HRP20030508A2

HRP20030508A2 - Methods and vaccines for providing in ovo protection against turkey rhinotracheitis

Info

Publication number: HRP20030508A2
Application number: HR20030508A
Authority: HR
Inventors: Frans Gerrit Davelaar
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2000-11-21
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2004-08-31
Also published as: HK1055914A1; US7348012B2; MXPA03004432A; KR20030055314A; PT1345658E; NZ526556A; DE60128264T2; AU2002243426B2; PL365848A1; CZ20031419A3; ATE361120T1; WO2002045745A2; CN1486206A; CN100379452C; ZA200304762B; US20060034868A1; US20030054016A1; ES2284717T3; EP1345658B1; AR031405A1

Description

Ova prijava štiti prioritet priključene privremene prijave pod rednim brojem 60/252,162, podnesene 21. studenog 2000, čiji cjelokupni opis je ovdje priključen kroz citat.

Ovaj izum je usmjeren na korisne postupke pružanja zaštite in ovo protiv purećeg rinotraheitisa (TRT) i/ili ”sindroma otečene glave” (SHS) kod peradi kao domaćina, kao što su purice i pilići. Određenije, pokazalo se da su cjepiva protiv TRT i sigurna i učinkovita nakon odgovarajućeg ordiniranja in ovo peradi kao domaćinu, kako se ovdje opisuje.

TRT je infekcija gornjeg dijela respiratornog trakta kod purica, koju izaziva pneumovirus. To je veoma zarazna, akutna bolest koja pogađa pure u svim starosnim dobima. Klinički simptomi infekcije TRT su zapaženi i česti, sa puno pjene, pražnjenja nosa, krkljanja, kašljuckanja, šmrkanja i tresenja glavom. Kod inficiranih purica može se zapaziti suzenje iz očiju ili otečene unutrašnje šupljine sinusa.

Otkrivena su antitijela TRT virusa (TRTV) u nekim jatima pilića (i kod brojlera i kod brojlera/odgajivača) koji pate od sindroma otečene glave (SHS). Pretpostavljeno je da TRTV igra ulogu u etiologiji SHS i srodnog respiratornog poremećaja.

Komercijalno dostupna cjepiva za TRT se ne ordiniraju in ovo. One se radije ordiniraju u raznim oblicima, nakon izlijeganja. Tipično, ta cjepiva se ordiniraju zahtjevnim postupcima raspršivanja (npr. ručnim raspršivanjem, raspršivačem koji se nosi na leđima ili automatskom opremom za raspršavanje) ili u kapima (za oči ili nos).

Kao što će potpunije biti objašnjeno u nastavku, postupci ordiniranja in ovo koriste TRT cjepiva modificirana za upotrebu in ovo, a pružaju primjetne prednosti u odnosu na nepodesne i vremenski zahtjevne puteve ordiniranja nakon izlijeganja, koji su danas dostupni.

Ovaj izum koristi komercijalno dostupna TRT cjepiva, prilagođena za postupke ordiniranja in ovo iz ovog izuma. Eksperimentalni rezultati potvrđuju sigurnost i učinkovitost ordiniranja in ovo ovih cjepiva purama i pilićima, kada se koriste odgovarajući parametri doziranja.

Postupci iz ovog izuma se mogu koristiti za zaštitu peradi kao domaćina od TRT i/ili TRT- ili SHS-srodnog respiratornog poremećaja, ordiniranjem tih cjepiva in ovo.

Dakle, predmet ovog izuma je pružanje postupka zaštite peradi kao domaćina od TRT i TRT- i/ili SRS-srodnog respiratornog poremećaja, korištenjem tehnika cjepljenja in ovo, koje su lakše i manje skupe za primjenu kod velikih populacija ptica.

Sledeći aspekt ovog izuma je pružanje takvog cijepljenja in ovo koje koristi cjepiva u dozama koje daju pogodan imunološki odgovor izleglim pticama kao domaćinu, bez štetnog efekta na brzinu izlijeganja.

Još jedan predmet ovog izuma je pružanje zaštite od SHS-srodnog respiratornog poremećaja korištenjem TRT cjepiva prilagođenih za ordiniranje in ovo.

Još jedan predmet ovog izuma je pružanje postupka za cijepljenje ptica kao domaćina protiv TRT i/ili SHS-respiratornog poremećaja, koji daje povećane titre na TRT, u usporedbi sa konvencionalno cijepljenim pticama, koristeći manje količine cjepiva antigena, što dovodi do uštede u troškovima.

Ovaj izum daje postupak za imunizaciju in ovo ptica kao domaćina protiv TRTV, pružajući tako zaštitu protiv TRT i/ili TRT i SHS respiratornog poremećaja. Cjepiva koje se koriste u postupcima iz ovog izuma mogu se pogodno dobiti iz komercijalno dostupnih TRT cjepiva. Posebno pogodno za upotrebu u ovom izumu je komercijalno dostupno cjepivo Poulvac®, koje se dobija iz firme Fort Dodge Animal Health, u Fort Dodge, Iowa ili Weesp, Nizozemska. Komercijalna formulacija Poulvac® TRT sadrži umrtvljen TRTV, soj K, sa titrom koji nije manji od 103,2 TCID50 po dozi, a koji nije dopušten ili indiciran za ordiniranje in ovo. Kroz ovu prijavu ”TCID50” se odnosi na infektivnu dozu za 50% kulture tkiva.

Tipično, cjepivo se resuspenira u pogodnom tekućem nosaču, tako da se dobije TCID50 u opsegu od oko 103,2 do oko 104,5, a ordinira se u količini približno od 0,05 do 0,1 mL po jajetu, ovisno o vrsti ptice koja se imunizira. Ordiniranje može biti ručno, ali tipičnije je i ekonomičnije da se za ordiniranje koristi komercijalno dostupna oprema za injektiranje jaja, kao što je ona koja se dobija iz Embrex, Inc., North Carolina. Točna doza koju je potrebno ordinirati ovisit će o vrsti ptice kojoj se daje cjepivo, npr. manje ptice zahtijevaju manje doze. Ordiniranje cjepiva se tipično dešava na ili prije 24. dana inkubacije (npr. purice), ali su i druga vremena cijepljenja in ovo unutar opsega ovog izuma, kao na primer, na ili prije 18. dana inkubacije (npr. pilići).

Ptice kao domaćini, kojima su namijenjena cjepiva i postupci iz ovog izuma su pilići, patke, purice, guske, bantam kokoške, prepelice i golubovi. Poželjne ptičje vrste su komercijalno značajna perad, kao što su pilići, patke i purice.

Sa iznenađenjem je pronađeno da je ne samo postupak cijepljenja in ovo sigurniji i lakši za ordiniranje, nego da se kod ptica domaćina koje su imunizirane na ovaj način nalaze viši titri.

Uz to, ovo cjepivo i postupak ordiniranja u biti ne dovode do smanjenja postotka jaja izleglih nakon cijepljenja in ovo, u usporedbi sa suštinski istom kontrolnom (necijepljenom) grupom. Poželjno je da ovo smanjenje bude manje od oko 10%, a poželjnije je da je manje od oko 5%, u odnosu na postotak koji se izleže u kontrolnoj grupi. Još je poželjnije smanjenje od oko 1-2%. U nekim realizacijama, cjepivo i postupak iz ovog izuma mogu stvarno povećati postotak izleglih jaja, ponekad za čitavih oko 1-2% ili čak i više. Dakle, cjepivo je i sigurno i učinkovito za ordiniranje ptičjim vrstama, kao što su pilići i purice.

Primjeri koji slijede opisuju detaljno postupke i tehnike koji ilustriraju ovaj izum. Onima koji su verzirani u stanje tehnike je jasno da se mogu obaviti mnoge modifikacije, i u materijalima i u postupcima, bez odstupanja od svrhe i namjene ovog opisa.

PRIMJERI

Primjer 1.

Izučavanje sigurnosti ordiniranja in ovo puricama

Oplođena pureća jaja za leženje dobijaju se iz matičnog jata purica, za koje je poznato da nemaju TRTV; i koje nije prethodno cijepljeno protiv TRT. Ova jaja su nasumice podijeljena u dvije različite grupe.

Prvoj grupi od 76 oplođenih jaja ordinirano je cjepivo in ovo 24. dana inkubacije.

Prvi dan inkubacije se smatra 0. danom. Jaja su snesena približno 2-7 dana prije inkubacije. Za pripremanje in ovo cjepiva korištena je Poulvac® TRT (šarža TR015, datum važenja 24. lipnja 1997, koja ima titar od 107,5 TCID50). Svaka od tri fiole komercijalnog proizvoda je resuspendirana u 10 mL sterilne otopine soli, dajući za rezultat suspenziju koja ima titar cjepiva od 105,5 TCID50 na 0,1 mL. Ovi sadržaji se dobro promješaju i sjedine. Promješani/sjedinjeni sadržaji se označavaju kao ”IOV”, u nastavku Primjera 1.

