CN100379452C - 卵内提供抗火鸡鼻气管炎保护的方法和疫苗 - Google Patents

Abstract

保护禽类宿主(如火鸡和/或鸡)免受火鸡鼻气管炎病毒和/或TRT或SHS呼吸窘迫的方法和组合物，卵内给予每蛋合适剂量水平的TRTV活体减毒株，以提供具有可接受安全性和功效特征的有效高效免疫，并且还在接种的禽中提供比常规给予的疫苗更高的滴度。

Description

卵内提供抗火鸡鼻气管炎保护的方法和疫苗

本申请要求对2000年11月21日申请的共同待审临时申请序号60/252,162的优先权，该临时申请的完整公开内容特此通过引用结合到本文中。

发明领域

本发明涉及对禽类宿主如火鸡和鸡卵内提供针对火鸡鼻气管炎(TRT)和/或“肿头综合征(Swollen Head Syndrome)”的保护的有用方法。更具体地说，已经证明抗TRT疫苗当如本文所述合适地卵内给予禽类宿主时安全有效。

发明背景

TRT是由肺病毒引起的火鸡上呼吸道感染。这是一种累及所有年龄火鸡的高度传染性急性疾病。TRT感染的临床症状包括显著频繁的泡沫状鼻排出物、水泡音、咔嗒声、打喷嚏和摇头。在受感染的火鸡中也可以观察到眼睛排出物或肿胀的眶下窦(infraorbitalsinus)。

已经在一些患有肿头综合征(SHS)的鸡群(肉用仔鸡和肉用仔鸡/种鸡)中检测到抗TRT病毒(TRTV)的抗体。人们推测TRTV在SHS和相关性呼吸窘迫中起作用。

针对TRT的商业化疫苗并不通过卵内给予。而是在孵出后以各种形式给予它们。一般通过劳动密集型的喷洒方法(如手工喷雾、背囊喷雾或自动喷雾设备)或滴剂方法(眼或鼻)给予所述疫苗。

根据下文更完全的解释，与目前使用的麻烦并且耗时的孵出后给予途径相比，使用改良的卵内应用TRT疫苗的卵内给予方法提供明显的好处。

发明简述

本发明利用商业化TRT疫苗改良用于本发明的卵内给予方法。实验结果证实了使用合适给药参数卵内给予火鸡和鸡这些疫苗的安全性和有效性。

可以利用本发明的方法，通过卵内给予所述疫苗，保护禽类宿主对抗TRT和/或TRT或SHS相关性呼吸窘迫。

因此，本发明的一个目标是提供保护禽类宿主对抗TRT和/或TRT或SHS相关性呼吸窘迫的方法，所述方法利用更简单并且更便宜地应用于大群禽类的卵内接种技术。

本发明的另一个目标是使用疫苗以一定剂量提供所述卵内接种，所述疫苗的剂量为孵出的禽类宿主提供合适的免疫反应，而不对孵化率有不良影响。

本发明的再一个目标是使用根据卵内应用改良的TRT疫苗，提供对抗SHS相关性呼吸窘迫的保护。

本发明的又一个目标是提供接种禽类宿主以对抗TRT和/或TRT或SHS呼吸窘迫的方法，所述方法比常规接种的禽类提供更高的抗TRTV滴度，使用更少量的疫苗抗原，因此降低费用。

发明详述

本发明提供卵内免疫禽类宿主对抗TRTV、因此提供对抗TRT和/或TRT和SHS呼吸窘迫的保护的方法。可以有利地从商业化TRT疫苗制备用于本发明方法的疫苗。尤其适用于本发明方法的疫苗是商业化PoulvacTRT疫苗，所述疫苗可以从Fort Dodge Animal Health，Fort Dodge，Iowa or Weesp，The Netherlands获得。PoulvacTRT商业化制剂包含TRTV减毒K株每剂滴度不低于10^3.2 TCID₅₀，该制剂未批准或指示用于卵内给予。在本申请中，“TCID₅₀”指50％组织培养感染剂量。

一般根据进行免疫的禽类，将所述疫苗重悬浮于合适媒介物，以便提供约10^3.2到约10^4.5范围内的TCID₅₀，并以每个蛋约0.05到0.1ml的量给予。可以手工进行给予，但更典型经济的方法是使用商业化蛋注射设备给予，所述商业化蛋注射设备例如可以从Embrex，Inc.，North Carolina获得。准确的给予剂量将取决于所述疫苗所给予的禽类物种，如较小的禽需要较少的剂量。通常在孵化第24天或之前给予所述疫苗(如火鸡)，但本发明的范围也包括其它卵内给予时间，例如孵化第18天或之前(如鸡)。

本发明的疫苗和方法所应用的禽类宿主包括鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡、鹌鹑和鸽。优选禽类物种是重要的商业家禽，例如鸡、鸭和火鸡。

已经惊人地发现：不仅卵内接种方法是安全而更简单的给予方法，而且在用该方法免疫的禽类宿主中存在更高的滴度。

此外，当与基本相同的对照(未接种)组进行比较时，所述疫苗和给予方法基本不降低卵内接种后蛋的孵化率。优选所述孵化率降低比对照组低约10％以下，更优选约5％以下。甚至更优选降低少于约1-2％。在一些实施方案中，本发明的疫苗和方法可能实际上增加蛋的孵化百分率，有时增加约1-2％或更高。因此，所述疫苗对于给予禽类物种如鸡和火鸡是安全有效的。

下面实施例详细描述本发明示例性的方法和技术。对于本领域内的技术人员，可以对材料和方法实施许多改变，而不偏离本公开内容的目的和宗旨。

实施例

实施例1-卵内给予火鸡的安全性研究

从已知未感染TRTV并且此前未针对TRT接种疫苗的亲代火鸡群获得用于孵化的可育火鸡蛋。将这些蛋随机分配到2个不同的组。

第一组76枚受精卵在孵化第24天卵内给予所述疫苗。孵化的第一天视为第0天。蛋在孵化前放置约2-7天。使用PoulvacTRT(批号TR015，有效期1997年6月24日，滴度107.5TCID₅₀)制备所述卵内疫苗。将三小管所述商业化产品各自重悬浮于10ml无菌盐水中，获得每0.1ml滴度为105.5 TCID₅₀的悬浮液。充分混合并汇集这些内容物。将所述混合/汇集的内容此后在实施例1中重命名为“IOV”。

