PT1345658E - Métodos e vacinas para proporcionar protecção in ovo contra a rinotraqueíte do peru. - Google Patents

Description

ΡΕ1345658 1 DESCRIÇÃO "MÉTODOS E VACINAS PARA PROPORCIONAR PROTECÇÃO IN OVO CONTRA A RINOTRAQUEÍTE DO PERU" Âmbito da Invenção A invenção refere-se a métodos úteis para conferir a protecção in ovo contra a rinotraqueite do peru (TRT) e/ou o "Síndrome da Cabeça Inchada" (SHS) em hospedeiros aviários tais como perus e galinhas. Mais particularmente, provou-se que as vacinas contra TRT eram tanto seguras como eficazes através da administração in ovo eficaz a hospedeiros aviários tal como aqui descrito.

Antecedentes da Invenção A TRT é uma infecção das vias respiratórias superiores dos perus que é causada por um pneumovirus. É uma doença aguda altamente contagiosa que afecta perus de todas as idades. Os sintomas clínicos da infecção por TRT incluem uma descarga nasal significativa, frequentemente espumosa, rala, estalidos, espirros e abanar da cabeça. Podem também ser observadas descargas oculares ou inchaço nos seios infraorbitais nos perus infectados.

Foram detectados anticorpos contra o vírus TRT (TRTV) nalguns bandos de galinhas (tanto em animais para 2 ΡΕ1345658 abate com em reprodutores) que sofriam do Síndrome da Cabeça Inchada (SHS). Postula-se que o TRTV desempenha um papel na etilogia de SHS e de dificuldades respiratórias relacionadas.

Ricks, C. e tal (1999): Advances in Veterinary Medicine, Vol. 41, páginas 495-515, apresenta uma tecnologia de vacinação in ovo. No. 99/53950 apresenta uma vacina para TRT que contém interferão.

As vacinas para a TRT comercialmente disponíveis não são administradas in ovo. Pelo contrário, são administradas após a saída do ovo numa variedade de formatos. Tipicamente, tais vacinas são administradas através dos métodos trabalhosos de pulverização (por exemplo, pulverização manual, com pulverizador de costas, ou com equipamento de pulverização automatizado) ou através de gotas (oculares ou nasais) .

Tal como explicado em maior detalhe abaixo, os métodos de administração in ovo de utilização de vacinas TRT modificadas para a utilização in ovo proporciona vantagens diferenciadoras relativamente às vias de administração após saída do ovo inconvenientes e morosas actualmente disponíveis.

Sumário da Invenção A presente invenção utiliza vacinas para TRT comercialmente disponíveis adaptadas para os métodos in ovo 3 ΡΕ1345658 de administração da presente invenção. Os resultados experimentais estabelecem a segurança e a eficácia da administração in ovo destas vacinas a perus e a galinhas utilizando os parâmetros de dosagem apropriados.

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para proteger o hospedeiro aviário contra TRT e/ou dificuldade respiratória relacionada com TRT ou SHS através da administração in ovo de tais vacinas. É assim objecto da presente invenção proporcionar um método de protecção de hospedeiros aviários contra TRT e/ou dificuldade respiratória relacionada com TRT ou SHS que proporcione elevados teores de TRTV em comparação com aves convencionalmente vacinadas, utilizando menores quantidades de antigénio de vacina, resultando assim em redução de custos.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção proporciona um método de imunização de hospedeiros aviários in ovo contra TRTV, proporcionando assim protecção contra TRT e/ou dificuldade respiratória relacionada TRT e SHS. As vacinas utilizadas nos métodos da presente invenção podem ser preparadas com vantagem a partir de vacinas para TRT comercialmente disponíveis. Especialmente adequada para utilização na presente invenção é a vacina comercialmente disponível Poulvac® TRT, disponível da Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa ou Weesp, Holanda. A formulação de Poulvac® TRT 4 ΡΕ1345658 contém TRTV atenuado, estirpe K, com um teor não inferior a 103'2 TCID50 por dose e não está aprovada ou indicada para administração in ovo. Ao longo deste pedido de patente, "TCID50" refere-se a uma dose infecciosa de 50% da cultura de tecido. A vacina é ressuspendida num veiculo adequado de modo a proporcionar um TCID50 na gama de 103'2 a 104'5, e é administrada numa quantidade de aproximadamente 0,05 a 0,1 mL por ovo, dependendo da espécie de ave que está a ser imunizada. A administração pode ser manual, mas é mais tipicamente e economicamente administrada utilizando equipamento de injecção de ovos tal como aquele disponível de Embrex, Inc., Carolina do Norte. A dose exacta a ser administrada dependerá da espécie de ave à qual a vacina é administrada, por exemplo, aves de menor porte necessitarão de doses mais baixas. A administração da vacina ocorre ao 24° dia de incubação ou antes (por exemplo, perus), por exemplo ao 18° dia de incubação ou antes (por exemplo, galinhas).

Os hospedeiros aviários para os quais as vacinas e os métodos da presente invenção destinados incluem galinhas, patos, perus, gansos, galinhas de Bantam, codornízes e pombos. As espécies de ave preferidas são aquelas que são aves de criação comercialmente importantes tais como galinhas, patos e perus.

Descobriu-se surpreendentemente que não só o método de vacinação in ovo era mais seguro e fácil de 5 ΡΕ1345658 administrar, mas como foram encontrados teores mais elevados em hospedeiros aviários que tinham sido imunizados deste modo.

Além disso, a vacina e o método de administração não resultam substancialmente em qualquer decréscimo na percentagem de ovos em que ocorre eclosão após a vacinação in ovo, quando se compara com um grupo controlo substancialmente idêntico (não vacinado). Preferentemente, esta diminuição é inferior a cerca de 10%, e mais preferentemente é inferior a cerca de 5% em relação à percentagem de ovos que eclodem no grupo de controlo. Ainda mais desejável é um decréscimo de menos do que cerca de 1-2%. Nalgumas realizações, a vacina e o método da invenção podem até aumentar o número de ovos que eclodem, por vezes até cerca de 1-2% ou mesmo mais. Assim, a vacina é simultaneamente segura e eficaz para administração a espécies aviarias tais como galinhas e perus.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Estudo de segurança para administração in ovo a perus.

Ovos de peru férteis para incubação foram obtidos de bandos de perus que se sabe não terem TRTV e eu não tinham sido previamente vacinados contra TRT. Estes ovos foram aleatoriamente atribuídos a 2 grupos diferentes.

Ao primeiro grupo de 76 ovos férteis administrou- 6 ΡΕ1345658 se a vacina in ovo no dia 24 de incubação. 0 primeiro dia de incubação é considerado dia 0. Os ovos são postos aproximadamente 2-7 dias antes da incubação. Utilizou-se Poulvac® TRT (lote TR015, data de expedição 24 de Junho de 1997 contendo um teor de 107'5 TCID50) para preparar a vacina in ovo. Ressuspendeu-se cada um de três frascos do produto comercial em 10 mL de solução salina estéril de modo a originar uma suspensão resultante com um teor de 105'5 TCID50 de vacina por cada 0,1 mL. Estes conteúdos foram bem misturados e separados em aliquotas. Estes conteúdos misturados/aliquotados são designados daqui para diante no Exemplo 1 como "IOV". A administração in ovo utilizou 0,1 mL do IOV por ovo contendo um teor de 105'5 TCID50 foi injectada no fluido amniótico de cada um dos 76 ovos férteis. Depois, estes ovos foram imediatamente colocados num incubador (sem serem voltados) e deixados a incubar no galinheiro isolado nos quais foram alojados. Estes ovos/eclosões referem-se como as aves vacinadas.

Um segundo grupo de 66 ovos férteis não foram vacinados e deixaram-se eclodir em condições semelhantes num segundo galinheiro isolado. Estes ovos/eclosões referem-se como as aves de controlo negativo.

Tanto para as aves vacinadas como para as aves de controlo negativo, a eclosão foi registada nos dias 27, 28 e 29 de incubação. A Tabela 1 apresenta as percentagens de eclosão observadas experimentalmente. Em relação à eclosão, 7 ΡΕ1345658 a vacinação in ovo da presente invenção produziu resultados excelentes com eclosão de 93,4% dos ovos vacinados em comparação com 92,4% para a eclosão de ovos de controlo negativo.

Tabela 1: Percentagens de Eclosão

Aves Dia 27 Dia 28 Dia 29 Total Vacinadas 19,7% 73,7% 0% 93,4% Controlo Negativo 28,8% 63, 6% 0% 92, 4%

Após a eclosão, 25 aves de cada grupo (ou seja, as aves vacinadas e as aves de controlo negativo) foram seleccionadas aleatoriamente e colocadas no chão em aparas de cada um dos respectivos galinheiros de isolamento. As restantes aves de cada grupo foram eliminadas.

No interior de cada grupo, cada ave foi examinada diariamente relativamente a sinais clínicos durante um período de 21 dias. A presença de exsudado nasal foi avaliada pressionando o bico. A gravidade da doença clínica foi classificada de acordo com a Tabela 2.

Tabela 2: Sistema de Pontuação Clínica

Pontuação Sintomas observados experimentalmente 0 nenhum 1 exsudado nasal claro 2 exsudado nasal truvo 3 seios infraorbitais inchados ou olhos espumosos e 1 ou 2 ΡΕ1345658 A pontuação diária de um grupo de aves foi calculada somando as pontuações individuais de cada ave nesse dia. A Tabela 3 apresente os sinais clínicos observados experimentalmente utilizando o sistema de pontuação relativa da Tabela 2.

Tabela 3: Resultados de Exame Clínico de Aves Vacinadas # Ave Idade da ave examinac la, em dias 3 4 5 6 7 8 9 10 11 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 77 0 0 1 1 0 0 0 0 0 78 0 0 1 0 2 0 0 0 0 79 0 0 0 2 0 0 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 81 0 0 0 0 0 0 0 0 0 82 0 0 0 0 0 0 0 0 0 83 0 0 0 0 0 0 0 0 0 84 0 0 0 0 0 0 0 1 0 85 0 0 0 0 0 0 0 0 0 86 0 0 0 0 0 0 0 0 0 87 0 0 0 2 1 2 0 0 0 88 0 0 0 0 0 0 0 0 0 89 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90 0 2 2 2 2 0 0 0 0 91 0 0 0 1 2 2 2 0 0 92 0 0 0 0 0 0 0 0 0 93 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 ΡΕ1345658 (continuação) # Ave Idade da ave examinac la, em dias 3 4 5 6 7 8 9 10 11 94 0 0 0 0 0 0 0 0 0 95 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 97 0 0 0 1 0 0 0 0 0 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 99 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 2 0 0 Total 0 2 4 9 7 4 4 1 0 Pontuação média/ave 0 0,08 0,16 0,36 0,28 0,16 0,16 0,04 0 # Positivos 0 1 3 6 4 2 2 1 0

As aves de controlo negativo foram igualmente examinadas relativamente a quaisquer sinais clínicos e não se observaram nenhumas anomalias, ou seja, tinham todas uma pontuação de zero.

Os resultados das observações acima estabelecem a segurança dos métodos de vacinação in ovo da presente invenção. A Pontuação média/Ave mais elevada (ou seja, 0,36) para aves com 6 dias de idade proporcionou uma margem de segurança adequada e indicou apenas sintomas ligeiros de TRT. 10 ΡΕ1345658

Foi também realizada análise serológica através da recolha de sangue de 10 aves no bando parental 6½ semanas após a date na qual foram recebidos os ovos. Também se recolheu sangue dos seguintes 4 grupos de aves: (a) a uma idade de 1 dia, de 20 aves de controlo negativo; (b) a uma idade de 21 dias, de 21 aves de controlo negativo; (c) a uma idade de 1 dia, de 20 aves vacinadas; e (d) a uma idade de 21 di, de 20 aves vacinadas. A análise serológica das amostras sanguíneas individuais indicou teores de anticorpos contra TRTV. Esta análise utilizou a técnica de ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay) que utiliza um antigénio de tipo A e expressa como teores 2log. Os teores de 2log h 6,0 medidos experimentalmente foram tomados como positivos. A média geométrica (MG) e o desvio padrão (DP) dos teores medidos experimentalmente também foram calculados. A análise dos teores estabeleceu os seguintes resultados. O bando de perus parental estava livre de TRTV [ver MG = 5,04 em comparação com o valor limite de positividade > 6,0]. Das 10 aves, uma tinha um teor elevado de 7,7- Ainda, os teores MG para as aves de controlo negativo com 1 dia de idade e das aves vacinadas eram praticamente idênticos; isto é, respectivamente, 4,05 e 4,06. No entanto duas aves do grupo das aves vacinadas tinham teores positivos [ver valores dos teores de 7,1 e 8,1 - cada um > 6,0]. Pelo contrário, 11 ΡΕ1345658 nenhuma das aves de controlo negativo tinha teores á 6,0. O DP para as aves de controlo negativo e para as aves vacinadas foram, respectivamente, 0,82 e 1,46.