Za ordiniranje in ovo koristi se 0,1 mL IOV po jajetu, sa titrom od 105,5 TCID50, pa se injektira u fluid unutarnje obloge fetusa svakog od 76 oplođenih jaja. Poslije toga, ova jaja se odmah vrate u inkubator (bez okretanja), i ostave se da se izlegu u izolacijskom ležištu, u kojem je smješteno. Ova jaja/inkubati se smatraju cijepljenim pticama.

Druga grupa od 66 oplođenih jaja nije cijepljena i ostavljena je da se izleže pod sličnim uvjetima u drugom izolacijskom ležištu. Ova jaja/inkubati se smatraju pticama negativne kontrole.

I za cijepljene ptice i ptice negativne kontrole, registrirano je da su se izlegli 27., 28. i 29. dana inkubacije. Tabela 1 predstavlja eksperimentalno opaženi postotak moći izlijeganja. U pogledu moći izlijeganja, cijepljenje in ovo iz ovog izuma dala je odličan rezultat sa 93,4% izleglih cijepljenih jaja, u odnosu na 92,4% izleglih jaja negativne kontrole.

Tabela 1. Moć izljeganja, u postocima

[image]

Poslije izljeganja, 25 purića iz svake grupe (tj. cijepljenih ptica i ptica negativne kontrole) je odabrano i stavljeno na pod sa iverjem u svakom od izolacijskih ležišta. Ostatak ptica iz svake grupe je žrtvovan.

Unutar svake grupe, svaka ptica je ispitivana svakog dana na kliničke znakove, tijekom 21 dana. Prisustvo nazalnog eksudata je testirano cijeđenjem kljuna. Ozbiljnost kliničke bolesti je vrednovana u skladu s Tabelom 2.

Tabela 2. Sustav kliničkog vrednovanja

[image]

Ukupna dnevna vrijednost za ptice je izračunavana zbrajanjem pojedinačnih vrijednosti za svaku pticu, toga dana. Tabela 3 predstavlja eksperimentalno opažene kliničke znakove, koristeći sustav vrednovanja iz Tabele 2.

Tabela 3. rezultati kliničkog ispitivanja cijepljenih ptica

[image] [image]

Ptice negativne kontrole su slično isptivane na bilo kakve kliničke znakove i nisu opažene nikakve abnormalnosti, tj. sve su imale rezultat nula.

Rezultati gornjih opažanja potvrđuju sigurnost postupaka cijepljenja in ovo iz ovog izuma. Najviši srednji rezultat/ptica (tj. 0,36) za sve ptice stare 6 dana pruža adekvatnu granicu sigurnosti i ukazuje samo na slabe/blage simptome TRT.

Obavljena je isto tako serološka analiza, uzimanjem krvi iz 10 ptica unutar matičnog jata purica, 6 1⁄2 tjedana poslije dana kada su primljena jaja. Isto tako, uzeta je krv iz slijedeće četiri grupe ptica: (a) starih 1 dan, od 20 ptica iz negativne kontrole; (b) starih 21 dan, od 21 ptice iz negativne kontrole; (c) starih 1 dan, od 20 cijepljenih ptica; i (d) starih 21 dan, od 20 cijepljenih ptica.

Serološka analiza pojedinačnih uzoraka krvi pokazuje titre antitijela prema TRTV. Ova analiza je koristila tehniku testa imunosorpcije vezivanja za enzim (ELISA), koja koristi A tip antigena i iskazuje se 2log titrima. Eksperimentalno izmjereni titri 2log titar ≥�6,0 uzeti su za pozitivne. Izračunate su isto tako geometrijska srednja (GM) i standardna devijacija (SD) za eksperimentalno izmjerene titre. Analiza titara je dala slijedeće rezultate. Matično jato purica bilo je bez TRTV [vidjeti, GM = 5,04, u usporedbi s pozitivnom graničnom vrijednošću�≥6,0. Od 10 ptica jedna je imala povišen titar od 7,7. Nadalje, GM titara za ptice iz negativne kontrole, starih 1 dan, i za cijepljene ptice, bile su skoro identične, tj. respektivno, 4,05 i 4,06. Međutim, dvije ptice među cijepljenim pticama su imale pozitivne titre [vidjeti vrijednosti titra od 7,1 i 8,1, od kojih je svaka ≥6,0]. Nasuprot tome, ni jedna od ptica iz negativne kontrole nije imala titar ≥6,0.Vrijednosti SD za ptice negativne kontrole i cijepljene ptice bile su, respektivno, 0,82 i 1,46.

Testovi uzoraka krvi starih 21 dan isto tako su pokazali jasne razlike u eksperimentalno izmjerenim titrima. Za ptice negativne kontrole, GM je opala na 3,53, a SD je opala na 0,46. Direktno suprotno nego za cijepljene ptice, gdje je GM porasla na 10,53, a SD je porasla na 0,85. Prema tome, cijepljene ptice su imale veoma povećane titre za TRTV.

Kod cijepljenih ptica, starih od 21 dan, bio je vrlo visok serološki odgovor. Ovaj odgovor je bio čak i veći od onog koji se tipično susreće kada se koristi ista doza (cijepljenjem kapima za oči) kod ptica starih 1 dan. Titri antitijela TRTV, koji imaju GM = 10,5, normalno se opažaju nakon zaraze sa virulentnim sojem TRTV. Za usporedbu, dva testa koja su koristila cijepljenje kapima za oči, sa 105,5 TCID50 Poulvac® TRT na osjetljivu pureću mladunčad (stare 1 dan), daju srednje titre antitijela jednake, respektivno, 8,3 i 8,7, u uzorcima krvi uzetim pri starosti od 21 dan.

Tabela 4 predstavlja podatke koji potvrđuju ovo serološko ispitivanje matičnog jata purica, ptica negativne kontrole i cijepljenih ptica.

Tabela 4: Titri TRTV

[image]

Dakle, ordiniranje in ovo (21. dana inkubacije) sa IOV iz ovog izuma, sa 105,5 TCID50, u oplođena pureća jaja, pruža neophodnu sigurnost u pogledu i moći izleganja i kliničkih znakova, kao i povećani imuno-odgovor, u odnosu na konvencionalno ordiniranje cjepiva.

Primjer 2.

Izučavanje sigurnosti ordiniranja in ovo pilićima

Specifična ne-patogena (u nastavku ”SPF”) jaja bijelih Leghorn kokošaka dobivena su iz komercijalnog izvora (Broekman Institut BV, Someren, Nizozemska). U inkubator se stavi 120 SPF jaja, a poslije 18 dana inkubacije jaja se prosvjetljavaju. Ovo je ukazalo na 5 neoplođenih jaja koja su odbačena, a prihvaćeno je 115 oplođenih jaja. Od 115 prihvaćenih jaja 100 je nasumice odabrano za cjepivociju in ovo. Ovih 100 jaja je podijeljeno u tri grupe kao što slijedi:

Grupa 1 jaja/inkubata je obilježena radi identifikacije sa oznakom krila narandžaste boje koje je imalo broj. Grupu 1 je činilo 30 jaja koja su, kao što je opisano niže, primila vakcinu in ovo sa izračunatom dozom po jajetu koja je imala titar od 105,5 TCID50.

Grupa 2 jaja/inkubata je obilježena radi identifikacije s oznakom krila zelene boje koje je imalo broj. Grupu 2 je činilo 40 jaja koja su, kao što je opisano niže, primila in ovo slanu otopinu istog volumena kao cjepivo koja je injektirana jajima iz Grupe 1.

Grupa 3 jaja/inkubata nije obilježavana. Grupu 3 je činilo 30 jaja kojima nije ordinirano ništa in ovo (ni cjepivo, niti slana otopina).

Broj na oznaci u obliku krila korišten je samo ukoliko je pile pokazalo znakove bilo TRT ili SHS.

Pilići iz obje grupe 1 i 2 su bili smješteni u istoj prostoriji u kojoj su se izlegli. Održavani su odgovarajući uvjeti (npr. hrana, voda za piće, drveno iverje kao materijal podloge, temperatura, relativna vlažnost itd.) .

Vremenska shema u ovom eksperimentu bila je slijedeća: Prvi dan inkubacije jaja iz Grupa 1, 2 i 3 je označen kao 0. dan inkubacije. Datum ordiniranja cjepiva i slane otopine in ovo za jaja Grupe 1 i Grupe 2, respektivno, bio je 18. dan inkubacije. Izračunati datum izlijeganja odgovarao je 21. danu inkubacije. Izučavanje je završeno s poslijednjim datumom izlijeganja 46. dana inkubacije.

