BG107826A

BG107826A - Методи и ваксини за доставяне in ovo на защита срещу ринотрахеит при пуйки

Info

Publication number: BG107826A
Application number: BG107826A
Authority: BG
Inventors: Frans G. Davelaar
Original assignee: Wyeth
Priority date: 2000-11-21
Filing date: 2003-05-19
Publication date: 2004-02-27
Also published as: HK1055914A1; US7348012B2; MXPA03004432A; KR20030055314A; PT1345658E; NZ526556A; DE60128264T2; AU2002243426B2; PL365848A1; CZ20031419A3; ATE361120T1; WO2002045745A2; CN1486206A; CN100379452C; ZA200304762B; US20060034868A1; US20030054016A1; ES2284717T3; EP1345658B1; HRP20030508A2

Description

Изобретението е насочено към полезни методи за предоставяне in ovo на защита срещу ринотрахеита при пуйките (TRT) и/или “Синдром на Подута Глава” (SHS) при гостоприемници птици, например, пуйки и пилета. По-специално, ваксините срещу TRT са доказали, че са както безопасни, така и ефикасни плри подходящо in ovo прилагане върху гостоприемници птици, както е описано в надтоящото.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

TRT представлява инфекция на горния респираторен тракт при пуйките, която се причинява от пневмовирус. Това е силно заразно, тежко заболяване, което поразява пуийки във всякаква възраст. Клиничните симптоми на TRT инфекцията белязано, често разпенено назално изпразване, хрипове, хълцане, кихане, и потрепване на главата. Също така, при инфектираните пуйки може да се наблюдава очен секрет или издуване на инфраорбиталните синуси.

Открити са антитела срещу TRT вируса (TRTV) в някои стада от пилета (както при бройлери, така и при бройлери/плодовити животни), страдащи от “Синдром на Подута Глава” (SHS). Поставя се постулата, че TRTV взима участи в етиологията на SHS и свързано респираторно страдание.

Ваксини за TRT, които се намират в търгонската мрежа не се прилагат in ovo. По-скоро, те се прилагат след излюпване в найразлични форми. Характерно, такива ваксини се прилагат чрез методи на впръскване (например, ръчно напръскване, впръскване с пръскалка, или автоматична екипировка за впръскване) или на капки (за очи или за нос).

Както е обяснено по-пълно по-долу, методите за in ovo прилагане, използуващи TRT ваксини, модифицирани за in ovo използуване, предоставят определени предимства над недостатъците и времеемките след-люпилни пътища на прилагане, които се използуват до момемнта.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение използува достъпни от търговската мрежа TRT ваксини, адаптирани за in ovo методи на прилагане на настоящото изобретение. Експерименталните резултати установяват безопасноста и ефективноста на in ovo прилагането на тези ваксини върху пуйки и пилетау при използуване на подходящи параметри на дозиране.

Методите на настоящото изобретение могат да се използуват за предпазване на госотоприемник птици от TRT, и/или TRT или SHS-свързано респираторно страдание чрез in ovo прилагане на такива ваксини.

Следователно, една цел на настоящото изобретение предоставя метод за защита на госотоприемник птици от TRT, и/или TRT или SHS-свързано респираторно страдание чрез in ovo техники на ваксиниране, които са по-лесни и по-евтини за прилагане на голяма популация от птици.

Друга цел на настоящото изобретение е да се предостави подходящ имунологичен отговор при излюпени птици гостоприемници, без да се засягат противоположно степените на излюпване.

Друга цел на настоящото изоберетение е да се предостави защита срещу SHS-свързано респираторно страдание при използуване на TRT ваксини, адаптирани за in ovo прилагане.

Друга цел на настоящото изоберетение е да се предостави метод за ваксиниране на госотоприемник птици срещу TRT, и/или TRT или SHS-свързано респираторно страдание, който да осигари високи титри на TRTV, в сравнение с птиците, ваксинирани конвенционално, при използуване на по-малки количества ваксинен антиген, при което се достига до намаляване на разходите.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение предоставя метод за имунизиране in ovo на госотоприемник птици срещу TRTV,KaTO по този начин се предоставя защита срещу TRT, и/или TRT или SHS-свързано респираторно страдание. Използуваните ваксини при методите на настоящото изобретение могат с предимство да се приготвят от TRT ваксини от търговската мрежа. По-специално подходяща за използуване в настоящото изобретение е намиращата се в търговската мрежа Poulvac® TRT ваксина, доставена от Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa или Weesp, The Netherlands. Търговската форма на Poulvac® TRT съдържа атенюиран TRTV, щам K, с титър от не по-малко от 10^3,2 TCID₅₀ на за доза и не подходяща или индикирана за in ovo прилагане. В настоящото описание “TCID₅₀” се отнася до 50% инфекциозна доза за тъканна култура.

Характерно, ваксината се ресуспендира в подходящ носител, така че да осигури TCID₅₀ в граници от приблизително 10^3,2 до приблизително 10^4,5, и да се прилага в количество от приблизително 0,05 до 0,1 ml на яйце, в зависимост от вида птица, която се имунизира. Прилагането може да е ръчно, но похарактерно и по-евтино се прилага чрез използуване на намираща се на пазара екипировка за инжектиране на яйца, като тази доставяна от Embrex, Inc., North Carolina. Точната доза, която трябва да се приложи зависи от вида птица, на който трябва да се достави ваксината, например, по-малките птици се нуждаят от помалки дози. Прилагането на ваксината характерно се проявява на или преди 24-тия инкубацианен ден (например, при пуйки), но и друг периад за in ovo ваксиниране, също така попада в обхвата на изобретението, например, на или преди 18-ия инкубацианен ден (например, пилета).

Птици гостоприемници, за които се отнасят ваксините и методите на настоящото изобретение включват пилета, патици, пуйки, гъски, bantam (порода дребни кокошки), пътпъдъци, и гълъби. Предпочитани видове птици са търговско значимите домашни птици, като пилета, патици и пуйки.

Открито бе, че само метода на ваксиниране in ovo е бизопасен и по-лесен за прилагане, но също така се откриват повисоки титп(ри в гостоприемниците птици , които са били имунизирани по този начин.

Освен това, ваксината и метода на прилагане водят до съществено намаляване на процента на яйца, които се излюпват след in ovo ваксиниране, при сравняване с по същество идентична контрорлна (не-ваксинирана) група. За предпочитане, това намаляване е по-малко от приблизително 5% по отношение на процента на излюпвания в контролната група. Още по-желателно е намаляване ат по-мако от приблизително 1-2%. При някои варианти за изпълнение на изобретението, ваксината и метода на изобретението могат в действителност да увеличат процента на яйцата, които се излюпват, понякога до 1-2% или даже и повече. Следователно, ваксината е както безопасна, така и ефективна за прилагане върху птичи видове, като пилета и пуйки.

Следните примери описват подробно методите и илюстративните техники на настоящото изобретение. За специалистите в областа е явно, че могат да се проведат многобройни модификации както на материалите, така и на методите, без да се излиза от целите и намеренията на настоящото описание.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ПРИМЕР 1

Изследване на безопасноста за in ovo пршбогони върху пуйки Оплодени яйца на пуйки за излюпване се получават от родителски пуешки стада, за които се знае, че нямат TRTV; и които не са били ваксинирани преди това срещу TRTV. Тези яйца се определят произволно на 2 различни групи.

На първата група от 76 оплодени яйца се прилага ваксината in ovo на 24-тия инкубационен ден. Първият ден на инкубиране се разглежда за ден 0. Яйцата са снесени приблизително 2-7 дни преди инкубиранего. Poulvac® TRT (партида TR015, срок на годност 24 юни 1997, съдържаща титтър от 107,5 TCID₅₀) се използува за приготвяне на in ovo ваксина. Три ампули с търговски продукт се суспендират отново, всяка от тях, в 10 ml стерилен физиологичен разтвор, за да дадат крайна суспенсия, притежаваща титър от 105,5 TCID₅₀ от ваксината за 0,1 ml. Това съдържание добре се размесва и се налива. Смесеното/налято съдържание се възстановява, като “IOV”, както е в пример 1, подолу.

In ovo прилагането използува 0,1 ml от IOV на яйце, като съдържа титър от 105,5 TCID₅₀, инжектирано в амниотичната течност на всяко от оплодените 76 яйца. След това, тези яйца веднага се поставят в инкубатор (без обръщане) и се оставят да се излюпят в изолационни клетки, в които са били прибрани. Тези яйца/ излюпвания се описват като ваксинирани птици.

Една втора група от 66 оплодени яйца не се ваксинират и се оставят да се излюпват при подобни условия във втора изолационна клетка. Тези яйца/ излюпвания се описват като птиците отрицателни контроли.

И за двете, ваксинираните птици и птиците отрицателните контроли се записват излюпванията в дните 27-ми, 28-ми и 29-ти от инкубирането. Таблица 1 показва експериментално-наблюдаван процент на излюпване. Като се има предвид излюпването, in ovo ваксинирането на настоящото изобретение дава отлични резултати с 93,4% от излюпването от ваксинираните яйца спрямо 92,4% излюпване на яйцата отрицателни контролни.

Таблица 1

Процент на излюпване

Птици	27-ми ден	28-ми ден	29-ден	Общо
Ваксинирани	19,7%	73,7%	0%	93,4%
Отрицателна контрола	28,8%	63,6%	0%	92,4%

След излюпване, 25 пуйчета от всяка група (т.е., ваксинираните птици и птиците отрицателни контроли) се избират произволно и се поставят на пода върху стърготини на всяко от съответните изолационни клетки. Останалите птици от всяка група се подбират (за клане).

Във всяка група, всяка птица се наблюдава дневноза клинични признаци за един период от 21 дни. Присъствието на назален ексудат се оценяват чрез стискане на човката. Тежестта на клиничното заболяване се изчислява съгласно таблица 2.

ТАБЛИЦА 2

СИСТЕМА ЗА КЛИНИЧНО ИЗЧИСЛЯВАНЕ

Резултат

Експериментално-наблюдавани признаци

0	Без
1	Чист назален ексудат
2	Мътен назален ексудат
3	Подути инфраорбитални синуси или замъглени очи и 1 или 2

Общият дневен резултат на група от птици се изчислява чрез сумиране на отделните резултати на всяка птица за този ден. Таблица 3 представя експериментално-наблюдаваните клинични признаци, при използуване на относителната система за изчисляване от таблица 2.

ТАБЛИЦА 3

Резултати от клинични прегледи на ваксинирани птици

Птица #	В 3	ъзраст 4	в дни 5	ча набг 6	подава 7	ната m 8	гица 9	10	1 1
76	0	0	0	0	0	0	0	0	0
77	0	0	1	1	0	0	0	0	0
78	0	0	1	0	2	0	0	0	0
79	0	0	0	2	0	0	0	0	0
80	0	0	0	0	0	0	0	0	0
81	0	0	0	0	0	0	0	0	0
82	0	0	0	0	0	0	0	0	0
83	0	0	0	0	0	0	0	0	0
84	0	0	0	0	0	0	0	1	0
85	0	0	0	0	0	0	0	0	0
86	0	0	0	0	0	0	0	0	0

87	0	0	2	1	2	0	0
88	0	0	0	0	0	0	0
89	0	0	0	0	0	0	0
90	2	2	2	2	0	0	0
91	0	0	1	2	2	2	0
92	0	0	0	0	0	0	0
93	0	0	0	0	0	0	0
94	0	0	0	0	0	0	0
95	0	0	0	0	0	0	0
96	0	0	0	0	0	0	0
97	0	0	1	0	0	0	0
98	0	0	0	0	0	0	0
99	0	0	0	0	0	0	0
100	0	0	0	0	0	2	0
Общо	2	4	9	7	4	4	1
Среден резултат/ птица	0,08	0,16	0,36	0,28	0,16	0,16	0,04
# позитивна	1	3	6	4	2	2	1

Птиците, негативни контроли се преглеждат по същия начин за какъвто и да е клиничен признак, и не се наблюдават абнормалности, т.е., всички са с резулатт нула.

Резултатите от горните наблюдания установяват безопасността от in ovo ваксиниране на настоящото изобретение. Най-високият среден резултат/птица (т.е., 0,36) на 6-тия ден предоставя адекватна граница на сигурност и обозначава единствено слаби/средни симптоми на TRT.

Серологичните анализи също се провеждат чрез събиране на кръв, събрана от 10 птици сред родителски стада на пуйки 6½ седмици след датата, на която се получават яйцата. Кръв се получава, също така, от следните 4 комплекта птици: (а) на възраст от 1 ден, от 20 птици негативни контроли; (Ь) на възраст от 21 дни, от 21 птици негативни контроли; (с) на възраст от 1 ден, от 20 ваксинирани птици; и (d) на възраст от 21 дни, от 20 ваксинирани птици.

