CN111139226A - 一株羊口疮病毒弱毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株羊口疮病毒弱毒株及其应用，该毒株是羊口疮病毒弱毒QFnm2015株，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201903。本发明通过对已分离的羊口疮病毒在羔羊睾丸细胞上增殖培养，通过连续传代培育出羊口疮病毒弱毒株，该病毒分离毒株对研制地方性ORFV的有效疫苗提供了优质的材料基础和选择空间，对于羊口疮的预防及治疗具有重要的意义。

Description

一株羊口疮病毒弱毒株及其应用
技术领域
本发明属于麻保沙星药物制剂技术领域，具体涉及一株羊口疮病毒弱毒株及其应用。
背景技术
羊口疮(Orf)又称羊传染性脓疱病(CE)，接触传染性脓疱性口炎，其主要由羊口疮病毒(Orfv)引起的一种接触性人畜共患病。ORF传染性强，发病率高。该病分布广泛，养羊的国家基本均有该病发生的相关报道，该病的发生对于养殖造成了严重经济损失，我国的养羊业均遭受影响。人也会被感染Orfv，主要症状有手部、鼻、嘴唇及面部出现丘疹，免疫失调者可出现非典型增生病变及自身免疫性障碍等并发症。Orfv是痘病毒科副痘病毒属中的典型代表。
目前并没有治疗羊口疮的特效药，所以对于羊口疮的预防工作就显得尤为重要，羊口疮疫苗现已研究出痂皮强毒疫苗、灭活疫苗、弱毒疫苗，但是到目前为止，灭活疫苗的保护力低，弱毒疫苗也有散播病毒和毒力反强的风险，应用的弱毒疫苗在免疫过程中仍效果不理想、保护率不高，到目前为止没有有效的疫苗用于羊口疮的防治。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一株羊口疮病毒弱毒株及其应用，该株具有较弱的毒力和很好的免疫原性。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一株羊口疮病毒弱毒株，是羊口疮病毒弱毒QFnm2015株，保藏编号为CCTCC NO：V201903，保藏日期为2019年3月29日。
进一步的，所述弱毒株是通过一株羊口疮病毒强毒株传代90代获得，所述强毒株是羊口疮病毒弱毒QD/2015株，保藏编号为CCTCC NO：V201963，保藏日期为2019年9月2日。
进一步地，所述羊口疮病毒强毒株在羊睾丸细胞上的TCID50为10-4.5，以及培养20代细胞毒TCID50结果为10-5.5，50代细胞毒TCID50结果为10-6，70代细胞毒TCID50结果为10-6.5，90代细胞毒TCID50结果为10-6.6。
第二个方面，本发明提供上述羊口疮病毒弱毒株在预防羊口疮病毒中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明通过对已分离的羊口疮病毒在羔羊睾丸细胞上增殖培养，通过连续传代培育出羊口疮病毒弱毒株，该病毒分离毒株对研制地方性ORFV的有效疫苗提供了优质的材料基础和选择空间，对于羊口疮的预防及治疗具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明实施例1的荧光定量PCR扩增结果图，其中M为DL2000 Marker； 1病料研磨液；2～3分离株。
图2为本发明实施例1的荧光定量PCR扩增曲线，其中2-1为PCR检测扩增曲线，2-2为PCR标准曲线，并且在图中：1～5：1×103～1×107copies/μL标准品； 6：检测20代细胞毒液；7：检测50代细胞毒液；8：检测90代细胞毒液；9：检测90代细胞毒液。
图3为本发明实施例1中ORFV-Q株B2L基因与其他25个国内外参考株的核酸同源性比对结果。