Os testes de amostragem sanguínea também mostraram diferenças claras nos teores medidos experimentalmente. Para as aves controlo negativo a MG aumentou para 3,53 e o DP diminuiu para 0,46. Em contraste directo, para as aves vacinadas, a MG aumentou para 10,53 e o DP aumentou para 0,85. Deste modo, as aves vacinadas tinham teores de TRTV mais elevados.

Nas aves vacinadas, a resposta serológica a uma idade de 21 dias era muito elevada. Esta resposta era ainda mais elevada do que aquele tipicamente encontrada utilizando a mesma dose (através de vacinação com gotas oculares) em aves de 1 dia de idade. Teores de anticorpo TRTV com uma MG = 10,5 são normalmente apenas observados após um teste com uma estirpe virulenta de TRTV, Para comparação, dois ensaios utilizando vacinas por gota oftálmica com 105'5 TCID50 Poulvac® a perus susceptíveis (de um dia de idade) resultaram em teores médios de anticorpo de, respectivamente, 8,3 e 8,7 para amostras sanguíneas recolhidas a uma idade de 21 dias. A Tabela 4 apresenta os dados que suportam este teste serológico do bando de perus parental, as aves de controlo negativo e as aves vacinadas. 12 ΡΕ1345658

Tabela 4: Teores de TRTV

Bando parental Aves de Controlo Negativo Aves Vacinadas 6½ semanas 1 dia de idade 21 dias de idade 1 dia de idade 21 dias de idade 3,7 3,0 3,8 5, 6 11,4 5, 5 3,0 3,7 3,9 10,4 4,7 4,5 3,8 4,9 9,5 5,9 4,3 3,0 3,4 11,6 7,7 3,0 3,0 4,0 9,3 5, 6 4,8 3,4 3,0 9,9 5,4 4,2 3, 6 3,0 11,8 3,7 4,7 3, 6 3,0 11,1 5,2 3, 9 4,2 3,0 11,0 3,0 3,0 4,5 7,1 9,7 4,7 4,3 5,2 11,1 5, 0 3,2 3,9 9,1 3,0 3, 9 4,4 11,3 4,8 3,0 3,0 vo o τ—1 3,3 3,8 8,1 11,5 5,1 3, 5 3,3 11,2 4,5 3,0 3,0 10,5 4,1 3,0 3,0 10,0 5,1 3, 5 3,0 9, 9 3,0 3,3 3, 5 9, 6 3,0 MG 5, 04 LO O 3, 53 4,06 10,53 DP 1,35 0,82 0,46 1,46 LO co o 13 ΡΕ1345658

Assim, a administração in ovo (ao dia 24 de incubação) de uma IOV da presente invenção a 105'5 TCID50 a ovos férteis de peru proporciona a segurança necessária em relação tanto à eclosão como aos sinais clínicos, assim como uma resposta imunitária aumentada em relação a vacinas administradas convencionalmente.

Exemplo 2: Estudo de segurança para administração in ovo a galinhas .

Obtiveram-se ovos da raça White Leghorn específicos livres de patogénicos (de seguida "SPF") de uma fonte comercial (Broekman Instituut BV, Someren, Holanda). 120 ovos SPF foram colocados numa incubadora, e após 18 dias de incubação, os ovos foram iluminados. Tal resultou em 5 ovos não fertilizados rejeitados e em 115 ovos fertilizados aceites. Dos 115 ovos aceites, 100 foram escolhidos aleatoriamente para vacinação in ovo. Estes 100 ovos foram divididos nos três grupos seguintes:

Grupo 1 ovos/crias foram marcados para identificação com uma marca laranja na asa contendo um número. O Grupo 1 consistiu em 30 ovos os quais, tal como descrito abaixo, receberam uma vacina in ovo numa dose calculada por ovo com um teor de 105'5 TCID5o.

Grupo 2 ovos/crias foram marcados para identificação com uma marca verde na asa contendo um número. O Grupo 2 consistiu em 40 ovos os quais, tal como descrito 14 ΡΕ1345658 abaixo, receberam uma solução salina in ovo de volume igual ao volume da vacina injectada nos ovos do Grupo 1.

Grupo 3 ovos/crias não foram. 0 Grupo 3 consistiu em 30 ovos que não receberam qualquer administração in ovo (quer de vacina ou da solução salina). O número nas marcas das asas foi apenas utilizado se a cria apresentava sinais clínicos de TRT ou de SHS.

As galinhas de ambos os Grupos 1 e 2 foram alojadas no mesmo biotério nos quais eclodiram. Foram mantidas condições apropriadas (por exemplo, alimentação, água para bebida, aparas de madeira como material de acamamento, temperaturas, humidades relativas, etc.). A calendarização desta experiência foi a seguinte: O primeiro dia de incubação dos ovos dos Grupos 1, 2 e 3 foi designado dia 0 de incubação. A data da administração in ovo aos ovos do Grupo 1 e Grupo 2 de, respectivamente, uma vacina e uma solução salina foi o dia 18 de incubação. A data calculada de eclosão correspondeu ao dia 21 de incubação. O estudo foi concluído numa data após a eclosão equivalente ao dia 46 de incubação.

Para se preparar a vacina para administração in ovo usou-se uma vacina comercialmente disponível, Poulvac® TRT contendo 2000 doses por frasco, disponível da Fort 15 ΡΕ1345658

Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa ou Weesp, Holanda. Numa base por dose, a vacina tinha um teor de 104'2 TCID50. Ressuspenderam-se doze (12) frascos desta vacina em solução salina com tampão fosfato (de seguida "PBS"), utilizando 5 mL de PBS por cada frasco de vacina. 0 conteúdo resultante foi bem misturado e separado em aliquotas. 0 material ressuspendido tinha um teor calculado de 105'5 TCID50 e um volume total de 60 mL. A vacina é de seguida referida como "IOV".

No dia 18 de incubação, a vacina IOV foi administrada in ovo a ovos do Grupo I através de injecção utilizando uma máquina de injecção em ovos comercialmente disponível Inovoject® da Embrex, Inc., Carolina do Norte. A administração da IOV por injecção nos ovos foi realizada de acordo com procedimentos convencionais. Do mesmo modo, administrou-se uma solução salina comercialmente disponível, CLEAR-FLEX® INFUSIEVLOESISTOF, da Bieffle Meditai SpA, Itália, aos ovos do Grupo 2. A Tabela 5 apresente o tratamento dos ovos nos Grupos 1, 2 e 3.

Tabela 5: Tratamento dos Ovos

Grupo # # ovos/grupo Dose calculada por ovo 1 30 105'5 TCID50 2 40 apenas solução salina 3 30 sem tratamento 16 ΡΕ1345658

As percentagens de eclosão dos ovos dos Grupos 1, 2, e 3 foram observadas experimentalmente e calculadas. Resumidamente, foram notadas as seguintes excepções. Devido a anomalias do esqueleto, spina bífida (que não foram atribuídas a qualquer acção adversa da vacinação in ovo), dois pintos do Grupo 1 foram removidos do estudo directamente após a sua eclosão e antes de serem marcados com uma marca identificadora na asa. Estes dois pintos foram excluídos das percentagens de eclosão calculadas para o Grupo 1. Ainda do grupo 1, um pinto tinha uma lesão nos dedos das patas e por isso removido do estudo após ter sido marcado. A autópsia deste pinto não revelou quaisquer sinais de TRT ou de qualquer outra doença ou quaisquer outros distúrbios. Este pinto foi igualmente excluído das percentagens de eclosão calculadas para o Grupo 1. Relativamente aos ovos/crias do Grupo 2, um pinto morreu após a eclosão mas antes de ser marcado com uma marcação identificadora. Este pinto foi de forma semelhante excluído das percentagens de eclosão calculadas para o Grupo 2.

Tal como planeado, as eclosões tanto do Grupo 1 como do Grupo 2 foram estudadas e examinadas ao longo de um período de observação de 25 dias. Durante este período, nenhum dos pintos apresentou quaisquer sinais de TRT ou de SHS. Todos os 30 ovos do Grupo 3 eclodiram. No dia em que eclodiram, todos os 30 pintos foram decapitados para recolha de amostras sanguíneas e na'lise subsequente tal como descrito mais tarde. 17 ΡΕ1345658 A Tabela 6 apresente os resultados de eclosão e de mortalidade observados experimentalmente para cada um dos Grupos 1, 2, e 3. Estes resultados estabeleceram que a vacinação in ovo da presente invenção era segura tanto em relação à eclosão como relativamenteaos sinais clínicos de TRT e/ou de SHS.

Tabela 6: Resultados de Eclosão/Mortalidade

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 (marca laranja (marca verde (sem marca na na asa) na asa) asa) vacina solução salina sem tratamento Incubados 30 40 30 Vacinados 30 40 0 Eclodidos 28 40 30 Percentagem de ovos: Vacinados 100 100 0 Eclodidos 93,3 100 100

Os pesos corporais dos pintos tanto do Grupo 1 (vacina) como do Grupo 2 (solução salina) foram obtidos ao dia 25. 0 peso corporal médio dos pintos do Grupo 1 era de 209 gramas com um desvio padrão de 22,1. Para os pintos do Grupo 2, o peso corporal médio era de 217 gramas com um desvio padrão de 24,8. Os pesos corporais dos Grupos 1 e 2 não diferiam significativamente tal como determinado estatisticamente utilizando um teste t de Student bilateral com P = 0,18). Estes resultados estabeleceram que a 18 ΡΕ1345658 vacinação in ovo da presente invenção não comprometia o peso corporal resultante ao dia 25 (o que é comercialmente importante) em comparação com aquele obtido com uma injecção in ovo de uma solução salina fisiológica.

Para se confirmar o estado livre de TRT dos ovo SPF utilizados nos Grupos 1, 2 e 3, no dia em que os ovos do Grupo 3 eclodiram, os pintos foram mortos por decapitação e foram recolhidas amostras de sangue que foram analisadas: o teste por ELISA não detectou quaisquer anticorpos para TRTV o que confirma o estado livre de TRT dos ovos SPF utilizados neste estudo.

Este estudo estabeleceu que a vacinação in ovo de ovos de galinha SPF era segura em relação com cada um dos parâmetros eclosão, mortalidade, sinais clínicos de TRT e/ou SHS, e peso corporal ao dia 25.

Exemplo 3: Estudo de eficácia para vacinas in ovo de galinhas SPF. 0 objectivo deste estudo foi verificar se a vacinação in ovo de embriões de galinha com 18 dias de idade era eficaz para a prevenção de TRT e/ou de SHS após um teste virulento às 3 ou 6 semanas de idade. Tal como estabelecido abaixo, a vacinação in ovo de ovos de galinha SPF férteis de 18 dias de idade com 104'2 TCID50 é segura enquanto que uma dose de 103'2 TCID50 é eficaz contra a doença clínica. 19 ΡΕ1345658

Obtiveram-se ovos férteis para eclosão de um bando parental de raça White Leghorn SPF adquiridos aos Whickman Laboratories, Reino Unido.