Серологичните анализи на кръвните проби на индивидите показват титри на антитела за TRTV. Този анализ използува техника на един ензим-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), който използува А тип антиген и изразява ²юд титри. Експериментално-измерените титри на ²юд титър > 6,0 се приемат за положителни. Геометричната среда (GM) и старндартното отклонение (SD) за експериментално-измерените титри също се изчисляват. Анализът на титрите установява следните резултати. Родителски стада на пуйки са без TRTV (виж GM = 5,04 в сравнение с > 6,0 позитивна крайна стойност. От десетте птици, една е с повишен титър от 7,7. освен това, GM титрите за 1-дневни птици негативни контроли и ваксинирани птици са почти идентични; т.е., съответно, 4,05 и 4,06. въпреки това, две птици измежду ваксинираните птици имат позитивини титри (виж стойности на титруване от 7,1 и 8,1 - всяка > 6,0). За разлика от това, нито една от птиците отрицателни контроли няма титри от > 6,0. SD за птиците отрицателни контроли и ваксинираните птици са, съответно, 0,82 и 1,46.

21-дневни тестови кръвни проби също показват ясни разлики први експериментално-измерените титри. За птиците отрицателни

контроли GM намалява до 3,53, a SD намалява до 0,46. В директен контраст, за ваксинираните птици, GM се увеличана зо 10,53, a SD се увеличава до 0,85. в съответствие, ваксинираните птици имат по-силно високи титри за TRTV.

Приваксинираните птици, серологичният отговор на едена възраст от 21 дни е много висок. Този отговор е даже по-висок от този, който характерно се среща при използуване на същата доза (чрез ваксиниране чрез капки за очи) за 1-дно дневни птици. Титри на TRTV антитела, притежаващи GM = 10,5 се виждат нормално единствено след заразяване с вирулентен щам на TRTV. За сравнение, два опита, при които се използува ваксиниране чрез капки за очи с 105,5 TCID₅₀ Poulvac® TRT за чувствителни poults на пуйки (на възраст от 1 ден) дават средни титри на антитела от, съответно, 8,3 и 8,7 за кръвни проби, събирани на възраст от 21 дни.

Таблица 4 представя данните, поддържащи това серологично тестване на родителски стада на пуйки, птиците отрицателни контроли, и ваксинираните птици.

ТАБЛИЦА 4

TRTV ТИТРИ

родителски стада	птици отрицателни контроли	ваксинирани птици
6½ седмици	1-о	21-а	1-о	21-а
	дневна	дневна	дневна	дневна
	възраст	възраст	възраст	възраст
3,7	3,0	3,8	5,6	11,4
5,5	3,0	3,7	3,9	10,4

	4,7	4,5	3,8	4,9	9,5
	5,9	4,3	3,0	3,4	11,6
	7,7	3,0	3,0	4,0	9,3
	5,6	4,8	3,4	3,0	9,9
	5,4	4,2	3,6	3,0	11,8
	3,7	4,7	3,6	3,0	11,1
	5,2	3,9	4,2	3,0	11,0
	3,0	3,0	4,5	7,1	9,7
		4,7	4,3	5,2	11,1
		5,0	3,2	3,9	9,1
		3,0	3,9	4,4	11,3
		4,8	3,0	3,0	10,6
		3,3	3,8	8,1	11,5
		5,1	3,5	3,3	11,2
		4,5	3,0	3,0	10,5
		4,1	3,0	3,0	10,0
		5,1	3,5	3,0	9,9
		3,0	3,3	3,5	9,6
			3,0
GM	5,04	4,05	3,53	4,06	10,53
SD	1,35	0,82	0,46	1,46	0,85

Следователно, in ovo прилагането (на 24-ия ден от инкубацията) на един IOV от настоящото изобретение при 105,5 ТСЮ₅₀ върху оплодени яйца на пуйки предоставя необходимата сигурност по отношение както на излюпването и на клиничните признаци, така и по отношение на един засилен имунен отговор над прилаганите конвенционно ваксини.

ПРИМЕР 2

Изследване на сигурността за in ovo прилагане при пилета

Специфични без-патогенни яйца от (в настоящото, “SPF) White Leghorn се доставят от търговски източник (Broekman Institute BV, Someren, The Netherlands). 120 SPF яйца се поставят в инкубатор и след 18 дни инкубиране, яйцата се наблюдават на свещ. Това дава 5 неоплодени се отхвърлят и 115 оплодени яйца се приемат. От 115-те приети яйца, се подбират рандомизирано 100 за in ονο ваксиниране. Тези 100 яйца се разделят в три групи както следва:

Група 1 яйца/излюпвания се маркират за идентифициране с маркировка с оранжево мастило, включващо номер. Група 1 се състои от 30 яйца, които, както е описано по-горе, получават in ονο ваксина при изчислена за яйце доза от титър от 105,5 ТСЮ₅₀.

Група 2 яйца/излюпвания се маркират за идентифициране с маркировка с зелено мастило, включващо номер. Група 2 се състои от 40 яйца, които, както е описано по-горе, получават in ovo физиологичен разтвор в равен обем на инжектираната ваксина на яйцата от група 1.

Група 3 яйца/ излюпвания не се маркират. Група 3 се състои от 30 яйца, които не получават каквото и да е in ovo прилагане (нито вексина, нито физиологичен разтвор).

Номерът на маркировките по крилата се използуват единствено ако пилето проявява клинични прояви или на TRT или на SHS.

Пилетата от двете групи 1 и 2 се прибират в същия кокошкарник, в който те се излюпват. Поддържат се подходящи условия (например, храна, питейна вода, дървесни стърготини като материал за спане, температура, относителна влажност, и ДР·)·

Програмата във времето за този експеримент е както следва: първият ден на инкубиране на яйцата от група 1, 2, и 3 приключва в деня 0 на инкубирането. Датата на in ovo прилагането върху яйцата от група 1 и група 2 на, съответно, ваксина и физиологичен разтвор е датата 18-и от инкубирането. Изчислената дата на излюпване съответства на ден 21 от инкубирането. Изследването завършва на датата след излюпването, еквивалентна на 46-ти ден от инкубирането.

За получаването на ваксината за in ovo прилагане се използува ваксината от търговската мрежа, Poulvac® TRT съдържаща 2000 дози на ампула, доставени от Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge, Iowa или Weesp, The Netherlands. Ha основата на една ампула, ваксината има титър 10^4,2 TCID50. на основата на една доза, ваксината има титър от 10^4,2 TCID50. дванадесет (12) ампули от тази ваксина се ресуспендират във физиологичен разтвор буфериран с фосфат (от тук нататъка като “PBS”), при използуване на 5 ml PBS на ампула с ваксината. Полученото съдържание се размесва добре и се налива. Ресуспендираният материал е с изчислен титър от 105,5 TCID₅₀ и общ обем от 60 ml. От тук нататъка ваксината се бележи като “IOV”.

На 18-тия ден от инкубацията IOV ваксината се прилага in ovo чрез инжектиране, при използуване на достъпен на пазара Inovoject® устройство за инжектиране на яйца от Embrex, Inc. North Carolina върху яйцата от група 1. прилагането чрез инжектиране на яйца на IOV се провежда съгласно стандартни процедури. По подобен начин, достъпен на пазара физиологичен разтвор CLEAR

FLEX® INFUSIEVLOESISTOF, от Bieffle Medital SpA, Italy ce прилага върху яйцата от група 2.

ТАБЛИЦА 5

Третиране на яйцата

Г рупа #	# яйця/група	Изчислена доза на яйце
1	30	10⁵'⁵ ТСЮ₅₀ ваксина
2	40	Само физиологичен разтвор
3	30	Без третиране

Процентът на излюпване на яйцата от групи 1, 2 и Зее наблюдава експериментално и се изчислява. На кратко, отбелязват се следните изключения. Поради скелетните анормалности на спина бифида (които не се дължат на каквото и да е странично действие на in ovo ваксинирането), две пилета от група 1 се отстраняват от изследването непосредствено след като са били излюпени и преди те са били маркирани с маркер с идентифициращо мастило. Тези две пилета се изключват от процентите на изчисленото излюпване на група 1. Също така в група 1, едно от пилетата получава нараняване на пръстите на крака и се отстранява от изследването след като вече е било маркирано. Посмъртното изследване на това пиле показва не разкрива белези нито от TRT или каквото и да е друго заболяване, нито на каквото и да е друго нарушение. По подобен начин, това пиле се изключва от процентите на изчисленото излюпване на група 1. По отношение на яйца/ излюпвания на група 2, едно пиле умира след като е било излюпено, но преди да е било маркирано с маркер с идентифициращо мастило. По подобен начин, това пиле се изключва от процентите на изчисленото излюпване на група 2.

Както е планирано, излюпванията от двете групи, 1 и 2, се изучават и се изследват за един период на изследване от 25 дни. По време на този период нито едно от пилетата не проявява клинични белези нито на TRT, нито на SHS. Всичките 30 яйца от група 3 се излюпват. В деня, в който те се излюпват, всичките 30 пилета се заколват за получаване на кръвна проба и последващ анализ, както се описва по-долу.

Таблица 6 представя експериментално-наблюдаваното излюпване и резултатите от смъртноста за всяка от групи 1, 2 и 3. Тези резултати установяват, че in ovo ваксинирането от настоящото изобретение е безопасно, както по отношение на излюпването, така и по отношение на TRT и/или SHS.

ТАБЛИЦА 6

РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗЛЮПВАНЕ/СМЪРТНОСТ

	Група 1	Група 2	Група 3
	Маркиране с оранжево мастило	Маркиране със зелено мастило	Без маркиране на крило
	ваксина	Физиологичен разтвор	Без лечение
Инкубирани	30	40	30
Ваксинирани	30	40	0
Излюпени	28	40	30
	Процент	яйца:
Ваксинирани	100	100	0
излюпени	93,3	100	100

Телесните тегла на пилетата от група 1 (ваксинирани) и група 2 (физиологичен разтвор) се получават на 25-тия ден. Средното телесно тегло на пилетата от група 1 е 209 грама със стандартно отклонение от 22,1. За пилетата от група 2, средното телесно тегло е 217 грама, със стандартно отклонение от 24,8. телесните тегла на групи 1 и 2 не се отличават съществено, както се установява статистически при използуване на 2-странен ученически тест, като Р = 0,18). Тези резултати установяват, че in ovo ваксинирането от настоящото изобретение не включва полученот на 25-ия ден телесно тегло (което е важно за търговията), в сравнение с това получено с in ovo инжектирането на физиологичния разтвор. За да се потвърди статуса без TRT на SPF яйцата, използуване в групи 1, 2 и 3, в деня, в който яйцата от група 3 се излюпват, пилетата се убиват чрез обезглавяване (заколват се) и се събират кръвни проби, които се анализират. Тестването с ELISA не открива никъкво антитяло към TRTV, което потвърждава статуса без TRV на SPF яйца, използувани в изследването.

Това изследване установява, че in ovo ваксинирането на SPF пилешки яйца е безопасно, по отношение на всяко излюпване, смъртност, клинични белези за TRT и/или SHS, и телесно тегло на 25-тия ден.

ПРИМЕР 3

Изследване на ефикастност за in ovo SPF ваксини за пилета

Целта на това изследване е да се потвърди дали in ovo ваксинирането на 18-дневни ембриони на пилета е ефикасно за предотвратяване на TRT и/или SHS заболяване след вирулентна зараза на 3- или 6-седмична възраст. Както е установено по-долу, in ovo ваксиниране на чувствителни 18-дневни заплодени SPF яйца на пилета с 10^4,2 TCID50 е сигурно, докато доза от 10³'² ТСЮ50 е ефикасна срещу клинично заболяване.

Оплодени яйца за излюпване се получават от стада от SPF родители Бял Легхорн, доставени от Whickham Laboratories, United Kingdom.

Получава се намираща се в търговската мрежа TRT ваксина, Poulvac® TRT, достъпна от Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge, Iowa, The Netherlands. In ovo ваксините от настоящото изобретение се получават от Poulvac® TRT, както следва. Всяка от три (3) ©

ампули от търговсксата ваксина съдържащи титър от 107,5 TCID₅₀, се ресуспендира в 4 ml стерилна вода и се разбъркват добре и се наливат. След това се изваждат 4 ml и се прибавят към 19,6 ml стерилен PBS, за да се получи крайно разреждане, еквивалентно на 200 ml на ампула и получена суспенсия, съдържаща титър от

10^4,2 TCID50 ваксина на 0,1 ml. След това ваксината се разрежда като се отнемат 2 ml и се прибавят 18 ml стерилен PBS, за да се получи крайна суспенсия от 10^3,2 TCID50 ваксина на 0,1 ml.

Заразяващият вирус се приготвя както следва. TRTV от UK © щам BUT 8544, изолиран от Dr R.C. Jones в Liverpool University (U.K.), се пасира 23 пъти в култура от орган трахея (по-долу се отбелязва като “ТОС”), веднъж в пуйче, отново се изолира, и се пасира още веднъж в ТОС. Титърът на тази зараза е 10^4,5 TCID₅₀на милилитър.

След 18 дни инкубиране, една първа група от 70 оплодени яйца (по-доле се бележи като Трупа 1”) се инокулира in ovo с 0,1 ml от възстановената TRT ваксина, съдържаща 10^3,2 TCID₅₀, както е описано по-горе. Втора група от 70 оплодени яйца (по-доле се бележи като Трупа 2”) по подобен начин се инокулира с 0,1 ml от възстановената TRT ваксина, съдържаща 10^4,2 ТСЮ₅₀, както е описано по-горе. Яйцата незабавно се поставят в инкубатор (без да се въртят) и се оставят да се излюпят в клетка, в която са били поставени. Яйцата от Група 1 и Група 2 се поставят отделно в подобни изолазионни клетки. Една трета група от 70 оплодени яйца не получава каквото и да е in ovo прилагане (Тук по-доле, като Трупа 3”). Група 3 се посочват по-доле като птици негативна контрола. Тези яйца се поставят в трети изобационни клетки.