Da bi se pripremilo cjepivo za ordiniranje in ovo upotrebljeno je komercijalno dostupno cjepivo Poulvac® TRT, koje sadrži 2000 doza po fioli, a koja se može dobiti iz firme Fort Dodge Animal Health, iz Fort Dodge, Iowa, ili iz Weesp, Nizozemska. Na osnovi određivanja po dozi, ovo cjepivo je imalo titar od 104,2 TCID50. Dvanaest (12) fiola ovog cjepiva je resuspendirano u slanom fosfatnom puferu (u nastavku ”PBS”), koristeći 5 mL PBS po fioli cjepiva. Dobiveni sadržaji su dobro promješani i sjedinjeni. Ovaj resuspendirani materijal je imao izračunati titar od 105,5 TCID50 i ukupni volumen od 60 mL. Ovo cjepivo se u nastavku označava kao ”IOV”.

Tijekom 18. dana inkubacije IOV cjepivo je ordinirano in ovo, injektiranjem jaja Grupe 1, koristeći komercijalno dostupni Inovoject® stroj za injektiranje jaja, iz firme Embrex, Inc., North Carolina. Ordiniranje injektiranjem IOV u jaja obavljeno je u skladu sa standarnim procedurama. Na sličan način ordinirana je jajima Grupe 2 komercijalno dostupna slana otopina, CLEAR-FLEX® INFUSIEVLOESISTOF, iz firme Bieffle Medital SpA, Italija.

Tabela 5 pokazuje tretman jaja iz Grupa 1, 2 i 3.

Tabela 5. Tretmana jaja

[image]

Postoci izleglih jaja iz Grupa 1, 2 i 3 su eksperimentalno registrirani i izračunati. Ukratko, opaženi su slijedeći izuzeci. Zbog abnormalnosti skeleta, spina bifida (koja nije pripisana bilo kakvom štetnom djelovanju cijepljenja in ovo) isključena su iz ispitivanja dva pileta iz Grupe 1, odmah nakon izlijeganja, a prije nego što su identificirana oznakom na krilu. Ova dva pileta su isključena iz Grupe 1 kada su računati postoci izlijeganja. Isto tako, iz Grupe 1 jednom piletu su bili povrijeđeni prsti, pa je i ono isključeno iz ovog izučavanja, nakon što je bilo obilježeno. Posmrtno ispitivanje ovog pileta nije pokazalo znakove bilo TRT ili bilo koje druge bolesti ili bilo kojeg drugog poremećaja. Isto tako, i ovo pile je isključeno iz Grupe 1 kada su izračunavani postoci izleganja. U pogledu jaja/inkubata iz Grupe 2, jedno pile je umrlo nakon izlijeganja, a prije nego što je obilježeno identifikacijskom oznakom na krilu. Ovo pile je na sličan način isključeno iz Grupe 2, kakad su izračunavani postoci izleganja.

Kao što je planirano, inkubati iz obje Grupe, 1 i 2, su ispitivani tijekom perioda promatranja od 25 dana. Tijekom ovog perioda ni jedno od pilića nije pokazalo kliničke znakove bilo TRT ili SHS. Svih 30 jaja iz Grupe 3 se izleglo. Na dan kada su se izlegli, svih 30 pilića je žrtvovano odsjecanjem glave radi uzimanja uzoraka krvi i naknadne analize, koja je opisana kasnije.

Tabela 6 prikazuje eksperimentalno registrirano izlijeganje i smrtnost u svakoj od Grupa 1, 2 i 3. Ovi rezultati potvrđuju da je cijepljenje in ovo iz sadašnjeg izuma sigurno u pogledu izleganja i kliničkih znakova TRT i/ili SHS.

Tabela 6. Rezultati izlijeganja/smrtnosti

[image]

Tjelesne mase pilića iz Grupe 1 (cijepljene) i Grupe 2 (slana otopina) određene su 25. dana. Srednja tjelesna masa pilića iz Grupe 1 bila je 209 g, uz standardnu devijaciju 22,1. Kod pilića iz Grupe 2, srednja tjelesna masa bila je 217 g, uz standardnu devijaciju 24,8. Tjelesne mase u Grupama 1 i 2 se ne razlikuju značajno, što je statistički utvrđeno korištenjem dvostranog Student-ovog testa, sa P = 0,18). Ovi rezultati su potvrdili da cijepljenje in ovo iz ovog izuma ne ugrožava tjelesnu masu 25. dana (što je komercijalno važno), u usporedbi s istom koja je dobivena injektiranjem in ovo fiziološke slane otopine.

Da bi se potvrdilo stanje SPS jaja, korištenih u Grupama 1, 2 i 3, da su bez TRT, onog dana kada su se jaja Grupe 3 izlegla, pilići su žrtvovani rezanjem glave, a uzeti uzorci krvi su analizirani. Testiranje pomoću ELISA nije otkrilo nikakva antitijela na TRTV, što potvrđuje da su SPF jaja, koja su korištena u ovom ispitivanju, bila u stanju bez TRT.

Ovo ispitivanje je potvrdilo da je cijepljenje in ovo SPF kokošjih jaja sigurno u pogledu izlijeganja, smrtnosti, kliničkih znakova TRT i/ili SHS i tjelesne mase 25. dana.

Primer 3.

Ispitivanje učinkovitosti cjepiva in ovo SPF pilića

Cilj ovog ispitivanja je da se utvrdi da li je cijepljenje in ovo pilećih embrija starih 18 dana učinkovito u prevenciji TRT i/ili SHS bolesti, nakon virulentne zaraze u 3. ili 6. tjednu starosti. Kao što je potvrđeno niže, cijepljenje in ovo osjetljivih oplođenih SPS kokošjih jaja, starih 18 dana, sa 104,2 TCID50 je sigurno, dok je doza od 103,2 TCID50 efikasna protiv kliničke bolesti.

Oplođena jaja za inkubate su dobivena iz jata matičnih SPF bijelih Leghorn kokošaka, koja su pribavljena iz firme Wickham Laboratories, Velika Britanija.

Komercijalno dostupno TRT cjepivo, Poulvac®TRT, dobiva se iz firme Fort Dodge Animal Helath, iz Fort Dodge, Iowa, ili iz Weesp, Nizozemska. Cjepiva in ovo iz ovog izuma se dobivaju iz Poulvac® TRT kao što slijedi. Svaka od tri (3) fiole komercijalnog cjepiva, koja ima titar od 107,5 TCID50, se resuspendira u 4 mL sterilne vode, pa se sve dobro izmješaju i sjedine. Zatim se izvuče 0,4 mL, pa doda 19,6 mL sterilnog PBS, dajući konačno razrijeđenje koje je ekvivalentno 200 mL po fioli, a dobijena suspenzija ima titar od 104,2 TCID 50 u 0,1 mL cjepiva. Ovo cjepivo se još razrijedi izdvajanjem 2 mL, a dodavanjem 18 mL sterilnog PBS, dajući tako suspenziju sa 103,2 TCID50 u 0,1 mL cjepiva.

Virus kojim je vršeno zaražavanje je pripremljen kao što slijedi. TRTV, iz soja BUT 8544 iz Velike Britanije, koji je izolirao Dr R. C. Jones s Liverpulskog Sveučilišta (Velika Britanija), propušten je 23 puta kroz kulturu organa traheje (u nastavku ”TOC”), jedanput kroz puriće, ponovo izoliran i još jedanput propušten kroz TOC. Titar ovog virusa je 104,5 TCID50 na mL.

Poslije 18 dana inkubacije inokulira se in ovo prva skupina od 70 oplođenih jaja (u nastavku ”Skupina 1”), sa 0,1 mL rekonstituirane TRT cjepiva koje sadrži 103,2 TCID50, kao što je opisano gore. Druga skupina od 70 jaja (u nastavku ”Skupina 2”) na isti način se inokulira sa 0,1 mL rekonstituiranog TRT cjepiva koje sadrži 104,2 TCID50, kao što je opisano gore. Jaja se odmah prenesu u inkubator (bez okretanja) i ostave da se izlegu u ležištu u koje su smještena. Jaja Skupina 1 i 2 su smještena odvojeno u sličnim izolacijskim ležištima. Treća skupina od 70 oplođenih jaja nije primila nikakvo ordiniranje in ovo (u nastavku ”Skupina 3”). Skupina 3 se u nastavku citira kao ptice negativne kontrole. Ova jaja se smještaju u treće izolacijsko ležište.

Izlijeganje je registrirano u dane: 20, 21, 22 i 23 nakon inkubacije (nulti dan je prvi dan inkubacije). Poslije izlijeganja, višak ptica starih jedan dan je žrtvovan, tako da je ostalo 50 ptica u svakoj skupini. Za skupine 1, 2 i 3 eksperimentalno registrirani postoci izlijeganja su bili, respektivno, 91%, 94% i 92%. Ovo potvrđuje da je cijepljenje in ovo, sa titrima 103,2 TCID50 i 104,2 TCID50 sigurno u pogledu izlijeganja.