所述卵内给予为每个蛋使用滴度为105.5 TCID₅₀的0.1ml IOV，注射入所述76个受精卵中每一个蛋的羊膜液。然后，立即将这些蛋置于孵化器内(不用旋转)，使它们在各自放置的隔离栏内孵化。这些蛋/孵化蛋称为接种的火鸡。

第二组66个受精卵不接受接种，在第二个隔离栏内于相似条件下孵化。这些蛋/孵化蛋称为阴性对照火鸡。

在孵化第27、28和29天记录所述接种火鸡和阴性对照火鸡的孵化情况。表1显示试验观察到的孵化百分率。关于孵化率，本发明的卵内接种产生极好的结果，有93.4％接种的蛋孵出，而有92.4％的阴性对照蛋孵出。

表1：孵化百分率

火鸡	第27天	第28天	第29天	总计
					接种火鸡	19.7％	73.7％	0％	93.4％
阴性对照火鸡	28.8％	63.6％	0％	92.4％

孵出后，每组(即接种火鸡和阴性对照火鸡)各随机选出25只幼禽，置于各自隔离栏内地板上的刨花上。剔出每一组的剩余火鸡。

每一组内，在21天的时间内每日检查每只火鸡的临床表现。挤压喙，检查鼻溢泌物的存在。根据表2记录临床疾病的严重性。

表2：临床记录系统

分数	试验观察症状
		0	无
1	清澈的鼻溢泌物
		2	混浊的鼻溢泌物
3	肿胀的眶下窦或泡状眼以及1或2

将一组火鸡中每一只火鸡在一天内的个体分数相加，得到该组火鸡的日总分数。表3显示使用表2的相对计分系统得到的试验观察到的临床表现。

表3：接种火鸡的临床检查结果

同样检查阴性对照火鸡的任何临床表现，没有观察到异常，即所有阴性对照火鸡都获得分数零。

上面观察的结果证明本发明卵内接种方法是安全的。6日龄火鸡的最高平均分/火鸡(即0.36)提供足够安全限度，表示仅有轻微/轻度的TRT症状。

收到所述蛋6_1/2周后，收集从亲代火鸡群内10只火鸡获取的血液，进行血清学分析。还从下面4组火鸡收集血液：(a)1日龄，从20只阴性对照火鸡；(b)21日龄，从21只阴性对照火鸡；(c)1日龄，从20只接种的火鸡；(d)21日龄，从20只接种的火鸡。

各个血液样品的血清学分析指示抗TRTV的抗体滴度。该分析使用其中应用A型抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，结果表示为²log滴度。试验测定的²log滴度≥6.0定为阳性。还计算试验测定滴度的几何平均值(GM)和标准差(SD)。所述滴度分析建立以下结果。亲代火鸡群未感染TRTV[见GM＝5.04，而阳性判断值≥6.0]。在所述10只火鸡中，一只火鸡的滴度高达7.7。此外，1日龄阴性对照火鸡和接种火鸡的GM滴度几乎相同，即分别是4.05和4.06。然而，两只接种火鸡有阳性滴度[见滴度值7.1和8.1，都≥6.0]。与此不同，没有一只阴性对照火鸡的滴度≥6.0。阴性对照火鸡和接种火鸡的SD分别是0.82和1.46。

所述21天血液取样测试也显示试验测定滴度明显差异。阴性对照火鸡的GM降低到3.53，SD降低到0.46。与此不同，接种火鸡的GM增加到10.53，SD增加到0.85。因此，所述接种火鸡具有极大提高的抗TRTV滴度。

在接种火鸡中，21日龄的血清学反应非常高。该反应甚至高于对1日龄火鸡使用同样剂量(通过滴眼接种)通常出现的反应。通常仅在用TRTV强毒株攻击后才观察到GM＝10.5的TRTV抗体滴度。与此相比，在使用105.5TCID₅₀PoulvacTRT通过滴眼接种易感火鸡幼禽(1日龄)的两个试验中，在21日龄收集的血液样品分别显示8.3和8.7的平均抗体滴度。

表4显示对亲代火鸡群、阴性对照火鸡和接种火鸡的血清学测试的数据。

表4：TRTV滴度

因此，将本发明的IOV以105.5 TCID₅₀卵内给予(在孵化第24天)火鸡受精卵在孵化率和临床表现方面提供必要的安全性，并且与常规给予的疫苗相比增强免疫反应。

实施例2：卵内给予鸡的安全性研究

从商业途径(Broekman Instituut BV，Someren，The Netherlands)获得无特定病原体(下文称为“SPF”)White Leghorn蛋。将120枚SPF蛋置于孵化器内，孵化18天后，透光检查这些蛋。剔出5枚未受精的蛋，115枚为合格受精蛋。在115枚合格蛋中，随机选取100枚进行卵内接种。将这100枚蛋分为如下三组：

组1蛋/孵化蛋用有数字的橙色翅识别标签进行标注。组1包括30枚蛋，如下所述按每枚蛋滴度105.5 TCID₅₀的计算剂量接受卵内疫苗。

组2蛋/孵化蛋用有数字的绿色翅识别标签进行标记。组2包括40枚蛋，如下所述卵内接受与组1蛋所注射疫苗同等体积的盐水溶液。

组3蛋/孵化蛋不标记。组3包括30枚蛋，不接受任何卵内给予(不论是疫苗还是盐水溶液)。

只有当小鸡表现TRT或SHS的临床表现时才使用翅标记上的数字。

组1和组2的小鸡置于它们孵化的同一动物房内。维持合适条件(如饲料、饮水、用作垫材的木刨花、温度、相对湿度等)。

该试验的时间表如下：组1、2和3孵化的第一天定义为孵化的第0天。分别卵内给予组1和组2疫苗以及盐水溶液的日期是孵化第18天。计算的孵化日期对应于孵化第21天。该研究在等于孵化第46天的孵出后日期结束。

