DK166905B1

DK166905B1 - Middel, der kan anvendes til passiv heterolog immunisering af et pattedyr

Info

Publication number: DK166905B1
Application number: DK053485A
Authority: DK
Inventors: Ralph J Stolle; Lee R Beck
Original assignee: Stolle Res & Dev
Priority date: 1984-02-07
Filing date: 1985-02-06
Publication date: 1993-08-02
Also published as: DE3504221C2; IE64365B1; IL74155A0; NZ211030A; JP2698778B2; DE3504221A1; CA1276884C; JPH08231424A; DK53485A; AU3829685A; EP0395120A3; JP2548115B2; EP0395120A2; JP2698779B2; US4748018A; JP2543633B2; EP0152270A3; DK227190D0; JPH08231426A; JPH04352729A

Description

i DK 166905 B1

Den foreliggende opfindelse angår et middel, der kan anvendes til passiv heterolog immunisering af et pattedyr mod en lidelse, der er forårsaget af et antigen.

5 Med et bovid menes i nærværende beskrivelse og krav et dyr af en bovin art.

Det er velkendt for fagfolk på immunologiområdet'at serumglo-bulinfraktioner, der består af forskellige antistoftyper, så-som IgA, IgM og IgG/kan anvendes til at bekæmpe de tilsvarende antigener, således at antigenernes skadelige virkninger neutraliseres . De forskellige antigener omfatter carcinogene bakterielle og virale arter og bioregulerende faktorer af vegetabilsk og animalsk oprindelse, såvel som toksiner og giftstoffer.

15

Ved udsættelse for et fremmedantigen vil et dyrs immunsystem normalt neutralisere antigenets bioregulerende og/eller skadelige virkninger. At et givet dyrs immunsystem udsættes for frem-medantigener kan enten ske naturligt eller værten kan udsættes for antigenet ved bevidst antigenindgift i form. af en vaccine.

Når dyr vaccineres med antigenisk stof, resulterer dette i et immunsvar, hvorved individet danner antistoffer. Denne proces betegnes almindeligvis som aktiv immunisering af værtsarten, som er blevet udsat for antigen. Antistofferne, som blev dannet af en given dyreart ved den aktive iramuniseringsproces, er homologe 2 5 antistoffer for den givne dyreart.

Det er velkendt at antistof, som er blevet dannet i en art, kan anvendes til at neutralisere virkningerne af det tilsvarende an-tigen i andre arter. Der forekommer passiv immunisering, når et individ fra en art får immunbeskyttelse fra antistoffer, der er dannet i et individ’ af en anden art. Denne proces kræver overførsel af antistoffer fra én donor til en modtager. Hvis donoren og modtageren er af den samme art, er antistofferne homologe. Hvis på den. anden side donoren og modtageren er af forskellige arter, 3 5 siges antistofferne at.være heterologe.

Selv om det er velkendt at passiv immunisering udgør en effektiv fremgangsmåde til forebyggelse og behandling af sygdom, er an- t vendeisen af passiv immunisering i human medicin begrænset på grund af at homologe humane antistofformuleringer ikke er almin- 2 DK 166905 B1 deligt til rådighed. Passiv immunisering af mennesker med heterologe antistoffer, der er dannet i en donordyreart, anvendes på den anden side kun i nødstilfælde, på grund af at anvendelsen af heterologe antistoffer kan være farlig. Eksempler på situa-5 tioner, hvor heterologe antistoffer anvendes til behandling af mennesker, omfatter anvendelsen af slangegift- og bistikantisera, som er fremstillet på heste. Disse antistoffer neutraliserer slange- og bitoksiner og fjerner og/eller formindsker skadevirkningerne deraf.

10

Passiv immunisering af mennesker med heterologe antistoffer er ikke sikker, på grund af at antistoffer af ikke human oprindelse er fremmede over for humanimmunsysternet. At udsætte modtagerens immunsystem for fremmeddonorantistofproteinet fremkalder en im-15 munreaktion i modtageren mod det fremmede antistof. Immunsvaret forårsager serumsyge, der kan føre til anafylaktisk chok og dødsfald. Til trods for den kendte og gunstige anvendelse af heterologe antistoffer anvendes denne behandlingsmetode derfor ikke almindeligt på grund af sikkerhedsforholdene.