Foi obtida uma vacina TRT comercialmente disponível, Poulvac® TRT, disponível da Fort Dodge Animal Health em Fort Dodge, Iowa ou Weesp, Holanda. As vacinas in ovo da presente invenção são preparadas a partir desta Poulvac® TRT como se segue. Três (3) frascos da vacina comercial contendo um teor de 107'5 TCID50 foram cada um ressuspendido em 4 mL de água estéril, e bem misturados e depois separados em alíquotas. Depois, removeu-se 0,4 mL e adicionou-se a 19,6 mL de PBS estéril de modo a resultar numa diluição final equivalente a 200 mL por frasco e uma suspensão resultante contendo um teor de 104'2 de TCID50 de vacina por cada 0,1 mL. Esta vacina foi ainda diluída através da remoção de 2 mL e adição destes a 18 mL de PBS estéril, resultando numa suspensão de 103'2 de TCID50 de vacina por cada 0,1 mL. O virus do teste foi preparado como se segue. TRTV da estirpe do Reino Unido BUT 8544, isolado pelo Dr. R.C. Jones na Universidade de Liverpool (Reino Unido), foi passado 23 vezes em cultura de células da traqueia (aqui de seguida referido como "TOC"), uma vez em crias, de novo isolado, e passado mais uma vez em TOC. O teor deste vírus de teste era de 104'5 de TCID50 de vacina por mL. 20 ΡΕ1345658

Após 18 dias de incubação, um primeiro conjunto de 70 ovos férteis (aqui de seguida, "Conjunto 1") foi inoculado in ovo com 0,1 mL da vacina TRT reconstituída contendo 103'2 TCID50 tal como descrito acima. Um segundo conjunto de 70 ovos (aqui de seguida "Conjunto 2") foi do mesmo modo inoculado com 0,1 mL da vacina TRT reconstituída contendo 104'2 TCID50 tal descrito acima. Os ovos foram imediatamente colocados num incubador (sem serem voltados) e deixados a incubar no galinheiro isolado nos quais foram alojados. Os ovos dos Conjuntos 1 e 2 foram alojados separadamente em galinheiros isolados semelhantes. Um terceiro conjunto de 70 ovos férteis não recebeu qualquer administração in ovo (de seguida, "Conjunto 3"). O Conjunto 3 é aqui de seguida referido como aves de controlo negativo. Estes ovos foram alojados num terceiro galinheiro isolado. A eclosão foi registada nos dias 20, 21, 22 e 23 após a incubação (sendo o dia zero o primeiro dia de incubação). Após a eclosão, as aves em excesso foram eliminadas à idade de um dia de modo a deixar cinquenta aves por conjunto. Para os Conjuntos 1, 2, e 3, as percentagens de eclosão observadas experimentalmente foram 91%, 94%, e 92%, respectivamente. Isto estabelece que as vacinações in ovo com teores de 103'2 TCID5o e 104'2 TCID5o foram seguras em relação à eclosão. Às três semanas de idade, dez aves de cada um dos grupos vacinados (isto é, dos Conjuntos 1 e 2) e das aves de controlo negativo (isto é, do Conjunto 3) foram marcadas 21 ΡΕ1345658 na asa e colocadas num quarto galinheiro isolado. Administrou-se então a cada ave o anteriormente referido vírus teste através de uma gota oftálmica contendo uma dose de 103'5 TCID5o TRTV (virulento) em 0,1 mL. Às 6 semanas de idade, mais 10 aves foram igualmente testadas com uma estirpe virulenta de TRTV. No entanto, devido à idade superior destas aves, a dose do teste foi aumentada para 103'8 TCID50 TRTV (virulento) em 0,2 mL numa base por ave.

As aves testadas foram monitorizadas experimentalmente durante 14 dias, após o que foram sangradas e mortas. Os sinais observados foram registados utilizando o Sistema de Pontuação Clínica da Tabela 2, tal como utilizado no Exemplo 1. A pontuação diária total de um grupo de aves foi calculada somando as pontuações individuais de cada ave nesse dia. A pontuação cumulativa é a soma das pontuações médias diárias aos dias 3-8. O teste χ2 foi utilizado para analisar os dados. Os sinais clinicos totais observados nos 2 grupos vacinados (Conjuntos 1 e 2) dos dias 3-8 foram comparados com aqueles observados nos controlos positivos (Conjunto 3) nos mesmos dias para ambos os testes de 3 semanas e de 6 semanas. Esta monitorização resultou nos seguintes resultados.

Em relação ao teste de 3 semanas com a estirpe virulenta TRTV a um teor de 103'5 TCID50, 90% das aves controlo não vacinadas do Conjunto 3 apresentaram sinais clínicos. Pelo contrário, pequenas percentagens de aves vacinadas dos Conjuntos 1 e 2 apresentaram sinais clínicos. Para o Conjunto 1 (vacinado com um teor de 103'2 TCID50 por 22 ΡΕ1345658 ovo), apenas 50% das aves apresentaram sinais clínicos. Para o conjunto 2 (vacinadas com um teor de 104'5 TCID50 por ovo), apenas 30% das aves apresentaram sinais clínicos. No Conjunto 3, apenas uma ave permaneceu sem quaisquer sinais clínicos. Em contraste, cinco aves do Conjunto 1 e sete aves do Conjunto 2 permaneceram sem quaisquer sinais clínicos.

Em relação ao teste de 6 semanas com a estirpe TRTV virulenta a um teor de 103'8 TCID50, 80% das aves controlo não vacinadas do Conjunto 3 apresentaram sinais clínicos. Para o Conjunto 1 (vacinado com um teor de 103'2 TCID50 por ovo), apenas 20% das aves apresentaram sinais clínicos. Para o conjunto 2 (vacinadas com um teor de 104'5 TCID50 por ovo), apenas 10% das aves apresentaram sinais clínicos. No Conjunto 3, apenas uma ave permaneceu sem quaisquer sinais clínicos. A análise estatística de χ2 estabeleceu, para o teste de 6 semanas, que os sinais clínicos observados experimentalmente em ambos os grupos de aves vacinadas (Conjuntos 1 e 2) eram significativamente menos graves do que aqueles observados nas aves de controlo negativo do Conjunto 3 (ver P < 0,01).

As Tabelas 7, 8, e 9 apresentam estes resultados para o teste de 3 semanas, o teste de 6 semanas, e a análise de qui-quadrado tal como discutido acima, respec-tivamente. 23 ΡΕ1345658

Tabela 7: Sinais Clínicos Para o Teste de 3 Semanas # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'5 TCID50 TRTV em 0,1 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 104 0 2 2 2 0 0 0 0 106 0 0 2 0 0 0 0 0 107 0 0 0 0 0 0 0 0 111 0 2 0 0 0 0 0 0 113 0 0 0 0 0 0 0 0 117 0 0 0 0 0 0 0 0 118 0 1 2 2 0 0 0 0 124 0 0 0 0 0 0 0 0 127 0 0 0 0 0 0 0 0 139 0 0 1 2 0 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 5 7 6 0 0 0 0 Pontuação Média Diária 0 0,5 0,7 O 0 0 0 0 Conjunto 1: Pontuação Cumulativa por Ave =1,8 ave # Para 0 Conjunto 2 (vacinado com IO4'2 TCID50) 3 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 11 1 0 0 0 0 0 0 0 12 0 1 2 0 0 1 0 0 24 ΡΕ1345658 (continuação) # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'5 TCID50 TRTV em 0,1 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para 0 Conjunto 2 (vacinado com 104'2 TCID50) 17 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 0 0 0 0 36 2 1 2 2 0 0 0 0 37 0 0 0 0 0 0 0 0 Pontuação Diária Total 3 2 4 2 0 1 0 0 Pontuação Média Diária 0,3 0,2 O 0,2 0 T-1 0 0 0 Conjunto 2: Pontuação Cumulativa por Ave =1,2 ave # Para 0 Conjunto 3 (não vacinac lo) 301 0 0 0 2 1 0 0 0 311 0 0 0 2 0 0 0 0 313 0 0 0 0 0 0 0 0 314 0 0 2 3 1 0 0 0 316 0 0 2 1 0 0 0 0 321 0 2 2 0 0 0 0 0 322 0 2 2 2 0 0 0 0 327 0 0 2 3 0 0 0 0 25 ΡΕ1345658 (continuação) # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'5 TCID50 TRTV em 0,1 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para 0 Conjunto 3 (não vacinado) 331 0 2 2 1 0 0 0 0 334 0 2 2 1 1 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 8 14 15 3 0 0 0 Pontuação Média Diária 0 O OO 1,4 1,5 0,3 0 0 0 Conjunto 3: Pontuação Cumulativa por Ave = 4,0

Tabela 8: Sinais Clínicos Para o Teste de 6 Semanas # de dias após 0 teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'8 TCID50 TRTV em 0,2 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103' TCID50) 108 0 0 0 2 0 0 0 0 110 0 0 0 0 0 0 0 0 114 0 0 0 0 0 0 0 0 115 0 0 0 0 0 0 0 0 119 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 26 ΡΕ1345658 (continuação) # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'8 TCIDso TRTV em 0,2 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para o Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 130 0 0 0 0 0 0 0 0 131 0 0 2 0 0 0 0 0 134 0 0 0 0 0 0 0 0 135 0 0 0 0 0 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 0 2 2 0 0 0 0 Pontuação Média Diária 0 0 0,2 0,2 0 0 0 0 Conjunto 1: Pontuação Cumulativa por Ave =0,4 ave # Para o Conjunto 2 (vacinado com 104'2 TCID50) 2 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 2 2 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 27 0 0 0 0 0 0 0 0 32 0 0 0 0 0 0 0 0 38 0 0 0 0 0 0 0 0 39 0 0 0 0 0 0 0 0 27 ΡΕ1345658 (continuação) # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'8 TCIDso TRTV em 0,2 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para o Conjunto 2 (vacinado com 104'2 TCID50) Pontuação Diária Total 0 0 2 2 0 0 0 0 Pontuação Média Diária 0 0 0,2 0,2 0 0 0 0 Conjunto 2: Pontuação Cumulativa por Ave =0,4 ave # Para o Conjunto 3 (não vacinac lo) 302 0 1 0 0 0 0 0 0 306 0 0 0 3 0 0 0 0 307 0 0 0 0 0 0 0 0 312 0 0 0 0 2 0 0 0 315 0 0 0 0 0 0 0 0 318 0 0 3 3 0 0 0 0 319 0 0 1 2 2 2 0 0 329 0 0 1 0 0 0 0 0 330 0 2 2 2 2 0 0 0 332 0 0 0 0 2 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 3 7 10 8 2 0 0 Pontuação Média Diária 0 0,3 0,7 1,50 O co 0,2 0 0 Conjunto 3: Pontuação Cumulativa por Ave =3,0 28 ΡΕ1345658

Tabela 9: Análise de Qui-Quadrado

Análise deχ2 das Pontuações Clínicas: Comparação de 2 Grupos Vacinados (Conjuntos 1 e 2) com 1 Grupo de Controlo Negativo (Conjunto 3) Grupo χ2 Graus de Liberdade Probabilidade Conjunto 1 (Teste de 3 semanas) 7,27 3 0,1>P>0,05 Conjunto 2 (Teste de 3 semanas) 10,133 3 0,02>P>0,05 Conjunto 1 (Teste de 6 semanas) 12,09 3 P<0,01 Conjunto 2 (Teste de 6 semanas) 12,09 3 P<0,01

Além de monitorizar as aves dos Conjuntos 1, 2 e 3 relativamente a sinais clínicos de TRT, as aves foram também submetidas a análise serológica na qual se determinou os anticorpos para TRTV em amostras sanguíneas individuais por técnicas de ELISA utilizando um antigénio de tipo A e expressa como teores 2log. Os teores de 2log > 6,0 medidos experimentalmente foram tomados como positivos. Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando um teste t de Student para dados não emparelhados. As tabelas 10 e 11 apresentam os resultados serológicos obtidos com as aves testadas dos Conjuntos 1, 2 e 3 para o teste de 3 semanas e o teste de 6 semanas, respectivamente. Nas Tabelas 10 e 11, "DT" refere-se a depois do teste; "MG" refere-se a média geométrica; e "DP" refere-se ao desvio padrão. Resumidamente, todos os grupos (isto é, Conjuntos 29 ΡΕ1345658 1, 2 e 3) apresentaram um aumento significativo nos teores de anticorpo a 7 dias após os testes e um aumento suplementar nos teores de anticorpo aos 14 dias após os testes.