为制备用于卵内给予的疫苗，使用商业化疫苗PoulvacTRT，该疫苗每小管含2000剂量，可从Fort Dodge Animal Health in FortDodge，Iowa or Weesp，The Netherlands获得。该疫苗每剂的滴度是10^4.2TCID₅₀。将十二(12)小管该疫苗重悬浮于磷酸盐缓冲溶液(下文称为“PBS”)，每小管疫苗使用5ml PBS。充分混合并汇集得到的内容物。所述重悬浮材料的计算滴度为105.5 TCID₅₀，总体积60ml。该疫苗下文称为“IOV”。

孵化第18天，使用得自Embrex，Inc.，North Carolina的商业化Inovoject蛋注射机器，通过注射卵内给予组1的蛋所述IOV疫苗。按照标准方法进行所述IOV的蛋注射给予。以相似方式，为组2的蛋给予得自Bieffe Medital SpA，Italy的商业化盐水溶液CLEAR-FLEXINFUSIEVLOESISTOF。

表5显示组1、2和3蛋的处理。

表5：蛋的处理

组#	#蛋/组	每蛋的计算剂量
			1	30	10<sup>5.5</sup> TCID<sub>50</sub>疫苗
2	40	仅盐水溶液
			3	30	无处理

在试验中观察并计算组1、2和3的蛋的孵化百分率。简要地说，注意到下面例外。组1的两只小鸡由于脊柱裂骨骼畸形(不归因于卵内接种的任何副作用)，在孵出后、用鉴别翅标签标记前直接从研究中去除。这两只小鸡不参与计算组1的孵化百分率。此外，在组1内，一只小鸡脚趾受伤，在标记后从研究中去除。对这只小鸡的尸体剖检揭示：没有TRT或任何其它疾病或任何其它紊乱的征象。这只小鸡同样不参与计算组1的孵化百分率。至于组2的蛋/孵化蛋，一只小鸡在孵出后、用鉴别翅标签标记前死亡。相似地，这只小鸡不参与计算组2的孵化百分率。

根据计划，在25天观察期内研究和检查组1和组2的孵化蛋。在此期间，没有一只小鸡显示TRT或SHS的临床表现。组3的所有30枚蛋都孵出。在它们孵出的那一天，所有30只小鸡都去头，取血样，如下文所述进行随后的分析。

表6显示试验观察到的组1、2和3的孵化率和死亡率。这些结果证明：本发明的卵内接种在孵化率以及TRT和/或SHS的临床表现方面是安全的。

表6：孵化率/死亡率结果

在第25天测量组1(疫苗)和组2(盐水)的小鸡体重。组1鸡的平均体重是209克，标准差22.1。组2鸡的平均体重是217克，标准差24.8。根据两侧斯氏t检验(P＝0.18)，组1和2的体重在统计学上差异并不显著。这些结果证明：本发明的卵内接种与卵内注射生理盐水溶液相比，不影响第25天的体重(该数据在商业上是重要的)。

为证实在组1、2和3中使用的SPF蛋处于无TRT状态，在组3的蛋孵出的那一天，去头处死小鸡，收集血液样品进行分析。ELISA测试未检测到针对TRTV的任何抗体，这证实在本研究中使用的SPF蛋的无TRT状态。

本研究证明：对SPF鸡蛋进行卵内接种对于孵化率、死亡率、TRT和/或SHS的临床表现以及第25天的体重都是安全的。

实施例3：卵内SPF鸡疫苗的效能研究

本发明的目的是确定对18日龄鸡胚的卵内接种是否有效预防3周或6周龄毒力攻击后的TRT和/或SHS疾病。下文证明：用10^4.2TCID₅₀卵内接种易感18日龄SPF鸡受精卵是安全的，而用10^3.2TCID₅₀的剂量有效对抗临床疾病。

从购自Whickham Laboratories，United Kingdom的SPF WhiteLeghom亲代群获取用于孵化的受精卵。

获得商业化TRT疫苗PoulvacTRT，该疫苗可以从Fort Dodge，Iowa or Weesp，The Netherlands获得。如下从所述PoulvacTRT制备本发明的卵内疫苗。分别用4ml无菌水重悬浮三(3)小管所述商业化疫苗(每小管的滴度为107.5 TCID₅₀)，充分混合并汇集。然后取出0.4ml，加入19.6ml无菌PBS，获得等同于每小管200ml的最终稀释液，最终悬浮液每0.1ml疫苗的滴度为10^4.2TCID₅₀取所述疫苗2ml加入18ml无菌PBS进一步稀释，得到最终悬浮液为每0.1ml疫苗10^3.2 TCID₅₀。

如下制备攻击病毒。来自UK株BUT 8544(由Liverpool University(U.K.)的Dr.R.C.Jones分离)的TRTV在气管器官培养物(下文称为“TOC”)中传代23次，在幼禽传代一次，再分离，然后在TOC中再传代一次。该攻击病毒的滴度是每ml 10^4.5TCID₅₀。

孵化18天后，用0.1ml上文所述包含10^3.2 TCID₅₀的重建TRT疫苗卵内接种第一组70枚受精卵(下文称为“组1”)。同样用0.1ml上文所述包含10^4.2 TCID₅₀的重建TRT疫苗接种第二组70枚蛋(下文称为“组2”)。所述蛋立即置于孵化器内(不用旋转)，使它们在各自放置的隔离栏内孵化。组1和组2的蛋分别放在相似的隔离栏内。第三组70枚受精卵不接受任何卵内给予(下文称为“组3”)。组3在下文称为阴性对照鸡。将这些蛋放置在第三个隔离栏内。

在孵化后第20、21、22和23天(第零天是孵化的第一天)记录孵出。孵出后，在一日龄每组选出五十只鸡，淘汰多余的鸡。试验记录的组1、2和3的孵化百分率分别是91％、94％和92％。这证明用滴度10^3.2 TCID₅₀和10^4.2 TCID₅₀进行卵内接种在孵化率方面是安全的。

在三周龄，从每个接种组(即组1和2)以及阴性对照组(即组3)各取10只鸡，标记翅膀并转移进第四个隔离栏。随后使用在0.1ml内含10^3.5 TCID₅₀(强毒)TRTV剂量的滴眼剂，给予每只鸡上文所述的攻击病毒。在6周龄，另外10只鸡同样接受TRTV强毒株攻击。然而，由于这些鸡的年龄增加，攻击剂量增加到每只鸡0.2ml共103.8TCID₅₀(强毒)TRTV。