20

Det er kendt, at domisticerede fuglearter, såsom høns, kalkuner og ænder,danner antistoffer i blodet og æggene mod faktorer, som forårsager fuglesygdomme, såvel som mod andre antigener. LeBacq-Verheyden, et al., Immunology, 27:683 (1974) og Nestle, G.A. et 25 al., J. Med., 130:1337 (1969) har f.eks. kvantitativt analyseret immunoglobuliner fra høns. Poison, A., et al., Immunological Communications, 9:495-514 (1980),immuniserede høner mod forskellige proteiner og naturlige blandinger af proteiner og påviste IgY-antistoffer i æggenes blommer. Fertel, R., et al., Biochemi-30 cal and Biophysical Research Communications, 102:1028-1033 (1981),immuniserede høner mod prostaglandiner og påviste antistoffer i æggeblommen. Jencenius, et al., Journal of Immunolo- -gical Methods, 46:363-368 (1981) angav en fremgangsmåde til i-solering af æggeblomme-IgG til anvendelse ved immunodiagnostik. 35 Poison, A., et al., Immunological Communications, 9:475-493 (1980),beskriver antistoffer, der er isoleret fra æggeblomme fra høner, som blev immuniseret med en række plantevira.

3 DK 166905 B1

Alle disse referencer angår imidlertid kun studier af fugle-immunoglobuliner produceret mod forskellige antigener, idet de ikke alle specielt påvirker eller fremkalder pattedyrssygdomme eller -lidelser. Som anført foreslår Polson (begge skrif-5 ter, 1980) eller Jencenius supra anvendelsen af fugleantistoffer i stedet for pattedyrsantistoffer som redskaber ved diagnostiske metoder. Polson, Immunilogical Communications, 475-493 (1980) /foreslår på side 491, at det kunne være muligt at beskytte nyudrugede kyllinger passivt mod sygdomme, som deres 10 mødre ikke har været udsat for,ved at injicere kyllingerne med blomme-IgY, der stammer fra høner, som blev hyperimmuniseret mod sygdommene. Dette forslag drejer sig,udover at det er spekulativt, ude lukkende om homogen passiv immunisering af en art med antistoffet opnået fra den samme art, omend et andet individ. 15

Jencenius, et al., Journal of Immunological Methods: 46, supra, angiver på side 67,at "man kan endog forestille sig , at ved at fremskaffe store mængder af pænt indpakket antistof, kunne æg fra passende immuniserede høns være nyttig og harmløs terapi 20 til nogle intestinalinfektioner, hvis der kan tages trin til at reducere antistofnedbrydningen med intestinale proteolytiske enzymer”. Forfatterne sammenligner dette med ideen om at behandle infektioner med mælk fra immuniserede dyr og citerer Camp-bel, et al.rs arbejde, Journal of Immune Milk, 1:3 (1964). For-25 slaget i Jencenius et al., er, som det direkte indrømmes, spekulativt. Det ledsages desuden af den advarsel, at antistoffet ville blive nedbrudt af intestinale proteolytiske enzymer.

Den fylogenetiske afstand mellem fugle og pattedyr har gjort 30 høns og andre domesticerede fugle til et ulogisk valg i forbindelse med fremstillingen af antistoffer mod pattedyrs sygdomme eller -lidelser. Det indlysende, valg af antistoffer til immunterapeutiske produkter, der er beregnede til behandlingen af pattedyrsarter,har været et andet pattedyr med et snævert bi-35 ogenetisk slægtskab. Det ville f.eks. ikke være logisk at behandle mennesker med hønseantistof indgivet i en parenteral dosisformulering, da hønseprotein er fremmed for humanimmun- DK 166905 B1 4 systemet og ville fremkalde allergiske reaktioner ved gentagen anvendelse.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til indgift af en heterolog lavantigenisk proteinformulering 5 til et individ under betingelser, som hindrer serumsyge eller anafylaktisk chok.

