CN102680685B

CN102680685B - 羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法

Info

Publication number: CN102680685B
Application number: CN201210183987.6A
Authority: CN
Inventors: 陈德坤; 李�杰; 李前瑞; 田婷婷; 姚运亮; 许君艳; 罗军; 曹斌云
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2012-06-06
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2032-06-06
Also published as: CN102680685A

Abstract

本发明涉及一种羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法。其利用犊牛睾丸原代细胞，通过羊口疮病毒的连续传代培养，获得的第六代细胞培养液作为原核克隆的模板，通过原核表达获得可溶性表达蛋白，其表达的蛋白作为包被抗原，制备羊口疮抗体检测试剂盒，通过分析确定羊口疮的流行病学特点，为羊口疮流行病学调查提供依据。

Description

羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法。

背景技术：

羊传染性脓疱病俗称羊口疮(Sore mouth disease)，是羊口疮病毒感染引起的一种急性、接触性、嗜上皮性的人兽共患传染病,主要感染绵羊和山羊，世界动物卫生组织 (OIE) 将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。本病在世界上几乎所有的养羊国家和地区都有存在和发生，自然情况下主要侵害绵羊和山羊，山羊较为多发。本病常呈群发性流行，3-6月龄羔羊最易感染，成年羊发病较少，病羊和带毒羊是本病的传染源。病毒可随病羊的唾液、脓疱和水疱分泌物以及脱落的痂皮排出，其传播途径主要是经损伤的皮肤或黏膜而感染。健康羊与病羊直接接触，或接触被病羊污染的饲槽、饲料、饮水、用具、垫草、牧场及厩舍等而感染。

目前，随着我国奶山羊养殖业的大发展，各地之间进行奶山羊的交易越来越多，在运输的过程中可能引起其他地区羊口疮疾病的暴发流行，导致严重的经济损失。由于羊口疮是人畜共患病，许多地区都是人工挤奶，乳汁中可能含有羊口疮病毒，挤奶工因接触乳汁而感染发病，加之越来越多的人食用羊奶，羊奶中是否含有羊口疮病毒，其含量多少，会不会带来食品安全问题，这些都尚不清楚，因而需对羊群进行普查，检测其感染情况，确定各地区该病的流行病学特点，以便为预防和治疗、研发疫苗提供依据。目前的检测方法有很多，包括病毒的分离及鉴定、PCR检测、LAMP检测、免疫电镜分析、血清学检测等，这些方法具有操作复杂、费用高、不能大范围推广等缺点，对羊口疮的流行情况不能做出说明，而且都是在动物感染羊口疮病毒发病后才能进行检测，对刚感染羊口疮病毒不久尚未发病或形成隐性感染的动物不能进行检测。因此，寻找一种简便快捷、能大范围推广、对所有感染羊口疮病毒的山羊或绵羊都能进行检测的方法显得尤为重要。

发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，本发明提供一种羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法，其通过对羊口疮病毒特有的早期就开始表达的高度保守性基因进行原核表达，其表达产物作为间接ELISA包被抗原制备检测试剂盒，来检测待检血清中是否有抗羊口疮病毒的抗体，从而确定动物是否感染羊口疮病毒，为羊口疮的流行情况提供依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP的克隆与原核表达；3）原核表达蛋白与羊口疮病毒细胞培养液分别作为包被抗原，检测待检血清样品，通过比较确定哪种蛋白的检测效果好，从而确定最佳包被抗原，作为检测试剂盒。

步骤3）中，所述的羊口疮病毒细胞培养液来源于以患病山羊的口唇部结痂分离的羊口疮病毒为原料，经牛睾丸原代细胞扩增获得的第六代羊口疮病毒细胞培养液。

所述的步骤2）中，羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP的原核表达采用以羊口疮病毒细胞培养液作为模板，扩增羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP，与原核克隆载体pGEM-T easy连接，转化到DH5α感受态，将鉴定为阳性的菌液提质粒，质粒与表达载体pET-32a经双酶切后连接，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导并经镍柱纯化获得可溶性的目的蛋白。

步骤3）中，以羊口疮病毒早期表达蛋白作为间接ELISA包被抗原制备检测试剂盒，包括寻找抗原、阴阳性血清最佳稀释度，最佳包被液、最佳封闭液、最佳酶标抗体工作浓度、最佳待检血清和酶标抗体作用时间、最佳冲洗稀释液、最佳显色时间、最佳终止条件、抗原包被板保存期、羊口疮病毒抗体间接ELISA临界值的确定及阳性结果的判定，从而建立快速、敏感的ELISA检测方法，并做阻断试验和交叉试验和敏感性、重复性试验。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：使用羊口疮病毒早期表达蛋白的基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP进行原核表达，这些基因是羊口疮病毒特有的，在羊口疮病毒感染早期就开始进行表达，在不同病毒株间这些基因高度保守，其原核表达蛋白能够与羊口疮血清中的抗体特异性结合，检测我国患羊口疮的山羊或绵羊的血清样品。本实验表达的蛋白是可溶性蛋白，与天然蛋白的空间构象相一致，能更好的进行检测。与羊口疮病毒、病毒细胞培养液、羊口疮病毒超声裂解液作为间接ELISA包被抗原相比，采用原核表达蛋白作为包被抗原，其特异性强，敏感性高，能防止假阳性结果的出现。