图4为本发明实施例1中F1L基因与选取的20个参考株的核酸同源性比对结果。
图5为本发明实施例1中VIR基因与选取的15个参考株的核酸同源性比对结果。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一株羊口疮病毒弱毒株的分离与鉴定方法，该弱毒株为 QFnm2015株，已经在中国典型培养物保藏中心提交保藏，保藏编号为CCTCC NO： V201903。该弱毒株是通过一株羊口疮病毒强毒株传代90代获得，所述强毒株是羊口疮病毒弱毒QD/2015株，也已经在中国典型培养物保藏中心提交保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201963。具体方法包括以下步骤：
一、强毒株的分离与鉴定
1材料准备
1.1病料
羊口疮痂皮：采自青岛某Orf发病养殖场，主要采集病羊唇部，口腔等病变明显部位的痂皮。(内蒙古农业大学传染病实验室保存)
1.2病毒株
ORFV/QD/2015：将从步骤1.1中获得痂皮进行病毒分离，得到的分离株由内蒙古农业大学兽医学院传染病教研室分离保存。
1.3实验动物
2～3月龄羔羊、成年羊由金宇宝灵生物制品有限公司提供。
1.4主要试剂
病毒基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自TIANGEN生物有限公司； DL-5000Marker、DL-1000Marker、2×Easy Taq SuperMix、质粒DNA小提试剂盒购自大连Takara宝生物公司；胎牛血清为Hyclone公司产品；胰酶、琼脂糖、酵母提取物为Sigma公司产品；碳酸氢钠粉末、链霉素、青霉素、无水乙醇、甲醛等化学试剂均为分析纯，购自呼和浩特宏之惠商贸有限公司。
1.5仪器
生物安全柜(Thermo)；PCR仪(Eppendof公司)；高压自动蒸汽灭菌器 (TOMY SX-500)；超速离心机(Sigma)；高速低温离心机；恒温培养箱；电子天平(德国Sartorius BS-210S)；微波炉(美的)；核酸电泳仪(Baygene)；水平电泳槽(Baygene)；紫外凝胶成像系统(Syngene)；恒温振荡培养器(Blue-pard)；电子显微镜(GEM-2000EX)，日本电子公司生产，内蒙古农业大学生科院提供。
2方法
2.1病料处理
用经过灭菌的生理盐水漂洗痂皮病料2次后剪碎，加入适量Hanks液充分研磨，再用Hanks液按1:5的体积比稀释成悬液，置-40℃和室温反复冻融三次，4000r/min离心10min，取上清用0.45um滤膜过滤，滤液经菌检为阴性后置-40℃保存待用。
2.2羔羊睾丸原代细胞的制备
(1)按无菌操作方法，摘取3月龄健康雄性绵羊睾丸1个，用含有双抗(青霉素、链霉素各300IU/mL)的Hanks液冲洗采集的睾丸组织3次。
(2)剥离鞘膜及白膜后，用组织剪将其剪碎，含双抗的Hanks液冲洗组织3 次。
(3)将所有组织吸入100mL玻璃瓶内，加入5倍于睾丸组织量的0.25％胰蛋白酶溶液后，37℃水浴消化30min，至睾丸组织呈蓬松状。
(4)弃掉瓶内液体，用含双抗的Hanks液清洗3次后，加入3mL细胞培养营养液反复吹打。
(5)将吹打分散的睾丸组织经高压灭菌处理的六层纱布过滤后，加入剩余细胞培养营养液。
(6)分装后，于37℃恒温培养箱中培养。
2.3羊睾丸细胞的传代
首先倒掉原细胞培养瓶中的营养液，用少量消化液先冲洗2次，然后再加入0.3mL左右消化液，盖好瓶盖后用肉眼观察，直到细胞面呈流沙状，或显微镜下观察到细胞完全脱离，然后用10mL吸管吸取3mL已配好的细胞生长液反复吹打消化好的细胞，使其完全脱壁并分散，补齐营养液，最后分装到各培养瓶中，盖紧瓶盖，放置37℃生化恒温培养箱中培养，并逐日观察其生长情况。
2.4病毒接种