Pri starosti od tri tjedna, po deset ptica iz svake cijepljene grupe (tj. Skupine 1 i 2) i od ptica negativne kontrole (tj. Skupina 3), je obilježeno na krilu, pa prebačeno u četvrto izolacijsko ležište. Svakoj ptici je zatim ordiniran prethodno opisani virus, preko kapi za oči, sa dozom do 103,5 TCID50 (virulentnog) TRTV, u 0,1 mL. Pri starosti od 6 tjedana, slično je 10 ptica izloženo djelovanju virulentnog soja TRTV. Međutim, zbog povećane starosti ovih ptica, zarazna doza je povećana na 0,2 mL po svakoj ptici, sa 103,8 TCID50 (virulentnog) TRTV.

Zaražene ptice su eksperimentalno promatrane 14 dana, a nakon toga su žrtvovane i uzeta im je krv. Opaženi znakovi su registrirani, koristeći klinički sustav vrednovanja iz Tabele 2, kao što je korišten u Primjeru 1. Ukupna dnevna vrijednost za grupu ptica se izračunava zbrajanjem pojedinačnih vrijednosti za svaku pticu tog dana. Kumulativna vrijednost je zbroj srednjih dnevnih vrijednosti u danima 3-8. Korišten je χ2 test za analiziranje rezultata. Opaženi klinički znakovi u 2 cijepljene grupe (Skupine 1 i 2) u danima 3 - 8, su uspoređivani s onima u (skupina 3) pozitivnim kontrolama u iste dane, zaraženimu 3. tjednu i 6. tjednu. Ovo promatranje je potvrdilo slijedeće rezultate.

U pogledu zaraze u 3. tjednu sa virulentnim sojem TRTV, sa titrom od 103,5 TCID50, 90% necijepljenih kontrolnih ptica iz Skupine 3 je pokazalo kliničke znakove. Nasuprot tome, manji postoci cijepljenih ptica iz Skupina 1 i 2 su pokazali kliničke znakove. U skupini 1 (cijepljenoj sa 103,2 TCID50 po jajetu), samo 50% ptica je pokazalo kliničke znakove. U Skupini 2 (cijepljenoj sa 104,2 TCID50 po jajetu), samo 30% ptica je pokazalo kliničke znakove. U Skupini 3, samo jedna ptica je ostala potpuno bez kliničkih znakova. Nasuprot tome, pet ptica iz Skupine 1 i sedam ptica iz Skupine 2 je ostalo potpuno bez kliničkih znakova.

U pogledu zaraze u 6. tjednu sa virulentnim sojem TRTV, sa titrom od 103,8 TCID50, 80% necijepljenih kontrolnih ptica iz Skupine 3 je pokazalo kliničke znakove. Nasuprot tome, manji postoci cijepljenih ptica iz Skupina 1 i 2 su pokazali kliničke znakove. U Skupini 1 (cijepljenoj s titrom od 103,2 TCID50 po jajetu) samo 20% ptica je pokazalo kliničke znakove. U Skupini 2 (cijepljenoj sa 104,2 TCID50 po jajetu) samo 10% ptica je pokazalo kliničke znakove.

Staitistička χ2 analiza je potvrdila kod zaraze u 6. tjednu da su u obje cijepljene grupe ptica (Skupine 1 i 2) eksperimentalno registrirani klinički znakovi značajno manje ozbiljni, nego kod onih koji su zabilježeni kod necijepljenih ptica negativne kontrole u Skupini 3 (videti P<0,01).

Tabele 7, 8 i 9 prikazuju ove rezultate, respektivno, za zarazu u 3. tjednu, zarazu u 6. tjednu, i statističku χ2 analizu, kao što je diskutirana gore.

Tabela 7. Klinički znakovi zaraze u 3. tjednu

[image] [image]

Tabela 8. Klinički znakovi zaraze u 6. tjednu

[image] [image]

Tabela 9. Analiza χ2

[image]

Uz praćenje ptica iz Skupina 1, 2 i 3 na kliničke znakove TRT, ove ptice su isto tako podvrgnute serološkoj analizi, pri čemu su antitijela na TRTV u pojedinačnim uzorcima krvi određivana tehnikama ELISA, korištenjem A tipa antigena, i iskazana kao 2log titara. Titri antitijela od 2log titar > 6,0 su uzeti za pozitivne. Rezultati su statistički analizirani kotištenjem Student-ovog testa za nesparene podatke. Tabele 10 i 11 predstavljaju serološke rezultate dobivene zaražavanjem ptica iz Skupina 1, 2 i 3, respektivno, u 3. tjednu i 6. tjednu. U Tabelama 10 i 11 ”PC” označava poslije zaraze; ”GM” označava geometrijsku sredinu; a ”SD” označava standardnu devijaciju. Ukratko, sve grupe (tj. Skupine 1, 2 i 3) su pokazale značajan porast u titrima antitijela 7. dana poslije zaraze i dodatni porast titara antitijela 14. dana PC.

Tabela 10. Titri antitijela TRTV (zaraza u 3. tjednu)

[image] [image]

Tabela 11. Titri antitijela TRTV (zaraza u 6. tjednu)

[image] [image]

Slična serološka analiza je isto tako obavljena u pogledu sve tri grupe (tj. Skupine 1, 2 i 3) koje nisu bile zaražene virulentnim sojem TRTV. Srednji titri antitijela određeni su za grupu kontrolnih ptica (Skupina 3) i za 2 grupe cijepljenih ptica (Skupine 1 i 2), starih od jedan dan do 8,5 tjedana. Kao što se očekivalo, titri antitijela kod kontrolnih ptica su ostali niski kroz čitavo ovo ispitivanje. Titri kontrolnih ptica su statistički uspoređeni s istim titrima cijepljenih ptica jednake starosti. Tabela 12 daje određene srednje vrijednosti titara antitijela poslije in ovo cijepljenja. Pojedinačni rezultati su dostupni (nisu pokazani) potvrđujući eksperimentalne rezultate koji su prikazani u tabeli 12. U Tabeli 12 ”n” se odnosi na broj ptica, a ”SD”na standardnu devijaciju.

Tabela 12. Srednji tritri antitijela poslije cijepljenja in ovo

[image] [image]

Analiza rezultata iz Primjera 3, uključujući eksperimentalno dobivena mjerenja i odgovarajuću statističku analizu, pokazuje da je niža doza cjepiva (103,2 TCID50 TRTV, dana in ovo, odgovarajućim 18 dana starim oplođenim kokošjim SPF jajima) učinkovita i da pruža značajnu zaštitu protiv zaraze sa virulentnim sojem TRT u 6. tjednu starosti. U 3. tjednu starosti, zaštita je isto tako opažena; međutim, s obzirom na broj ptica, opažene razlike u pruženoj zaštiti padaju upravo ispod granice signifikantnosti. S povećanom dozom cijepljenja od 104,2 TCID50 TRTV po jajetu (porast za red veličina približno 1log10), za zaraze u 3. tjednu i 6. tjednu, opažena je značajna zaštita od izlaganja virulentnom soju TRTV.

Ordiniranje cjepiva in ovo, izvedene iz Poulvac® TRT, jasno je povezano sa stvaranjem specifičnih antitijela na TRTV u pticama koje su cijepljene/ inokulirane. Ova povezanost je ovisna o dozi. Viša doza cjepiva in ovo za starost od 3 tjedna izaziva porast srednjeg titra antitijela do razine koja je značajno viša od iste kod ptica negativne kontrole, a na razine koji su bliske graničnoj vrijednosti od 6,0. Odgovor cirkulatornog antitijela kod cijepljenja in ovo, s višom dozom od 104,2 TCID50 po jajetu, izgleda da se povećava s prolaskom vremena; maksimum je dobiven u šestom tjednu starosti, a poslije toga titri su ostali neizmijenjeni do starosti od 8,5 tjedana.

Nasuprot gore diskutiranim rezultatima za visoku dozu cijepljenja, ptice kojima je dana niža doza od 103,2 TCID50 po jajetu, izgleda da pokazuju odloženi odgovor antitijela na cijepljenje. Titri su počeli rasti tek pri starosti od 8,5 tjedana, kada su distigli razine značajno više od istih kod kontrolnih ptica. U to vrijeme (tj. 8,5 tjedan) titri za ptice sa niskim cjepivom (Skupina 1) su slični razinama onih za ptice sa visokom cjepivom (Skupina 2), stare 3 tjedna. Smatra se vjerojatnim da bi sa prolaskom još dodatnog vremena, poslije 8,5 tjedana, titri antitijela porasli na razine iznad 6,0.

Postoji veza između titara antitijela i smanjenja kliničkih znakova TRT. U svakoj grupi ptica u kojoj su titri antitijela značajno viši od istih kod kontrolnih ptica, ali ipak ispod pozitivne granice od 6,0, opaženo smanjenje kliničkih znakova TRT je statistički značajno.