附图说明：

图1为B2L、 F1L PCR产物琼脂糖电泳鉴定结果；

图2 VIR PCR产物琼脂糖电泳鉴定结果；

图3 CBP PCR产物琼脂糖电泳鉴定结果。

具体实施方式：

本发明通过进行羊口疮病毒早期表达蛋白基因的克隆及原核表达，将羊口疮病毒早期表达蛋白作为包被抗原建立检测试剂盒，检测血清中是否有抗羊口疮病毒的抗体，从而确定其感染情况和病毒的流行特点。

羊口疮抗体检测试剂盒的制备，包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP的克隆与原核表达；3）原核表达蛋白与羊口疮病毒细胞培养液分别作为包被抗原，检测待检血清样品，通过比较确定哪种蛋白的检测效果好，从而确定最佳包被抗原，作为检测试剂盒，确定其感染情况和病毒的流行特点。（4）羊口疮抗体检测试剂盒的建立及特异性、敏感性、重复性试验。

其中，所选用的基因为羊口疮病毒早期表达蛋白基因，是羊口疮病毒所特有的，在感染早期就开始进行表达，而且不同株间其相似性很高，能达到97%以上。这四种蛋白通过不断寻找可溶性表达条件，获得可溶性表达蛋白，其表达的蛋白与天然蛋白的空间构象几乎一致，能更好的进行检测，防止假阳性的出现。羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP都能刺激机体产生强烈的抗体反应，能与待检血清中的抗羊口疮病毒的抗体特异性结合。羊口疮病毒细胞培养液中除含有羊口疮病毒，还含有牛睾丸原代细胞表达的蛋白，其阳性血清应为山羊抗羊口疮病毒的抗体，这样就不会与牛睾丸原代细胞表达的蛋白结合，不会影响实验结果；原核表达蛋白作为包被抗原时使用的阳性血清为兔抗羊口疮病毒多克隆抗体。所建立的试剂盒能用于检测我国所有地区的待检山羊或绵羊血清样品，能大范围推广。

步骤2）中，羊口疮病毒早期表达蛋白基因的原核表达采用以羊口疮病毒细胞培养液作为模板，扩增羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP，与原核克隆载体pGEM-T easy连接，转化到DH5α感受态，将鉴定为阳性的菌液提质粒，质粒与表达载体pET-32a经双酶切后连接，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导并经镍柱纯化获得可溶性的目的蛋白。

步骤3）中，羊口疮病毒细胞培养液来源于以陕西省富平县患病山羊的口唇部结痂分离的羊口疮病毒为原料，经牛睾丸原代细胞扩增获得的第六代羊口疮病毒细胞培养液。

步骤3）中，以羊口疮病毒早期表达蛋白作为间接ELISA包被抗原制备检测试剂盒，包括寻找抗原、阴阳性血清最佳稀释度，最佳包被液、最佳封闭液、最佳酶标抗体（兔抗羊IgG-HRP）工作浓度、最佳待检血清和酶标抗体作用时间、最佳冲洗稀释液、最佳显色时间、最佳终止条件、抗原包被板保存期、羊口疮病毒抗体间接ELISA临界值的确定及阳性结果的判定，从而建立快速、敏感的ELISA检测方法，并做特异性试验(阻断试验和交叉试验)和敏感性、重复性试验。使用羊口疮检测试剂盒对云南省石林县、山东青岛、陕西省杨陵示范区奶山羊养殖基地的几千份奶山羊血清样本进行血清学调查，获得奶山羊羊口疮流行病学情况。

实施例：

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的保护范围。

1、奶山羊羊口疮病毒的分离与初步培养

采集患病奶山羊的口唇结痂放入灭菌青霉素瓶中，加入8～10ml含100IU/ml青链霉素的无菌PBS缓冲液进行浸泡。24～36h后将痂皮夹入研钵中加PBS进行研磨，直至研碎，再加PBS洗剩余残渣，将其放入另一新泡酸青霉素瓶中，把悬浊液置于4℃过夜。第二天取出悬浊液4000rpm，离心10min，取上清液0.22??m滤膜过滤除菌，300??L～500??L接种犊牛睾丸原代细胞，连续盲传5代后，再接种犊牛睾丸原代细胞后的72h～96h可观察到细胞病变。当细胞病变达到80%～90%后或细胞变圆，-20℃冰冻细胞培养液24h以上，反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物。