受攻击的鸡试验监测14天，然后取血并处死。使用表2临床计分系统如实施例1所述记录所观察到的体征。将每组内每只鸡在一天内各自的分数相加，计算得到每组鸡的日总分数。累计分数是第3-8天平均日分数的加和。使用χ2检验分析所述数据。将在2个接种组(组1和2)第3-8天观察到的总临床表现与(组3)阳性对照在3周龄攻击和6周龄攻击中同样天数观察到的总临床表现比较。该监测建立下面结果。

当用强毒TRTV株以滴度10^3.5 TCID₅₀进行3周龄攻击时，90％组3的未接种对照鸡表现临床表现。与此不同，组1和2接种鸡显示临床表现的百分率较小。在组1(每蛋以滴度10^3.2 TCID₅₀接种)中，仅50％的鸡显示临床表现。在组2(每蛋以滴度10^4.2 TCID₅₀接种)中，仅30％的鸡显示临床表现。在组3中，只有一只鸡保持完全没有临床表现。与此不同，组1的五只鸡和组2的七只鸡保持完全没有临床表现。

当用强毒TRTV株以滴度103.8 TCID₅₀进行6周龄攻击时，80％组3的未接种鸡显示临床表现。与此不同，组1和2接种鸡显示临床表现的百分率较小。在组1(每蛋以滴度10^3.2 TCID₅₀接种)中，仅20％的鸡显示临床表现。在组2(每蛋以滴度10^4.2 TCID₅₀接种)中，仅10％的鸡显示临床表现。

χ2统计检验证明：对于6周龄攻击，在两个接种组鸡(组1和2)试验观察到的临床表现比在组3未接种阴性对照鸡记录到的临床表现显著更轻(P＜0.01)。

表7、8和9分别显示上文讨论的3周龄攻击、6周龄攻击和卡方统计分析的结果。

表7：3周龄攻击的临床表现

表8：6周龄攻击的临床表现

表9：卡方分析

除监测组1、2和3的鸡的TRT临床表现外，还对所述鸡进行血清学分析：其中通过应用A型抗原的ELISA测定各个血液样品中的抗TRTV抗体，结果表示为²log滴度。²log滴度＞6.0的抗体滴度定为阳性。使用用于非配对数据的斯氏t检验对所述结果进行统计分析。表10和11显示组1、2和3受攻击的鸡分别在3周龄攻击和6周龄攻击中获得的血清学结果。在表10和11中，“PC”指攻击后；“GM”指几何平均值；“SD”指标准差。简要地说，所有组(即组1、2和3)在攻击后7天显示抗体滴度显著升高，在攻击后14天抗体滴度进一步升高。

表10：TRTV抗体滴度(3周龄攻击)

表11：TRTV抗体滴度(6周龄攻击)

对未用TRTV强毒株攻击的所有三个组(即组1、2和3)也进行相似的血清学分析。确定对照鸡(组3)和2个接种鸡组(组1和2)从一日龄到8_1/2周龄的平均抗体滴度。如预期的一样，对照鸡的抗体滴度在本研究中始终保持低水平。将对照鸡的滴度与同样年龄接种鸡的滴度进行统计比较。表12显示卵内接种后测定的平均抗体滴度。所获得的各个结果(数据未显示)支持表12中显示的实验结果。在表12中，“n”指鸡的数量，“SD”指标准差。

表12：卵内接种后平均抗体滴度

对实施例3的结果(包括试验获得的测量、结果和相应统计分析)分析指出：更低疫苗剂量(将10^3.2 TCID₅₀ TRTV卵内传递到易感18日龄SPF鸡受精卵)是有效的，因为所述剂量赋予对抗周TRTV强毒株在6周龄攻击的显著保护。在3周龄也观察到保护：然而，由于鸡的数量，试验观察到的在保护上的差异刚好在显著水平以下。当接种剂量增加到每枚蛋10^4.2 TCID₅₀ TRTV(增加约¹log10)，则在3周龄攻击和6周龄攻击中，都观察到对暴露于TRTV强毒株的显著保护。

卵内给予从PoulvacTRT制备的疫苗明显与免疫/接种鸡内TRTV特异性抗体的产生有关。该相关看起来是依赖于剂量的。所述卵内疫苗的更高剂量导致三周龄的平均抗体滴度增加到显著高于阴性对照鸡滴度的水平，稍低于判断值6.0。用每蛋10^4.2 TCID₅₀更高剂量卵内接种的循环抗体反应看起来随时间而增加；在六周龄观察到最大值；此后，滴度保持稳定直到8_1/2周龄。

与上述高接种剂量的结果不同，接受每蛋更低剂量10^3.2 TCID₅₀的鸡看起来对接种的抗体反应延迟。滴度在8_1/2周龄才开始增加-那时它们达到显著高于对照鸡滴度的水平。低剂量疫苗鸡(组1)在此时(即8_1/2周)的滴度类似于高剂量疫苗鸡(组2)在3周龄的滴度。看起来，可能随着时间超过8_1/2周，所述抗体滴度将增加到高于6.0的水平。

在抗体滴度和TRT临床表现减少之间有相关关系。在抗体滴度显著高于对照鸡的滴度但仍然低于6.0阳性判断值的每一组鸡中，所观察到的TRT临床表现的降低在统计学上是显著的。

以至少每蛋10^3.2 TCID₅₀到至少每蛋10^4.2 TCID₅₀的大致范围内剂量(尤其是用每枚蛋约10^4.2 TCID₅₀的剂量)卵内接种易感18日龄SPF鸡受精卵对于对抗TRTV强毒株攻击正常引起的临床疾病是安全有效的。

实施例4：卵内商业化鸡疫苗的效能研究

本研究的目的是确认卵内接种18日龄孵化的鸡受精卵是否在4或6周龄攻击后有效预防TRT和/或SHS疾病，其中所述鸡受精卵来自商业化肉用仔鸡的亲代群。按照下文讨论，用来自PoulvacTRT的疫苗，以每蛋10^3.2 TCID₅₀卵内接种来自TRTV抗体阳性亲代的易感18日龄受精卵有效对抗临床鼻气管炎疾病。