Записват се излюпванията на 20-тия, 21-ия, 22-ия и 23-тия 0 ден след инкубирането (денят нула е първия ден на инкубиране).

След излюпване, птиците в повече се заколват на еднодневна възраст, за да останат 50 птци в група. За Групи 1, 2 и 3, експериментално регистрираните проценти на излюпване са, съответно, 91%, 94% и 92%. Това установява, че in ovo ваксинирането с титри от 10^3,2 ТСЮ50 и 10^4,2 ТСЮ50 е сигурно по отношение на излюпване.

На три-седмична възраст, 10 птици от всяка ваксинирана група ( т.е., Групи 1 и 2) и от птиците негативна контрола (т.е., Група 3) се маркират на крилото и се преместват в четвърта ^w изолационна клетка. След това на всяка птица се прилага по-горе описания заразен вирус чрез капки за очи, съдържащи доза от

10^3,5 ТСЮ₅₀ (вирулентен) TRTV в 0,1 ml. При 6-седмична възласт, допълнитоелни десет птици се заразяват по подобен начин с вирулентен щам от TRTV. Въпреки това, поради напредналата възраст на тези птици, дозата за заразяване се увеличава на 103,8 TCID50 (вирулентен) TRTV в 0,2 ml на база на птица.

Заразените птици експериментално се наблюдават в продължение на 14 дни, след от тях се взима кръв и се убиват. Записват се наблюдаваните признаци при използуване на Таблица

Clinical Scoring System, както е използувано в пример 1. тоталният дневен резултат от група от птици се изчислява чрез сумиране на индивидуалните резултати за всяка птица от посочения ден. Събирателния резултат е сумата от средните дневни резултати в дните 3-8. използува се χ2 тест за анализиране на данните. Общите клинични признаци, които се наблюдават в двете ваксинирани групи (Групи 1 и 2) за дните 3-8 се сравняват с тези, наблюдавани в (Група 3) положителните контроли за същия ден, както заЗ-седмичните, така и за 6седмичните заразени. Това наблюдение установява следзните резултати.

По отношение на 3-седмичното заразяване с вирулентен TRTV щам при титър от 10^3,5 TCID50, 90% от неваксинираните контролни птици от Група 3 проявяват клинични признаци. В директна противоположност, малки проценти от ваксинираните птици от Групи 1 и 2 проявяват клинични признаци. За Група 1 (ваксинирани с титър от 10^3,2 ТСЮ50 на яйце), единствено 50% от птиците проявяват клинични признаци. За Група 2 (ваксинирани с титър от 10⁴’² ТСЮ₅₀ на яйце), единствено 30% от птиците проявяват клинични признаци. За Група 3, единствено 1 птица остава съвсем чиста от проявява на клинични признаци. В контраст с това, пет птици от Група 1 и седем от Група 2 остават съвсем чисти от праява на клинични признаци.

По отношение на 6-седмичното заразяване с вирулентен TRTV щам при титър от 103,8 ТСЮ₅₀, 80% от неваксинираните контролни птици от Група 3 проявяват клинични признаци. В директна противоположност, малки проценти от ваксинираните птици от Групи 1 и 2 проявяват клинични признаци. За Група 1 (ваксинирани с титър от 10^3,2 ТСЮ₅₀ на яйце), единствено 20% от птиците проявяват клинични признаци. За Група 2 (ваксинирани с титър от 10^4,2 TCID₅₀ на яйце), единствено 10% от птиците проявяват клинични признаци.

χ2 статистическият анализ установява за 6-седмичното заразяване, че експериментално наблюдаваните клинични признаци и в двете ваксинирани групи от птици (Групи 1 и 2) са значително по-малко тежки, отколкото тези, записани при неваксинираните птици негативни контроли от Група 3 (виж Р > 0,01).

Таблици 7, 8 и 9 представят тези резултати за, съответно, 3седмичното заразяване, 6-седмичното заразяване, и chiквадратичния статистически анализ, както се обяснява по-горе.

ТАБЛИЦА 7

Клинични признаци за 3-седмично заразяване

	# на дните след заразяването с вирулентан TRTV щам под формата на капки за очи при доза от 10^3,5 TCID₅₀ TRTV в 0,1 ml на птица
3	4	5	6	7	8	9	10
птица #	за Група 1 (вак синирани с10^3,2 TCID₅₀ )
104	0	2	2	0	0	0	0	0
106	0	0	2	0	0	0	0	0
107	0	0	0	0	0	0	0	0
111	0	2	0	0	0	0	0	0
113	0	0	0	0	0	0	0	0
117	0	0	2	0	0	0	0	0
118	0	1	0	0	0	0	0	0
124	0	0	0	0	0	0	0	0

127	0	0	0	0	0	0	0	0
139	0	0	0	0	0	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	5	7	6	0	0	0	0
Среден дневен резулт.	0	0,5	0,7	0,6	0	0	0	0
	Група 1 кумулативен резултат на Птица = 1,8
птица #	За група 2 (ваксинирани с 10^4,2 ТСЮ₅₀)
3	0	0	0	0	0	0	0	0
6	0	0	0	0	0	0	0	0
11	1	0	0	0	0	0	0	0
12	0	1	2	0	0	1	0	0
17	0	0	0	0	0	0	0	0
20	0	0	0	0	0	0	0	0
21	0	0	0	0	0	0	0	0
29	0	0	0	0	0	0	0	0
36	2	1	2	2	0	0	0	0
37	0	0	0	0	0	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	8	14	15	3	0	0	0
Среден дневен резулт.	0	0,8	1,4	1,5	0,3	0	0	0

	Група 2 кумулативен резултат за птица = 1,2
птица #	за Група 3 (неваксинирани)
301	0	0	0	2	1	0	0	0
311	0	0	0	2	0	0	0	0
313	0	0	0	0	0	0	0	0
314	0	0	2	3	1	0	0	0
316	0	0	2	0	0	0	0	0
321	0	2	2	0	0	0	0	0
322	0	2	2	2	0	0	0	0
327	0	0	2	3	0	0	0	0
331	0	2	2	1	0	0	0	0
334	0	2	2	1	1	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	8	14	15	3	0	0	0
Среден дневен резулт.	0	0,8	1,4	1,5	0,3	0	0	0

ТАБЛИЦА 8

Клинични признаци за 6-седмично заразяване

	# на за оч	дни след зараз и при доза от 1	яване с вирулентен TRTV щам с капки О^3,5 ТСЮ₅₀ TRTV в 0,2 ml на птица
	3	4	5	6	7	8	9	10
птица #	за Група 1 (ваксинирани с 10^3,2 TCID₅₀)
	за Група 1 (вак синирани с
108	0	0	0	2	0	0	0	0
110	0	0	0	0	0	0	0	0
114	0	0	0	0	0	0	0	0

115	0	0	0	0	0	0	0	0
119	0	0	0	0	0	0	0	0
120	0	0	0	0	0	0	0	0
130	0	0	0	0	0	0	0	0
131	0	0	2	0	0	0	0	0
134	0	0	0	0	0	0	0	0
135	0	0	0	0	0	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	0	2	2	0	0	0	0
Среден дневен резулт.	0	0	0,2	0,2	0	0	0	0
	Група 1 кумулативен резултат на Птица = 0,4
птица #	За група 2 (ваксинирани с 10^4,2 ТСЮ₅₀)
2	0	0	0	0	0	0	0	0
4	0	0	0	0	0	0	0	0
8	0	0	0	0	0	0	0	0
13	0	0	0	0	0	0	0	0
18	0	0	2	2	0	0	0	0
25	0	0	0	0	0	0	0	0
27	0	0	0	0	0	0	0	0
32	0	0	0	0	0	0	0	0
38	0	0	0	0	0	0	0	0
39	0	0	0	0	0	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	0	2	2	0	0	0	0

Среден дневен резулт.	0	0	0,2	0,2	0	0	0	0
	Група 2 кумулативен резултат на Птица = 0,4
птица #	За група 3 (не ваксинирани)
302	0	1	0	0	0	0	0	0
306	0	0	0	3	0	0	0	0
307	0	0	0	0	0	0	0	0
312	0	0	0	0	2	0	0	0
315	0	0	0	0	0	0	0	0
318	0	0	3	3	0	0	0	0
319	0	0	1	2	2	2	0	0
329	0	0	1	0	0	0	0	0
330	0	2	2	2	2	0	0	0
332	0	0	0	0	2	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	3	7	10	8	2	0	0
Среден дневен резулт.	0	0,3	0,7	1,0	0,8	0,2	0	0
	Група 3 кумулативен резултат на птица = 3,0

ТАБЛИЦА 9

Chi -квадратичен анализ

%2-анализ на клиничните резултати: сравнение на 2 вексинирани групи (Група 1 и Група 2) с 1 негативна контролна група (Група 3)
Група	%2	Степен на свобода	вероятност
Г рупа 1 (3- седмично заразяване)	7,27	3	0,1>Р>0,5
Група 2 (3- седмично заразяване)	10,133	3	0,2>Р>0,05
Г рупа 1 (6- седмично заразяване)	12,09	3	Р<0,01
Г рупа 2 (6- седмично заразяване)	12,09	3	Р<0,01

В допълнение към наблюдението на птиците от Групи 1, 2 и 3 за клинични признаци на TRT, птиците се подбагат, също така, на серологичен анализ, при който се определят антитела за TRTV в отделните кръвни проби чрез ELISA техника, при използуване на А тип антиген и се изразяват като ²log титри. Титри на антителата на ²юд титри > 6,0 се приемат като положителни. Резултатите се анализират статистически чрез използуване на Ученически t-тест за не-повторените данни. Таблици 10 и 11 представят серологичните резултати, получени ссъс заразени птици от Групи 1, 2 и 3 за, съответно, 3-седмично заразяване и 6-седмично заразяване. В таблици 10 и 11, “PC” се отнася до след заразяването; “GM” се отнася до средно геометрично; и “SD” се отнася до стандартно отклонение. Накратко, всички групи (т.е., Група 1, 2 и 3) проявяват значително покачване на титрите на антителата на 7-мия ден след заразяването и допълнително покачаване на титрите на антителата на 14-ия ден PC.

ТАБЛИЦА 10

ТИТРИ НА TRTV АНТИТЕЛА (3-седмично заразяване)

	Титри на ²юд антитела след заразяване с вирулентен TRTV в капки за очи при доза от 10^3,5ТСЮ₅₀ в 0,1 ml на птица
Преди заразяването	7 дни PC	14 дни PC
Птица #	За Група 1 (вакс	лнирани с 10^4,2 ТСЮ₅₀)
104	4,4		9,9
106	3,6	9	9,9
107	6,2	7	9,5
111	6,6	10,4	11,2
113	3,4		9,4
117	3,5		8,8
118	3,6	6,4	9,5
124	3,2	6,8	9,7
127	10,1		10,9
139	3,4		10,2
GM	4,8	7,92	9,9
SD	2,2	1,71	0,72

Птица #	За Група 1 (ваксинирани с 10^4,2 TCID₅₀)
3	4,4	9	9,9
6	9,7		10,6
11	4,6	10,3	10,9
12	4,3	7,5	10
17	8,4	10,6	11,1
20	9,1
21	4,5		10
29	4,4		10
36	3,6	9,6	10
37	4,8		10,1
GM	5,78	9,4	10,29
SD	2,31	1,23	0,45
Птица #	За Група 1 (вакс	инирани с 10^4,2 TCID₅₀) .
301	3,3		9,2
311	3,4	9	9,7
313	3	7	9,5
314	3,7	9,9	10,3
316	3,7		10,2
321	4,2	9,5	9,8
322	3,9	7,7	10
327	3,4		10
331	3,5		10,5
334	3,5		10,3
GM	3,56	9,04	9,99
SD	0,28	0,83	0,37

ТАБЛИЦА 11:

Титри на TRTV антитела (6-седмично заразяване)

	Титри на ²юд антитела след заразяване с вирулентен TRTV в капки за очи при доза от 10^3,8ТСЮ₅₀ в 0,2 ml на птица
Преди заразяването	7 дни PC	14 дни PC
Птица #	За Група 1 (вакс	инирани с 10^3,2 ТСЮ₅₀)
108	4		10,2
110	5,9		10,1
114	4,7		9,8
115	4	6	9,9
119	4,1	6,5	10,7
120	4		10,4
130	3,9		9,8
131	3,5	7	9,9
134	3,9	6,4	9,6
135	4	5,5	10
GM	4,2	6,28	10,04
SD	0,67	0,56	0,32
Птица #	За Група 1 (вакс	инирани с 10⁴’² TCID50)
2	5,8		10
4	7,1		9,3
8	6,4	10	10,4
13	5,2		10,2
18	8,6	10,2	11,2
25	10,4	10,7	10,9
27	10,2	10,5	11,4
32	10,3

38	10,8	10,9	11,1
39	6,8		9,5
GM	8,16	10,52	10,47
SD	2,14	0,29	0,72
Птица #	За Група 1 (вакс	инирани с 10⁴’² ТСЮ₅₀)
302	3,8	7,1	10,4
306	4,4	8,1	10,1
307	4,1		10,1
312	3,8	6,3	9,9
315	4,1	6	9,9
318	3,9		10
319	3,9		10
329	3,8		9,9
330	4,3	7,7	9,7
332	3,4		9,9
GM	3,98	7,04	9,98
SD	0,30	0,89	0,19

Подобен серологичен анализ също се осъществява по отношение на всичките три групи (т.е., Групи 1, 2 и 3), които не са били заразени с вирулентен щам TRTV. Определят се средните титри на антителата от контролните птици (Група 3) и от двете групи на ваксинирани птици (Групи 1 и 2) от 1-но днева възраст до 8¹Л-седмична възраст. Както се очаква, титрите на антителата за контролните птици остават ниски по време на това изследване. Титрите на контролните птици са статистически сравними с тези на ваксинираните птици от същата възраст. Таблица 12 представя post in ovo определяне на средни титри на антитела. Отдерните резултати се предсотавят (данните не са представени) за подръжка на експреименталните резултати, представени на таблица 12. в таблица 12, “п” се отнася до броя птици, a “SD” се отнася до Стандартното Отклонение.