Opfindelsen angår således et middel, der kan anvendes til heterolog passiv immunisering af et pattedyr mod en lidelse, der er forårsaget af et antigen, hvilket middel er ejendommeligt 10 ved at det omfatter: a} et stof med en forøget antistoftiter mod antigenet opnået ud fra ægget fra en domesticeret fugl, der er blevet immuniseret mod antigenet, og b) et stof med en forøget antistoftiter mod antigenet 15 opnået ud fra mælken fra et bovid, der er blevet im_ muniseret mod antigenet, hvilket pattedyr har forudgående udvikling af immunsyStemtoie-rance ved forudgående fodring af pattedyret med midlet og hvilket middel ikke giver serumsygdom eller anafyls^isk chok hos det med midlet administrerede pattedyr.

20 Fra GB patentansøgning nr. 2.057.451 kendes et middel, ^er |<an anvendes til passiv heterolog immunisering af et pattedyr udvundet fra æg af høns, der er immuniseret med et antigen. Fra DK 166905 B1 5 EP patentansøgning nr. 74.240 og DK patentskrift nr. 87.610 kendes fremstilling af antistoffer ved immunisering af køer og udvinding af antistofferne fra mælken. I modsætning til de kendte midler indeholder midlet ifølge opfindelsen et hetero-5 logt antistof, som ikke fremkalder serumsyge eller anafylak-tisk chok, når de indgives til et dyr, der tidligere har indtaget midlet. Sædvanligvis udgør indgivelse af et heterologt antistof med henblik på passiv immunisering en fare, idet der er en immunreaktion mod antistoffet. I nærværende tilfælde har 10 det vist sig, at antistoffer i æg fra immuniserede høns og i mælk fra immuniserede køer kunne indgives til individer uden skadelige immunologe reaktioner. Dette skyldes antageligt, at tidligere indtagelse af mælk og æg giver en immunologisk tolerance hos disse individer. Det er således nu muligt at frem-15 stille mælk og æg, der indeholder ønskelige heterologe antistoffer og at indgive disse antistoffer for at tilvejebringe passiv immunisering uden skadelige bivirkninger. Antistofferne kan indgives på sikker måde til individer, som er gjort tolerante ved forudgående indtagelse af produkterne, dvs. mælk og/ 20 eller æg.

Den foreliggende opfindelse udgør således et middel, der indeholder et heterologt antistof, der kan anvendes til passiv immunisering af et pattedyr. De heterologe præparater kombineres ud fra to kilder, nemlig æg og mælk, når blot det pattedyr, 25 der indtager det kombinerede middel har immuntolerance over for begge kilder.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes også et middel, som omfatter: a) antistof, der er renset fra ægget fra en domesticeret fugl, der er blevet immuniseret mod et givet pattedyrs antigen, sammen med 30 DK 166905 B1 6 b) antistof, der er renset ud fra mælken fra et bovid, der er blevet immuniseret mod antigenet.

Et dyrs immunsystems manglende reaktion på fremmedprotein er en tilstand, der kendes som immunologisk tolerence. Det er des-5 uden velkendt for fagfolk på immunologiområdet, at pattedyr af en given art mangler tolerance over for antistoffer fra forskellige dyrearter, herunder andre pattedyrsarter. Det er derfor indlysende, at heterologe antistoffer , der stammer fra fremmede arter, ikke sikkert kan anvendes til behandlingen af pattedyr. Op-, 10 dageisen af den foreliggende opfindelse er en undtagelse fra dette almindeligt accepterede heterologe immunologisynspunkt. Det har vist sig, at et pattedyrs immunsystem kan bringes til at tåle heterologt antistof, der findes i serum eller ægprodukter fra domesticerede fugle. Denne tolerance optræder i pattedyrsindivi-15 der, som tidligere har indtaget et stof, som indeholder antistoffer fra den heterologe fugleart. Individer, som ikke har fortæret stof, som indeholder antistoffer fra heretologt domesticeret fugl, mangler tolerance over for det senere indgivne fugleantistof.