Tabela 10: Teores de Anticorpo para TRTV (Teste de 3 Semanas)

Teores de antic virulento em gotí TCID50 em 0,1 mL orpo 2log após teste com TRTV as oftálmicas a uma dose de 103'5 3or ave antes do teste 7 dias DT 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 104 4,4 9, 9 106 3, 6 9 9, 9 107 6,2 7 9,5 111 6, 6 10,4 11,2 113 3,4 9,4 117 3,5 8,8 118 3,6 6,4 9,5 124 3,2 6,8 9,7 127 10,1 10,9 139 3,4 10,2 MG 4,8 7,92 9,9 DP 2,22 1,71 0,72 ave # para 0 Conjunto 2 (vacinado com 104'2 TCID50) 3 4,4 9 9,9 6 9,7 10,6 11 4,6 10,3 10,9 12 4,3 7,5 10 30 ΡΕ1345658 (continuação)

Teores de antic virulento em gotí TCID50 em 0,1 mL ; orpo 2log após teste com TRTV as oftálmicas a uma dose de 103'5 3or ave antes do teste 7 dias DT 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 17 8,4 10, 6 11,1 20 9,1 21 4,5 10 29 4,4 10 36 3, 6 9, 6 10 37 4,8 10,1 MG 5, 78 9, 4 10,29 DP 2,31 1,23 0,45 ave # para 0 Conjunto 3 (não vacinado) 301 3,3 9,2 311 3,4 9,1 9, 9 313 3 9 9,7 314 3,7 9, 9 10,3 316 3,7 10,2 321 4,2 9,5 9,8 322 3,9 7,7 10 327 3,4 10 331 3, 5 10,5 334 3, 5 10,3 MG 3, 56 9, 04 9,99 DP 0,28 0,83 0,37 31 ΡΕ1345658

Tabela 11: Teores de Anticorpo para TRTV (Teste de 6 Semanas)

Teores de antic virulento em gotí TCID5o em 0,2 mL ; orpo 2log após as oftálmicas a oor ave teste com TRTV uma dose de 103'8 antes do teste 7 dias DT 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 108 4 10,2 110 5,9 10,5 114 4,7 9,8 115 4 6 9, 9 119 4,1 6, 5 10, 7 120 4 10,4 130 3,9 9,8 131 3, 5 7 9, 9 134 3,9 6, 4 9, 6 135 4 5, 5 10 MG 4,2 6,28 0 0 T—1 DP 0, 67 0,56 0,32 ave # para 0 Conjunto 2 (vacinado com 104'2 TCID50) 2 5, 8 10 4 7,1 9,3 8 6, 4 10,3 10,4 13 5,2 10,2 18 8,6 10,2 11,2 25 10,4 10,7 10, 9 27 10,2 10,5 11,4 32 10,3 32 ΡΕ1345658 (continuação)

Teores de antic virulento em gotí TCID50 em 0,2 mL orpo 2log após teste com TRTV as oftálmicas a uma dose de 103'8 oor ave antes do teste 7 dias DT 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 2 (vacinado com 104'2 TCID50) 8 OO O \—1 Oh O \—1 11,1 39 OO 9,5 MG 8,16 10,52 Γ- 0 \—1 DP τ—1 CM 0,29 0,72 ave # para 0 Conjunto 3 (não vacinado) 302 3,8 7,1 10, 4 306 4,4 τ—1 OO 10,1 307 \—1 10,1 312 OO OO 6,3 9,9 315 \—1 6 9, 9 318 co OO 10 319 4,2 9, 9 329 OO OO 9,9 330 4,3 7,7 9,7 332 3,4 9,9 MG 3,98 7,04 OO CJ3 DP 0,30 0,89 0,19

Uma análise serológica semelhante foi também realizada em relação a todos os três grupos (isto é, Conjuntos 1, 2 e 3) que não foram testados com uma estirpe virulenta de TRTV. Determinaram-se os teores médios de 33 ΡΕ1345658 anticorpo das aves controlo (Conjunto 3) e dos dois grupos de aves vacinadas (Conjuntos 1 e 2) desde um dia de idade até uma idade de 8½ semanas. Como esperado, os teores de anticorpo para as aves controlo mantiveram-se baixos ao longo deste estudo. Os teores das aves controlo foram estatisticamente comparados com aqueles das aves vacinadas da mesma idade. A Tabela 12 apresente os teores médios de anticorpo determinados após o período in ovo. Os resultados individuais estiveram disponíveis (dados não apresentados) para suportar os resultados experimentais apresentados na Tabela 12. na Tabela 12, "n" refere-se ao número de aves e "DP" refere-se a Desvio Padrão.

Tabela 12: Teores Médios de Anticorpo Após o Período In Ovo n DP Teor Médio de Anticorpo Idade Para o Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 1 Dia de Idade 10 0,87 4,95 1 Semana 5 0,51 4,06 2 Semanas 5 1,54 3,88 3 Semanas 20 1,71 4,06 4 Semanas 5 0,22 4,28 5 Semanas 10 0, 67 4,55 6 Semanas 10 0, 67 4,2 8h Semanas 10 2.04 5,83 Idade Para o Conjunto 2 (vacinado com IO4'2 TCID50) 1 Dia de Idade 11 0,56 4,3 1 Semana 5 0,45 4,26 2 Semanas 5 2,82 4,76 34 ΡΕ1345658 (continuação) n DP Teor Médio de Anticorpo Idade Para o Conjunto 2 (vacinado com 104'2 TCID50) 3 Semanas 20 2,42 5,98 4 Semanas 5 2, 98 7,16 5 Semanas 10 2,38 7,03 6 Semanas 10 2,12 8,14 8½ Semanas 9 2,56 8,13 Idade Para o Conjunto 3 (não vacinados) 1 Dia de Idade 10 0, 73 3,88 1 Semana 5 0, 96 4,72 2 Semanas 5 0,26 3,8 3 Semanas 18 0,27 3,49 4 Semanas 5 0,17 4,4 5 Semanas 11 0,55 3,61 6 Semanas 11 0,35 3,92 8H Semanas 9 0.86 3,98

Uma análise dos resultados do Exemplo 3, incluindo as medições obtidas experimentalmente, e a correspondente análise estatística, indica que a dose mais baixa de vacina (IO3,2 TCID5o de TRTV administrada in ovo aos ovos de galinha SPF férteis de 18 dias de idade) foi eficaz no que conferiu protecção significativa contra um teste com uma estirpe virulenta de TRTV às 6 semanas de idade. Às 3 semanas de idade, também se observou protecção; no entanto, à luz do número de aves, as diferenças experimentalmente observadas na protecção conseguida caiu imediatamente 35 ΡΕ1345658 abaixo do nível de significância. A dose aumentada de vacinação de 104'2 TCID50 de TRTV por ovo (um aumento aproximadamente da ordem de 1loglO), observou-se, tanto para os testes de 3 semanas como de 6 semanas, uma protecção significativa contra a exposição a uma estirpe virulenta de TRTV. A administração in ovo da vacina derivada da Poulvac® TRT esteve claramente associada com a produção de anticorpos específicos para TRTV nas aves vacinadas/ino-culadas. Esta associação pareceu estar dependente da dose. A dose mais elevada da vacina in ovo causou um aumento no teor médio de anticorpo às três semanas de idade a níveis significativamente mais elevados do que aqueles das aves de controlo negativo e a níveis aproximadamente abaixo do valor limite de 6,0. A resposta de anticorpo circulante à vacinação in ovo com a dose mais elevada de 104'2 TCID50 por ovo pareceu aumentar com o passar do tempo; um máximo foi obtido às seis semanas de idade; e, depois, os teores permaneceram estáveis até às 8½ de idade.

Contrariamente aos resultados acima discutidos para a dose de vacinação elevada, as aves que receberam a dose mais baixa de 103'2 TCID50 por ovo pareceram apresentar uma resposta retardada de anticorpos à vacinação. Os teores apenas começaram a aumentar às 8h semanas de idade - quando atingiram teores significativamente mais elevados do que aqueles das aves controlo. Nesta altura (isto é, 8½ semanas) os teores para as aves com baixos níveis de vacina 36 ΡΕ1345658 (Conjunto 1) estavam em níveis similares que aqueles das aves com elevados níveis de vacina (Conjunto 2) a uma idade de 3 semanas. Pareceu provável que, com a passagem de ainda mais tempo para além das 8½ semanas, os teores de anticorpo teriam aumentado até níveis acima de 6,0.

Evidenciou-se uma relação entre os teores de anticorpo e a redução em sinais clínicos de TRT. Em cada agrupamento de aves em que os teores de anticorpo eram significativamente mais elevados do que aqueles das aves controlo mas no entanto abaixo do valor limite positivo de 6,0; a redução observada dos sinais clínicos de TRT era estatisticamente significativa. A vacinação in ovo a ovos de galinha SPF férteis susceptíveis de 18 dias de idade com doses na gama aproximada de pelo menos 103'2 TCID50 por ovo até pelo menos 104'2 TCID50 por ovo, e, em particular, com doses de aproximadamente IO3'2 TCID50 por ovo pareceu simultaneamente segura e eficaz contra a doença clínica que normalmente seria esperada após um teste com uma estirpe virulenta de TRTV.

Exemplo 4: Estudo de eficácia para vacinas comerciais in ovo para galinhas. O objectivo deste estudo foi verificar se a vacinação in ovo de ovos de galinha férteis incubados com 18 dias de idade provenientes de um bando parental de aves 37 ΡΕ1345658 para abate é eficaz na prevenção de TRT e/ou doença SHS após teste virulento às 4 ou 6 semanas de idade. Tal como estabelecido abaixo, a vacinação in ovo de ovos férteis de 18 dias de idade susceptiveis de parentes positivos para o anticorpo TRTV com 103'2 TCID50 por ovo com uma vacina derivada de Poulvac® TRT é eficaz contra a doença clinica da rinotraqueite.

Ovos férteis para eclosão foram obtidos a partir de um bando de parentes para abate comerciais de 37 semanas de idade que tinham sido previamente vacinados com a vacina TRT viva às 10 semanas de idade e com a vacina TRT morta às 18 semanas de idade. Estes ovos foram obtidos do bando da linhagem Mossbank, Marshall Agriculture, Whitburn, Escócia.

Uma vacina TRT comercialmente disponível, Poulvac® TRT, disponível da Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa ou Weesp, Holanda foi utilizada para preparar as vacinas in ovo da presente invenção. Três frascos desta vacina comercial contendo um teor de 107'5 TCID50 foram cada uma ressuspendida em 5 mL de água estéril, e o conteúdo foi bem misturado e separado em alíquotas. A vacina sofreu uma diluição suplementar em solução salina com tampão fosfato (PBS) de modo a resultar numa suspensão de 103'2 TCID50 por 0,1 mL. O vírus para teste foi preparado do modo seguinte. TRTV da estirpe do Reino Unido BUT 8544 (ver página 12) foi passado 23 vezes em cultura de células da 38 ΡΕ1345658 traqueia (aqui de seguida referido como "TOC"), uma vez em crias, de novo isolado, e passado mais uma vez em TOC. 0 teor deste virus de teste era de 104'5 de TCID5o de vacina por mL.

Após 18 dias de incubação, 57 ovos férteis foram inoculados in ovo com 0,1 mL da vacina TRT reconstituída contendo 103'2 de TCID50 tal como descrito acima. Os ovos foram imediatamente colocados numa incubadora (sem serem voltados) e deixados até eclodir no galinheiro isolado em que foram alojados. Após a eclosão, 40 aves foram removidas da incubadora e colocados no chão sobre aparas.

Um determinado número de ovos férteis (110) não foi vacinado/inoculado e deixou-se a eclodir separadamente. Um dia após a eclosão, quarenta aves foram alojadas num segundo galinheiro de isolamento como aves de controlo negativo. As aves controlo testadas foram denominadas aves de controlo positivo. A eclosão foi registada aos dias 20, 21, 22 e 23 após a incubação (dia e inoculação - zero). Após a eclosão, as aves em excesso foram mortas por acção humana ou utilizadas para recolha de sangue. As percentagens de eclosão para os ovos não vacinados e para os ovos vacinados foram de 89% e 91%, respectivamente o que estabelece que, em relação à eclosão, a vacinação com um teor de 103'2 TCID50 foi segura. 39 ΡΕ1345658 Às 4 semanas de idade, dez aves do grupo vacinado e dez aves de controlo negativo foram marcadas na asa e colocadas num terceiro galinheiro isolado. Administrou-se então a cada ave o anteriormente referido virus teste através de uma gota oftálmica contendo uma dose de 103'5 TCID5o TRTV (virulento) em 0,1 mL. Às 6 semanas de idade, mais 14 aves foram igualmente testadas com uma estirpe virulenta de TRTV. No entanto, devido à idade superior destas aves, a dose do teste foi aumentada para 103'8 TCID50 TRTV (virulento) em 0,2 mL numa base por ave.

As aves testadas foram monitorizadas experimentalmente durante 14 dias, após o que foram sangradas e mortas. Os sinais observados foram registados utilizando o Sistema Revisto de Pontuação Clinica da Tabela 13. O sistema da Tabela 13 era similar mas não idêntico ao do sistema da Tabela 2 anteriormente descrito no Exemplo 1 acima.

Tabela 13: Sistema Revisto de Pontuação Clínica

Pontuação Sintomas observados experimentalmente 0 Nenhum 1 exsudado nasal claro 1 olhos espumosos mas ausência de exsudado nasal (F) 2 exsudado nasal truvo 3 seios infraorbitais inchados ou olhos espumosos e 1 ou 2 40 ΡΕ1345658 A pontuação diária de um grupo de aves foi calculada somando as pontuações individuais de cada ave nesse dia. A pontuação cumulativa é a soma das pontuações médias diárias. O teste χ2 foi utilizado para analisar os dados. Os sinais clinicos totais observados no grupo vacinado do Conjunto 1 foram comparados com aqueles observados nos controlos positivos do Conjunto 2 nos mesmos dias para ambos os testes de 4 semanas e de 6 semanas. Esta monitorização estabeleceu os seguintes resultados.