Cijepljenje in ovo 18 dana starih oplođenih kokošjih SPF jaja, s dozama koje su približno u opsegu od najmanje 1032 TCID50 po jajetu do najmanje 104,2 TCID50 po jajetu, sigurna je i učinkovita protiv kliničke bolesti koja se normalno očekuje pri zarazi s virulentnim sojem TRTV.

Primjer 4.

Izučavanje učinkovitosti in ovo komercijalnog kokošjeg cjepiva

Cilj ovog ispitivanja je da se utvrdi da li je učinkovito cijepljenje in ovo 18 dana starih inkubiranih oplođenih kokošjih jaja iz matičnog jata komercijalnih brojlera, u prevenciji TRT i/ili SHS bolesti, nakon virulentne zaraze u 4. ili 6. tjednu starosti. Kao što je niže utvrđeno, cijepljenje in ovo 18 dana starih oplođenih jaja od roditelja koji su pozitivni na TRT-antitelo, sa 103,2 TCID50 po jajetu, cjepivom koje se izvodi iz Poulvac® TRT, učinkovita je protiv kliničke bolesti rinotraheitisa.

Oplođena jaja za izlijeganje se dobivaju iz jata 37 tjedan starih roditelja komercijalnih brojlera, koji su prethodno cijepljeni sa živim TRT cjepivom u 10. tjednu starosti i sa umrtvljenim TRT cjepivom u 18. tjednu starosti. Ova jaja se dobivaju iz firme Mossbank breeder flock, Marshall Agriculture, iz Whitburn-a u Škotskoj.

Komercijalno dostupno TRT cjepivo, Poulvac® TRT, koja se dobiva iz firme Fort Dodge Animal Helath, iz Fort Dodge, Iowa, ili iz Weesp, Nizozemska, koristi se za pripremanje cjepiva in ovo iz ovog izuma. Tri fiole ovog komercijalnog cjepiva, koja ima titar od 107,5 TCID50, se resuspendiraju u 5 mL sterilne vode, pa se ti sadržaji dobro izmješaju i spoje. Cjepivo se još razrijedi sterilnom fosfatnom slanom puferskom otopinom (PBS), tako da se dobije suspenzija cjepiva sa 103,2 TCID50 u 0,1 mL.

Virus za zaražavanje se dobiva kao što slijedi. TRTV, soj BUT 8544 iz Velike Britanije, (vidjeti stranu 14) propusti se 23 puta kroz kulturu organa traheje (u nastavku ”TOC”), jedanput kroz puriće, ponovo izolira i još jedanput propusti kroz TOC. Titar ovog virusa za zaražavanje je 104,5TCID50 po mL.

Poslije 18 dana inkubacije, inokulira se 57 oplođenih jaja in ovo sa 0,1 mL rekonstituisanog TRT cjepiva, koja ima 103,2 TCID50, kao što je opisano gore. Jaja se odmah vrate u inkubator (bez okretanja), pa se ostave da se izlegu u izolacijskom ležištu u koje su smještena. Poslije izlijeganja izvadi se 40 ptica iz inkubatora i stavi na pod sa iverjem.

Jedan broj (110) oplođenih jaja nije cijepljen/inokuliran, i ostavljen je da se odvojeno izleže. Dan poslije izlijeganja, smjesti se 40 ptica u drugo izolacijsko ležište, i predstavlja grupu ptica negativne kontrole. Zaražene kontrolne ptice se zovu grupa pozitivnih kontrolnih ptica.

Registrirano je izlijeganje u dane: 20, 21, 22 i 23 (dan inokulacije je nulti). Poslije izlijeganja višak ptica se humano žrtvuje ili se koristi za sakupljanje krvi. Postoci izlijeganja necijepljenih jaja i cijepljenih jaja su, respektivno, 89% i 91%, što potvrđuje da je u pogledu izlijeganja cijepljenje sa titrom od 103,2 TCID50 sigurno.

U 4. tjednu starosti, 10 ptica iz grupe cijepljenih i deset ptica iz grupe negativne kontrole se uzmu i obilježe oznakom na krilu, i premjeste u treće izolacijsko ležište. Svakoj od ptica se zatim ordinira pethodno opisani zarazni virus, preko kapi za oči, koje sadrže dozu od 103,5 TCID50 TRTV (virulentan) u 0,1 mL. U 6. tjednu starosti 14 ptica se na isti način zarazi sa virulentnim sojem TRTV. Međutim, zbog porasta starosti ovih ptica, zarazna doza je povećana na 103,8 TCID50 TRTV (virulentan) u 0,2 mL, po jednoj ptici.

Zaražene ptice se eksperimentalno promatraju 14 dana, a nakon toga žrtvuju i uzme im se krv. Opaženi znakovi su registrirani, koristeći se Tabelom 13 sa revidiranim kliničkim sustavom vrednovanja. Sustav u Tabeli 13 je sličan, ali ne identičan sa sustavom u Tabeli 2, koji je ranije opisan u Primjeru 1, gore.

Tabela 13. Revidirani sustav kliničkog vrednovanja

[image]

Ukupna dnevna vrijednost za grupu ptica se izračunava zbrajanjem pojedinačnih vrijednosti za svaku pticu toga dana. Kumulativna vrijednost je zbroj srednjih dnevnih vrijednosti. Za analiziranje podataka koristi se χ2 test. Ukupni klinički znakovi u Skupini 1 cijepljene grupe se usporede s onim koji je opažen u Skupini 2 pozitivnih kontrola u istom danu, za zarazu u 4. tjednu i u 6. tjednu. Ovo promatranje je dalo slijedeće rezultate.

Kada se radi o zarazi u 4. tjednu sa virulentnim sojem TRTV, sa titrom 103,5 TCID50, klinički znakovi su opaženi samo 6. i 7. dana, a maksimalni znakovi su opaženi 6. dana u obje grupe (tj. u Skupini 1 i 2). U cijepljenoj grupi (Skupina 1) samo 30% ptica je pokazalo kliničke znakove poslije prvog zaražavanja, a kumulativna srednja vrijednost po ptici bila je 0,6. U skupini 1, sedam od deset ptica je ostalo kompletno bez kliničkih simptoma. Ukupni klinički znakovi, opaženi kod cijepljenih ptica su statistički uspoređeni s onima iz grupe ptica pozitivne kontrole. Iako su cijepljene ptice pokazale manje ozbiljne kliničke znakove nego one iz pozitivne kontrole, ovi rezultati nisu statistički značajni (0,1<P<0,3).

Kada se radi o zarazi u 6. tjednu sa viruletnim sojem TRTV, sa titrom 103,8 TCID50, klinički znakovi su opaženi u dužim periodima vremena kod ptica pozitivne kontrole, nego poslije zaraze u 4. tjednu s nižom dozom. Međutim, kod cijepljenih ptica, klinički znakovi su opaženi samo jednog dana. Kod ptica iz pozitivne kontrole kod 57% su se pokazali klinički znakovi, a kumulativna vrijednost po ptici je bila 1,35. Od 14 ptica u ovoj grupi, 6 je ostalo potpuno bez kliničkih znakova. Jedna ptica je pokazala ozbiljne kliničke znakove 5. i 6. dana unutar perioda opažanja i poslije toga je uginula, devet dana nakon zaražavanja. Posmrtno ispitivanje ove ptice je otkrilo dilataciju desne predkomore, kongestiju srčanih vena, kongestiju pluća, višak mukoze u traheji i fibrozni eksudat po jetri. Vjerojatni uzrok smrti je smetnja u desnoj strani srca i moguće, hepatitis. Suprotno tome, samo 14% ptica iz cijepljene grupe je pokazalo kliničke znakove nakon zaražavanja, a kumulativna vrijednost po ptici bila je 0,14. Od 14 ptica u ovoj grupi 12 je ostalo potpuno bez kliničkih znakova. Ukupni klinički znakovi u cijepljenoj grupi (Skupina 1) su statistički uspoređeni, koristeći analizu χ2, sa istima iz grupe ptica pozitivne kontrole (Skupina 2). Ova analiza je potvrdila da su klinički znakovi, opaženi u cijepljenoj grupi, bili značajno manje ozbiljni od onih koji su opaženi kod ptica pozitivne kontrole (0,02<P<0,05).

Tabele 14, 15 i 16 prikazuju ove rezultate, respektivno, za zarazu u 4. tjednu, za zarazu u 6. tjednu i statističku analizu χ2, kao što je gore diskutirana.