挑选形态完好且长成致密单层的羊睾丸细胞，弃掉培养瓶中的细胞培养液，用Hanks液清洗细胞2次，接种已处理的病毒液1mL，对照细胞接1mL的生理盐水，37℃吸附1h，加入MEM维持液后置于细胞培养箱37℃继续培养，观察细胞病变(CPE)，当细胞出现80％病变时收毒，反复冻融3次后继续传代
2.5病毒毒力(TCID50)的测定
(1)将羊睾丸细胞培养于96孔板中，每个孔所加营养液为0.18mL。
(2)取无菌EP管10个，置于提前准备好的试管架上，每个EP管中加入 900uLHanks液，用无菌处理的移液管吸取100uL羊口疮病毒液加入到第一个离心管中，反复吹打混匀，再从第一个离心管中吸取100uL混合液加入到第二个管中，同样充分混匀，照这种方法，一直到第10个管。根据此方法，我们对病毒液做了10倍梯度稀释。
(3)待步骤(1)中的细胞长成致密单层，弃掉每个孔中的营养液，用Hanks清洗两次，然后每孔接入已经稀释好的病毒液20uL，每个稀释梯度做8个重复，从10-1、10-2、10-3等，从左到右每个梯度一列8个孔，其余两排16个孔作为对照。
(4)将培养板放置于37℃培养箱中培养，每日观察孔中细胞的病变，观察5d，最后用Reed-Muench法计算分离株TCID50。
2.6动物回归实验
将4只三月龄羔羊分为两组，实验组3只，对照组1只，取产生稳定病变的细胞培养物病毒液，在羔羊的唇部划痕接种，每只接种1mL，对照羊只以同样方法接种等量生理盐水，并与实验组隔离饲养。接种后观察接种部位病变，每天测量体温、记录临床症状和拍照，实验组的羔羊均表现出羊口疮发病症状，并且确诊为典型的羊口疮。
2.7病毒PCR鉴定
2.7.1引物设计与合成
根据GenBank中已公布的羊口疮病毒F1L基因序列(登录号为KC569751) 和病毒全基因组序列(登录号：JN613810)，利用软件Premier 6.0设计特异性引物，由上海生工合成，引物序列和目的片段大小见下表1。
表1 F1L扩增PCR引物信息
Figure RE-GDA0002400594090000061
2.7.2病毒DNA的提取
用TIANGEN病毒DNA提取试剂盒从产生稳定病变的分离株细胞培养液中提取病毒总DNA，操作方法及步骤按试剂盒说明书进行。
2.7.3 PCR扩增
以提取的羊口疮病毒的总DNA为模板，进行PCR扩增，取6μLPCR产物，配制1.5％琼脂糖凝胶，1×TAE中，以110V电压进行电泳，电泳30min，完毕后经凝胶成像系统观察结果并记录。具体的反应体系和反应参数如下：
PCR反应体系(25μL)为：
2×Easy Taq SuperMix 12.5μL，
上游引物(10μmol/L)1.0μL，
下游引物(10μmol/L)1.0μL，
DNA模板1.0μL，
RNase-Free ddH2O 9.5μL；
实验PCR扩增反应具体参数为：预变性95℃5min，变性94℃30s，退火 Tm 30s，35个循环；延伸72℃30s，终延伸72℃10min；扩增结果如图1和2 所示。
2.7.4琼脂糖凝胶目的片段的回收
按照TIANGEN胶回收试剂盒说明书操作
2.8目的片段与载体pMD19-T的连接
表2载体连接体系
体系组分 各组分体积(μL)
目的基因片段回收产物 4
pMD19-T载体 1
SolutionⅠ 5
2.9重组质粒的转化
(1)从-80℃冰箱中取出E.coli DH5ɑ感受态细胞放在冰上融化，待稍微化开，用枪头轻试，稍微有些冰即可。
(2)取过程2.2.10.5中的10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，用手指轻弹混匀，冰浴20min。
(3)将EP管立刻放入42℃水浴锅中，热激90sec，热激结束后立即取出。
(4)冰浴2min，时间需要准确。