Em relação ao teste de 4 semanas com a estirpe virulenta TRTV a um teor de 103'5 TCID5o, apenas se observaram sinais clinicos aos dias 6 e 7, tendo sido observados para ambos os grupos sinais máximos no dia 6 (ou seja, Conjuntos 1 e 2) . No grupo vacinado (Conjunto 1), apenas 30% das aves exibiram sinais clínicos após o teste e a pontuação média cumulativa para cada ave era de 00,6. no Conjunto 1, sete de um total de dez aves permaneceram completamente livres de sinais clinicos. Os sinais clínicos totais observados nas aves vacinadas foram estatisticamente comparados com aqueles das aves de controlo positivo. Apesar das aves vacinadas exibirem sinais clinicos menos graves do que aqueles das aves de controlo positivo, estes resultados não foram estatisticamente significativos (0,2<P<0,3) .

Em relação ao teste de 6 semanas com a estirpe TRTV virulenta a um teor de 103'8 TCID50, os sinais clinicos foram observados durante períodos de tempo mais longos nas 41 ΡΕ1345658 aves de controlo positivo do que após o teste de 4 semanas com a dose mais baixa. No entanto, nas aves vacinadas, os sinais clínicos foram observados apenas durante um da. Das aves controlo positivo, 57% apresentaram sinais clínicos e a pontuação cumulativa por ave foi de 1,35. Das 14 aves deste grupo, 6 permaneceram completamente livres de sinais clínicos. Uma ave apresentou sinais clínicos graves nos dias 5 e 6 do período e observação e subsequentemente morreu nove dias após o teste. 0 exame post mortem desta ave revelou um ventrículo direito dilatado, veias cardíacas congestionadas, excesso de muco na traqueia, e um exsudado fibrinoso no fígado. A causa provável da morte foi uma paragem cardíaca direita e possivelmente hepatite. Em contraste, apenas 14% do grupo vacinado de aves apresentou sinais clínicos após teste e a pontuação cumulativa por ave foi de 0,14. Das 14 aves deste grupo, 12 permaneceram completamente livres de sinais clínicos. Os sinais clínicos totais no grupo vacinado (Conjunto 1) foram estatisticamente comparados utilizando uma análise χ2 com aqueles observados nas aves controlo positivo (Conjunto 2) . Esta análise estabeleceu que os sinais clínicos observados no grupo vacinado foram significativamente menos graves do que aqueles observados nas aves de controlo positivo (0,02<P<0,05).

As Tabelas 14, 15, e 16 apresentam estes resultados para, o teste de 4 semanas, o teste de 6 semanas, e a análise de χ2 tal como discutida acima. 42 ΡΕ1345658

Tabela 14: Sinais Clínicos Para o Teste de 4 Semanas # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'5 TCID50 TRTV em 0,1 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 41 0 0 0 0 F 0 0 0 42 0 0 0 0 0 0 0 0 43 0 0 0 2 0 0 0 0 44 0 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 0 0 0 0 0 0 46 0 0 0 0 0 0 0 0 47 0 0 0 0 0 0 0 0 48 0 0 0 2 F 0 0 0 49 0 0 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 0 0 4 2 0 0 0 Pontuação Média Diária 0 0 0 0 0,2 0 0 0 Conjunto 1: Pontuação Cumulativa por Ave =0,6 ave # Para 0 Conjunto 2 (não vacinac los) 391 0 0 0 3 0 0 0 0 392 0 0 0 0 0 0 0 0 393 0 0 0 0 0 0 0 0 394 0 0 0 2 0 0 0 0 43 ΡΕ1345658 (continuação) # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'5 TCID50 TRTV em 0,1 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para 0 Conjunto 2 (não vacinados) 395 0 0 0 3 F 0 0 0 396 0 0 0 0 F 0 0 0 397 0 0 0 0 0 0 0 0 398 0 0 0 1 F 0 0 0 399 0 0 0 1 0 0 0 0 400 0 0 0 0 0 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 0 0 10 3 0 0 0 Pontuação Média Diária 0 0 0 1 0,3 0 0 0 Conjunto 2: Pontuação Cumulativa por Ave =1,3

Tabela 15: Sinais Clínicos Para o Teste de 6 Semanas # de dias após 0 teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'8 TCID50 TRTV em 0,2 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 44 ΡΕ1345658 (continuação) # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103,8 TCIDso TRTV em 0,2 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para o Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 3 0 0 0 0 0 0 0 0 52 0 0 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 0 0 0 54 0 0 0 0 0 0 0 0 55 0 0 0 0 0 0 0 0 56 0 0 0 0 0 0 0 0 57 0 0 0 0 0 0 0 0 59 0 0 0 F 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 62 0 0 0 0 0 0 0 0 65 0 0 0 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 0 0 2 0 0 0 0 Pontuação Média Diária 0 0 0 0,14 0 0 0 0 Conjunto 1: Pontuação Cumulativa por Ave = 0,14 ave # Para o Conjunto 2 (não vacinados) 381 0 0 0 0 0 0 0 0 383 0 0 0 0 0 0 0 0 45 ΡΕ1345658 (continuação) # de dias após o teste com a estirpe TRTV virulenta em gotas oftálmicas a uma dose de 103'8 TCIDso TRTV em 0,2 mL por ave 3 4 5 6 7 8 9 10 ave # Para o Conjunto 2 (não vacinados) 387 0 0 0 0 0 0 0 0 388 0 F 0 0 0 0 0 0 389 0 0 0 0 0 1 0 0 390 0 0 F 0 0 0 0 0 463 0 0 2 F 0 1 0 0 464 0 0 0 0 0 0 0 0 465 0 0 0 2 0 0 0 0 4 69 0 0 0 0 0 1 0 0 474 0 0 0 0 0 0 0 0 476 0 0 3 3 0 0 morta 0 477 0 0 0 0 0 0 0 0 478 0 0 2 F 0 0 0 0 Pontuação Diária Total 0 1 8 7 0 3 0 0 Pontuação Média Diária 0 0, 07 0,57 0,5 0 0,21 0 0 Conjunto 2: Pontuação Cumulativa por Ave = 1,35 46 ΡΕ1345658

Tabela 16: Análise de Qui-Quadrado dos Dados de Pontuação Clíncia

Análise de χ2 das Pontuações Clínicas: Comparação do Grupo Vacinado (Conjuntos 1) com 1 Grupo de Controlo Positivo (Conjunto 2) Grupo x2 Graus de Liberdade Probabilidade Conjunto 1 (Teste de 4 semanas) 3, 95 3 0,2<P<0,3 Conjunto 2 (Teste de 6 semanas) 8,43 3 0,02<P<0,05

Além da monitorização das aves dos Conjuntos 1 e 2 para sinais clínicos de TRT, as aves foram também sujeitas a análise serológica na qual os anticorpos para TRTV em amostras sanguíneas individuais foram determinadas através de técnicas ELISA desenvolvidas a Leahurst, Liverpool (Reino Unido) utilizando um antigénio do tipo A e expressas como teores 2log. Os teores 2log de anticorpo superiores de teor > 6,0 foram considerados positivos. Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando um teste t de Student para dados não emparelhados. As tabelas 17 e 18 apresentam os resultados serológicos obtidos com as aves testadas dos Conjuntos 1 e 2 para o teste de 4 semanas e o teste de 6 semanas, respectivamente. Nas Tabelas 17 e 18, "DT" refere-se a depois do teste. 47 ΡΕ1345658

Tabela 17: Teores de Anticorpo para TRTV (Teste de 4 Semanas)

Teores de anticorpo 2log após teste com TRTV virulento em gotas oftálmicas a uma dose de 103'5 TCID5o em 0,1 mL por ave antes do teste 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 41 3, 0 9, 4 42 3, 0 9,2 43 3, 0 10,1 44 3, 0 9,5 45 6, 9 OO O \—1 46 5,4 11,2 47 3, 0 10,2 48 3, 0 10, 6 49 8,2 9, 9 50 9,2 11, 0 Média 4,77 10,19 Desvio Padrão 2,48 O O ave # para 0 Conjunto 2 (não vacinado) 391 3, 3 9, 5 392 3, 5 10,3 393 3, 0 9,7 394 3,1 9,1 395 3, 6 8,9 396 3, 6 9,7 397 3,1 9,8 398 3,4 9,3 48 ΡΕ1345658 (continuação)

Teores de anticorpo 2log após teste com TRTV virulento em gotas oftálmicas a uma dose de 103'5 TCID50 em 0,1 mL por ave antes do teste 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 2 (não vacinado) 399 3,0 9,7 400 3,4 9,9 Média 3,3 9, 6 Desvio Padrão 0,24 0,41

Tabela 18: Teores de Anticorpo para TRTV (Teste de 6 Semanas)

Teores de anticorpo 2log após teste com TRTV virulento em gotas oftálmicas a uma dose de 103'8 TCID50 em 0,2 mL por ave antes do teste 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 1 (vacinado com 103'2 TCID50) 1 6,3 11, 6 2 4,3 10,4 3 4,2 10,1 52 3, 6 10, 6 53 4,1 10,6 54 3,7 10,7 55 4,8 9,7 56 3, 6 9,9 57 8,1 10,1 59 3,4 10,2 49 ΡΕ1345658 (continuação)

Teores de anticorpo 2log após teste com TRTV virulento em gotas oftálmicas a uma dose de 103'8 TCID50 em 0,2 mL por ave antes do teste 14 dias DT ave # para 0 Conjunto 1 (vacinado com IO3'2 TCID50) 60 3, 6 9,8 62 9,3 65 5, 3 O O \—1 69 4,9 10,1 Média 4,61 10,22 Desvio Padrão 1,34 0,55 ave # para 0 Conjunto 2 (não vacinado) 381 4,2 9,8 383 5,2 9,2 387 3,0 9, 9 388 3,4 9, 6 389 3,8 9,0 390 5,4 8,8 463 4,0 O O \—1 464 3,0 9,7 465 3,7 8,7 4 69 3,0 9, 6 474 3,9 9, 9 476 4,7 477 4,8 9, 9 478 5, 0 9, 6 Média co 0 9, 52 Desvio Padrão 0,83 0,44 50 ΡΕ1345658

Uma análise serológica similar foi também realizada em relação às aves que não foram testadas com uma estirpe virulenta de TRTV, utilizando dez amostras de soro recolhidas de aves de cada um dos 5 espaços ao ar dos bandos parentais da linhagem Mossbank (Marshalls Agriculture) aos 25 e aos 41 dias de idade. A Tabela 19 apresenta os teores médios de anticorpo destas aves do bando parental de criação.

Tabela 19: Teores Médios de Anticorpo do Bando Parental do Criação_ 25 semanas de idade (n = 10) 41 semanas de idade (n = 10) casa Média DP Média DP 4A 7,60 2,57 7,39 1,72 5A 7,51 t—1 00 o 8,27 0,87 3B 7,44 2,55 7,29 1,50 4B 8,16 0,67 6,64 1,46 5B 7,34 1,81 7,17 00 Oh o

Tanto para as aves vacinadas não testadas como para as de controlo negativo não testadas, recolheu-se sangue às idades de 1 dia e de 4, 6 e 8 semanas de idade. A Tabela 20 apresenta estes teores médios de anticorpo para as aves não testadas. 51 ΡΕ1345658

Tabela 20: Teores Médios de Anticorpo para Aves Não Testadas aves de controlo não vacinadas aves vacinadas idade média DP n média DP n 1 dia 7,23 1,32 10 6,46 0, 99 10 4 semanas 3,52 0,54 38 4,38 1,86 39 6 semanas 3,93 0,72 28 4,72 1, 62 27 8 semanas 3,54 0,75 14 5,09 1, 68 14

Tanto para as aves vacinadas testadas como para as de controlo positivo testadas, recolheu-se sangue 14 dias após o teste para cada um dos grupos testados às 4 semanas ou às 6 semanas. A Tabela 21 apresenta estes teores médios de anticorpo para as aves testadas nestes 2 grupos.

