird erneut Serum. gewonnen und auf seinen Antikörpertiter untersucht. Der geometrische mittlere Antikörpertiter bei sämtlichen Gruppen ist~größer als 1 : 160. Zu keiner Zeit werden ungünstige Nebenwirkungen beobachtet. Vier Monate nach der Vaccinierung gewonnene Serumproben werden auf ihren Antikörpertiter gegen Tollwut untersucht. Der Titer ist ausreichend hoch7 um die Tiere gegen das Straßenvirus zu schützen. Bei den Hunden der Gruppe A und D beträgt der geometrische mittlere Antikörpertiter 1 : 140 bzw. 1 : 151.
• Die vorstehenden Beispiele erläutern die verbesserte Antigenität der erfindungsgemäß hergestellten ERA-Stamm-Vaccinen, die wurden in MDBK-RinderIIierengewehe erzeugt/und die Verbesserung des Virustiters dieser Vaccine. Die. verbesserte Antigenit;at dieser Vaccine wird erhalten, ohne daß gleichzeitig die Virulent des Virus gegenüber Hunden, Katzen oder Rindern erhöht ist. Das Verfahren der Erfindung läßt sich in verschiedener Weise abwandeln, um z.B. unterschiedliche Effekte bei der Virusausbeute zu erzielen oder die Produktion des modifizierten Virus mit einer größeren oder kleineren Zahl von Passagen in MDBK-Rindernierengewebekulturen zu erreichen, z.B. mit 1 Passageshis bis 10, bis 50, bis 100 oder mehr Passagen, Es können z.B. andere Nährmedien, wie mit fötalem Lämmerserum oder mit Antibiotica ergänztem Medium 199, verwendet werden. Ferner können chemisch definierte Medien verwendet werden, die-kein Serum enthalten. Die Beimpfung der: MDBK-Zellen mit dem Virus kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die Vaccine kann mehrfach geerntet werden, indem man in Ze. tabständen Virus enthaltende Kulturflüssigkeit vor dem Ernte intraceilulären Virus durch Einfrieren und Auftauen der Zellen abzieht. Weitere Passagen in primären Schweinegewebekulturen oder anderen geeigneten Geweben können entweder vor oder nach der Züchtung des ERA-Stammes in den MDBK-Rindernierengewebekulturen angewandt werden.

Claims (10)

P a tse n t a n s p r ü c h e

1) Verfahren zur Herstellung einer Tollwut-Lebendvaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man den abgeschwächten ERA-Stamm des Tollwutvirus, das zum Wachsen an Schweinenierenzellengewebe adaptiert worden ist, in Madin-Darby Gewebekultur von nicht-primären - rindrnierenzellen einer solchen - Anzahl von Passagen unterwirft, bis die Antigenität ausreichend erhöht ist.

2) Verfahren zur Vermehrung eines modifizierten, lebenden Tollwut-Virus des ERA-Stammes) der zur Vermehrung in Schweinenierenzellen adaptiert worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Madin-Darby Rindernierenzellen, die einer kont-inuioerlichen Rindernlerenzellenlinie entstammen, mit dem Virus infiziert und in einem Gewebekultur-Nährmediüm so lange inkubiert, daß Virusvermehrung erfolgt.

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man -die Inkubation etwa 3 bis 14 Tage bei Temperaturen von etwa 32 bis 370C durchführt.

4) Verfahren zur Herstellung einer Tollwut-Lebendvaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man ein lebendes, abgeschwächtes tollwut-Virus des ERA-Stammes, das an Schweinenierengewebekulturen adaptiert worden ist, das Tiere immunisiert, ohne schwere Nebenreaktionen in starkem Ausmaß zu erzeugten, in Madin-Darby Gewebekulturen von Rindernierenzellen einer Zellenlinie überimpft und das Virus und die Zellen in einer Nährflüssigkeit so lange inkubiert, dass Virusvermehrung erfolgt, und zumindest einen Teil des erzeugten-Virus erntet.

5) Verfahren zur Herstellung einer Tollwut-Lebendvaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man ein lebendes abgeschwächtes Tollwut-Virus, das zum Wachsen an Schweinenierengewebekulturen adaptiert worden ist, das Haustiere immunisiert, aber ohne schwere Nebenreaktionen in starkem Ausmaß zu erzeugen,jedoch keine hohen Antikörpertiter in Haustiere erzeugen kann, in Madin-Darby Gewebekulturen von Rindernierenzellen, die eine oder mehrere Passagen vom Primärgewebe entfernt sind, überimpft, das Virus und die Zellen in einer Nährflüssigkeit so lange inkubiert, daß Virusvermehrung erfolgt, mindestens einen Teil des erzeugten Virus erntet und in frsche Rindernierengewebeilturen überimprt und diese Kulturpassagen des Virus aufeinanderfolgend für eine genügende Anzahl von Passagen durchführt, bis ein hinsichtlich des Ausmaßes der Antikörperreaktion modifiziertes Virus erhalten wird.

6) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation etwa 5 bis 14 Tage bei Temperaturen von etwa 52 bis 570C durchführt,

7) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation bei Temperaturen von etwa 32 bis 370c durchführt und die Inkubation in der letzten Passage so lange fortsetzt, bis sich das Virus ausreichend vermehrt hat, das gebildete Virus isoliert und die erhaltene Vaccine gefriert.

8) Verfahren zur Herstellung einer Tollwut-Lebendvaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man ein lebendes abgeschwächtes Tollwut-Virus, das zum Wachsen an Schweinenierengewebekulturen adaptiert worden ist und das Tiere immunisiert, ohne schwere Nebenreaktionen in starkem Ausmaß zu erzeugten, in Rindernierenzellen Passagen unterwirft, indem man das Virus in Gewebekultu-Zellenlinie ren einer / von Madin-Darby Rindernierenzellen überimpft, die Zellen und das Virus 30 lange in einer Nährflüssigkeit inkubiert) die das Zellwachstum ermöglicht und gegenüber dem Virus ungiftig ist, so daß Virugsvermehrung erfolgt, mindestens in einen Teil des erzeugten Virus erntet und/frische Rindernierengewebekulturen überimpft und diese Kulturpassagen des Virus aufeinanderfolgend für eine solche Anzahl von Passagen durchführt, bis ein hinsichtlich des Ausmaßes der Antikörperreaktion modifiziertes Virus erhalten wird, ohne die Antigenität zu vermindern.

9) Verfahren zur Herstellung einer Tollwut-Lebendvaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man einen fixierten lebenden Tollwut-Virus des ERA-Stammes in Madin-Darby Rindernierengewebekulturen Passagen unterwirft, indem man das Virus in nicht-primären Rindernierengewebekulturen, die aus einer Zellenlinie stammen, überimpft, wobei diese Zellen ihrer Geschlchte nach frei von Verunreinigungen sind, das Virus und die Zellen in einer Nährflüssigkeit so lange inkubiert, daß stich das Virus vermehrt, mindestens einen Teil des erzeugten Virus erntet und in frische Rindernierengewebekulturen überimpft und diese Kulturpassagen aufeinanderfolgend wiederholt, bis ein Virus erhalten wird, welches im Hinblick aus das Ausmaß der Antikörperreaktion modifiziert ist.

10) Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bebrütung in der Endpassage so lange fortführt, bis Virus in genügender Konzentration vorhanden ist, das Virus erntet, gegebenenfalls mit einem Stabilisator versetzt und gegebenenfalls gefriertrocknet.