从一群37周龄商业化肉用仔鸡亲代获得用于孵化的受精卵，所述肉用仔鸡亲代先前在10周龄用活体TRT疫苗接种，然后在18周龄用灭活TRT疫苗接种。从Mossband种鸡群，Marshall Agriculture，Whitburn，Scotland获得这些蛋。

使用商业化TRT疫苗PoulvacTRT制备本发明的卵内疫苗，所述PoulvacTRT可从Fort Dodge Animal Health，Fort Dodge，Iowa orWeesp，The Netherlands获得。分别用5ml无菌水重悬浮三小管所述商业化疫苗(每小管的滴度为107.5 TCID₅₀)，充分混合并汇集。所述疫苗随后在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中进一步稀释，得到最终悬浮液为每0.1ml疫苗含10^3.2 TCID₅₀。

如下制备攻击病毒。来自UK株BUT 8544(见第12页)的TRTV在气管器官培养物(下文称为“TOC”)中传代23次，在幼禽传代一次，再分离，然后在TOC中再传代一次。该攻击病毒的滴度是每ml 10^4.5TCID₅₀。

孵化18天后，用0.1ml上文所述包含10^3.2 TCID₅₀的重建TRT疫苗卵内接种57枚受精卵。所述蛋立即置于孵化器内(不用旋转)，使它们在各自放置的隔离栏内孵化。孵出后，从孵化器中取出40只鸡，置于地板的刨花上。

若干(110)受精卵不免疫/接种，分别孵化。孵出后一天，取四十只鸡置于第二个隔离栏内作为阴性对照鸡。受到攻击的对照鸡称为阳性对照鸡。

在第20、21、22和23天(第零天是孵化的第一天)记录孵出。孵出后，人道处死多余的鸡或用于取血。未接种蛋和接种蛋的孵化百分率分别是89％和91％，这证明用滴度10^3.2 TCID₅₀进行卵内接种在孵化率方面是安全的。

在4周龄，从接种组以及阴性对照组各取十只鸡，标记翅膀，转移进第三个隔离栏。随后使用在0.1ml内含10^3.5 TCID₅₀(强毒)TRTV剂量的滴眼剂，给予每只鸡上文所述的攻击病毒。在6周龄，另外14只鸡同样接受TRTV强毒株攻击。然而，由于这些鸡的年龄增加，攻击剂量增加到每只鸡0.2ml共103.8 TCID₅₀(强毒)TRTV。

受攻击的鸡试验监测14天，然后取血并处死。使用表13修正的临床计分系统记录所观察到的征象。所述表13系统与上文实施例1所述的表2系统相似但并不相同。

表13：修正的临床计分系统

分数	试验观察的症状
		0	无
1	清澈的鼻溢泌物
		1	泡状眼但没有鼻溢泌物(F)
2	混浊的鼻溢泌物
		3	肿胀的眶下窦或泡状眼以及1或2

将每组内每只鸡在一天内各自的分数相加，计算得到每组鸡的日总分数。累计分数是平均日分数的加和。使用χ2检验分析所述数据。将在组1接种组观察到的总临床表现与组2阳性对照在4周龄攻击和6周龄攻击同样天数观察到的总临床表现进行比较。该监测得到下面结果。

在用强毒TRTV株以滴度10^3.5 TCID₅₀进行的4周攻击中，仅在第6和7天观察到临床表现，-两组(组1和2)都在第6天观察到最多征象。在接种组(组1)中，仅30％的鸡在攻击后显示临床表现，每只鸡的累积平均分数是0.6。在组1中，十只鸡中有七只完全没有临床表现。将在接种鸡中观察到的总临床表现与阳性对照鸡的临床表现进行统计比较。虽然接种鸡显示比阳性对照鸡更轻的临床表现，但这些结果在统计学上并不显著(0.2＜P＜0.3)。

在用强毒TRTV株以滴度103.8 TCID₅₀进行的6周龄攻击中，观察阳性对照鸡临床表现的时间比4周龄更低剂量攻击的后观察的时间更长。然而，在接种鸡中，仅观察临床表现一天。在阳性对照鸡中，57％显示临床表现，每只鸡的累积分数是1.35。在该组的14只鸡中，6只保持完全没有临床表现。一只鸡在观察期的第5和6天显示严重临床表现，随后在攻击后第九天死去。对该鸡的尸体剖检揭示右心室扩大、心静脉充血、肺充血、气管内过量粘液以及肝表面的纤维素性渗出物。可能死因是右心衰竭和可能的肝炎。与此不同，接种组仅14％的鸡在攻击后显示临床表现，每只鸡的累积分数是0.14。在该组的14只鸡中，12只保持完全没有临床表现。使用χ2分析，对接种组(组1)中观察到的总临床表现与阳性对照鸡(组2)内观察到的总临床表现进行统计比较。该分析证明：在接种组内观察到的临床表现比在阳性对照鸡中观察到的临床表现显著更轻(0.02＜P＜0.05)。

表14、15和16分别显示上文讨论的4周龄攻击、6周龄攻击和χ2统计分析的结果。

表14：4周攻击的临床表现

表15：6周龄攻击的临床表现

表9：卡方分析临床分数数据

除监测组1和2的鸡的TRT临床表现外，还对所述鸡进行血清学分析：其中通过在Leahurst，Liverpool，(U.K.)发展的应用A型抗原的ELISA技术测定各个血液样品中的抗TRTV抗体，并表示为²log滴度。²log滴度＞6.0的抗体滴度定为阳性。使用用于非配对数据的斯氏t检验对所述结果进行统计分析。表17和18显示组1和2受攻击的鸡分别在4周龄攻击和6周龄攻击中获得的血清学结果。在表17和18中，“PC”指攻击后。

表17：TRTV抗体滴度(4周攻击)

表18：TRTV抗体滴度(6周龄攻击)

另外对未用TRTV强毒株攻击的那些鸡进行相似的血清学分析，其中使用Mossbank(亲代种鸡群(Marshalls Agriculture)5个不同气隙的鸡在25周龄和41周龄取来的每个空间十个血清样品。表19显示来自亲代种鸡群的这些鸡的平均抗体滴度。