(5)在无菌条件下加入890μL LB液体培养基，轻轻混匀。
(6)放入摇床，保持37℃，150rpm慢摇1h。
(7)恢复室温后，放入离心机中设置4000rpm，离心5min。
(8)弃去800μL上清液，用移液器轻轻吹打管底菌液，充分混匀，用涂布器涂于含有氨苄青霉素的LB平板上。
(9)37℃倒置平皿培养16h左右，待出现单个菌落，立即取出。
2.10阳性菌的筛选
在恒温培养箱中取出倒置的平皿，观察菌落大小和蓝白斑出现情况，如果菌落太小，则需继续放置于培养箱中，直至菌落较大，能被挑起；如果蓝斑太少或者未出现，则需放置4℃，待出现较多蓝斑后取出。提前在10mL的EP管中移入5mL的LB液体培养基，在无菌工作台上用灭菌的接种环挑取单个白色菌落，尽量挑取间距较大、在平皿边缘位置的菌落，然后迅速接种到含Amp+的液体培养基中。盖上管盖后放入摇床，保持37℃、200rpm慢摇16h。当菌液密度较大(培养基底部有菌落沉淀出现，摇匀后出现浑浊)，可停止摇菌。短时间保存可放置4℃，如需长时间保藏，需加入甘油保藏，使其甘油体积占菌液总体积的15％～20％，并置于-40℃。
2.11重组质粒的提取
(1)取1.5mL经过夜培养的菌液，加入高压灭菌的EP管中，使用离心机 12000rpm，离心5min，弃去上清液。
(2)向EP管中加入250uL的溶液P1，用移液器枪头完全悬浮菌液沉淀。
(3)将250uL的溶液P2加入EP管中，然后温和的将EP管上下翻转8 次，完全裂解菌体。
(4)向EP管沿壁加入350uL溶液P3，同样温和翻转8次，12000rpm，离心10min。
(5)将步骤(4)的上清液转入吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，弃掉废液。
(6)用移液器向CP3中加入500uL的PD溶液，充分混匀，12000rpm离心 1min，弃废液。
(7)再向CP3中加入600uL溶液PW，12000rpm离心1min，弃废液。
(8)重复以上操作步骤(7)。
(9)将吸附柱重新放回离心管中，空离心2min，彻底去除残留的溶液PW。
(10)将吸附柱转移到另一个灭菌的EP管中，向中部悬空滴加50uL无菌水，室温静置3min，12000rpm离心2min，弃吸附柱，将EP管中质粒放入-20℃保存。
2.12质粒测序
根据2.2.10的结果，挑选最亮的目的条带所属样品进行OD值检测，符合测序结果的质粒送上海生工测序。
2.13核苷酸的同源性分析
运用DNAStar软件，选取GenBank中己经发表的国内外羊口疮病毒的B2L 基因、FIL基因和VIR基因序列与本分离株ORFV-Q相关基因进行同源性比较分析。结果表明，ORFV-Q株B2L基因与其他25个国内外参考株的核酸同源性为96.8％、 98.9％(图3)；F1L基因与选取的20个参考株的同源性为96.25、99.9％(图4)； VIR基因与选取的15个参考株的同源性为94.9％、99.8％(图5)。
小结：利用羊睾丸细胞成功分离出一株羊口疮病毒，命名为QD/2015株(保藏号为：CCTCC NO：V201963)，其在羊睾丸细胞上的TCID50为10-4.5/0.1ml，该毒株为强毒株，临床症状表现为典型的羊口疮发病症状。
二、弱毒株的传代与鉴定
1材料
1.1病毒株羊口疮病毒QD/2015株。
1.2动物2～3月龄羔羊、成年羊由金宇宝灵生物制品有限公司提供，
1.3荧光定量PCR TaqMan探针:由内蒙古农业大学兽医学院传染病教研室提供。
1.4主要试剂
MEM、胰蛋白酶、胎牛血清等购自Gibco公司，水解乳蛋白、生理盐水、甲酸等由实验室配制，病毒基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司， Montanide ISA 201 VG佐剂、Montanide ISAⅡR VG佐剂购自法国Seppic公司，红细胞裂解液购自Solarbio科技有限公司，CD4+、CD8+荧光单克隆抗体购自美国 BD公司。