Det er således et væsentligt træk ved den foreliggende opfindel-20. se, at heterologt antistof, som stammer fra serum eller ægprodukter fra domesticeret fugl, og som er blevet specielt immuniseret mod forskellige antigener, kan indgives passivt til en pattedyrsart ved indgift ad oral, intraperitoneal eller parenteral vej (dvs. intravenøst eller intramusculært) uden at forår-25 sage serumsyge eller anafylaktiske reaktioner.

7 DK 166905 B1

Et andet væsentligt træk ved den foreliggende opfindelse er, at heterologt antistof, som er blevet opnået fra serum eller levnedsmiddelprodukter fra domesticeret bovid, og som er blevet specielt immuniseret mod forskellige antigener, kan ind-5 gives passivt til en pattedyrsart ved parenteral indgift uden at foretage serumsyge eller anafylaktiske reaktioner.

Som forklaret ovenfor, optræder immunsystemtolerancen, som er en nødvendig betingelse for heterolog antistofindgift, ikke 10 naturligt og skal opbygges i et pattedyrsindivid med tiden ved fortæring af et stof, som indeholder fugleantistoffer.

Ethvert pattedyr kan behandles med midlet ifølge den foreliggende opfindelse. Disse omfatter så-15 danne domesticerede pattedyrsarter som kaniner, køer, heste, geder, får og andre sådanne arter, der anvendes i husdyrbrug.

Ikke domesticerede dyr, såsom aber,kan også behandles. Endeligt kan opfindelsen anvendes til passiv heterolog immunisering af mennesker.

20

Ethvert antigen eller enhver kombination af antiger kan anvendes. Antigenet kan være bakterielt, viralt, cellulært eller ethvert andet stof, som en domesticeret fugls eller et domesticeret bovids immunsystem vil reagere på og som vil fremkalde en til-25 stand af immunfølsomhed i fuglen eller bovidet. Antigenerne er fortrinsvis de, som forårsager forskellige lidelser i pattedyrsarter, såsom mikroorganisme- eller virusfremkaldte infektioner, forgiftelsestilstande og lignende. Egnede eksempler på bakterielle antigener omfatter Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas malto-30 phiia, Streptococcus eguisimili, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis. Streptococcus bovis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Moraxella bovis, Actinobacillus lig-nieresi, Corynebacterium renale, Fusobacterium necrophorum,

Bacillus cerus, Salmonella dublin. Salmonella heidelberg-, Sal-35 monella paratyphi, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Aerobacter DK 166905 B1 8 aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae. Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Streptococcus viridans, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Streptococcus, Group B, Diploccoccus pneumoniae, Strep-5 tococcus mutans, Corynebacterium, Acne, typerne 1 og 3. <

Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus vaginalis, Group b, Streptococcus ecoli, Microplasma ho-minis, Hemophilus dycreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia, venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus, Brucella meliten-10 sis, Brucella suis. Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Actinobacillus eguuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus semi-15 nis. Mycoplasma bovigenitalium, Clostridium tetani og lignende.

Egnede virale antigener omfatter Equine herpes virus. Equine arteritis virus, IBR-IBP virus, BVD-MD virus, Herpes virus (humo-nis typer 1 og 2) og lignende.

20

Typiske polypeptider er proteiner,som påvirker pattedyr,for hvilke passiv immunisering er gavnlig. De omfatter bioregulerende faktorer, hormoner, enzymer, slangegifte, bigifte, toksiner og andreinsekt- og reptilgifte.