表19：亲代种鸡群的平均抗体滴度

对于未受攻击的接种鸡和未受攻击的阴性对照鸡，在1日龄和4、6和8周龄收集血液。表20显示所述未受攻击鸡的平均抗体滴度。

表20：未受攻击鸡的平均抗体滴度

对于受到攻击的接种鸡和受到攻击的阳性对照鸡，在4周攻击/组和6周龄攻击/组中，在攻击后14天收集血液。表21显示在这2个组中受到攻击鸡的平均抗体滴度。

表21：攻击后14天受攻击鸡的滴度

各个结果支持上面表14-21显示的数据。根据上述血清学分析，得出下面结论。对于接种鸡和阴性对照鸡，在1日龄，这些鸡具有抗TRTV的母体抗体(MA)。在4周龄，阴性对照鸡的抗体水平降到阴性范围并在试验剩余时间保持低水平。在用从PoulvacTRT制备的疫苗以滴度10^3.2 TCID₅₀卵内给予后，平均抗体滴度保持在阴性范围内(即低于6.0的阳性判断值)，但随着年龄增加而增加。在4、6和8周龄，接种鸡的平均抗体滴度水平在统计学上显著高于阴性对照的所述水平。从4周龄开始，20％到22％的接种鸡具有阳性滴度。在受到攻击的鸡中，所有鸡在攻击后14天都表现血清转变。在4周攻击研究和6周龄攻击研究中，接种组的平均滴度高于阳性对照鸡的平均滴度，并且这种差异在统计学上是显著的(P＜0.05)。

对实施例4整体的分析(包括实验获得的测量、结果以及相应的统计分析)指出：在18天孵化用从PoulvacTRT制备的疫苗以每蛋10^3.2 TCID₅₀剂量滴度卵内接种母体抗体阳性(MA+)的商业化肉鸡蛋不对孵化率有副面影响，并且所述接种提供可靠、高效率和有效的疫苗给予方法。该疫苗还在用TRTV在6周龄攻击时赋予显著保护-此时所观察到的临床表现显著减少。在4周龄有一定程度的保护-然而，这个时候甚至在未接种阳性对照鸡观察到的临床表现也不十分严重。因此，虽然存在对4周龄攻击所赋予的保护，但在统计学上不显著。

本实施例4数据以及上文实施例1-3的数据结合证明：鸡对TRT疫苗的敏感性要低得多。卵内接种后没有观察到阳性的平均抗体滴度(高于6.0的判断值)。然而，在接种组中的该水平显著高于阴性对照中观察到的水平。约五分之一的接种鸡在4周龄后有阳性滴度。因此，在攻击时，总血清转变达到ELISA水平高于6.0可能不是衡量卵内接种所实际赋予的保护的好指标。局部免疫可能在所诱导的保护和实验测定的滴度的相互作用间起作用。

在分析上文实验1-4前，已经推定母体抗体的存在会副面影响疫苗的有效性。实施例4仍然并且令人吃惊地证明：以每蛋滴度10^3.2TCID₅₀卵内给予TRT疫苗有效降低MA+鸡的临床TRT疾病。实施例4增强并延伸了在上面实施例3获得的结论；即同样接受卵内接种的SPF(MA-)鸡表现临床疾病减少。

实施例5：研究TRT疫苗联合其它禽疫苗

在本研究中使用下面缩写：

AHS：Animal Health Service，Deventer，The Netherlands

BC：Biochek，Gouda，The Netherlands

CVL：Central Veterinary Laboratory，Weybridge，UK

EID50：50％蛋感染剂量

ELISA：酶联免疫吸附测定

FAT：荧光抗体测定

HI：血凝抑制

IB：传染性气管炎

IBD：传染性滑液囊病

i.m.：肌内

MD：Marek氏病

ND：新城病

P：概率

TCID50：50％组织培养感染剂量

TRT：火鸡鼻气管炎

本研究使用下面疫苗材料：

PoulvacTRT，批号TR02100和TR02200，每剂量分别含104.1和104.1TCID50TRT病毒。

PoulvacOvoline ND，批号BB010，每小管含103.9 EID50 ND病毒(每小管5000剂量)。

Bursamune IN OVO，批号61640，每小管含5000剂量。

PoulvacMarek HVT lyo，批号350129，含MD病毒FC126株(每小管1000剂量)。

PoulvacNDW，批号BL03200和BL04302。

PoulvacIB Primer，批号CX02301，每剂量含105.0 EID50 IB病毒血清型M41和D207(D274克隆)(每小管1000剂量)。

PoulvacBursa Plus，批号62481，每小管含103.2 EID50 IBD病毒V877株(每小管2000剂量)。

除Bursamune IN OVO外，所有疫苗都由Fort Dodge AnimalHealth Benelux，Weesp，The Netherlands提供。Bursamune IN OVO得自Fort Dodge Animal Health，Australia。

各批疫苗避光保存在0-8℃直到使用，根据生产商的说明书使用。重建后，在两小时内使用疫苗。制备下面疫苗稀释物。

用PoulvacMarek稀释剂(批号C8109)重建并进一步稀释卵内接种组1 PoulvacTRT(批号TR02100)、PoulvacOvoline ND和Bursamune IN OVO的疫苗稀释物。每种疫苗最终稀释物在0.05ml内含一个商业化剂量。

用PoulvacMarek稀释剂(批号C8109)重建并进一步稀释肌内接种组1和2抗MD PoulvacMarek HVT lyo的疫苗稀释物。所述稀释物在0.5ml内含一个商业化剂量。

周2.2升软化水重建并进一步稀释粗喷雾(coarse spray)接种组1PoulvacIB Primer的疫苗稀释物。所述稀释物在0.5ml内含一个商业化剂量。

用3升软化水重建并进一步稀释粗喷雾接种组2PoulvacNDW(批号BL04302)、PoulvacIB Primer和PoulvacTRT(批号TR02200)的疫苗稀释物。最终稀释物在0.5ml内含一商业化剂量。

用自来水重建并进一步稀释抗饮用水IBD接种组2的三小管PoulvacBursa Plus的疫苗稀释物。

用软化水重建并进一步稀释用于抗ND接种组1和2的Atomistspray PoulvacNDW (批号BL03200)的疫苗稀释物，直到最终稀释物在0.5ml内含一商业化剂量。