2、羊口疮抗体检测试剂盒的包被抗原的确定：

分别以羊口疮病毒、B2L蛋白、F1L蛋白、VIR蛋白、CBP蛋白作为包被抗原，确定抗原最佳包被浓度、抗体最佳稀释度，然后以抗原最佳包被浓度包被抗原，检测采集的山羊血清，通过与羊口疮病毒作为包被抗原的检测结果进行比较，确定出哪个蛋白的检测效果更好，从而确定羊口疮抗体检测试剂盒的包被抗原。

抗原最佳稀释度的确定：用0.05mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原F1L蛋白，按1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200，分别加入酶标板的1-8行，每孔100??L，37℃作用1h，置4冰箱过夜。用PBST洗5次，加1%BSA/PBS封闭,每孔加入250??L，37℃作用2h后倒掉，用PBST洗5次，用PBS按1：3200、1:64000、1:12800、1:25600、1:51200稀释兔抗羊口疮病毒阳性血清，加入酶标板的1、3、5、7、9列，阴性血清作同样处理加到2、4、6、8、10列， 11、12列为PBST 空白对照，每孔100??L， 37℃作用2.5h后倒掉，用PBST洗5次，每孔加100??L 1:5000稀释的鼠抗兔IgG-HRP，37℃作用2h后倒掉，用PBST洗5次，每孔加100??LTMB，37℃避光作用15min，加终止液2M H₂SO₄100??L，用酶标仪测OD_450nm值。经计算P/N值见下表1：

由表1可知F1L蛋白最佳稀释度为1：800，血清最佳稀释度为1：12800。

最佳抗原的确定：分别用不同抗原对应的最佳包被液按最佳稀释度稀释羊口疮病毒、B2L蛋白、F1L蛋白、VIR蛋白、CBP蛋白，作为包被抗原，分别加入各自的酶标板，每孔100??L，共96孔，37℃作用1h，置4冰箱过夜。然后用PBST洗5次，加相应的最佳封闭液封闭,每孔加入250??L，37℃作用1h后倒掉，用PBST洗5次，用PBS按每种抗原对应的最佳稀释度稀释兔抗羊口疮病毒阳性血清，加入酶标板的第1列，阴性血清作同样处理加到第2列， 3、12列为PBST 空白对照，4-11列加入待检血清，每孔100??L， 37℃作用2h后倒掉，用PBST洗5次，1、2、3列加100??L 1:5000稀释的鼠抗兔IgG-HRP，4-12 列加100??L 1:5000稀释的兔抗羊IgG-HRP，37℃作用2h后倒掉，用PBST洗5次，每孔加100??LTMB，37℃避光作用15min，加终止液2M H₂SO₄100??L，用酶标仪测OD_450nm值。经计算B2L、 F1L、VIR、CBP 和Orfv作为包被抗原检测西农羊场样品的平均值见下表2：

注：B2L蛋白、VIR蛋白、羊口疮病毒细胞培养液分别作为包被抗原，检测93份在奶山羊养殖场随机采取的血清样品的检测结果。

本发明建立的试剂盒能用于检测我国所有地区的待检山羊或绵羊血清样品，能大范围推广。

Claims

1.羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP的克隆与原核表达；3）原核表达蛋白与羊口疮病毒细胞培养液分别作为包被抗原，检测待检血清样品，通过比较确定哪种原核表达蛋白的检测效果好，从而确定最佳包被抗原，作为检测试剂盒；

步骤2）中，羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP的原核表达采用以羊口疮病毒细胞培养液作为模板，扩增羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP，与原核克隆载体pGEM-T easy连接，转化到DH5α感受态，将鉴定为阳性的菌液提质粒，质粒与表达载体pET-32a经双酶切后连接，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导并经镍柱纯化获得可溶性的目的蛋白；

步骤3）中，所述的羊口疮病毒细胞培养液来源于以患病山羊的口唇部结痂分离的羊口疮病毒为原料，经牛睾丸原代细胞扩增获得的第六代羊口疮病毒细胞培养液；

步骤3）中，以羊口疮病毒早期表达蛋白作为间接ELISA包被抗原制备检测试剂盒，包括寻找抗原、阴阳性血清最佳稀释度，最佳包被液、最佳封闭液、最佳酶标抗体工作浓度、最佳待检血清和酶标抗体作用时间、最佳冲洗稀释液、最佳显色时间、最佳终止条件、抗原包被板保存期、羊口疮病毒抗体间接ELISA临界值的确定及阳性结果的判定，从而建立ELISA检测方法，并做阻断试验和交叉试验和敏感性、重复性试验。