Tabela 14. Klinički znakovi zaraze u 4. tjednu

[image] [image]

Tabela 15. Klinički znakovi zaraze u 6. tjednu

[image] [image]

Tabela 16. Analiza χ2 podataka o kliničkim vrijednostima

[image]

Uz praćenje ptica iz Skupine 1 i 2 na kliničke znakove TRT, ove ptice su isto tako podvrgnute serološkoj analizi u kojoj su određivana antitijela na TRTV u pojedinačnim uzorcima krvi, korištenjem tehnike ELISA, koju je razvio Leahurst u Liverpoolu (Velika Britanija), korištenjem A tipa antigena, i iskazivanjem 2log tritrima. Titri antitijela čije su 2log titar vrijednosti bile > 6,0 uzete su kao pozitivne. Ovi rezultati su analizirani statistički, korištenjem Student-ovog t-testa za nesparene podatke. Tabele 17 i 18 prikazuju serološke rezultate dobivene sa zaraženim pticama Skupine 1 i 2, respektivno, zaraženim u 4. tjednu i zaraženim u 6. tjednu. U Tabelama 17 i 18 ”PC” se odnosi na podatak poslije zaražavanja.

Tabela 17. Titri antitijela TRTV (zaraza u 4. tjednu)

[image] [image]

Tabela 18. Titri antitijela TRTV (zaraza u 6. tjednu)

[image] [image]

Slična serološka analiza je obavljena isto tako s obzirom na one ptice koje nisu

zaražene virulentnim sojem TRTV, korištenjem uzoraka seruma od kojih je svaki uzet od ptica iz 5 različitih zračnih prostora, iz Mossbank matičnog uzgojnog jata (Marshall Agriculture) u 25. i 41. tjednu starosti. Tabela 19 predstavlja srednje titre antitijela ovih ptica iz matičnog uzgojnog jata.

Tabela 19. Srednji titri antitijela matičnog uzgojnog jata

[image]

I za nezaražene cijepljene i nezaražene ptice negativne kontrole, krv je sakupljena u starosti 1 dan, 4, 6 i 8 tjedana. Tabela 20 predstavlja ove srednje titre antitijela nezaraženih ptica.

Tabela 20. Srednji titri antitijela nezaraženih ptica

[image]

I za zaražene cijepljene i zaražene ptice pozitivne kontrole, krv je sakupljena 14 dana poslije zaražavanja za svaku grupu zaraženu u 4. tjednu i u 6. tjednu. Tabela 21 predstavlja srednje titre antitijela zaraženih ptica u ove dvije grupe.

Tabela 21. Titri zaraženih ptica 14 dana poslije zaražavanja

[image]

Na raspolaganju su pojedinačni rezultati da potvrde gore dane podatke u Tabelama 14-21. Na osnovi gornjih seroloških analiza doneseni su slijedeći zaključci. I za cijepljene ptice i za ptice negativne kontrole, stare 1 dan, utvrđeno je da ove ptice imaju materinska antitijela (MA) na TRTV. U starosti od 4 tjedna razine antitijela kod ptica negativne kontrole su pale u negativni opseg i ostale niske kroz cijeli preostali dio pokusa. Poslije ordiniranja in ovo, sa titrom od 103,2 TCID50 cjepiva izvedene iz Poulvac® TRT, titri antitijela su ostali u negativnom opsegu (tj. ispod pozitivne granične vrijednosti od 6,0), ali su rasli sa starenjem. U starosti od 4, 6 i 8 tjedana cijepljene ptice su imale srednje razine titra antitijela koji su statistički značajno viši od istih kod ptica negativne kontrole. Od 4. tjedna starosti, 20% do 22% cijepljenih ptica ima pozitivne titre. U pogledu zaraženih ptica, sve ptice su pokazale serokonverziju 14. dana poslije zaraze. U isptivanjima sa zarazom u 4. tjednu i u 6. tjednu, srednji titri cijepljene grupe su bili viši od istih kod ptica pozitivne kontrole, a ta razlika je statistički značajna (P<0,05).

Cjelovita analiza Primjera 4, uključujući eksperimentalno dobivena mjerenja, rezultate i odgovarajuće statističke analize, ukazuje da cijepljenje in ovo materinski pozitivnih antitijela (MA+) komercijalnih jaja brojlera 18. dana inkubacije, sa cjepivom izvedenom iz Poulvac® TRT, i dozom titra od 103,2 TCID50 po jajetu, ne utječe štetno na izlijeganje i predstavlja pouzdanu, djelotvornu i učinkovitu metodu ordiniranja cjepiva. Ova cijepljenje isto tako pruža značajnu zaštitu protiv zaraze sa virulentnim sojem TRTV u starosti od 6 tjedana, kada su opaženi klinički znakovi značajno umanjeni. Postoji i stupanj zaštite u starosti od 4 tjedna, međutim, čak i kod necijepljenih ptica pozitivne kontrole opaženi klinički znakovi u tom vremenu nisu veoma ozbiljni. Prema tome, iako je prisutna, zaštita protiv zaraze u starosti od 4 tjedna nije statistički značajna.

Podaci koji su dani u Primjeru 4, u kombinaciji s onima iz Primjera 1-3 gore, potvrđuju da su pilići manje osjetljivi na TRT cjepiva. Pozitivni srednji titri antitijela (iznad pozitivne granične vrijednosti od 6,0) nisu opaženi poslije cijepljenja in ovo. Međutim, ove razine u cijepljenoj grupi su bili značajno više od onih koji su opažene kod negativne kontrole. Približno petina cijepljenih ptica ima pozitivne titre poslije 4 tjedna starosti. Stoga, u vrijeme zaraze, ukupna serokonverzija na razine ELISA iznad 6,0 ne mora biti dobar indikator zaštite koja se stvarno postiže cijepljenjem in ovo. Ulogu može igrati i lokalni imunitet u interakciji između izazvane zaštite i eksperimentalno određenih titara.

Prije analize gornjih eksperimenata 1-4, bilo je pretpostavljeno da prisustvo materinskih antitijela može štetno utjecati na učinkovitost cjepiva. Ipak, Primjer 4 sa iznenađenjem potvrđuje da je ordiniranje in ovo TRT cjepiva, sa titrom od 103,2 TCID50 po jajetu, učinkovito u smanjivanju kliničke bolesti TRT kod pilića koji su MA+. Primjer 4 pojačava i širi zaključke donesene u gornjem Primjeru 3; naime, SPF (MA-) pilići koji su cijepljeni in ovo isto tako su pokazali umanjenje kliničke bolesti.

Primjer 5.

Proučavanje TRT cjepiva u kombinaciji s drugim cjepivima za živad

U ovom ispitivanju koriste se sledeće kratice:

AHS Animal Helath Service, Deventer, Nizozemska

BC Biochek, Gouda, Nizozemska

CVL Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Velika Britanija

EID50 infektivna doza za 50% jaja

ELISA test imunosorpcije vezivanja za enzim

FAT test fluorescentnog antitijela

HI inhibicija hemaglutinacije

IB infektivni bronhitis

IBD infektivna bolest burze

i.m. intramuskularno

MD Marek-ova bolest

ND Newcastle bolest

P vjerojatnost

TCID50 doza infektivna za 50% kulture tkiva

TRT pureći rinotraheitis

U ovom ispitivanju korišteni su slijedeći materijali cjepiva:

Poulvac® TRT, šarže TR02100 i TR2200, koje sadrže 104,1 i 104,1 TCID50 TRT virusa po dozi, respektivno

Poulvac® Ovoline ND, šarža BB010, koja sadrži 103,9 EID50 ND virusa u fioli (5000 doza po fioli).

Bursamune IN OVO, šarža 61640, koja sadrži 5000 doza po fioli.

Poulvac® Marek HVT lyo, šarža 350129, koja sadrži MD virus, soj FC 126 (1000 doza po fioli).

Poulvac® NDW, šarže BL03200 i BL04302.

Poulvac® IB Primer, šarža CX02301, koja sadrži 105,0 EID50 IB virus, serotipovi M41 i D207 (klon D274) po dozi (1000 doza pi fioli).

Poulvac® Bursa Plus, šarža 62481, koja sadrži EID50 IBD virus, soj V877, po fioli (2000 doza po violi).

Sva cjepiva, izuzev Bursamune IN OVO, dobavljaju se iz Fort Dodge Animal Health Benelux, Weesp, Nizozemska. Bursamune IN OVO se dobija iz Fort Dodge Animal Health, Australia.

Šarže cjepiva se čuvaju na 0-8°C, zaštićene od svjetla, do dana kada se upotrebljavaju u skladu s preprukama proizvođača. Poslije rekonstituiranja cjepivo se mora iskoristiti tijekom dva sata. Pripremana su slijedeća razrjeđenja cjepiva.

Razrjeđenje cjepiva za cijepljenje in ovo grupe 1 Poulvac® TRT, šarža TR02100, Poulvac® Ovoline ND i Bursamune IN OVO, rekonstituiraju se i dalje razrijeđuju u razrjeđivač Poulvac® Marek, šarža C8109. Krajnje razrjeđenje sadrži jednu komercijalnu dozu svakog cjepiva u 0,05 mL.