14895枚用于生产肉鸡的Cobb品种商业化蛋得自Pronk，Meppel，The Netherlands，将这些蛋置于Fort Dodge AHH，Muiden，TheNetherlands实验农庄内位于MUK-5/6的一个孵化器内。所有蛋孵化17天后透光检查。去除未受精的蛋或死胚蛋。

6001枚分配到组1的蛋接种每蛋0.05ml含1剂量PoulvacTRT、PoulvacOvoline ND和Bursamune IN OVO的稀释物，所述接种使用Embrex Inovoject蛋注射机按照生产商的指导进行。6028枚分配到组2的蛋不接种。

已接种(组1)和未接种(组2)的蛋分别置于Fort Dodge AHH，Muiden，The Netherlands实验农庄孵化器1和4内，继续孵化(不用旋转)直到孵出。孵出后，分别有4452只鸡(接种，组1)和5248只鸡(未接种，组2)进入本研究。这些鸡按组安置在Fort Dodge AHH，Muiden，The Netherlands实验农庄同一平房内动物饲养设施的木刨花上。组1的鸡安置在MUL-L，组2的鸡安置在MUL-R。所有鸡自由取食商业化肉用仔鸡饲料(broiler pellet)，自由饮用漏斗饮水器内的水。

接种计划见表22。在一日龄，用PoulvacIB Primer接种组1的鸡。使用花园喷雾器(Gardena)通过粗喷雾按每只鸡0.5ml给予一商业化剂量。在一日龄，用PoulvacTRT、PoulvacNDW和PoulvacIB Primer接种组2的鸡。与组1相同，通过粗喷雾按每只鸡0.5ml给予一商业化剂量每种疫苗。在粗喷雾接种前，将鸡置于鸡盒(chickenbox)中，直到接种后3小时。

所有鸡都在一日龄按每只鸡一商业化剂量接种PoulvacMarekHVT lyo。使用Pullet Inection Gun(Veterinary Supplies，Mijdrecht，TheNetherlands)，预设体积0.5ml，在大腿肌内施用所述疫苗。

组2的鸡在2周龄接种PoulvacBursa Plus，所述疫苗用饮用水给予，每只鸡一商业化剂量。将所述疫苗分配在一定量的水中，在2小时内喂食。给予所述疫苗前2小时内，禁止鸡饮水。

所有鸡在4周龄接种PoulvacNDW。通过雾化器按每只鸡0.5ml共一商业化剂量应用。

表22：接种计划

组1	接种年龄蛋孵化18天	疫苗Poulvac TRT)Poulvac Ovoline ND)Bursamune IN OVO	应用方法注射机器
				1	鸡1日龄	Poulvac IB Primer)Poulvac Marek HVT lyo	在鸡盒内粗喷雾i.m.
2	鸡1日龄	Poulvac TRT)Poulvac NDW)Poulvac IB Primer)Poulvac Marek HVT lyo	在鸡盒内粗喷雾i.m.
				2	鸡2周龄	Poulvac Bursa Plus	饮用水
1和2	鸡4周龄	Poulvac NDW	雾化器

每组30只鸡在一日龄断头后取血液样品。每组取10只鸡的血液样品，在AHS进行血清学检测。每组取另外10只鸡的样品，在Central Veterinary Laboratory，Weybridge，UK(CVL)进行血清学检测。剩余的10个样品在BC进行血清学检测。每组在2、3、4、5和6周龄从翅脉取血液样品，直到最多24只鸡。

使用HI检验测定针对ND、IB M41和IB D274抗原的抗体滴度。HI检验的检测限对于ND抗原是2log HI滴度＝1.0，对于IB抗原是2log HI滴度＝3.0。计算HI滴度的几何平均值。使用ELISA方法(IDEXX)，根据生产商的指导测量针对TRT和IBD病毒的抗体滴度，计算平均滴度。这些检验在AHS完成。

BC完成使用ELISA方法滴定针对ND、IB、TRT和IBD的抗体滴度。针对ND和IB病毒的ELISA抗体滴度分别在1159和834或以上时被认为是阳性。也使用IDEXX检测试剂盒测定针对ND病毒的抗体滴度(在396或以上被认为是阳性)和针对IB病毒的抗体滴度。使用BC99软件计算平均滴度。

对AHS和CVL获得的结果进行统计分析。通过斯氏双侧t检验就抗体滴度比较这两个组。针对IBD、TRT和MD的ELISA抗体滴度在分析前进行log转换(10g[x+1])。≥1600和阴性MD测量值在计算中分别用1600和25取代。概率P≤0.05被认为是统计学上的显著差异。

结果：表23和24显示AHS和BC测定的针对ND、IB、IBD和TRT抗原的平均滴度。

表23：AHS测定的针对ND、IB M41、IB D274、IBD和TRT的平均抗体滴度。

^*与组1在统计学上有显著差异(P≤0.05)。

表24：BC测定的针对ND、IB、IBD和TRT的平均抗体滴度。

表25显示对MD病毒的平均FAT滴度，该滴度代表呈现特异性荧光的平均血清稀释度。组2在2、3和4周龄观察到在统计学上显著更高的FAT滴度，这显示在所述禽的更年轻年龄有更高的免疫反应。

表25：对MD病毒的平均FAT滴度。

^*与组1在统计学上有显著差异(P≤0.05)。

实施例5-讨论

两组的鸡都有抗ND、IB、IBD、TRT和MD病毒的MA。在一日龄接种后观察到对ND和IB的血清反应。两组内对这些抗原的滴度产生都在正常范围内。使用PoulvacNDW的第二次接种在两组中都诱导血清反应。两组都发展对IBD、TRT和MD病毒的抗体滴度。

在许多情况下，观察到各组间抗体滴度上的某些差异。组1(从接种蛋孵出的鸡)中对ND的抗体滴度在所有情况下都相对更高(6周龄除外)。组1中对TRT的抗体滴度在所有情况下都相对更高，除6周龄外，这些差异在统计学上都是显著的。组1中对MD的血清反应有点慢，但达到组2在5周龄的同样水平。没有观察到各组间在对IB和IBD抗原的平均抗体滴度上有明显差异。在大多数情况下，BC完成的滴定结果的模式与AHS所获得的结果的模式相同，对IBD和TRT的ELISA滴度值更高。BC测试在3周龄显示对IBD的血清反应，这比在IDEXX测试中出现血清反应早一周。BC ELISA测试对于测量针对ND的抗体滴度看起来比HI方法更敏感。BC ELISA测试从3周龄起显示比HI方法更明显的对IB病毒的反应。