ТАБЛИЦА 12

Post in ovo средни титри на антитела

	η	SD	Средни титри на антитела
Възраст	За Група 1 (вакс	инирани с 10^3,2 ТСЮ₅₀)
1-но дневна възраст	10	0,87	4,95
1 седмица	5	0,51	4,06
2 седмици	5	1,54	3,88
3 седмици	20	1,71	4,06
4 седмици	5	0,22	4,28
5 седмици	10	0,67	4,55
6 седмици	10	0,67	4,2
8 % седмици	10	2,04	5,83
Възраст	За Група 2 (ваксинирани с 10^4,2 ТСЮ₅₀)
1-но дневна възраст	11	0,56	4,3
1 седмица	5	0,45	4,26
2 седмици	5	2,82	4,76
3 седмици	20	2,42	5,98
4 седмици	5	2,98	7,16
5 седмици	10	2,38	7,03
6 седмици	10	2,12	8,14
8 % седмици	9	2,56	8,13
Възраст	За Група 1 (ваксинирани с 10^4,2 ТСЮ₅₀)

1-но дневна възраст	10	0,73	3,88
1 седмица	5	0,96	4,72
2 седмици	5	0,26	3,8
3 седмици	18	0,27	3,49
4 седмици	5	0,17	4,4
5 седмици	11	0,5	3,61
6 седмици	11	0,35	3,92
8 ¹/2 седмици	9	0,86	3,98

Анализ на резултатите от Таблица 3, включително експериментално получените измервания, резултати и съответния статистически анализ показват, че най-ниската доза на ваксина (10^3,2 ТСЮ50 TRTV, произлезъл in ovo за чувствителни 18-дневни оплодени SPF пилешки яйца) са ефикасни за това, че придават значителна защита срещу заразяване с вирулентен щам на TRTV на 6-седмична възраст. На 3-седмична възраст, предпазване също се наблюдава ; въпреки това, в светлината на броя на птиците, експериментално наблюдаваните разлики в предпазването претърпяват несполука точно под нивото на значимост. При увеличената доза на ваксиниране от 10^4,2 TCID50 TRTV на яйце (едно увеличение от типа на приблизително ¹1од 10), се наблюдава за двете 3-седмични и 6-седмични зарази, значимо предпазване срещу заразяване с вирулентен щам TRTV.

In ovo прилагане на ваксината, произлезла от Poulvac® TRT ясно се свързва с производството на TRTV-спацифични антитела във ваксинирани/инокулирани птици. Това асоцииране изглежда да е зависимо от дозата. Високата доза от in ovo ваксината причинява покачване в средния титър на антитела при триседмична възраст до нива значително по-високи от тези на птиците негативни контроли и нива приблизително по-ниски от крайната стойност от 6,0. циркулиращият отговор на антитялото към in ovo ваксиниране с висока доза от 10^4,2 TCID₅₀ на яйце изглежда, че се увеличава с времето на пасажа; наблюдава се максимум при шест-седмична възраст; и, следователно, титрите остават постоянни да 8½ -седмична възраст.

Противно на горе-разискваните резултати за високата доза на ваксиниране, птиците,на които е приложена по-ниска доза от 10²² ТСЮ₅₀ на яйце изглежда претърпява дневен отговор на антитяло към ваксината. Титрите едва започват да нарастват при 8½ седмична възраст - когато те достигнат нива, значително повисоки от тези на контролните птици. В този момент, (т.е., 8½ седмици), титрите за птиците с ниски нива на ваксиниране (Група 1) са подобни нива, като тези на птиците с високи нива на ваксиниране (Група 2), при една 3-седмична възраст. Изглежда възможно, при пасирането на допълнително време над 8½ седмици, титрите на антителата да са нарастнали до нива над 6,0.

Проявява се взъимовръзка между титрите на антителата и намаляването на клиничните признаци на TRT. При всяка група от птици, където титрите на антителата са значително по-високи от тези, на контролните птици, но въпреки всичко под стойността на позитивната крайна контрола от 6,0; - наблюдаваната редукция на клиничните признаци на TRT е статистически значима.

In ovo ваксинирането на чувствителни 18-дневни оплодени SPF птичи яйца с дози от приблизителна степен от поне 10^3,2TCID50 на яйце до поне 10^4,2 TCID50 на яйце, по-специално, с дози от приблизително 10^4,2 TCID50 на яйце, изглеждат и двете сигурни и ефикесни срещу клинични болести, нормално очквани от атака с вирулентен TRTV щам.

ПРИМЕР 4

Изследване на ефикастността на in ovo пазарни ваксини за пилета.

Целтта на това изследване е да се устянави, дали in ovo ваксинирането на 18-дневни инкубирани оплодени яйца на пилета от родителски стада на намиращи се в търговската мрежа бройлери е ефикасно при предпазването от TRT и/или SHS заболяване след вирулентна атака при4 или 6-седмична възраст. Както се установява по-долу, in ovo ваксинирането на чувствителни 18-дневни оплодени яйца от TRTV-антитяло позитивни родители с 10^3,2 TCID₅₀ на яйце с ваксина, произлезла от Poulvac® TRT е ефикасно срещу клинично заболяване на ринотрахеит.

Оплодените яйца от излюпванията се получават от родителски стада на 37-седмични намиращи се в търговската мрежа бройлери, които са били преди това ваксинирани с жива TRT ваксина при 10-седмична възраст и убита TRT ваксина при 18седмична възраст. Тези яйца се получават от Mossbank breeder flock, Marshall Agriculture, Whitburn, Scotland.

Намираща се в търговската мрежа TRT ваксина, Poulvac® TRT, доставена от Fort Dodge, Iowa, The Netherlands се използува за получаване на in оуоваксини от настоящото изобретение. Три ампули от тази пазарна ваксина, съдържащи титър от 107,5 TCID₅₀се ресуспендират, всяка, в 5 ml стерилна вода, и съдържанието добре се разбърква и се налива. След това, ваксината са разрежда в стерилен физиологичен разтвор във фосфатенн буфер (PBS), за да се получи суспенсия от 10^3,2 ТСЮ₅₀ вексина на 0,1 ml.

Вирусът за заразяване се приготвя, както следва. TRTV от UK щам BUT 8544 се пасира 23 пъти в култура от орган трахея (подолу, като “ТОС”), веднъж в пуйчета, изолира се отново, и отоново се пасира в ТОС. Титърът на този вирус за заразяване е 10^4,5ТСЮ₅₀ на ml.

След 18-дневно инкубиране, 57 оплодени яйца се инокулират in ovo с 0,1 ml от възстановената TRT ваксина, съдържаща 10^3,2TCID₅o, както е описано по-горе. Яйцата се поставят незабавно в инкубатор (без обръщане) и се оставят да се излюпат в изолационна клетка, в която са били настанени. След излюпване, 40 птици се отстраняват от инкубатора и се поставят на пода върху стърготини.

Известен брой (110) оплодени яйца не се ваксинират/инокулират и се оставят да се излюпат по отделно. Денят след излюпването, четиридесет птици се настъняват във втора изолационна клетка, като птици негативни контроли. Заразените контролни птици се наричат птици позитивни контроли.

Излюпването се записва на 20-тия, 21-ия, 22-ия и 23-тия ден (инокулиране в деня нула). След излюпване, птиците в излишък се убиват хуманно или се използуват за събиране на кръв. Процентът на излюпване за не-ваксинираните яйца и за ваксинираните яйца, съответно, 89% и 91%, който установява, че по отношение на способноста за излюпване, ваксинирането с титър от 10^4,2 ТСЮ₅₀ е сигурно.

На 4-седмична възраст, десет птици от ваксинираната група и десет птици от негативните контроли се маркират на крилото и се преместват в трета изолационна клетка. След това се прилага върху всяка птица горе-описания вирус за заразяване чрез капки за очи, съдържащи доза от 10^3,5 TCID₅₀ (вирулентност) TRTV в 0,1 ml. На 6-седмична възраст, допълнително 14 птици се атакуват по подобен начин, с вирулентен щам на TRTV. Все пак, поради напредналата възраст на тези птици, заразната доза се увеличава до 103,8 TCID₅₀ (вирулентност) TRTV в 0,2 ml на осоновата на птица.

Заразените птици се наблюдават експериментално в продължение на 14 дни, след което им се взима кръвта и се убиват. Наблюдаваните признаци се записват при използуване на таблица 13 Ревизирана Клинична Система за Отчитане. Системата на таблица 13 е подобна на, но не идентична на системата от таблица 2, описано по-горе в пример 1.

ТАБЛИЦА 13

Ревизирана Клинична Система за отчитане

резултат	Експериментално наблюдавани симтоми
0	Без признаци
1	Чист назален ексудат
1	мътни очи, но без назален ексудат
2	Мътен назален ексудат
3	Подути инфраорбитални синуси или мътни очи и 1 или 2

Общият дневен резултат на група от птици се изчислява чрез сумиране на отделните резултати за всяка птица на съответния ден. Кумулативният резултат представлява сумата от средните дневни резултати. За анализиране на данните се използува χ2 теста. Общите клинични признаци, които се виждат при Група 1 ваксинирана група се сравняват с тези, които се виждат при Група

2, позитивни контроли в същите дни и за двете - 4-седмична и 6седмична зараза. Това проследяване установява следните резултати.

По отношение на 40седмичното заразяване с вирулентен TRTV щам при титър от 10^3,2 TCID₅₀, клиничните признаци се наблюдават едва на 6-ти и 7-и ден, - максимумът от признаци се наблюдават на β-тия ден и в двете групи (т.е., Група 1 и 2). При ваксинираната група (Група 1), едва 30% от птиците проявяват клинични признаци след заразяване и кумулативният среден резултат за птица е 0,6. при Група 1, седем от десет птици остават абсолютно чисти откъм клинични признаци. Общите клинични признаци при ваксинираните птици се сравняват статистически с тези на птиците позитивна контрола. Въпреки, че ваксинираните птици проявяват по-малко тежки клинични признаци от тези, от птиците позитивна контрола, тези резултати не са статистически значими (0,2 <Р<0,3).

По отношение на 6-седмично заразяване с вирулентен TRTV щам с титър от 103,8 TCID₅₀, клинични признаци се наблюдават за по-дълги периоди от време при птиците позитивни контроли, отколкото след 4-седмично заразяване с по-ниска доза. Въпреки това, при ваксинираните птици, клинични призпаци се наблюдават само за един ден. От птиците позитивни контроли, 57% проямяват клинични признаци и кумулативният резултат за птица е от 1,35. от 14те птици в тази група, 6 остават съвсем чисти откъм клинични признаци. Една птица прлоявява тежки клинични признаци на 5тия и 6-тия ден от наблюдателния период и в последствие умира девет дни след заразяването. Прегледът след смърта на тази птица показва разширена дясна вентрикула, изпълнени с кръв сърдечни вени, изпълване с кръв на белите дробове, мукоза в излишък в трахеята, и фибринозен ексудат върху черния дроб. Вероятната причина за смърта е дясно сърдечно спукване и възможен хепатит. В противовес, единствено 14% от ваксинираната група от птици проявява клинични признаци след заразяване и кумулативния резултат за птица е 0,14. от 14-те птици в тази група, 12 остават съвсем чисти откъм клинични признаци. Общите клинични признаци при ваксинираната група (Група 1) се сравнява статистически при използуване на χ2 анализ за тези, които се наблюдават при птиците позитивни контроли (Група 2). Този анализ установява, че клиниичните признаци, наблюдавани при ваксинираната група са значително по-малко тежки, отколкото наблюдаваните при птиците позитивни контроли (0,2<Р<0,05).

Таблици 14, 15 и 16 представят тези резултати за, съответно,

4-седмично заразяване, 6-седмично заразяване, и χ2 статистически анализ, както се описва по-горе.