Tabela 21: Teores Para Aves Testadas a 14 Dias DT

Teste às 4 semanas Teste às 6 semanas grupo média DP (P) n média DP (P) n aves controlo positivo 9, 6 0,41 (-) 10 9,52 O 1 13 Aves vacinadas 10,19 0,70 (0,031) 10 10,22 0,55 (0,001) 14

Os resultados individuais estavam disponíveis para suportar os dados apresentados acima nas Tabelas 14-21. Com base nas análises serológicas acima, foram tiradas as seguintes conclusões. Tanto para as aves vacinadas como 52 ΡΕ1345658 para as aves de controlo negativo, a uma idade de 1 dia, estas aves possuíam anticorpos maternais (AM) para TRTV. Às 4 semanas de idade, os níveis de anticorpo nas aves de controlo positivo tinha diminuído para a gama negativa e permaneceram baixos ao longo do resto da experiência. Após a administração in ovo com um teor de 103'2 TCIO50 de uma vacina derivada de Poulvac® TRT, os teores médios de anticorpo mantiveram-se na gama negativa (isto é, abaixo do valor limite positivo de 6,0) mas aumentaram com a idade. Às 4, 6, e 8 semanas de idade, as aves vacinadas possuíam níveis de teores médios de anticorpo que eram estatisticamente significativamente mais elevados do que aqueles das aves de controlo negativo. A partir das 4 semanas de idade, 20% a 22% das aves vacinadas apresentava teores positivos. Em relação às aves testadas, todas as aves apresentaram seroconversão após 14 dias depois do teste. Tanto para os estudos do teste às 4 semanas como às 6 semanas, os teores médios do grupo vacinado foram mais elevados do que aqueles das aves do controlo positivo e esta diferença foi estatisticamente significativa (P < 0,05) .

Uma análise da globalidade do Exemplo 4, incluindo as medições obtidas experimentalmente, resultados, e análise estatística correspondente indica que a vacinação in ovo dos ovos de aves de abate comerciais positivos para anticorpos maternos (AM+) aos 18 dias de incubação com uma vacina derivada da Poulvac® TRT a um teor de dose de 103'2 TCID50 por ovo não afectou de modo adverso a eclosão e 53 ΡΕ1345658 proporcionou um método fiável, eficiente e eficaz para administração da vacina. Esta vacinação também conferiu uma protecção significativa contra um teste com uma estirpe virulenta de TRTV às 6 semanas de idade - quando os sinais clinicos foram significativamente reduzidos. Existiu um grau de protecção às 4 semanas de idade - no entanto, mesmo nas aves de controlo positivo não vacinadas os sinais clinicos observados nesta altura não foram muito graves. Deste modo, apesar de presente, a protecção conseguida contra um teste às 4 semanas não foi estatisticamente significativa.

Os dados apresentados neste Exemplo 4, em combinação com aqueles dos Exemplos 1-3 acima, estabelece que as galinhas são muito menos susceptiveis a vacinas TRT. Não foram observados teores médios de anticorpo positivos (acima do valor positivo limite de 6,0) após a vacinação in ovo. No entanto, os teores no grupo vacinado foram significativamente mais elevados do que aqueles observados nos controlos negativos. Aproximadamente um quinto das aves vacinadas tinha teores positivos após as 4 semanas de idade. Deste modo, na altura do teste, a seroconversão global a níveis de ELISA acima de 6,0 pode não ser um bom indicador da protecção de facto conseguida através da vacinação in ovo. A imunidade local pode desempenhar um papel na interacção entre a protecção induzida e os teores determinados experimentalmente.

Antes da análise das Experiências 1-4 acima, foi 54 ΡΕ1345658 postulado que a presença de anticorpos maternais teria efeitos adversos na eficácia das vacinas. No entanto, o Exemplo 4 estabelece surpreendentemente que a administração in ovo de uma vacina TRT a um teor de 103'2 TCID50 por ovo era eficaz para a redução da doença clinica TRT em galinhas que são AM+. 0 Exemplo 4 reforça e estende as conclusões alcançadas no Exemplo 3 acima; nomeadamente, que galinhas SPF (MA-) que foram vacinadas in ovo igualmente apresentaram uma redução de doença clinica.

Exemplo 5: Estudo da vacina TRT em combinação com outras vacinas de avicultura.

As seguintes abreviaturas são utilizadas neste estudo:

AHS BC CVL EID50 ELISA TAF IH BI IBD i .m. DM DN

Animal Health Service, Deventer, Holanda Biochek, Gouda, Holanda

Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Reino Unido dose infecciosa de 50% dos ovos "enzyme-linked immunosorbent assay" teste com anticorpo fluorescente inibição de hemaglutinação bronquite infecciosa bursite infecciosa intramuscular(mente) doença de Marek's doença de Newcastle 55 ΡΕ1345658 Ρ : probabilidade TCID50 : dose infecciosa de 50% de uma cultura de tecidos TRT : rinotraqueite do peru

Foram utilizadas as seguintes vacinas para este estudo:

Poulvac® TRT, lotes TR02100 e TR02200, contendo 104'1 e 104'1 TCID50 de virus TRT virus por dose, respectivamente.

Poulvac® Ovoline ND, lote BB010, contendo 103'9 EID50 DN de virus por frasco (5000 doses por frasco) .

Bursamune IN OVO, lote 61640, contendo 5000 doses por frasco.

Poulvac® Marek HVT lyo, lote 350129, contendo virus DM, estirpe FC126 (1000 doses por frasco).

Poulvac® NDW, lotes BL03200 e BL04302.

Poulvac® IB Primer, lote CX02301, contendo IO5'0 EID50 vírus BI, serotipos M41 e D207 (Clone D274), por dose (1000 doses por frasco).

Poulvac® Bursa Plus, lote 62481, contendo 103'2 EID50 vírus IBD, estirpe V877, por frasco (2000 doses por frasco) . 56 ΡΕ1345658

Todas as vacinas, excepto a Bursamune IN OVO, foram fornecidas por Fort Dodge Animal Health Benelux, Weesp, Holanda. Bursamune IN OVO foi obtida de Fort Dodge Animal Health, Austrália.

Os lotes das vacinas foram conservados a 0 - 8 °C, protegidos da luz, até o dia de utilização e foram utilizados de acordo com as especificações do fabricante. Após reconstituição, as vacinas foram utilizadas no espaço de duas horas. Foram preparadas as seguintes diluições das vacinas. A diluição da vacina para vacinação in ovo do grupo 1 Poulvac® TRT, lote TR021 00, Poulvac® Ovoline ND e Bursamune IN OVO foram reconstituídas e diluídas no diluente Poulvac® Marek, lote C8109. A diluição final continha uma dose comercial de cada vacina em 0,05 mL.

Diluição da vacina para a vacinação intramuscular (i.m.) dos grupos 1 e 2 contra DM.

Poulvac® Marek HVT lyo foi reconstituída e diluídas no diluente Poulvac® Marek, lote C8109. A diluição final continha uma dose comercial por 0,5 mL.

Diluição da vacina para vacinação por pulverização do grupo 1 Poulvac® IB Primer foi reconstituída e diluída em 2,2 litros de água desmineralizada. A diluição continha uma dose comercial por 0,5 mL. 57 ΡΕ1345658

Diluição da vacina para vacinação por pulverização do grupo 2 Poulvac® NDW, lote BL04302, Poulvac® IB Primer, e Poulvac® TRT, lote TR02200, foram reconstituídas e diluídas em 3 litros de água desmineralizada. A diluição continha uma dose comercial por 0,5 mL.

Diluição da vacina para vacinação do grupo 2 contra IBD em água para consumo humano. Três frascos de Poulvac® Bursa Plus foram reconstituídos e diluídos em água da torneira.

Diluição da vacina para vacinação dos grupos 1 e 2 contra DN por Atomist spray Poulvac® NDW, lote BL03200 foi reconstituída e diluída em água desmineralizada até que a diluição final continha uma dose comercial por 0,5 mL. 14895 ovos comerciais da linhagem Cobb para produção de aves para abate, obtidos de Pronk, Meppel, Holanda, foram colocados numa incubadora localizada em MUK-5/6 na quinta de testes da Fort Dodge AHH, Muiden, Holanda. Todos os ovos foram iluminados após 17 dias de incubação. Os ovos não fertilizados ou com embriões mortos foram removidos. 6001 ovos atribuídos ao grupo 1 foram inoculados com 0,05 mL de uma diluição contendo 1 does de Poulvac® 58 ΡΕ1345658 TRT, Poulvac® Ovline ND e Bursamune IN OVO por ovo após 18 ias de incubação utilizando uma máquina de injecção em ovos Embrex Inovoject de acordo com as instruções do fabricante. 6028 ovos atribuídos ao grupo 2 foram deixados sem inoculação.

Os ovos inoculados (grupo 1) e não inoculados (grupo 2) foram ainda incubados (sem serem voltados) até eclodirem nas incubadoras 1 e 4, respectivamente, localizadas na quinta de testes da Fort Dodge AHH, Muiden, Holanda. Após a eclosão, 4452 (inoculados, grupo 1) e 5248 (não inoculados, grupo 2) pintos foram, respectivamente, incluídos no estudo. Os pintos foram alimentados ad libitum com ração comercial e tinham acesso livre a água disponi-bilizada em bebedouros pendulares. A calendarização de vacinação é apresentada na Tabela 22. A um dia de idade, os pintos do grupo 1 foram vacinados com Poulvac® IB Primer. Uma dose comercial foi administrada por pulverização utilizando um pulverizador de jardim (Gardena) em 0,5 mL por pinto. A um dia de idade, os pintos do grupo 2 foram vacinados com Poulvac® TRT, Poulvac® NDW e Poulvac® IB Primer. Uma dose comercial de cada vacina foi administrada por pulverização num volume de 0,5 mL por pinto, tal como no grupo 1. Antes da vacinação por pulverização, os pintos foram colocados em caixas apropriadas e foram aí deixados até 3 horas após a vacinação. 59 ΡΕ1345658

Todos pintos foram vacinados com Poulvac® Marek HVT lyo, uma dose comercial por pinto, a um dia de idade. A vacina foi aplicada i.m. na coxa, utilizando uma Pistola de Injecção (Veterinary Supplies, Mijdrecht, Holanda) com um volume predeterminado de 0,5 mL.

Os pintos do grupo 2 foram vacinados com Poulvac® Bursa Plus, uma dose comercial por pinto na água de beber, às 2 semanas de idade. A vacina foi distribuída numa quantidade de água que foi consumida no espaço de 2 horas. Os pintos foram privados de água de beber durante 2 horas antes da administração da vacina.

Todos os pintos foram vacinados com Poulvac® NDW às 4 semanas de idade. Uma dose comercial em 0,5 mL por pinto foi aplicada através de um atomizador.

Tabela 22: Calendarização da Vacinação

Grupo Idade aquando da vacinação vacina método de aplicação 1 Ovos 18 dias de incubação Poulvac TRT) Poulvac Ovoline ND) Bursamune IN OVO) máquina de injecção 1 Pintos 1 dia de idade Poulvac IB Primer) Poulvac Marek HVT lyo pulverização em caixa i.m. 2 Pintos 1 dia de idade Poulvac TRT) Poulvac NDW) Poulvac IB Primer) Poulvac Marek HVT lyo pulverização em caixa i.m. 60 ΡΕ1345658 (continuação)

Grupo Idade aquando da vacinação vacina método de aplicação 2 Pintos 2 semanas de idade Poulvac Bursa Plus água de beber 1 e 2 Pintos 4 semanas de idade Poulvac NDW atomizador

Recolheram-se amostras de sangue de 30 pintos de cada grupo após decapitação a um dia de idade. Utilizaram-se amostras de 10 pintos de cada grupo para testes serológicos em AHS. Amostras de outros 10 pintos de cada grupo foram utilizadas para testes serológicos no Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Reino Unido (CVL). As restantes 10 amostras foram utilizadas para testes serológicos em BC. As amostras sanguíneas foram recolhidas da veia da asa até um número máximo de 24 pintos por grupo a 2, 3, 4, 5 e 6 semanas de idade.

Os teores de anticorpo para os antigénios DN, BI M41 e BI D247 foram determinados utilizando testes IH. O limite de detecção dos testes IH corresponde com teor 21og IH = 1,0 para o antigénio DN e com teor 21og IH = 3,0 para os antigénios para BI. Foram calculadas as médias geométricas dos teores IH. Os teores para os vírus TRT e 61 ΡΕ1345658 IBD foram medidos utilizando um método ELISA (IDEXX) de acordo com as instruções do fabricante e foram calculados os teores médios. Estes testes foram realizados a AHS.

As titulações de anticorpos para os vírus DN, BU, TRT e IBD utilizando métodos ELISA foram levados a cabo pela BC. Os teores de anticorpo determinados por ELISA de 1159 e 834 ou acima, respectivamente, para os vírus DN e BI são considerados positivos. Os teores de anticorpo para DN (considerado positivo a 396 ou acima) e BI foram também determinados utilizando kits de teste IDEXX. Os teores médios foram calculados utilizando o programa informático BC99.