Razrjeđenje cjepiva za intramuskularno (i.m.) cijepljenje grupa 1 i 2 protiv MD Poulvac®Marek HVT se rekonstituira i dalje razrijeđuje u Poulvac®Marek razrjeđivaču, šarža C8109. Ovo razrjeđenje sadrži jednu komercijalnu dozu u 0,5 mL.

Razrjeđenje cjepiva za cijepljenje grubim raspršivanjem grupe 1 Poulvac® IB Primer, se rekonstituira i dalje razrjeđuje u 2,2 litra demineralizirane vode. Razrjeđenje sadrži jednu komercijalnu dozu u 0,5 mL.

Razrjeđenje cjepiva za cijepljenje grubim raspršivanjem grupe 2 Poulvac®NDW, šarža BL04302, Poulvac®IB Primer i Poulvac®TRT, šarža TR02200, rekonstituiraju se i dalje razrjeđuju u 3 litra demineralizirane vode. Krajnje razrjeđenje sadrži jednu komercijalnu dozu u 0,5 mL.

Razrjeđenje cjepiva za cijepljenje grupe 2 IBD u vodi za piće. Tri fiole Poulvac®Bursa Plus se rekonstituiraju i dalje razrjeđuju vodom iz pipe.

Razrjeđenje cjepiva za cijepljenje grupa 1 i 2 protiv ND pomoću spreja Atomist Poulvac®NDW, šarža BL03200, rekonstituira se i dalje razrijeđuje u demineraliziranoj vodi, sve dok krajnje razrjeđenje ne dostigne komercijalnu dozu u 0,5 mL.

Stavi se 14895 komercijalnih jaja iz proizvodnje brojlera pasmine Cobb, dobivenih iz firme Pronk, Meppel, Nizozemska, u jedan inkubator smješten u MUK-5/6 na ispitivačkoj farmi Fort Dodge AHH, u Muidenu, Nizozemska. Sva jaja se prosvjetljavaju poslije 17 dana inkubacije. Neoplođena jaja, ili jaja s mrtvim embrijom, se odbace.

Inokulira se 6001 jaje, pripisano grupi 1, sa 0,05 mL razrjeđenja u kojem je sadržana 1 doza Poulvac®TRT, Poulvac®Ovoline ND i Bursamine IN OVO po jajetu, poslije 18 dana inkubacije, korištenjem stroja za injektiranje jaja Embres Inovoject, u skladu s uputstvima proizvođača. 6028 jaja, pripisanih grupi 2, ostavljeno je bez inokulacije.

Inokulirana (grupa 1) i ne-inokulirana (grupa 2) jaja se dalje inkubiraju (bez okretanja) do izljeganja u inkubatorima 1 i 4, respektivno, smještenim na istraživačkoj farmi Fort Dodge AHH u Muidenu, Nizozemska. Poslije izlijeganja u isptivanje je uključeno 4452 (inokuliranih, grupa 1) i 5248 (ne-inokuliranih, grupa 2) pilića, respektivno. Ovi pilići su u grupama smješteni na drveno iverje u životinjskim objektima koji su smješteni pod istom nadstrešnicom na istraživačkoj farmi Fort Dodge AHH u Muidenu, Nizozemska. Pilići grupe 1 su smješteni u MUL-L,a pilići grupe 2 u MUL-R. Svi pilići su imali slobodan pristup hrani koju čine komercijalne pelete za brojlere i slobodan pristup vodi za piće, koja se nalazi u zvonastim napajalicama.

Shema cijepljenja je pokazana u Tabeli 22. Pilići grupe 1, stari 1 dan, cijepljeni su sa Poulvac®IB Primer cjepivom. Jedna komercijalna doza je ordinirana grubim raspršivanjem, koristeći vrtni raspršivač (Gardena), sa 0,5 mL po piletu. Pilići grupe 2, stari 1 dan, cijepljeni su sa Poulvac®TRT, Poulvac®NDW i Poulvac®IB Primjer. Jedna komercijalna doza svakog cjepiva je ordinirana grubim raspršivanjem u jednom volumenu od 0,5 mL po piletu, kao u grupi 1. Prije cijepljenja grubim raspršivanjem, pilići su stavljeni u kutije za piliće, gdje su ostali 3 sata nakon cijepljenja.

Svi pilići su cijepljeni s Poulvac®Marek HVT lyo, jedna komercijalna doza po piletu, starom 1 dan. Ova cjepivo je davano i.m. u krilo, koristeći Pullet Injection Gun (Veterinary Supplies, Mijdrecht, Nizozemska), sa prethodno podešenim volumenom od 0,5 mL.

Pilići grupe 2 su cijepljeni sa Poulvac® Bursa Plus, jedna komercijalna doza po piletu, u vodi za piće, pri starosti od 2 tjedna. Cjepivo se dijeli s količinom vode koja se potroši tokom 2 sata. Pilićima je bila uskraćena voda za piće tijekom 2 sata prije ordiniranja cjepiva.

Svi pilići starosti 4 tjedna su cijepljeni sa Poulvac®NDW. Jedna komercijalna doza u 0,5 mL po piletu, davana je kroz atomizer.

Tabela 22. Shema cijepljenja

[image]

Uzeti su uzorci krvi iz 30 pilića starih 1 dan, iz svake grupe, poslije dekapitacije. Uzorci 10 pilića iz svake grupe su korišteni za serološke testove u AHS. Uzorci drugih 10 pilića iz svake grupe su korišteni za serološke testove u Central Veterinary Laboratory, u Weybridge, Velika Britanija (CVL). Preostalih 10 uzoraka je korišteno za serološke testove u BC. Uzorci krvi su uzimani iz vene krila, do maksimalnog broja od 24 pileta u grupi, starosti 2, 3, 4, 5 i 6 tjedana.

Testovi antitijela na antigene ND, IB M41 i IB D274 određivani su korištenjem testova HI. Granica detekcije testova HI odgovara 2log HI titar = 1,0 za antigen ND, a 2log HI titar = 3,0 za antigene IB. Izračuna se geometrijska sredina HI titara. Titri antitijela na TRT i IBD virus mjere se korištenjem metode ELISA (IDEXX), u skladu s uputstvima proizvođača, a izračunavaju su srednji titri. Ovi testovi su urađeni u AHS.

Titracije antitijela na ND, IB, TRT i IBD virus, korištenjem ELISA metode, obavljeni su u BC. Pozitivnim se smatraju ELISA titri antitijela od 1159 i 834 na ND i IB virus. Titri antitijela na ND (pozitivnim se smatraju veći od 396) i IB virus određeni su isto tako korištenjem test-kompleta IDEXX. Izračunavaju se srednji titri, koristeći software BC99.

Rezultati, dobiveni u AHS i CVL, analizirani su statistički. Uspoređene su dvije grupe s obzirom na titre antitijela, pomoću Student-ovog dvostranog testa. Prije analize, ELISA titri antitijela za IBD, TRT i MD bili su logaritamski transformirani (log[x+1]).

U izračunavanjima, mjerenja MD ≥1600 i neg. bili su zamijenjeni sa 1600 i 25, respektivno. Vjerojatnost P�0,05 smatrana je statistički značajnom razlikom.

Rezultati: srednji titri antitijela za ND, IB, IBD i TRT antigena, određeni su u AHS i BC, kao što pokazuju Tabele 23 i 24.

Tabela 23. Srednji titri antitijela za ND, IB M41, IB D274, IBD i TRT, određeni u AHS

[image] * Statistički značajno različito od grupe 1 (P�0,05). ;Tabela 24. Srednji titri antitijela za ND, IB, IBD i TRT, određeni u BC ;[image] ;Srednji FAT titri za MD virus, predstavljaju srednje razrjeđenje seruma koje pokazuje specifičnu fluorescenciju, a prikazani su u Tabeli 25. Statistički značajni viši FAT titri su opaženi u grupi 2 za starost od 2, 3 i 4 tjedna, što pokazuje viši imunološki odgovor ptica u mlađoj dobi. ;Tabela 25. Srednji FAT titri za MD virus ;[image] * Statistički značajno različito od grupe 1 (P�0,05).

Primjer 5. Diskusija

Pilići iz obje grupe su imali MA protiv ND, IB, IBD, TRT i MD virusa. Opažen je sero-odgovor na ND i IB poslije cijepljenja u starosti 1 dan. Razvoj titara na ove antigene bio je unutar normalnog opsega u obje grupe. Druga cijepljenja s Poulvac® NWD izazvala je sero-odgovor u obje grupe. Obje grupe su razvile titre antitijela prema IBD, TRT i MD virusu.