ТАБЛИЦА 14

Клинични признаци за 4-седмично залазяване

	Номер на дни след заразяване с вирулентен TRTV в капки за очи при доза от 10^3,5 ТСЮ₅₀ в 0,1 ml на птица
	3	4	5	6	7	8	9	10
Птица #	За Група 1 (ваксинирани с 10^3,2 TCID	5θ)
41	0	0	0	0	F	0	0	0
42	0	0	0	0	0	0	0	0
43	0	0	0	2	0	0	0	0
44	0	0	0	0	0	0	0	0
45	0	0	0	0	0	0	0	0
46	0	0	0	0	0	0	0	0
47	0	0	0	0	0	0	0	0
48	0	0	0	2	F	0	0	0
49	0	0	0	0	0	0	0	0
50	0	0	0	0	0	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	0	0	4	2	0	0	0
Среден дневен резулт.	0	0	0	0,4	0,2	0	0	0
	За Група 1 кумулативен резултат за	птица =	0,6
Птица #	За Група 2(неваксин	/\|рани)
391	0	0	0	3	0	0	0	0
392	0	0	0	0	0	0	0	0
393	0	0	0	0	0	0	0	0
394	0	0	0	2	0	0	0	0
395	0	0	0	3	F	0	0	0
396	0	0	0	0	F	0	0	0
397	0	0	0	0	0	0	0	0
398	0	0	0	1	F	0	0	0
399	0	0	0	1	0	0	0	0
400	0	0	0	0	0	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	0	0	10	3	0	0	0
Среден дневен резулт.	0	0	0	1	0,3	0	0	0
	За Група 2 кумулативен резултат за	птица =	1,3

ТАБЛИЦА 15

Клинични признаци за 6-седмично заразяване

	Номер на дни след заразяване с вирулентен TRTV в капки за очи при доза от 103,8 ТСЮ₅₀ в 0,2 ml на птица
3	4 15	6	7 8 9 10
Птица #	За Гр'	/па 1 (ваксинирани с 10^3,2 TCI	Обо)
1	0	0	0	0	F	0	0	0
2	0	0	0	0	0	0	0	0
3	0	0	0	2	0	0	0	0
52	0	0	0	0	0	0	0	0
53	0	0	0	0	0	0	0	0
54	0	0	0	0	0	0	0	0
55	0	0	0	0	0	0	0	0
56	0	0	0	2	F	0	0	0
57	0	0	0	0	0	0	0	0
59	0	0	0	0	0	0	0	0
60
62
65
69
Общ дневен резулт.	0	0	0	4	2	0	0	0
Среден дневен резулт.	0	0	0	0,4	0,2	0	0	0
	За Група 1 кумулативен резултат за птица = 0,14
Птица #	За Гр'	/па 2 (неваксинирани)
381	0	0	0	0	0	0	0	0
383	0	0	0	0	0	0	0	0
387	0	0	0	0	0	0	0	0
388	0	F	0	0	0	0	0	0
389	0	0	0	0	0	1	0	0
390	0	0	F	0	0	0	0	0
463	0	0	2	F	0	1	0	0
464	0	0	0	0	0	0	0	0
465	0	0	0	2	0	0	0	0
469	0	0	0	0	0	1	0	0
474	0	0	0	0	0	0	0	0
476	0	0	3	3	0	0	мъртъв	0
477	0	0	0	0	0	0	0	0

478	0	0	2	F	0	0	0	0
Общ дневен резулт.	0	1	8	7	0	3	0	0
Среден дневен резулт.	0	0,07	0,57	0,5	0	0,21	0	0
	За Група 2 кумулативен резултат за птица	= 1,35

ТАБЛИЦА 16 Chi-квадратичен анализ на данните от клиничния резултат

χ2 - анализ на клиничните scores: сравняване на 1 ваксинирана група (Група 1) с 1 група позитивна контрола (Група 2)
Група	λ²	Степен на свобода	Вероятност
Г рупа 1 (4седмично заразяване)	3,95	3	0,2<Р<0,3
Група 1 (6седмично заразяване)	8,43	3	0,02<Р<0,05

В допълнение към проследяването на птиците от Група 1 и 2 за клинични прояви на TRT, птиците се подлагат, също така, на серологичен анализ, при който антитела към TRTV в отделни кръвни проби се определят чрез ELISA техники, развити от Leahurst, Liverpool, (U.K.), при използуване на А тип антиген и се представя като ²юд титри. Титрите на антителата на ²юд титри>6,0 се приемат за позитивни. Резултатите се анализират статистически при използуване на Student’s t-тест за данни без повторение. Таблици 17 и 18 представят серологичните резултати, получени със заразените птици от Групи 1 и 2 за, съответно, 4седмично заразяване и 6-седмично заразяване. Таблици 17 и 18, “PC” се отнасят до след-заразяването.

ТАБЛИЦА 17

TRTV титри на антитела (4-седмично заразяване)

	²юд титри на антителата след заразяване с вирулентен TRTV в капки за очи при доза от 10^3,5 ТСЮ₅₀ в 0,1 ml на птица
Преди заразяване	14 дни PC
Птица #	За Група 1 (вексинирани с 10^3,5 TCID50)
41	3,0	9,4
42	3,0	9,2
43	3,0	10,1
44	3,0	9,5
45	6,9	10,8
46	5,4	11,2
47	3,0	10,2
48	3,0	10,6
49	8,2	9,9
50	9,2	11,0
Средно	4,77	10,19
Стандартно отклонение	2,48	0,70
Птица #	За Група 1 (вексинирани с 10^3,5 ТСЮ₅₀)
391	3,3	9,5
392	3,5	10,3
393	3,0	9,7
394	3,1	9,1
395	3,6	8,9
396	3,6	9,7
397	3,1	9,8

398	3,4	9,3
399	3,0	9,7
400	3,4	9,9
Средно	3,3	9,6
Стандартно отклонение	0,24	0,41

ТАБЛИЦА 18

TRTV титри на антитела (6-седмично заразяване)

	²юд титри на антителата след заразяване с вирулентен TRTV в капки за очи при доза от 10³’⁸ ТСЮ₅₀ в 0,2 ml на птица
Преди заразяване	14 дни PC
Птица #	За Група 1 (вексинирани с 1O³’⁵TCID₅o)
1	6,3	11,6
2	4,3	10,4
3	4,2	10,1
52	3,6	10,6
53	4,1	10,6
54	3,7	10,7
55	4,8	9,7
56	3,6	9,9
57	8,1	10,1
59	3,4	10,2
60	3,6	9,8
62		9,3
65	5,3	10,0
69	4,9	10,1

Средно	4,61	10,22
Стандартно отклонение	1,34	0,55
Птица #	За Група 1 (вексинирани с 10^3,5TCID₅₀)
381	4,2	9,8
383	5,2	9,2
387	3,0	9,9
388	3,4	9,6
389	3,8	9,0
390	5,4	8,8
463	4,0	10,0
464	3,0	9,7
465	3,7	8,7
469	3,0	9,6
474	3,9	9,9
476	4,7
477	4,8	9,9
478	5,0	9,6
Средно	4,08	9,52
Стандартно отклонение	0,83	0,44

Провежда се подобен серологичен анализ по отношение на тези птици, които не са заразени с вирулентен щам TRTV, при използуване на десет серумни проби, взети от птици от пет различни пространства от Mossbank родителски стада от плодовити животни (Marshalls Agriculture) при 25 и 41 седмична възраст. Таблица 19 представя средните титри на антителата от тези птици от родителски стада от плодовити животни.

ТАБЛИЦА 19

Средни титри на антинела от родителски стада от плодовити животни

	25-седмична възраст (п = 10)	41-седмична възраст (п=10)
клетка	Средно	SD	Средно	SD
4А	7,60	2,57	7,39	1,72
5А	7,51	0,81	8,27	0,87
ЗВ	7,44	2,55	7,29	1,50
4В	8,16	0,67	6,64	1,46
5В	7,34	1,81	7,17	0,98

И за двете групи, незаразени ваксинирани и незаразени птици негативни контроли, кръвта се събира на 1-дно дневна възраст и 4-, 6- и 8-седмична възраст. Таблица 20 представя тези средни титри на антитела за незаразените птици.

ТАБЛИЦА 20

Средни титри на антинела за незаразени птици

	Незаразени птици негативни контроли	Ваксинирани птици
Възраст	Средно	SD	η	Средно	SD	η
1-ден	7,23	1,32	10	6,46	0,99	10
4 седмици	3,52	0,54	38	4,38	1,86	39
6 седмици	3,93	0,72	28	4,72	1,62	27
8 седмици	3,54	0,75	14	5,09	1,68	14

И за двете групи, заразени ваксинирани и заразени птици положителни контроли, кръвта се събира14 дни след заразяването за всяко от 4-седмичното и 6-седмично заразяване/групи. Таблица 21 представя тези средни титри на антитела за заразените птици в тези две групи.

ТАБЛИЦА 21

	4-седмични заразени	6-седмични заразени
Група	Средно	SD (Р)	η	Средно	SD (Р)	η
Птици позитивна контрола	9,6	0,41(-)	10	9,52	0,44(-)	13
Ваксинирани птици	10,19	0,70(0,031)	10	10,22	0,55(0,001)	14

Отделните резултати се предоставят за подръжка на данните, представени по-горе в таблици 14-21. на основата на горния серологичен анализ се правят следните изводи. И за двете, ваксинираните птици и птиците негативни контроли, на възраст от 1 ден, тези птици притежават майчини антитела (МА) за TRTV. 4седмична възраст, нивата на антитела при птиците негативни контроли са спаднали до негативни нива и остават ниски за остатъка на експеримента. След in ovo прилагане на ваксина с титър 10³’² ТСЮ₅₀, произлезла от Poulvac® TRT, средни титри на антитела остават на негативни нива (т.е., под положителната крайна стойност от 6,0), но нарастват с възраста. При 4-, 6- и 8седмична възраст, ваксинираните птици притежават нива на средни титри на антитела, които които са статистически значително по-високи от тези на птиците негативни контроли. На 4седмична възраст, 20% до 22% от ваксинираните птици имат позитивни титри. По отношение на заразените птици, всички птици проявяват сероконверсия 14 дни след заразяването. И за двете, изследване на 4-седмичното заразяване и 6-седмичното заразяване, средните титри на ваксинираните групи са по-високи от тези на птиците позитивни конроли и тази разлика е статистически значима (Р<0,05).

Анализ на цялоста на пример 4,включително експериментално получените измервания, резултати, и съответните статистически анализи показват, че in ovo ваксинирането на майчини-антитяло-позитивни (МА+) пазарни яйца на бройлер при 18-дневно инкубиране с ваксина, произлезла от Poulvac® TRT при доза от титър 10^3,2 ТСЮ₅₀ на яйце не действа противоположно на способноста за излюпване и осигурява достоверен, продуктивен и ефикасен и метод за прилагане на ваксина. Това ваксиниране придава, също така, предпазване срещу зараза с вирулентен щам на TRTV на 6-седмична възраст когато наблюдаваните клинични признаци са значително намалени. Съществува степен на предпазване на 4-седмична възраст - все пак, въпреки че при неваксинираните птици позитивни контроли наблюдаваните клинични признаци по това време не са много тежки. В съответствие, въпреки че присъстват, предпазването възможно срещу заразяване при 4-седмици не е статистически значимо.

Данните представени в този пример 4, в комбинация с тези от примери 1-3 по-горе, установяват, че пилетата са далеч помалко чувствителни на TRT ваксини. Позитивните средни титри на антитела (под позитивната крайна стойност от 6,0) не се наблюдават след in ovo ваксиниране. Въпреки това, нивата при ваксинираната група са значително по-високи от тези, наблюдавани при негативните контроли. Прибилизително една пета от ваксинираните птици имат позитивни титри след 4седмична възраст. Следователно, по времето на заразяването, цялостната сероконверсия към ELISA нива над 6,0 може да не е добър индикатор за предпазването, позволено от in ovo ваксиниране. Локалният имунитет може да играе роля при взаимодействието между индуцираното предпазване и експериментално определените титри.

Преди анализирането на експерименти 1-4 по-горе, е било постулирано, че присъствието на майчини антитела биха засегнали противоположно ефективноста на ваксините. Пример 4 въпреки това изненадващо установява, че in ovo прилагането на TRT ваксини при титър 10^3,2 TCID₅₀ на яйце ефикасни при редуцирането на клиничното TRT заболяване при пилета, които са МА+. Пример 4 засилва и разширява обхвата на изводине, до които стига пример 3, по-горе; по-точно, че SPF (МА+) пилета, които са ваксинирани in ovo претърпяват намаляване на клиничното заболяване.

ПРИМЕР 5

Изследване на TRT ваксина в комбинация с други птичи ваксини

В изследването се използуват следните съкращения: AHS: Animal Health Service, Deventer, The Netherlands BC: Biochek, Gouda, The Netherlands

CVL: Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK

EID50: 50% доза за инфектиране на птица

ELISA: ензим-свързан имуносорбентен опит

FAT: флуоресцентен тест на антитяло

HI: инхибиране на хемаглутинацията

IB: инфекциозен бронхит

IBD. инфекциозно заболяване на бурсата

i.m.: интрамускулно

MD: болест на Марек

ND: болест на Нюкасел

Р: вероятно

TCID50: 50%инфектираща доза за тъканна кубтура

TRT: ринотрахеит при пуйките

При това изследване се използуват следните материали за ваксини:

Poulvac® TRT, партиди TR02100 и TR02200, съдържащи 104,1 и 104,1 TCID50TRT, вирус на доза, съответно.