Os resultados obtidos em AHS e CVL foram analisados estatisticamente. Os dois grupos foram comparados em relação aos teores de anticorpo por intermédio de um teste de t de Student bilateral. Os teores de anticorpo para IBT, TRT e DM determinados por ELISA sofreram uma transformação logarítmica antes da análise (log[x+l]). As medições DM ^ 1600 e neg. foram respectivamente substituídas por 1600 e 25 nos cálculos. Uma probabilidade de P ^ 0,05 foi considerada como uma diferença estatisticamente significativa.

Resultados: Os teores médios de anticorpo para os antigénios DN, BI, IBD e TRT, determinados por AHS e BC, são apresentados nas Tabelas 23 e 24. 62 ΡΕ1345658

Tabela 23: Teores médios de anticorpo para DN, BI M41, BI P274, IBP e TRT, determinados por AHS._

Teor médio de anticorpo IH 21og teor médio de anticorpo ELISA idade grupo ND IBM41 IBD274 IBD TRT um dia 1 5,4 8,0 7,9 2377 4896 2 (n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=10) 5,8 8,1 7,9 3084 1628 (n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=10)* 2 semanas , vacinação com Poulvac Bursa Plus (grupo 2) 1 2,3 6,2 6, 5 94 509 (n=24) 2 (n=24) (n=24) (n=24) (n=24) 371 2,2 5, 8 6,3 109 (n=24)* (n=24) (n=24) (n=24) (n=24) 3 semanas 1 2,5 5,4 5, 6 51 203 (n=24) 2 (n=24) (n=24) (n=24) (n=24) 90 (n=24)* 1,2 5,4 5,4 45 (n=23)* (n=20) (n=23) (n=24) 4 semanas, vacinação com Poulvac NDW (grupos 1 e 2) 1 1,8 3,8 4,1 951 76 (n=23) 2 (n=24) (n=23) (n=24) (n=24) 7 (n=24)* 1,3 3,7 4,0 1196 (n=24) (n=24) (n=24) (n=24) 5 semanas 1 3, 6 4, 6 4,9 1392 426 (n=24) 2 (n=24) (n=21) (n=21) (n=24) 41 (n=24)* 1,8 4,0 4,2 1210 (n=24)* (n=22) (n=22) (n=24) 63 ΡΕ1345658 (continuação)

Teor médio de anticorpo IH 21og teor médio de anticorpo ELISA idade grupo ND IBM41 IBD274 IBD TRT 6 semanas 1 2,3 4,3 4, 6 1907 215 (n=24) 2 (n=24) (n=24) (n=24) (n=24) 72 (n=24) 3,3 3,7 3,8 1857 (n=24)* (n=24)* (n=24)* (n=24) * diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo 1 TJ IA o 05)

Tabela 24: Teores médios de anticorpo para DN, BI, IBD e TRT, determinados por BC._ teor médio de anticorpo por ELISA Idade Grupo DN BI IBD TRT um 1 7309 (n=10) 6316 (n=10) 4643 (n=10) 11144 (n=10) dia 2 7087 (n=10) 6148 (n=10) 4601 (n=10) 2594 (n=10) 2 semanas, vacinação com Poulvac Bursa Plus (grupo 2) 1 1279 (n=24) 497 (n=24) 399 (n=24) 804 (n=24) 2 1088 (n=24) 64 9 (n=24) 400 (n=24) 610 (n=24) 3 semanas 1 1934 (n=24) 687 (n=24) 440 (n=24) 316 (n=24) 2 763 n=24) 718 (n=24) 854 (n=24) 258 (n=24) 4 semanas, vacinação com Poulvac NDW (grupos 1 e 2) 1 924 n=24) 1100 (n=24) 5448 (n=24) 298 (n=24) 2 530 n=24) 680 (n=24) 6291 (n=24) 451 (n=24) 5 semanas 1 2918 (n=24) 1041 (n=24) 6142 (n=24) 483 (n=24) 2 1604 (n=24) 752 (n=24) 5948 (n=24) 279 (n=24) ΡΕ1345658 64 (continuação)

Idade 6 semanas

teor médio de anticorpo por ELISA

Grupo 1 3074 (n=24) 1435 (n=24) 6322 (n=24) 456 (n=24) 2 2536 (n=24) 2662 (n=24) 6801 (n=24) 681 (n=24)

Teores médios TAF para o vírus DM, representando a diluição média de soro que apresenta fluorescência específica, são apresentados na Tabela 25. Foram observados teores de TAF mais elevados estatisticamente significativos no grupo 2 às 2, 3 e 4 semanas de idade, apresentando uma resposta imunológica mais elevada numa idade mais precoce das aves .

Tabela 25. Teores TAF para vírus DM.

Idade grupo no. amostras teor TAF médio do vírus DM um dia 1 10 880 2 10 940 2 semanas 1 24 66 2 24 175* 3 semanas 1 24 172 2 24 612* 4 semanas 1 24 369 2 24 823* 65 ΡΕ1345658 (continuação)

Idade grupo no. amostras teor TAF médio do virus DM 5 semanas 1 24 950 2 24 877 6 semanas 1 24 1129 2 24 1267 * diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo 1 (P é 0,05).

Exemplo 5 - Discussão

Os pintos de ambos os grupos tinham AM contra os virus DN, BI, IBD, TRT e DM. Uma resposta serológica para DN e IB foi observada após vacinação a um dia de idade. 0 desenvolvimento de titulos para este antigénios ocorreu em gamas normais para ambos os grupos. A segunda vacinação com Poulvac® NDW induziu uma resposta serológica em ambos os grupos. Ambos os grupos desenvolveram teores de anticorpos para os virus IBD, TRT e DM.

Nalguns casos, foram observadas algumas diferenças nos teores de anticorpos entre grupos. Os teores de anticorpos para DN foram mais elevados no grupo 1 (os pintos eclodiram dos ovos inoculados) em todos os casos excep-to às 6 semanas de idade. Os teores de anticorpo para TRT foram igualmente mais elevados no grupo 1 em todos os casos e estas diferenças foram estatisticamente significativas, excepto para a diferença às 6 semanas de idade. A resposta serológica a DM foi relativamente mais lenta no grupo 1, 66 ΡΕ1345658 mas atingiu o mesmo valor que no grupo 2 às 5 semanas de idade. Não se observaram diferenças claras entre grupos nos teores médios de anticorpo para antigénios IB e IBD. Na maioria dos casos, os resultados das titulações realizadas em BC seguiram o mesmo padrão do que aqueles obtidos em AHS, com valores mais elevados para os teores ELISA para IBD e TRT. Verificou-se que uma resposta serológica a IBD pelo teste BC às 3 semanas de idade, o que é uma semana antes do que aquela observada no teste IDEXX. 0 teste ELISA BC parece ser mais sensivel para medir teores de anticorpos para DN do que o método IH. 0 teste ELISA de BC apresentou uma resposta mais pronunciada ao virus IB do que o método IH a partir das 3 semanas de idade. A vacinação in ovo de ovos comerciais ara produção de aves para abate com uma dose comercial de Poulvac® TRT, Poulvad® Ovoline ND e Bursamune IN OVO após 18 dias de incubação seguida por vacinação com Poulvac IB Primer e Pouclvac® HVT a um dia de idade é compatível relativamente à eficácia com a vacinação dos pintos após eclosão com doses comerciais de Poulvac TRT, Poulvac® NDW, Poulvac® IB Primer e Poulvac® Marek HVT lyo no primeiro dia de vida e com vacinação com Poulvac® Bursa Plus às 2 semanas de idade.

Os kits de teste ELISA BC parecem favoráveis para a medição de níveis de teores de anticorpos de antigénios virais para DN, BI, IBD e TRT em comparação com os testes IH para DN, NI M41 e BI D274, ou kits de IDEXX para IBD ou TRT. 67 ΡΕ1345658

As Tabelas 26 a 35 apresentam resultados adicionais de teores de anticorpos.

Tabela 26. Teores por IH de anticorpo para o vírus DN, determinados por AHS. ida de Grupo no. pintos indicado de com o teor vírus DN 21og IH Soro Insuficiente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 um dia 1 1 5 3 1 2 2 2 2 4 2 semanas 1 6 12 6 1 1 1 2 2 2 16 3 3 semanas 1 7 7 6 1 2 1 2 20 2 1 1 4 semanas 1 15 4 2 1 1 1 2 19 3 1 1 5 semanas 1 4 3 6 4 7 2 12 7 4 1 6 semanas 1 7 7 6 3 1 2 4 4 4 6 4 2 68 ΡΕ1345658

Tabela 27. Teores por IH de anticorpo para o antigénio BI M41, determinados por AHS. ida de Grupo no. pintos indicado de com o teor 21og antigénio BI M41 IH Soro Insuficiente 3 4 5 6 7 8 9 10 11 um dia 1 3 2 4 1 2 3 5 1 1 2 semanas 1 1 3 3 5 8 4 2 1 7 11 5 3 semanas 1 2 2 7 10 3 2 2 3 3 9 3 4 4 semanas 1 10 9 3 1 2 14 5 4 1 5 semanas 1 7 3 6 3 1 1 3 2 11 3 6 2 2 6 semanas 1 6 10 4 4 2 11 10 2 1 69 ΡΕ1345658

Tabela 28. Teores por IH de anticorpo para o antigénio BI D27 4, determinados por AHS. ida de Grupo no. pintos indicado de com o teor 21og antigénio BI D274 IH Soro Insuficiente 3 4 5 6 7 8 9 10 11 um dia 1 1 1 4 2 2 1 2 2 2 3 1 1 2 semanas 1 2 3 5 9 5 2 2 12 10 3 semanas 1 4 5 12 2 1 2 1 4 6 8 4 4 semanas 1 8 8 6 2 2 10 8 3 2 1 5 semanas 1 7 2 3 6 1 2 3 2 7 6 6 3 2 6 semanas 1 5 6 9 1 3 2 12 6 5 1 ΡΕ1345658 70

Tabela 29: Teores individuais de anticorpo para o virus IBD por ELISA, determinados por AHS._

Teor de anticorpo para o vírus IBD através de ELISA por grupo a várias idades 1 dia 2 semanas 3 semanas 4 semanas 5 semanas 6 semanas grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 1124 531 0 0 0 0 38 33 567 342 564 644 1547 1927 0 2 0 0 174 57 648 368 826 809 1799 2076 2 25 0 0 299 299 648 653 1038 1004 2388 2584 8 38 0 0 570 325 954 907 1132 1012 2421 2989 8 38 0 0 577 564 1005 986 1279 1462 2453 3355 8 51 0 0 637 660 1024 1119 1314 1497 2529 3466 13 57 0 0 721 690 1084 1167 1418 1524 2704 4096 13 57 0 0 729 744 1114 1339 1550 1533 3199 4550 19 64 0 0 751 886 1128 1339 1683 1674 3600 5262 25 64 0 0 805 919 1152 1378 1701 1728 32 77 0 0 867 984 1183 1388 1719 1844 44 77 3 0 883 1031 1243 1456 1871 1853 44 111 15 3 929 1084 1247 1460 1888 1897 51 118 19 3 953 1141 1257 1577 1969 1987 57 118 57 8 968 1185 1538 1577 1987 1906 105 125 65 15 976 1261 1716 1972 2078 1996 118 125 80 15 984 1269 1762 1987 2195 2014 147 161 104 28 1000 1430 1767 448 2250 2123 161 168 137 28 1078 1690 1873 613 2387 2214 175 182 137 28 1567 1808 1875 1179 2432 2250 234 197 137 113 1681 2009 1903 1217 2885 2314 271 212 146 182 1772 2326 1993 1281 2968 2497 278 234 154 214 1862 2362 2062 1308 3033 3005 446 316 162 434 2011 3951 2654 1981 3616 3787 ΡΕ1345658 71

Tabela 30: Teores individuais de anticorpo para o virus TRT por ELISA, determinados por AHS._

Teor de anticorpo para o vírus TRT através de ELISA por grupo a várias idades 1 dia 2 semanas 3 semanas 4 semanas 5 semanas 6 semanas grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 6167 1627 465 0 0 1134 85 46 316 0 0 0 5889 2936 0 0 0 0 85 0 0 0 0 0 6096 4819 371 602 0 0 0 0 0 0 19 0 3542 1457 65 0 0 0 0 0 0 0 709 0 1036 1853 0 1686 0 0 153 0 342 0 0 0 3305 681 19 0 0 0 153 0 0 0 380 337 1784 295 371 0 0 0 0 0 342 0 204 161 7540 1332 2504 0 65 414 0 0 0 931 342 69 3899 840 227 740 241 0 0 0 781 0 123 0 9698 442 711 1612 346 0 383 0 19 0 0 0 346 0 213 0 55 0 275 0 881 0 565 0 0 376 0 0 709 0 0 69 0 0 0 0 0 0 289 0 0 500 1876 0 465 0 0 0 380 0 0 0 0 0 0 0 0 126 106 0 0 0 103 368 0 0 0 0 45 0 262 0 0 1669 442 0 0 0 0 0 1669 0 840 289 442 0 0 0 2620 0 0 0 120 0 499 0 0 0 1289 0 0 0 0 881 741 0 0 0 761 46 219 0 499 1063 1008 89 169 0 852 0 204 365 1161 0 227 0 282 0 781 0 0 89 1547 0 103 144 454 0 204 0 0 144 430 0 85 0 0 0 123 0 140 0 72 ΡΕ1345658

Tabela 31. Teores TAF individuais para o virus DM, determinados a CVL.