1.5主要仪器
HW.SYⅡ-K2型电热恒湿水浴锅、BJ-2CD型双人单面垂直净化工作台超净工作台、HZQ-X300型电热恒温培养箱、Eppendorf 5417R小型台式高速冷冻离也机、 BCD-215KAJ型低温冰箱、SX-500型高压锅、G:BOX紫外凝胶成像系统、梯度PCR 仪等由内蒙古农业大学兽医学院传染病实验室提供。
2方法
2.1羊口疮病毒的増殖
2.1.1羊睾丸细胞的制备
(1)无菌条件下采集2～3月龄黑羊睾丸放入无菌平皿内。
(2)将羊睾丸置于超净工作台内用Hanks液冲洗3遍，用无菌剪镊将其移至另一无菌平皿内，剪去白膜、鞘膜用Hanks液冲洗3遍。
(3)将组织剪碎，Hanks液冲洗3遍。
(4)以无菌吸管将其无菌处理过的100mL瓶中，加入0.25％的胰酶约组织的4～ 5倍)，置于37℃水浴锅消化30min，每隔10min摇晃一次，消化至组织成蓬松状。
(5)吸弃消化液，Hanks液冲洗3次。
(6)加入少量配好的营养液，反复吹打。
(7)经无菌处理过的，六层纱布、漏斗将其过滤至细胞瓶，补液，分装每瓶8mL 液体。
(8)将分装好的细胞水平放入37℃恒温培养箱，使其贴壁生长。
2.1.2羊睾丸细胞的传代
(1)当细胞贴壁长满，无菌条件下弃去细胞液，用消化液快速洗3次。
(2)加消化液于培养瓶中，封闭细胞瓶，在倒置显微镜下观察，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下细胞瓶后加3mL培养液终止消化。
(3)10mL无菌吸管反复吹打，待细胞完全被吹散成单个细胞补齐培养液，轻轻吹打匀后吸出一半，分装到新的培养瓶中，放入37℃恒温培养箱培养。
2.1.3羊口疮病毒的接种
(1)取嘉羊睾丸原代细胞进行细胞培养，待细胞铺满细胞瓶壁时弃去培养液，向细胞瓶接种己分离的强毒株800μL，对照瓶加入维持液800μL，同时放入 37℃恒温培养箱吸附1h后补齐维持液至8mL后放入37℃恒温培养箱。
(2)观察细胞病变情况，当细胞脱落至70％以上，且呈现拉网状时，将其放入－20℃冻融3次后做F1代毒备用。
(3)将强毒株接种到铺满细胞瓶的细胞中，依次增殖，接种传代至90代。取10代、20代、59代、70代、90代细胞毒冻存，做TCID50检测病毒滴度及荧光定量PCR检测病毒含量，其中传代到90代的弱毒株即为本申请提交保藏的弱毒株。
实施例2
羊口疮病毒相关测试
1羊口疮病毒荧光定量
1.1 PCRTaqMan探针：由内蒙古农业大学兽医学院传染病教研室提供。
1.2主要试剂
MEM、胰蛋白酶胎牛血清等购自Gibco公司，水解乳蛋白、生理盐水、甲醛等由实验室配制，病毒基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司， Montanide ISA 201 VG佐剂、Montanide ISA 11 R VG佐剂购自法国Seppic公司，红细胞裂解液购自Solarbio科技有限公司，CD4+、CD8+荧光单克隆抗体购自美国BD公司。
1.3主要仪器
HW.SY11-K2型电热恒温水浴锅、BJ-2CD型双人单面垂直净化工作台超净工作台、HZQ-X300型电热恒温培养箱、Eppendorf 5417R小型台式高速冷冻离心机、BCD-215KAJ型低温冰箱、SX-500型高压锅、G：BOX紫外凝胶成像系统、梯度PCR仪等由内蒙古农业大学兽医学院传染病实验室提供。
1.4羊口疮病毒荧光定量PCR的测定