Poulvac® TRT Ovoline ND, партида BB010, съдържаща 103,9 EID50 ND вирус на ампула (5000 дози на ампула).

Bursamune IN OVO, партида 61640, съдържаща 5000 дози на ампула.

Poulvac® Marek HTV lyo, партида 350129, съдържаща MD вирус, щам FC126 (1000 дози на ампула).

Poulvac® NDW, партиди BL03200 и BL04302.

Poulvac® IB Праймер, партида СХ02301, съдържаща 105,0 EID50 IB вирус, серотипове М41 и D207 (D274 Клон), на доза (1000 дози на ампула).

Poulvac® Bursa Plus, партида 62481, съдържаща 103,2 EID50 BD вирус, щам V877, на ампула (2000 дози за ампула).

Всички ваксини, с изключение на Bursamune IN OVO, се доставят от Fort Dodge Animal Health Benelux, Weesp, The Netherlands. Bursamune IN OVO се получава от Fort Dodge Animal Health, Australia. Партидите ваксини се съхраняват при 0-8°, предпазени от светлина, до деня на употриба, съгласно предписанията на производителя. След възстановяване, ваксините се използуват до два часа. Изготвят се следните разреждания на ваксини.

Разреждане на ваксина за ваксиниране in ovo на Група 1 Poulvac® TRT, партида TR02100, Poulvac® Ovoline ND и Bursamune IN OVO се възстановяват, след което се разреждат в Poulvac® Marek разтворител, партида С8109. крайният разтвор съдържа една пазарна доза от всяка от ваксините в 0,05 ml.

Разреждането на ваксини за интрамускулно (i.m.) ваксиниране на Групи 1 и 2 срещу MD, Poulvac® Marek HTV lyo се възстановява с последващо разреждане в Poulvac® Marek разтворител, партида С8109. разреждането съдържа една пазарна доза за 0,5 ml.

Разреждането на ваксини за едрозърнест спрей ваксиниране Група 1 Poulvac® IB Праймер се възстановява и се разрежда допълнително в 2,2 литра деминерализирана вода. Разреждането включва една пазарна доза на 0,5 ml.

Разреждането на ваксини за едрозърнест спрей ваксиниране Група 2 Poulvac® NDW, партида BL04302, Poulvac® IB Праймер, и Poulvac® TRT, партида TR02200, се възстановяват и се разреждат допълнително в 3 литра деминерализирана вода. Крайното разреждане включва една пазарна доза на 0,5 ml.

Разреждане на ваксини за ваксиниране на Група 2 срещу IBD в питейна вода три ампули Poulvac® Bursa Plus се възстановяват и се разреждат допълнително водопроводна вода.

Разреждането на ваксини за ваксиниране на Групи 1 и 2 срещу ND чрез атомизаторен спрей Poulvac® NDW, партида BL03200 се възстановява и се разрежда допълнително в деминерализирана вода докато крайното разреждане не съдържа една пазарна доза на 0,5 ml.

14895 яйца от търговската мрежа от порода Cobb бройлери ф за производство, получени от Pronk, Meppel, The Netherlands, се поставят в инкубатор, намиращ се в MUK-5/6 при ферма за тестове Fort Dodge АНН, Muiden, The Netherlands. Всички яйца се гледат на свещ след 17 дни инкубиране. Неооплодените яйца или яйцата с умрели ембриони се отстраняват.

6001 яйца определени към Група 1 се инокулират с 0,05 ml разтвор, съдържащ 1 доза Poulvac® TRT, Poulvac® Ovoline ND и Bursaumne IN OVO на яйце след 18 дни инкубиране, при използуване на Embrex Inovoject устройство за инжектиране на q яйца, съгласно инсрукциите на производителя. 6028 яйца определени към Грула 2 не се инокулират. Инокулираните (Група 1) и неинокулираните (Група 2) яйца се инкобират освен това (без да се въртят) до излюпване в инкубатори 1 и 4, съотоветно, намиращи се във ферма за тестове Fort Dodge АНН, Muiden, The Netherlands. След излюпване, 4452 (инокулирани, Група 1) и 5248 (неинокулирани, Група 2) пиленца се включват в изследването, съответнво. Пиленцата се настаняват на групи върху дървесни стърготини, намиращи се в същия навес във фермата за тестове Fort Dodge АНН, Muiden, The Netherlands. Пиленцата от Група 1 се настаняват на групи в MUL-L, а пиленцата от Група 2 в MUL-R.

Всички пиленца се хранят ad libitum с пазарни пелети за бройлери и имат свободен достъп до вода, доставяна в поилки.

Програмата за ваксиниране е показана на таблица 22. На еднодневна възраст, пиленцата от Група 1 се ваксинират с Poulvac® IB Праймер. Една пазарна доза се прилага чрез едрозърнест спрей, при използване на градинска пръскачка (Gardena) при 0,5 ml на пиленца. На еднодневна възраст, пиленцата от Група 2 се ваксинират с Poulvac® TRT, Poulvac® NDW и Poulvac® IB Праймер. Една пазарна доза от всяка ваксина 9 се прилага чрез едрозърнест спрей, в един обем от 0,5 ml на пиленце, както при Група 1. Преди ваксинирането с едрозърнест спрей, пиленцета се поставят в кафези и се оставят там до 3 часа след ваксинирането.

Всички пилета се ваксинират с Poulvac® Marek HVT lyo, една пазарна доза на пиле, на еденодневна възраст. Ваксината се прилага интрамускулно в бедрото, при използуване на Pullet Injection Gun )Veterinary Supplies, Mijdrecht, The Netherlands) c предварително определен обем от 0,5 ml.

р Пиленцата от Група 2 се ваксинират с Poulvac® Bursa Plus, една пазарна доза на пиленце чрез питейната вода, на вдуседмична възраст. Ваксината се разпределя в такова количество вода, което се консумира за 2 часа. Пиленцета се лишават от питейна вода 2 часа преди прилагането на ваксината.

Всички пиленца се ваксинират с Poulvac® NDW на четириседмична възраст. Една пазарна доза в 0,5 ml на пиленца се прилага чрез атомизатор.

ТАБЛИЦА 22

Програма на ваксиниране

Група 1	Възраст при ваксиниране на яйцате 18 дни след инкулиране	Ваксина Poulvac TRT) Poulvac Ovoline ND Bursamune IN OVO)	Начин на прилагане Устройство за прилагане
1	Пиленца на възраст 1 ден	Poulvac IB Праймер) Poulvac Marek HVT lyo	едрозърнест спрей в клетки за пилета i.m.
2	Пиленца на възраст 1 ден	Poulvac TRT) PoulvacNDW) Poulvac IB Праймер Poulvac Marek HVT lyo	едрозърнест спрей в клетки за пилета i.m.
2	Пиленца на възраст 2 седмици	Poulvac Bursa Plus	Питейна вода
1 и2	Пиленца на възраст седмици	Poulvac NDW	Атомизатор

Взимат се кръвни проби от 30 пилета от всяка група след заколване на еднодневна възраст. Проби от 10 пилета от всяка група се използват за серологични тестове при AHS. Проби от деЮ други пилета се използуват за серологични тстове при Center Vetetinary Laboratory, Weybridge, UK (CVL). Осотаналите 10 проби се използуват за серологични тестове при ВС. Кръвните проби се събират от крилната вена от максимален брой 24 пилета от група при 2, 3, 4, 5 и 6 седмична възраст.

Определят се титрите на антитела за ND, IB М41 и IB S274 антигени при използуване на HI тестове. Границата на откриване на HI тестовете сйответства на 2log HI = 1,0 за ND антиген и на 2log HI = 3,0 за IB антигени. Изчислява се геометричния център. Титртите на антителата за TRT и IBD вируси се измерват при използуване на ELISA метод (IDEXX), съгласно предписанията на производителя, а средните титри се изчисляват. Тези тестове се правят при AHS.

Титруването на антитела за ND, IB, TRT и IBD вируси използуващо ELISA методи се провежда чрез ВС. ELISA титрите на антитела от 1159 и 834 или повече от ND и IB вируси, съответно, се приемат за положителни. Титрите на антитела за ND (приемат се позитивни при 396 или повече) и IB вируси също се определят при използуване на IDEXX тест китове. Средните титри се изчисляват при използуване на ВС99 софтуер.

Получените резултати при AHS и CVL се анализират статистически. Двете групи се сравняват по отношение на титрите на антитела чрез средното от 2-странен ученически t тест. ELISA антитела титрите към IBD и MD се трансформират с log (логаритмуват) (юд[х+1]) преди анализа. MD измерванията > 1600 и neg. се заместват с 1600 и 25 при изчисленията, съответно. Вероятност от Р < 0,05 се приема като статистически значима разлика.

Резултати: средните титри на антитела за ND, IB, IBD и TRT антигени, определени чрез AHS и ВС са показани на таблици 23 и

24.

ТАБЛИЦА 23

Средни титри на антитела за ND, IB М41, IBD D274, IBD и

TRT, определени чрез AHS

	Среден титър 2log HI на антитела	Среден ELISA титър на антитела
Възраст Група	ND	IBM41	IBD D274	IBD	TRT
Един ден	1 2	5,4 (п=10) 5,8 (п=10)	8,0 (п=10) 8,1 (п=10)	7,9 (п=10) 7,9 (п=10)	2377 (п=10) 3084 (п=10)	4896 (п=10) 1628 (п=10)*
2 седмици ваксиниране с Poulvac Bursa Plus (Група 2)
	1 2	2,3 (п=24) 2,2 (п=24	6,2 (п=24) 5,8 (п=24)	6,5 (п=24) 6,3 (п=24)	94 (п=24) 109 (п=24)	509 (п=24) 371 (п=24)*
3 седмици
	1 2	2,5 (п=24) 1,2 (п=24)	5,4 (п=24) 5,4 (п=24)	5,6 (п=24) 5,4 (п=24)	51 (п=24) 45 (п=24)	203 (п=24) 90 (п=24)*
4 седмици ваксиниране с Poulvac NDW (Групи 1 и 2)
	1 2	1,8 (п=24) 1,3 (п=24)	3,8 (п=24) 3,7 (п=24)	4,1 (п=24) 4,0 (п=24)	951 (п=24) 1196 (п=24)	76 (п=24) 7 (п=24)*
5 седмици

	1 2	3,6 (п=24) 1,8 (п=24)	4,6 (п=24) 4,0 (п=24)	4,9 (п=24) 4,2 (п=24)	1382 (п=24) 1210 (п=24)	426 (п=24) 41 (п=24)*
6 седмици
	1 2	2.3 (п=24) 3.3 (п=24)	4,3 (п=24) 3,7 (п=24)	4,6 (п=24) 3,8 (п=24)	1907 (п=24) 1857 (п=24)	215 (п=24) 72 (п=24)

* статистистически различен от Група 1 (Р < 0,05).

ТАБЛИЦА 24

Средни титри на антитела за ND, IB, IBD и TRT, определени чрез ВС

	Среден ELISA титър на антитела
Възраст	Група	ND	IB М41	IBD D274	IBD	TRT
Един ден	1 2	5,4 (п=10) 5,8 (п=10)	8,0 (п=10) 8,1 (п=10)	7,9 (п=10) 7,9 (п=10)	2377 (п=10) 3084 (п=10)	4896 (п=10) 1628 (п=10)*
2 седмици ваксиниране с Poulvac Bursa Plus (Група 2)
	1 2	2,3 (п=24) 2,2 (п=24	6,2 (п=24) 5,8 (п=24)	6,5 (п=24) 6,3 (п=24)	94 (п=24) 109 (п=24)	509 (п=24) 371 (п=24)*

3 седмици
	1 2	2,5 (п=24) 1,2 (п=24)	5,4 (п=24) 5,4 (п=24)	5,6 (п=24) 5,4 (п=24)	Γ5Ϊ (п=24) 45 (п=24)	203 (п=24) 90 (п=24)*
4 седмици ваксиниране с Poulvac NDW (	рупи 1 и 2)
	1 2	1,8 (п=24) 1,3 (п=24)	3,8 (п=24) 3,7 (п=24)	4,1 (п=24) 4,0 (п=24)	951 (п=24) 1196 (п=24)	76 (п=24) 7 (п=24)*
5 седмици
	1 2	3,6 (п=24) 1,8 (п=24)	4,6 (п=24) 4,0 (п=24)	4,9 (п=24) 4,2 (п=24)	1382 (п=24) 1210 (п=24)	426 (п=24) 41 (п=24)*
6 седмици
	1 2	2.3 (п=24) 3.3 (п=24)	4,3 (п=24) 3,7 (п=24)	4,6 (п=24) 3,8 (п=24)	1907 (п=24) 1857 (п=24)	215 (п=24) 72 (п=24)

Средните FAT титри за MD вирус, представящи средното серумно разреждане показващи специфичната флуоресценция са показани на таблица 25. Статистически по-високите FAT титри се наблюдават при Група 2 при 2, 3 и 4 седмична възраст, което показва по-високи имонологични отговори при птици на по-млада възраст.