Teor TAF para o vírus DM por grupo c várias idades 1 dia de 2 semanas 3 semanas 4 semanas 5 semanas 6 semanas idade de idade de idade de idade de idade de idade grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 800 >1600 100 200 100 400 100 >1600 800 200 800 800 400 800 50 400 neg. 400 200 800 800 50 >1600 800 >1600 800 50 200 100 200 100 200 400 >1600 800 800 800 800 neg. 400 400 >1600 200 >1600 800 >1600 400 800 400 200 100 400 50 400 100 400 200 400 800 800 800 >1600 100 200 50 800 800 800 >1600 >1600 800 >1600 400 400 100 100 50 800 200 >1600 800 400 800 >1600 >1600 >1600 100 100 50 >1600 50 800 400 800 >1600 >1600 >1600 800 50 50 400 800 800 800 400 800 >1600 800 400 800 50 200 400 400 100 800 >1600 800 800 800 50 100 100 800 400 100 200 >1600 >1600 800 100 200 200 200 50 400 >1600 400 >1600 >1600 50 100 400 100 100 >1600 800 800 >1600 800 50 200 200 >1600 800 800 >1600 800 >1600 800 50 20 50 400 100 >1600 >1600 800 >1600 >1600 100 200 400 200 100 200 400 >1600 400 >1600 100 200 200 200 200 400 >1600 800 >1600 >1600 50 200 100 200 800 >1600 800 >1600 400 >1600 50 50 200 >1600 400 400 400 400 >1600 >1600 100 100 100 400 >1600 800 800 800 100 >1600 50 100 200 200 400 50 400 400 >1600 >1600 neg. 100 200 200 400 400 >1600 >1600 200 >1600 50 100 50 400 50 £1600 >1600 800 >1600 >1600 neg. 100 100 800 800 400 >1600 400 >1600 >1600 ΡΕ1345658 73

Tabela 32: Teores individuais de anticorpo ELISA para o vírus DN, determinado por BC._

Teor individual de anticorpo ELISA para o vírus DN por grupo a várias idades 1 dia de idade 2 semanas de idade 3 semanas de idade 4 semanas de idade 5 semanas de idade 6 semanas de idade grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 6742 6546 901 1126 2507 258 1338 215 705 1563 3275 818 9414 8225 454 550 490 175 500 175 1954 351 543 4924 7434 6129 1689 576 245 175 179 2169 4934 6719 9252 377 10709 10884 1123 384 6093 199 262 235 1172 596 434 1623 5639 7348 1808 977 2278 2202 818 149 5709 1606 1427 1225 1874 5096 864 1185 73 182 162 235 1964 1682 2010 9378 9248 9033 1152 242 1957 1252 520 894 3457 2477 4477 1401 6510 4179 1199 1652 5828 325 401 702 2119 285 4076 818 7530 4997 735 801 215 225 5030 1960 3695 394 3623 3265 7990 8434 460 2477 209 149 2179 242 1864 801 3858 2374 1116 1010 5768 199 30 149 3176 242 2536 6990 1427 1785 126 4503 1533 182 1334 3884 586 791 1132 1652 2745 967 1063 1543 9305 1046 1136 884 1921 669 245 626 901 818 6090 2308 1079 149 752 775 215 225 871 50 222 4060 3192 139 1457 1669 639 566 745 318 3146 623 3291 3146 656 1099 1927 325 172 268 4222 1096 5205 3053 1073 1709 113 199 1182 182 1179 977 4149 944 3729 626 7477 242 1301 50 1079 437 8639 5305 656 583 2070 132 66 450 616 1334 5679 937 2715 917 447 242 179 460 6364 1470 2010 5424 983 993 3997 318 371 182 2073 877 1589 2374 2344 1093 430 325 96 126 3566 123 871 4467 358 1553 321 4295 2285 977 86 3536 851 63 74 ΡΕ1345658

Tabela 33. Teores individuais de anticorpo ELISA para o virus BI, determinado por BC._

Teor individual de anticorpo idades ELISA para o virus BI por grupo a várias 1 dia de 2 semanas 3 semanas 4 semanas 5 semanas 6 semanas idade de idade de idade de idade de idade de idade grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 3606 4019 609 700 671 504 496 354 1401 113 484 2230 8858 7858 71 179 496 629 233 329 4331 1071 375 338 8041 10238 671 629 671 434 596 434 1342 1784 442 538 7254 7199 171 296 321 308 233 225 513 263 171 3152 5386 6366 684 1105 221 1080 1296 179 825 338 4715 834 8458 3231 321 388 271 271 2639 746 267 438 484 634 4206 8296 896 504 521 700 196 1209 1863 1284 375 8075 3177 2364 534 1059 784 354 1751 1034 592 475 7212 1547 8267 6620 384 342 846 296 3039 1151 1384 163 117 3539 5911 5290 158 688 721 1255 1034 571 429 488 1276 6257 634 363 258 850 271 1601 742 1109 909 1372 984 988 959 1000 971 271 1984 475 5603 7141 521 667 521 2168 2526 988 1251 2943 1042 1684 496 817 258 467 884 342 742 1346 934 288 434 642 371 780 634 1255 975 1672 484 1109 521 467 333 688 884 446 1793 1447 3460 1409 384 780 1547 504 2289 780 346 200 1888 4786 796 1392 1676 513 308 192 688 659 1984 1868 183 1255 233 388 1184 1000 567 250 308 859 1109 563 1184 296 671 805 333 350 1342 1034 271 434 846 780 1713 133 525 450 158 5920 296 342 221 513 584 513 1492 375 196 3139 371 513 1009 1776 596 805 363 188 225 5619 434 467 1559 667 1372 967 238 175 267 513 ΡΕ1345658 75

Tabela 34. Teores individuais de anticorpo ELISA para o virus IBP, determinado por BC._

Teor individual de anticorpo ELISA para o virus IBD por grupo a várias idades 1 dia de idade 2 semanas de idade 3 semanas de idade 4 semanas de idade 5 semanas de idade 6 semanas de idade grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 grupo 1 grupo 2 4992 3837 352 674 129 166 8581 184 5384 7522 8305 6358 6396 3265 215 436 33 115 9353 7700 4798 6419 4698 7756 5302 4215 129 352 76 2558 3938 9419 5133 12583 7539 7472 8986 7267 730 45 26 29 1071 11617 4971 4881 7152 13687 2112 5817 926 528 50 100 59 8172 6510 3848 4612 5131 1829 5150 582 511 8044 174 121 4568 7488 7006 5047 5850 7548 3613 687 192 76 2188 3574 4800 11164 5825 5373 7140 1970 3624 644 769 186 158 2786 9591 4971 4383 7410 6833 3898 2243 323 174 352 201 5652 4340 5762 8615 3090 5946 3400 6978 76 1088 149 115 7776 6419 8829 333 7023 8192 323 133 26 6777 7469 8866 3925 6225 8818 9620 121 606 79 3455 9341 6336 5095 4822 7435 6261 129 380 26 100 938 6992 6947 9934 3450 5789 323 473 79 29 10310 5289 5825 5191 5398 2334 50 462 94 45 551 5474 5436 6688 8424 3592 404 316 102 108 4595 7435 4389 7533 7295 4868 243 380 264 93 9600 5828 5248 6627 6156 5523 344 325 18 38 8365 4090 5674 7006 8073 6128 753 52 50 29 90 69 6491 9992 5861 5185 10466 215 209 205 68 5368 6444 6446 6103 6372 6297 571 235 94 115 2714 11605 5839 3893 5811 8840 139 425 79 2 5562 2047 5523 5047 6588 6945 861 262 112 3703 5781 2755 5471 2953 6065 7104 425 568 205 133 8177 4523 6599 3466 6421 5095 ΡΕ1345658 76

Tabela 35: Teores individuais de anticorpo ELISA para o virus TRT, determinado por BC._

Teor individual de anticorpo ELISA para o idades vírus TRT por grupo a várias 1 dia de 2 semanas 3 semanas 4 semanas 5 semanas 6 semanas idade de idade de idade de idade de idade de idade grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 14811 1295 983 179 560 371 821 636 258 258 33 507 18017 3530 99 66 195 46 225 248 344 354 215 583 17444 6109 368 1334 99 401 238 513 460 497 517 1099 6566 5815 298 103 427 103 268 136 248 172 536 2023 19653 3338 99 2990 99 56 195 159 828 66 149 646 2626 1854 99 169 722 103 17 103 397 76 53 583 6285 288 146 219 56 136 99 401 560 291 129 411 1325 1162 4086 248 338 656 166 2119 119 76 20 497 7152 1467 447 626 540 169 318 626 86 225 387 119 17563 1083 470 1844 288 46 530 921 225 732 440 1281 480 209 166 483 407 533 685 593 1729 884 417 788 56 798 983 705 1609 205 526 1099 99 56 99 474 146 298 685 507 387 689 4460 103 629 103 99 7 291 368 656 152 99 103 99 7 579 228 106 195 106 646 156 877 298 331 510 411 20 109 20 517 447 228 540 106 407 169 387 109 1556 430 1132 513 268 66 175 563 987 464 924 550 348 381 136 533 288 411 1278 421 235 656 96 1083 679 103 298 381 656 368 772 1023 530 868 649 126 17 666 546 205 934 689 1146 17 99 103 99 103 526 195 33 626 2083 321 156 778 99 228 33 109 546 517 712 1305 397 96 166 258 258 109 53 109

Lisboa, 30 de Julho de 2007

Claims (10)

1. ΡΕ1345658 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade imunogenica-mente eficaz de uma estirpe viva atenuada de virus relacionado com a rinotrqueite de perus (TRT) no fabrico de uma vacina in ovo para a protecção de um hospedeiro aviário de TRT e/ou de insuficiência respiratória relacionada com TRT ou com o sindrome da cabeça inchada (SHS), em que a referida quantidade imunogenicamente eficaz proporciona a gama de desde 103'2 TCID5o a 101'2 TCID50 por ovo e a referida vacina é administrada ao ou antes do dia 24 de incubação, em que a referida vacina consiste numa solução tamponizada de uma estirpe viva, atenuada de virus de rinotraqueite do Λ p peru numa quantidade imunogenicamente eficaz de desde 10 ' TCID50 a 101'2 TCID50 numa base por ovo.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida quantidade imunogenicamente eficaz é formulada num veiculo aceitável de 0,05 a 0,1 mL por ovo.
3. 3. Utilização de qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que a quantidade imunogenicamente eficaz é de 103,/ TCID50 por ovo. 1 Utilização de qualquer das reivindicações 1 2 ou 2, em que a quantidade imunogenicamente eficaz é de 101'2 TCID50 por ovo. 2 ΡΕ1345658
4. 5. Utilização de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o hospedeiro aviário é um embrião de peru ou um embrião de galinha.
5. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida administração ao referido embrião de peru ocorre ao dia 24 de incubação.
6. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida administração ao referido embrião de galinha ocorre ao dia 18 de incubação.
7. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade imunogenicamente eficaz é eficaz contra exposição subsequente após eclosão do peru e/ou da galinha a vírus de rinotraqueíte do peru virulenta; e não produz qualquer diminuição na percentagem dos ovos de peru e/ou de galinha vacinados in ovo que eclodem após expirar o período de incubação.
8. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a vacina é administrada em conjunto com pelo menos uma outra vacina seleccionada do grupo que consiste da vacina da Doença de Newcastle e a vacina da bursite infecciosa. 3 ΡΕ1345658
9. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida vacina é administrada com uma vacina pós-in ovo seleccionada do grupo consistindo em vacina da bronquite infecciosa e vacina da doença de Marek.
10. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a referida vacina pós-in ovo é administrada ao dia 1 de idade. Lisboa, 30 de Julho de 2007