下面两种接种在功效上是一致的：一种是孵化18天后用一商业化剂量PoulvacTRT、PoulvacOvoline ND和Bursamune IN OVO卵内接种用于生产肉鸡的商业化蛋，然后在一日龄接种Poulvac IBPrimer和PoulvacHVT；第二种是孵出的鸡在一日龄接种商业化剂量的Poulvac TRT、PoulvacNDW、PoulvacIB Primer和PoulvacMarek HVT lyo，然后在2周龄接种PoulvacBursa Plus。

与HI检测测量针对ND、IB M41和IB D274的抗体滴度水平或IDEXX检测试剂盒测量针对IBD或TRT的抗体滴度水平相比，BCELISA检测试剂盒看起来对于测量针对ND、IB、IBD和TRT病毒抗原的抗体滴度水平更有利。

表26到35提供其它抗体滴度结果。

表26.AHS测定的对ND病毒的HI抗体滴度。

表27.AHS测定的对IB M41抗原的HI抗体滴度。

表28.AHS测定的对IB D274抗原的HI抗体滴度。

表29.AHS测定的对IBD病毒的各个ELISA抗体滴度。

表30.AHS测定的对TRT病毒的各个ELISA抗体滴度。

表31.在CVL测定的对MD病毒的各个FAT滴度。

表32.BC测定的对ND病毒的各个ELISA抗体滴度。

表33.BC测定的对IB病毒的各个ELISA抗体滴度。

表34.BC测定的对IBD病毒的各个ELISA抗体滴度。

表35.BC测定的对TRT病毒的各个ELISA抗体滴度。

虽然已经在上文相当详细地描述本发明，但申请人要求在参考上面教导但不限于任何具体公开的实施例的情况下，专利保护下述权利要求定义和确定的专利保护范围，并且在所有情况下，所述专利保护范围与符合本申请精神和范围的权利要求的最大可能范围一致。

Claims (22)

1.火鸡鼻气管炎病毒活体减毒株在制备用于保护禽类宿主避免TRT和/或TRT或SHS相关性呼吸窘迫的卵内疫苗中的应用，其中所述疫苗包含免疫原性有效量的火鸡鼻气管炎病毒活体减毒株，所述免疫原性有效量范围为每枚蛋10^3.2TCID₅₀到每枚蛋10^4.5TCID₅₀，其中在孵化第24天或之前给予所述疫苗。

2.权利要求1的应用，其中所述免疫原性有效量使用每枚蛋0.05到0.1ml的合适媒介物给予。

3.权利要求2的应用，其中所述免疫原性有效量是每枚蛋10^3.2TCID₅₀。

4.权利要求2的应用，其中所述免疫原性有效量是每枚蛋10^4.2TCID₅₀。

5.权利要求1的应用，其中所述禽类宿主是火鸡胚或鸡胚。

6.权利要求5的应用，其中，当所述禽类宿主是鸡，所述给予在孵化18天进行或当所述禽类宿主是火鸡，所述给予在孵化24天进行。

7.权利要求3的应用，其中所述禽类宿主或者是火鸡胚或者是鸡胚。

8.权利要求7的应用，其中所述禽类宿主是火鸡胚。

9.权利要求7的应用，其中所述禽类宿主是鸡胚。

10.火鸡鼻气管炎病毒活体减毒株在制备用于保护火鸡和鸡免受火鸡鼻气管炎病毒强毒株影响的卵内疫苗中的应用，其中该疫苗包含以每枚蛋计的免疫原性有效量的火鸡鼻气管炎病毒活体减毒株，其中所述疫苗的应用使蛋孵出率的降低在2％以下。

11.权利要求10的应用，其中所述免疫原性有效量在每枚蛋10^3.2TCID₅₀到每枚蛋10^4.2TCID₅₀的范围内。

12.一种保护火鸡和/或鸡不受强毒火鸡鼻气管炎病毒影响的卵内疫苗，所述疫苗包含含以每枚蛋计的免疫原性有效量的火鸡鼻气管炎病毒活体减毒株的缓冲溶液，所述免疫原性有效量为10^3.2TCID₅₀到10^4.2TCID₅₀。

13.权利要求11的疫苗，其中所述免疫原性有效量疫苗有效保护火鸡和/或鸡孵出后不受强毒火鸡鼻气管炎病毒的影响；而且不会使孵化期结束后卵内接种火鸡蛋和/或鸡蛋的孵出率明显降低。

14.权利要求13的疫苗，其中所述免疫原性有效量是10^4.2TCID₅₀。

15.TRT病毒活体减毒株在制备用于接种家禽使其免患火鸡鼻气管炎疾病的卵内用组合物中的应用，其中所述组合物包含药学可接受载体内的免疫原性有效量的TRT病毒活体减毒株，所述免疫原性有效量在至少每枚蛋10^3.2TCID₅₀到每枚蛋10^4.2TCID₅₀的范围内。

16.权利要求15的应用，所述应用还包括与所述TRT一起给予至少一种选自以下的其它疫苗：新城病疫苗和传染性滑液囊病疫苗。

17.权利要求16的应用，所述应用还包括给予至少一种选自以下的疫苗：传染性支气管炎疫苗和Marek氏病疫苗，其中所述疫苗在卵内给予后给予。

18.权利要求17的应用，其中所述在卵内给予后给予的疫苗在1日龄给予。

19.权利要求15的应用，其中所述应用不会使孵出蛋的数量明显降低。

20.权利要求15的应用，其中所述应用使蛋的孵出率降低在5％以下。

21.权利要求15的应用，其中所述应用使蛋的孵出率降低在1％以下。

22.一种提高抗TRTV效价的方法，所述方法包括配制减毒TRTV抗原的卵内疫苗，然后给予所述疫苗，从而可以给予在每枚蛋0.05到0.1ml媒介物内含每枚蛋10^3.2到10^4.5范围内的TCID₅₀。