ТАБЛИЦА 25

Средни FAT титри за MD вирус

Възраст	Група	№ на проба	Среден FAT титър за MD вирус
Един ден	1	10	880
	2	10	940

2 седмици	1	24	66
	2	24	175*

3 седмици	1	24	172
	2	24	612*
4 седмици	1	24	369
	2	24	823*

5 седмици		24	950
		24	877

6 седмици	1	24	1129
	2	24	1267

ПРИМЕР 5

Дебати

Пиленцата и от двете групи имат МА срещу ND, IB, IBD, TRT и MD вируси. Серологичният отгвор срещу ND и IB се наблюдава след ваксиниране на еднодневна възраст. Развитието на титрите срещу тези антигени е в нормални граници и в двете групи.

Второто ваксиниране с Poulvac® NDW индуцира серологичен отговор и в двете групи. И двете групи титри на антитела за IBD, TRT и MD вируси.

При голям брой случаи се наблюдават известни разлики в титрите на антителата между групите. Титрите на антитела към ND са по-високи в Група 1 (пиленца, излюпени от инокулирани яйца) във всички случаи, с изключение на 6 седмична възраст. Титрите на антителата за TRT също са по-високи в Група 1 във всички случаи и тези разлики са статистически значими, с изключение за разликата при 6 седмична възраст. Серологичният отоговор на MD е малко по-бавен в група 1, но достига същото ниво, като при Група 2 при 5 седмична възраст. Не се наблюдават ясни разлики между групите в средните титри на антитела за IB и IBD. В повечето случаи, резултатите от титруването, извършени при ВС следват същия модел, като тези получени при AHS, с по-високи стойности за ELISA титри за IBD и TRT. Серологичен отговор на IBD е показан чрез ВС тест на 3 седмична възраст, който е една седмица преди да се покаже в IDEXX теста. ВС ELISA тестът изглежда по-чувствителен за измерване на титрите на антитела към ND, отколкото HI метода. ВС ELISA тестът показва поподчертан отговор на IB вирус, отколкото HI методът за 3 седмична възраст и по-голяма.

In ovo ваксиниране на яйца от търговската мрежа за получаване на бройлери, с една търговска доза Poulvac® TRT, Poulvac® Ovoline ND и Bursamune IN OVO след 18 дневно инкубиране, следвано от ваксиниране с Poulvac® IB Праймер и Poulvac® HVT на еденодневна възраст е съвместимо по отношение на ефикастноста с ваксиниране на излюпени пиленца с

дози от търговската мрежа на Poulvac® TRT, Poulvac® NDW, Poulvac® IB Праймер и Poulvac® Marek HVT lyo през първия ден от живота и с ваксиниране с Poulvac® Bursa Plus на двуседмична възраст.

Китовете за ВС ELISA теста изглеждат благоприятни за измерване нивата на титрите на антителата за ND, IB, IBD nTRT вирусни антигени, в сравнение с HI тестовете за ND, IB М41 и IB D274, или китовете за IDEXX тестове за IBD или TRT.

Таблици 26 до 35 предоставят резултати от титри на допълнителни антитела.

ТАБЛИЦА 26

Титри на HI антитела за ND вирус, опрделен чрез AHS

Група

№ на пиле с посочен 2 log HI титър за ND вирус

недос тиг

Възраст един ден	1	2	3	4	5	6	7	8	9	Се рум
	1				1	5	3	1
	2				2	2	2	4
2 седмиц	и
	1	6	12	3	1	1		1
	2	2	16	6
3 седмиц	и
	1	7	7	6	1	2		1
	2	20	2	1							1

4 седмии	\|и
	1	15	4	2	1	1	1
	2	19	3	1	1
5 седмии	и
	1	4	3	6	4		7
	2	12	7	4	1
6 седмии	[И
	1	7	7	6	3	1
	2	4	4	4	6	4	2

ТАБЛИЦА 27

Титри на HI антитела за IB М41 вирус, опрделен чрез AHS

	№ на пиле с посочен 2log HI титър за	недос
Група	IB М41 антиген	тиг

Възраст един ден	3	4	5	6	7	8	9	10	11	Се рум
	1				3		2	4	1
	2					3	5	1		1
2 седмии	и
	1	1	3	3	5	8	4
	2		1	7	11	5
3 седмии	и
	1	2	2	7	10	3
	2	2	3	3	9	3					4
4 седмии	[И
	1	10	9	3	1
	2	14	5	4		1

5 седмии	и
	1	7	3	6	3	1	1	3
	2	11	3	6	2			2
6 седмии	и
	1	6	10	4	4
	2	11	10	2	1

ТАБЛИЦА 28

Титри на HI антитела за IB D274 антиген, опрделен чрез AHS

Група	№ на пиле с посочен 2 log HI титър за ND вирус	недос тиг
Възраст един ден	3	4	5	6	7	8	9	10	11		Се рум
	1				1	4	2	2		1
	2			1	2	2		3	1	1
2 седмии	и
	1		2	3	5	9	5
	2			2	12	10
3 седмии	\|И
	1		4	5	12	2	1
	2	1	4	6	8	4
4 седмии	\|И
	1	8	8	6	2
	2	10	8	3	2	1
5 седмии	\|И
	1	7	2	3	6	1	2				3
	2	7	6	6	3						2
6 седмии	и
	1	5	6	9	1	3
	2	12	6	5	1

Въпреки че настоящото изобретение бе описано по-горе в значителни подробности, заявителите желаят патентна защита в пълен размер, възможен доколкото е дефиниран от патентните претенции, формулирани и определени по-долу, като се имат предвид и и извлечените познания, но без да се ограничава до който и да е определен пример за изпълнение, ивсички събътия, имащи отношение към възможно най-разширения обхват на патентните претенции, следващи духа и обхвата на настоящото описание.

от CXJ < =г е; ш < н

Индивидуални ELISA титри на антитела за IBD вирус, определени чрез AHS

I ELISA титри на антитела за IBD вирус за група при различна възраст I	6 седмици	Група 2		'м-смсмь-^м-сом-сот-сог^ь.сосо-м-со-м-о^г^сос'’Τσ>θ'τ-<ρσ>Νη^.Ννιοο>Μθσ)τ-Ντ·ιητ-®οαι ЧОООмЕ^мчоюсоь-сососодаспспоч-смсмсом-дг* CD CO ύ— г~ т~ т- ν- т“ т- т— V“ ν— № т— CM CM CM CM CM CM CO CO
ГО е х Q. L-		СОСМСЛ^СООСОт-СЛ^СОСЛГ-СОЮО^-СМЮСОСОСО T'COcocob-r-vtocoOT-KcocDcob-OJiocococococo^<осмог-смсом-ю<ог^г~сосослс»от-смсотг<1оа>дср IO CO τ- τ v ч— vvt— T“T~T“T“VT—CMCMCMCMCMCMCMCOCO
S 3* S S Ci ф О	Група 2		0)ΝΟ)0)ίΟ(0(ΟΟΝΝΝΝ O> b* CO т“ смсосос-сот-соспсог^оойсВЬ-с-г-сососог^з-содсо М^!С0ЮОС01^»-С0С0с0С0^:<Г'Т>О«>0>0»5^-'г-СМСМС00> CoC0C00>0>v“T“v-v-VT-v-T”^,r-T^_v-4-vC0<”t“^”^—
,“1 (0 Е £ 1_		CO’iM-’tCOCMCOCOf^^-CgCDCMI^-COinCOCOCMMr ь-сосо^ГОсмсот-смюсо^тчосот-сосог^ь-ослсосо (ОмгЗЙбоот-т-г-г-счмслонкьясооюдсо SCDCDOiT-^-fv-T-v-T-T-v-vr-M-M-^v-T-x-T-CMCM
4 седмици	СМ го Е >* CL 1—		v^’rlOvOQOCOOXON’r ОЮ^ФОО^ГСОСП^СОСО^ФСОСОСОСООООСЧЮЮ COhO)N(pOO)^COvCOOOT-Y-NCM^(DOOO«rtO) COlOCMCOtf>(O(OS»CO0>0>T“* 7—.У- T- ▼- 7— t— ▼- t- CM CM CM CO
Група 1		O CO b* CM CM ’tO)ONhvO)^-inS(Oa)COOO<DtON(p®S(Ovоога>ьКсосмсмюосососмюфь-гаоою<0Ьсоо СО7-СМЮЮ(0ЬЬ-ЬСОООСОа)О)О)О)СЙ7г-т-т-^-яг-7“СМ
1 3 седмици	Група 2		CO CM M ICllOOOCOCO v CO v- CO OOOOOOOOOOOOCOCOCOt-t-CMCMCMx-t-CM'M-
r-J ги Е >> Q. L-		γΝΝΜρ·ΐΝ юампоопппчйф ОООООООООООСОч-г-ЮСОСОч-т-т-т-т-т-ч-
2 седмици	Група 2 \|		„ . . . . . т-сосоююч-сосмк-см^со OCMCMCOCOlOlOLOCDCDr^N-T^-т—т—r—т—т—т^-Г-Т—СМСМ0
Група 1		ЮООЬ-т-Ю^т-ООЮ fOC*)ChlOCM^^,,tvNOv’t(ONr)NN'7 OOCMCOCOCOT-T-T-CMCO’TViniOv-t-x-’r-T-CMCMCM'^·
1 1 ден	Група 2		r*- co 'f a> ю co co o cm 1-СМГ-сОСОЮСОО>ЮСО co σ> o to o> co 5 q co cm co ν cm cm cm co rt 7· to

1 Група 1		cc r-~ cd co v- co o>’t α» ο 1 NTOWNUICMOraO Я T-lOhCOMMinNT-CD B v «-CM CM CM CM CM CO CO \|

чО

1 ELISA титри на антитела за TRT вирус за група при различна възраст I	6 седмици I	(N ТО С £ L—		CO <0 О> 0)0 (0 0)5 \| 00000(0т-(0000(0ш0000000йю?о1
Група 1 I		0> Ц 0) О’Ф CM CO СМ (О 0> ’Ф он 0)0 00 ОФ N ® CD СО т- О ·Φ Н ООт-?ОСОСМ<От-ОСОООООСМООСМСМООт-\|\|
5 седмици 1	Група 2 I		V- оооооооЗооооооооооофоооо
Г рупа 1 I		ОО) to CM CM v 1000)0(0 СМ СО т-CM м^-со V- М- 5 ^tOOSOMMOO CO CM CO tO CO O CM СООООсООСООЬ-т-СМЬ-СМСОт-чГОСМт-Г-СОЬ-СМ»-
4 седмици I	(N Л5 С > Q.		CD CD CM φ Ο Ο Q Ο Ο Ο Ο Q Ο Ο Ο Ο O V“ O O O o o o CD o
Г рупа 1		co co co o> cm II tn Ю ЮЮ coin CO CO tO II COCOOOv-v-OOOCOtOOOOOOOOOOx-CMM-O]
3 седмици \|	Група 2 \|		? 5 r? 5 II ^ooooootooocooooooooooo^oI
Група 1 \|		T- CO CO to CM CM O) ч- O b- CO 1 Ю M-5 V to V o> T O CM O to 1 OOOOOOOtONnNOOTOO'iT'CST-N^ffll
2 седмици \|	1 Група 2 I		<0 CM O) CO Й CM M Or- Op to O) T- to O <0 5ГС0 <0 to CO 00 Ο π ООСООт-ООО^ч-ОООООЛч-СМОСОч-ООО
I Група 1 1		S Σ' _Λ Σ* § t:co oo otco^ol <D_ Г^Ю^СЛЬ-ЮСМт-^ФСО CO O чф CM Oi т-ЙсПЯ 'M'OCOCOOT-COCMCMb'COlOO'v-O'i-Onv-O'tI'T-r-Vn
1 1 Ден \|	Група 2		h(DO)Nn N CM CO V to to T-to CO O CM CO O) 00 M-to CO O) CO 4 X 1 T- CM M· r- x- to CM <- co +
\| Група 1		b-0)C0CMC0tOM-Q0)C0 coooo>^coocovo>o> r-tooinocoMfttom С010<0с0ч-С0ч-Ь-С00>