将前面获取的强毒株在羊睾丸细胞上培养传代20代、50代、70代、90代细胞病毒液的DNA，参照已内蒙古农业大学兽医学院传染病教研室建立的 TaqMan探针荧光定量PCR方法对羊口疮病毒进行检测。所用引物、探针、反应参数与条件均由本教研室提供，其引物和探针和反应体系如表3所示。
表3 TaqMan探针法引物及探针序列
Figure RE-GDA0002400594090000131
TaqMan实时荧光定量PCR反应体系：
Premix Ex TaqT M(Probe qPCR)：2×10μL，
上游引物10μmol/L：0.6μL，
下游引物10μmol/L：0.6μL，
TaqMan 10μmol/L：0.5μL，
DNA模板：1.0μL，
超纯水：7.3μL，
合计：20μL；
TaqMan实时荧光定量PCR反应参数：预变性95℃30s，变性95℃5s，退火 58℃30s，45个循环；延伸58℃30s。
2羊口疮病毒的相关检验
2.1 TCID50试验结果
强毒株在羊睾丸细胞上的细胞毒TCID50结果为10-4.5，及培养20代细胞毒TCID50结果为10-5.5，50代细胞毒TCID50结果为10-6，70代细胞毒结果为10-6.5，90代细胞毒TCID50结果为10-6.6，如表4所示为90代细胞毒TCID50结果。
表4 90代细胞毒TCID50结果
Figure RE-GDA0002400594090000141
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝(77％-50％)/(77％-33％)＝0.61；
lgTCID50＝-6+0.61*1＝-6.61；
TCID50＝10-6.6；
2.2羊口疮病毒荧光定量PCR测定结果
运用传染病教研室建立的TaqMan荧光定量PCR方法对羊口疮病的在羊睾丸细胞上培养的20代、50代、70代和90代细胞毒液进行定量检测，结果均为阳性，阴性对照未出现扩增曲线。所选取的浓度为1×103～1×107copies/μL 标准品，其线性关系良好，相关系数R2＝0.998，扩增效率(Eff﹪)＝87.61，起始拷贝数的对数与Ct值的表达式为y＝-3.66x+4.622。
2.3羊口疮病毒灭活效果检验结果
将37℃以0.4甲醛灭活48h的传代90的弱毒株接种于羊睾丸细胞上观察3～5天，结果显示细胞没有产生病变，盲传3代后细胞仍然没有产生病变，病毒已灭活不具备感染能力。
综上，本发明通过对已分离的羊口疮病毒在羔羊睾丸细胞上增殖培养，通过连续传代培育出羊口疮病毒弱毒株，该病毒分离毒株对研制地方性ORFV的有效疫苗提供了优质的材料基础和选择空间，对于羊口疮的预防及治疗具有重要的意义。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.一株羊口疮病毒弱毒株，其特征在于：是羊口疮病毒弱毒QFnm2015株，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201903。
2.根据权利要求1所述的一株羊口疮病毒弱毒株，其特征在于：所述弱毒株是通过一株羊口疮病毒强毒株传代90代获得，所述强毒株是羊口疮病毒弱毒QD/2015株，保藏编号为CCTCC NO：V201963。
3.根据权利要求1所述的一株羊口疮病毒弱毒株，其特征在于：所述羊口疮病毒强毒株在羊睾丸细胞上的TCID50 为10-4.5，以及培养20代细胞毒 TCID50 结果为10-5.5，50代细胞毒TCID50 结果为10-6，70 代细胞毒 TCID50 结果为10-6.5，90代细胞毒 TCID50结果为10- 6.6。
4.权利要求1~3任意一项所述的一株羊口疮病毒弱毒株在预防羊口疮病毒中的应用。
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