U brojnim slučajevima opažene su određene razlike u titrima antitijela između grupa. Titri antitijela prema ND bili su viši u grupi 1 (pilići koji su se izlegli iz inokuliranih jaja), u svim slučajevima osim u 6. tjednu starosti. Titri antitijela na TRT isto tako su bili viši u grupi 1, u svim slučajevima, i ove razlike su statistički značajne, izuzev za razliku u 6. tjednu starosti. Sero-odgovor na MD bio je nešto usporeniji u grupi 1, ali je dostigao istu razinu kao u grupi 2 u 5. tjednu starosti. Nije opažena jasna razlika između grupa u srednjem titru antitijela za IB i IBD antigene.

U većini slučajeva, rezultati titracija koji su obavljeni sa BC, slijedili su istu shemu kao oni dobiveni sa AHS, s višim vrijednostima ELISA titara za IBD i TRT. Sero-odgovor na IBD, pokazan je BC testom u 3. tjednu starosti, što je jedan tjedan ranije nego što je pokazao test IDEXX. Čini se da je BC ELISA test osjetljiviji na mjerenje titara antitijela za ND, nego HI postupak. BC ELISA test je pokazao izraženiji odgovor na IB virus nego HI postupak, od starosti 3 tjedna, pa nadalje.

Cijepljenje in ovo komercijalnih jaja za proizvodnju brojlera, s jednom komercijalnom dozom Poulvac® TRT, Poulvac®Ovoline ND i Bursamune IN OVO, poslije 18 dana inkubacije, poslije koje slijedi cijepljenje sa Poulvac®IB Primer i Poulvac®HVT, u starosti od 1 dan, kompatibilno je u pogledu efikasnosti cijepljenja izleglih pilića s komercijalnim dozama Poulvac® TRT, Poulvac®NDW, Poulvac®IB Primer i Poulvac®Marek HVT lyo, 1. dana života, sa cijepljenjem sa Poulvac® Bursa Plus u starosti od 2 tjedna.

Kompleti BC ELISA testa su pogodni za mjerenje razine titra antitijela na ND, IB, IBD i TRT virusne antigene, u usporedbi s HI testovima na ND, IB M41 i IB D274, ili kompletima IDEXX testova na IBD ili TRT.

Tabele 26 do 35 pružaju dodatne rezultate za titar antitijela

Tabela 26. HI titri antitijela na ND virus, određeni u AHS

[image]

Tabela 27. HI titri antiteal na IB M41 antigen, određeni u AHS

[image]

Tabela 28. HI titri antitijela na IB D274, određeni u AHS

[image]

Tabela 29. Pojedinačni ELISA titri antitijela na IBD virus, odrđeni u AHS

[image] [image]

Tabela 30. Pojedinačni ELISA titri antitijela na TRT virus, određeni sa AHS

[image] [image]

Tabela 31. Pojedinačni FAT titri na MD virus, određeni sa CVL

[image] [image]

Tabela 32. Pojedinačni ELISA titri antitijela na ND virus, određeni sa BC

[image] [image]

Tabela 33. pojedinačni ELISA titri antitijela na IB virus, određeni sa BC

[image] [image]

Tabela 34. Pojedinačni ELISA titri antitijela na IBD virus, određeni sa BC

[image] [image]

Tabela 35. Pojedinačni ELISA titri antitijela TRT virusa, određeni sa BC

[image] [image]

Iako je ovaj gore opisani izum dan u značajnim detaljima, podnositelji prijave žele puni mogući opseg patentne zaštite, kako je definirana i određena patentnim zahtjevima koji se ovdje iznose, s pozivanjem na gornja izlaganja, ali bez ograničavanja bilo kojim opisanim primjerom, koja je u svakom slučaju konzistentna s najširim mogućim opsegom patentnih zahtjeva koji su u duhu i unutar opsega ove prijave.

Claims

1. Postupak za zaštitu peradi od TRT i/ili TRT ili SHS-srodnih respiratornih poremećaja, naznačen time, što se sastoji u ordiniranju cjepiva in ovo u oplođena jaja koja sadrže embrij peradi kao domaćina, pri čemu spomenuto cjepivo sadrži imunogeno-djelotvornu količinu živog, oslabljenog soja virusa purećeg rinotraheitisa, približno u opsegu od oko 103,2 TCID50 po jajetu, do oko 104,5TCID50 po jajetu, a spomenuto cjepivo se ordinira prije 24. dana inkubacije.

2. Postupak prema Zahtjevu 1, naznačen time, što se imunogeno-djelotvorna količina ordinira u pogodnom tekućem nosaču volumena približno 0,05 mL po jajetu.

3. Postupak prema Zahtjevu 2, naznačen time, što je imunogeno-djelotvorna količina oko 103,2 TCID50 po jajetu.

4. Postupak prema Zahtjevu 2, naznačen time, što je imunogeno-djelotvorna količina oko 104,2 TCID50 po jajetu.

5. Postupak prema Zahtjevu 1, naznačen time, što domaćina peradi predstavlja pureći ili pileći embrij.

6. Postupak prema Zahtjevu 5, naznačen time, što je spomenuto ordiniranje približno 18. dana inkubacije (pilići) ili približno 24. dana inkubacije (pure).

7. Postupak prema Zahtjevu 3, naznačen time, što domaćina peradi predstavlja ili pureći ili pileći embrij.

8. Postupak prema Zahtjevu 1, naznačen time, što domaćina peradi predstavlja pureći embrij.

9. Postupak prema Zahtjevu 1, naznačen time, što domaćina peradi predstavlja pileći embrij.

10. Postupak za zaštitu purića i pilića od izlaganja virulentnim sojevima virusa purećeg rinotraheitisa, naznačen time, što se ordinira in ovo u oplođena jaja cjepivo koje sadrži, računato po jajetu, imunogeno-djelotvornu količinu živog, avirulentnog soja virusa purećeg rinotraheitisa, pri čemu spomenuto ordiniranje dovodi do umanjenja postotka izleglih jaja, koji je manji od oko 2%.

11. Postupak prema Zahtjevu 10, naznačen time, što je imunogeno-djelotvorna količina približno unutar opsega od oko 103,2 TCID50 po jajetu, do oko 104,2 TCID50 po jajetu.

12. Cjepivo in ovo za zaštitu purića i/ili pilića od izlaganja virulentnom virusu purećeg rinotraheitisa, sadrži, računato po jajetu, puferiranu otopinu živog, oslabljenog soja virusa purećeg rinotraheitisa u imunogeno-djelotvornoj količini od oko 103,2 TCID50 do oko 104,2 TCID50.

13. Cjepivo prema Zahtjevu 11, naznačeno time, što je imunogeno-djelotvorna količina učinkovita nakon izlijeganja protiv izlaganja purića i/ili pilića virulentnom virusu purećeg rinotraheitisa, i ne izaziva suštinsko smanjenje postotka cijepljenih in ovo purećih i/ili pilećih jaja, koja se izlegu nakon isteka perioda inkubacije.

14. Cjepivo prema Zahtjevu 13, naznačena time, što je imunogeno-djelotvorna količina oko 104,2 TCID50.

15. Postupak inokulacije peradi protiv bolesti purećeg rinotraheitisa, naznačen time, što se sastoji u ordiniranju in ovo imunološki djelotvorne količine živog, oslabljenog soja virusa TRT u farmaceutski prihvatljivom tekućem nosaču, unutar opsega od najmanje oko 103,2 TCID50 po jajetu, do oko 104,2 TCID50 po jajetu.

16. Postupak prema Zahtjevu 15, naznačen time, što se sastoji u ordiniranju, zajedno sa spomenutom TRT, još najmanje jednog cjepiva koja se bira iz grupe koju čine cjepivo Newcastle bolesti i cjepivo infektivne bolesti burze.

17. Postupak prema Zahtjevu 16, naznačen time, što se sastoji u ordiniranju još najmanje jednog cjepiva koja se bira iz grupe koju čine cjepivo infektivnog bronhitisa i cjepivo Marek-ove bolesti, pri čemu se spomenuto cjepivo ordinira post-in ovo.

18. Postupak prema Zahtjevu 17, naznačen time, što se post-in ovo cjepivo ordinira približno prvog dana starosnog doba.

19. Postupak prema Zahtjevu 15, naznačen time, što ne dovodi do suštinskog smanjenja broja izleglih jaja.

20. Postupak prema Zahtjevu 15, naznačen time, što spomenuti postupak izaziva smanjenje postotka izleglih jaja za manje od oko 5%.

21. Postupak prema Zahtjevu 20, naznačen time, što spomenuti postupak izaziva smanjenje postotka izleglih jaja za manje od oko 1%.

22. Postupak za osiguravanje povećanih titara na TRT, naznačen time, što se sastoji u formuliranju cjepiva in ovo s oslabljenim antigenom TRTV, pa ordiniranjem spomenutog cjepiva, tako da se osigura da je TCID50 u opsegu od oko 103,2 do oko 104,5 po jajetu, u tekućem nosaču, volumena približno 0,05 do 0,1 mL po jajetu.