1 FAT титри към MD вирус за група при различна възраст \|	6 седмична възраст 1	Група 2 \|	—	QOOOQOOQOOOOQOQOOOQOQQQQ OOOOOOQOOOOOOOOOQQQOOOQQ СОСОСОСОвО<О<О<ОсОСОСО<ОСОСО<0<ОфФ<О<ОСО<О<ОФ Ч“ Ч— Г* ч- v’rvr-vr't-r-T-v ΑΙΛΙΛΙ ΛΙ ΛΙΛΙΛΙΛΙΛΙΛΙΛ1ΛΙΛΙΛΙ
Група 1 \|		§SSSSSS8SS§SS§SSSSSSSSS§ ΛΙ ΛΙ Al ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ
5 седмична възраст I	Група 2 I		8888888888888888888§§888 СМ ЙШМШТИСОСОО^ИИеОЮИшяОТШвМ· ч“ Ч— Ч“ ЧГ- Ч— Ч“ Ч— ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ
Група 1 I		2QQQOQQOQOOOOQOQOOQOOQQQ OOQOOOOQQOOOOQOQOOQOQOOQ ΟβΜ'ίΟΝΦωνΤΟΝΙίΐαΐίδίΟ'ΨΙΟίΟΜβΤΦφίδ Ч— ч- ч— ч— ч— ч— г· Ч— V ΛΙ ΛΙΛΙΛΙΛΙΛΙ ΛΙΛΙΛΙ
4 седмична възраст \|	Г\1 го с X Q. L—		QQOOQOOOOOOOOOQOOQOOOQQQ ооооооооооооообоооооюооб (DCOIMIDteOtOCOtOr-TOIOiONTIOTe МИТ ч— ч— ч— ч— Ч— ЧГ- Ч— ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ
Група 1 I		888888888888888888888888 Т- СМ т- CM W- ¢0 СМ €Ог-*ф vCOT-r-NCOtOvv 00 AJ
3 седмична възраст \|	Група 2 1		OOQQOQQQOQOOOQQQOQQQQQQQ ooooqoooooooooqoooqoooqo Т'Т-СЧ<О^аЗСО<Ода-<1-»<Мч-СО^СМСЧСМ<О'ФСч1<М^СО ч— Ч— чг— ч— ΛΙ ΛΙ ΛΙ ΛΙ
Група 1 I		S\|8§8888\|8§8§88§§8888888
2 седмична възраст \|	Група 2 I		8SS888888888888888888888
Ύ—1 ГО с >. Q. !_		888^88888888888888883^8^ v gvT-т-т- v т- v- - С С
\| 1 дневна възраст \|	Група 2 J		ОООООООООО оооооооооо (ОИЮЮМИТШИИ т ч-ч- ΛΙ ΛΙ ΛΙ
I Група 1 I		OOOQOOOOOO оооооооооо 00ТИС0ТС0ТОИТ ч— ч-ч- Al ΛΙ ΛΙ

с· чо

co co

ΞΞΓ

S c; LQ < H

1 ELISA титри на антитела за IB вирус за група при различна възраст 1	6 седмици	ΓΧΙ CD с а 1—		nnninnrt StmiOh'tOOOOtOiDinnNnr- τN (O Ю T- CO <O Ο ΙΟ ΙΟ Ν Ο τ- (Ο N r- 4· s co a o o> to ion СМ П а τ- CO (D ν т~ т- т- V — — Ю rt u5 II
V—< аз с > Q. L—		есосмч-ю-м-слсмг-состсрсмм-^срсоттсосмсосою r-fl asvsr-cosvr-sQovrtatoaao'famNai М-СОМ· — Г^’ГС0СМ^СМ0><0ОС»^^,3«0>С^,>Лт-г-СМ CM fl V h- Ύ- W — rt — V- т- \|
5 седмици	Грула 2 Ί		a^vrtaaviomaaarttONSoaoooaaiol v-b'COCOrtrteOt'-COCQOr^M-ih-M-OlQinininb.COKB ч-ОЬ-СМСОМ-СММ· — М-СЛСОСОМ-СМСОСМСОЧСП - —fl -- - - см--- 1
05 С X Q. 1—		4£rtrtUlOOCMCOincOMbO>CMb-CONrt<0lOCOlO$COCMD — V— — — — — - — 1
4 седмици	Група 2		rt CO Tt CM — N N □ r-a S N O A Ν V N T-O a — in CO otI — — — — — 4- \|
I Група 1		cortcommotcp — o> v — — St SS £x\| ®nortSn8>anrtssNartacooi>S;raas м- см ю см см a — ν ο ο N o> ю a a a n co - asina cob cm — co — cm cm — — —J
3 седмици	\| Група 2		о-ао-иот- ο ϋ co a ο o co ν ο ω ϋ a a a ο а и r~\| o co rt o a ν δ ή 3) io й ο co a a a o - co cn co — h» co fl а а м η o cm s rt cm cm a δ ,-v s a in a rt cm s a K co fl T- T- V- CM — 1
Група 1		Г S2 Γ Γ Γ Γ Γ Ϊ 4 i? ® — ο — rt n a η ο· ο ν a oil -- - „J
\| 2 седмици	Група 2		2155522592^^5^^^0^^0-01^-00110(0^01(00-1 P^^j^O^Q^P^'OOCDOOtO’r^tQcQcntn^tOw^trtB N-v-cooiT^^SioocoiocoocooocO’iFo-iOoiS^rtio v\|
1 Група 1		0 T- V r· xt r- (O CO ф 4- (Ο Ϋ Ή (Ο (Ο ф T· (O 4- xd*\| o b- b- 0- co CM σ> (O CD Ю co CO Ol 0) co Ol co σ> CO O b- O> I^s- co fl CO (D v (0 ω CO ΙΟ (Ο V φ O) ю t Ю CO b 1 Ή CN (N CO ’ФН 1
1 1 ден	Група 2	I i	a aa aa r- a ν ο o U — !£?£3«<осоа5<осм3> fl ’гьаг^асоасчаю II
1 Група 1	!	S'?’^- Taaass roajirtainob.av JSsss^fSssa — ^N ® naasaa^-naa

1 ELISA титри на антитела за IBD вирус за група при различна възраст 1	6 седмици	ΓΝ ГО с >. Q. 1—		ОООСПСМ^СОт-СЛт-СОСОООЮМГт-СОЮЮСМСОСМ^-О 1П1ПООС£>1ПМ-Мч-СМСООСО-г-С010М->ПСООСОС01П'гт- СМ т- т-
Група 1 I		«inMOraMOOSOaxONIOtOOtD'iinNTtnCQD сог-т-со-^шсмсмоо^счсмсотосмспсмсп^сосо^т СМ Ш 1П т- т- CD 4 Ь- Ю CO CO г- ιη σι см ь* oi 1О т~ т—
5 седмици I	Група 2		CO'tNNttKOT-COinNninStOinQro'ir-MWJOgffl Sil0a)N<0b0)hfMC90)OO®®OO<0N®OtnOO <М CO ·Τ ν СМ СМН1ПСМЮС0-«-т-т--Ч--Ч'С')СМт-т-т-
1—4 го с >Q. U		S ϊ 9 5 ® N О G) (О Ю Ю 0 « υ-(0 ο N N аз (D (О (О го co в й Д δΣΰδΚ’’® Ί CO Ο CO 0) Ο CM co CO N ιο V N Й Si СМСО^СМСОСОЮт CM CO (O CD CM v CO OX CM CD А Ю cm 1 4— 'I
4 седмици I	Група 2 I		CD 00 CO CD O) CO T- σ>φ V-(OIO CO N· CO r- OX CO v-T- CD CO CO CO\| CO M· T- co Ю O Q T- CM CM CO O OX CMv-COCD’t-COCDOCM Ю1 lDNlOvv-T-^T-(DO)lOh(M СЧ^т-ЮЧСОСОт-СМСМ! CM \|
Група 1 \|		v- in и «о ш ь- σι co co o r> co co σι σι o b- in co co b- σι σι coB NcMniooi’-oior-MCjcovaS’-gbtoaT'C)® col 00 CM CM CM T- r- « Ю Ϊ СЯ Γ- Ю Ю M r- N N ’“I
3 седмици	Група 2 \|		£^388883 3^58^8 88388^81
т-Ч ГО с Cl		o in o> ь- σι cm cd co o co cd co σ» σι σι co o co co σι σ> g> co £~ll (ОООТМИПЙП^СОЮЮИМЙГОМЧОПГхТГОЮ Dll Ю T- XT I^s- CO in CM T- CO CM in CM r- CO CO V CO \|
2 седмици	Група 2		roCDTnOOOigcOTfflOOCOOnbCOn'rnwST'inj Ь-СОСОООТСОт-ЧсмЧОСОЮООЬ-СМ^-СОСОСОт-СМ ol T- CO V- σι V- CM CM CD CD CM b- V- T- CO CM in co o co co col CM T~ v и
Г рупа 1 \|		EJSSSSSS’iSie'T’f'-OOb-CnOCDCON-CMCDlOOCOCO CM II 2 ⁰¹ S ® °> °> + 2 S ь g ,- от io o> ю ·<τ « v ® n ? и i DI CO CM T- p 4 M· Ч 4- 4 >- V V CD 41 T- O b-B M· ч T- «- cm If
1 1 ден \|	ΓΧΙ го с >а 1—		inpcnmcoM-oocMb-cn \|\| DlCOOt-COincOCOCOCO I СМ1П1-С0С0С0СМТ-М-О I t-CDCDIOCOt-4-ч-т- 1
го с Q. 1—		T-r^^cOCOCDtnincMCO T-T-^CDWCMOOCMlOCD COOM’inCDCOCMCOv-in TCOb(OroCMCOr-bb V- V T— T- T-

Claims

1. Използуване на имуногенно-ефективно количество жив, атенюиран щам на вируса на ринотрахеита по пуйките в количество от приблизително 10^3,2 ТСЮ50 за яйце до приблизително 10^4,5 ТСЮ50 за яйце за предпазване на птица гостоприемник от TRT и/или TRT или SHS-свързано респираторно страдание при прилагане на ваксина in ovo върху ополодено яйце, съдържащо ембрион на птицата гостоприемник, при което ваксината се прилага на или преди 24-тия ден от инкубирането.

2. Използуване, съгласно претенция 1, където посоченото имуногенно-ефективно количество се прилага върху подходящ носител от приблизително 0,05 до 0,1 ml на яйце.

3. Използуване, съгласно претенция 2, където посоченото имуногенно-ефективно количество е приблизително 10^3,2 TCID₅₀ на яйце.

4. Използуване, съгласно претенция 2, където посоченото имуногенно-ефективно количество е приблизително 10^4,2 ТСЮ₅₀на яйце.

5. Използуване, съгласно претенция 1, където посоченият гостоприемник птица е ембрион на пуйка или на пиле.

6. Използуване, съгласно претенция 5, където посоченото прилагане се провежда приблизително на 18-тия ден от инкубирането (при пилета) или приблизително на 24тия ден от инкубирането (при пуйки).

7. Използуване, съгласно претенция 3, където посоченият гостоприемник птица е ембрион на пуйка или на пиле.

8. Използуване, съгласно претенция 7, където гостоприемникът птица е ембрион на пуйка.

9. Използуване, съгласно претенция 7, където гостоприемникът птица е ембрион на пиле.

10. Метод за предпазване на пуйки и пилета от излагане на вирулентен щам на вируса на ринотрахеита при пуйки, включващ прилагане in ovo върху оплодени яйца на ваксина съдържаща, на базата на едно яйце, на имуногенноефективно количество жив, авирулентен щам на вируса на ринотрахеита при пуйки, характеризиращ се с това, че посоченото прилагане води до намаляване на процента на яйца, които се излюпват по-малко от приблизително 2%.

11. Метод, съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че имуногенно-ефективното количество е в приблизително количество от 10^3,2 ТСЮ50 на яйце до приблизително 10^4,2 ТСЮ50 на яйце.

12. In ovo ваксина за предпазване на пуйки и/или пилета от излагане на вирулентен вирус на ринотрахеита при пуйки, характеризираща се с това, че включва буфериран разтвор, съдържащ, на базата на едно яйце, жив, атенюиран щам на вируса на ринотрахеита при пуйки в имуногенно-ефективно количество от приблизително 10^3,2 TCID50 до приблизително 10⁴²TCIDso.

13. Ваксина, съгласно претенция 12, характеризираща се с това, че имуногенно-ефективнота количество е ефикасно срещу последващо след излюпване излагане на пуйка и/или пиле на вирулентен вирус на ринотрахеита при пуйки; и не предизвиква значимо намаляване на процента на in ovo ваксинирани яйца на пуйки и/или на пилета, които се излюпват след изтичането на периода на инкубиране.

14. Ваксина, съгласно претенция 13, характеризираща се с това, че имуногенно-ефективното количество е приблизително 10^4,2 ТСЮ₅₀.

15. Метод за инокулиране на домашни птици срещу заболяване от ринотрахеит при пуйки, характеризиращ се с това, че се прилага имуногенно-ефективно количество жив, атенюиран щам на вируса TRT във фарамацевтично приемлив носител in ovo в граници от най-малко приблизително 10^3,2ТСЮ50 на яйце до приблизително 10^4,2 ТСЮ50 на яйце.

16. Метод, съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че се прилага, също така, заедно с посочения TRT на най-малко една друга ваксина, избрана от група, състояща се от ваксина срущу заболяване Newcastle, и ваксина срещу инфекциозно бурсално заболяване.

17. Метод, съгласно претенция 16„ при което се прилага, също така, друга ваксина, избрана от група, състояща се от ваксина срещу инфекциозен бронхит и ваксина срещу болеста на Marek, характеризиращ се с това, че посочената ваксина се прилага post-in ovo.

18. Метод, съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че посочената post-in ovo ваксина се прилага на приблизително еднодневна възраст.

19. Метод, съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че не се стига до съществено намаляване на броя на яйцата, които се излюпват.

20. Метод, съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че намалява процента на яйцата, които се излюпват помалко от приблизително 5%.

21. Метод, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че намалява процента на яйца, които се излюпват помалко от приблизително 1%.

22. Метод за постигане на високи титри на TRTV, характеризиращ се с това, че се формулира in ovo ваксина от атенюиран TRTV антиген, и се прилага посочената ваксина, така че да достави TCID₅₀ в граници от приблизително 10^3,2 до приблизително 10^4,2 за яйце с носител от приблизително 0,05 до 0,1 ml за яйце.