25

Med henblik på at fremkalde en tolerance over for fugle- eller bovidantistofprotein i et pattedyr gives et stof med en signifikant tolerancefremkaldende mængde antistoftiter mod antigenet, som blev opnået ud fra levnedsmiddelproduktet af en domesticeret 30 fugl eller domesticeret bovid, der er immuniseret mod antigenet, til pattedyret,indtil pattedyret udvikler en væsentlig tolerance over for antistoffet.-Dette sker normalt ved at give en diæt, der indeholder æg eller mælk, og som skal indtages på periodisk basis i et tidsrum fra.mindst ca. to uger til adskillige måneder. 35 For yngre dyr eller mennesker kan den minimale tidsperiode være så kort som 10-14 dage. For ældre dyr og mennesker kan den 9 DK 166905 B1 minimale tid, som kræves for at opnå tolerance,udgøre indtil flere måneder. Ved en foretrukket udførelsesform forøges anti-stoftiteren i materialet i forhold til normale koncentrationer deraf ved forudgående immunisering af fuglen.

5

Et pattedyrs immunsystems tolerance over for fugleantistof kan simpelt påvises ved den manglende forekomst af fremkaldt serumsyge eller anafylaktisk chock hos et sådant æg- eller mælkfor-tærende individ, når det injiceres med renset fugle- og bovid-10 antistof enten intravenøst eller intramuskulært ved gentagne lejligheder. Et sikkert tegn,på at der forekommer tolerance,er langsomt at forøge dosen af fugle- eller bovidantistoffet. Mangel på tolerance vil blive ledsaget af immunreaktioner i værten på injektionsstedet. Hvis dette sker,bør behandlingen afbrydes.

15 Hvis indgiften er oral,vil manglende tolerance fremkalde gastrointestinal lidelse.

Fuglematerialet, som gives til pattedyret,bør være normale æg eller kan have en forøget titer mod det givne antigen. Det kan 20 enten være hele æg eller dele deraf, såsom æggeblommen,hvor i der er tendens til at de fleste fugleantistoffer bliver koncentreret. Materialet bør desuden gives under sådanne betingelser, at fugleantistoffet, som findes i materialet,ikke har. mistet sin immunogene virkning, mere specielt at fugleantistoffet deri ikke må 25 være blevet denatureret. Hvis således æg gives til pattedyret, må det ikke have en form, hvori proteinet er blevet denatureret.

Det er kendt,at de fleste fugleæg indeholder antistoffer mod en vært af naturligt forekommende antigenpåvirkende domesticeret 30 fugl. I forbindelse med den foreliggende opfindelse kan sådanne æg gives til pattedyret for at fremkalde tolerance. På den anden side kan antistoftiteren i æggene, som gives til pattedyret, også være over den, der findes i naturligt forekommende antistoffer i æg fra domesticeret fugl. I sådanne tilfælde er anti-35 stofferne i de fleste tilfælde immunologisk reaktive med antigener, som forårsager lidelser, der er specifikke for pattedyr, DK 166905 B1 10 ikke fuglearten. Selv om de naturligt forekommende antistoffer, der findes i blommen fra ikke immuniseret domesticeret fugl, ikke har specificitet mod antigener, der forårsager lidelser i pattedyrsarten, tjener de ikke desto mindre til at fremkalde im-5 muntolerance.

Bovidmaterialet, der gives til pattedyret, bør være normal mælk eller kan have en forøget titer mod det givne antigen. Mælk bør gives under sådanne betingelser, at bovidantistof, der findes i 10 materialet,ikke har mistet dets immunogeniske virkning, nærmere bestemt bør bovidanstistoffet deri ikke være blevet denatureret.' Hvis således mælk gives til pattedyret bør mælken ikke være i en tilstand, hvor proteinet er blevet denatureret.

15 Med "forøget titer" er det hensigten,at man i den foreliggende tekst også skal forstå fugleantistoftiterkoncentrationer over for antigener, som er mindst 100% højere end de normale baggrundskoncentrationer af fugleantistoftitere mod det samme antigen.

20

Domesticeret fugl, der kan tjene som kilde for æg, omfatter høns, kalkuner, ænder, gæs og lignende. Høns foretrækkes især.

Boviddyr, som er ønskelige antistofkilder, omfatter dyr af 25 slægten Bos, fortrinsvis køer, får og geder. Køer foretrækkes især.

Når der først er blevet opnået tolerance i pattedyret, er dette klar til at modtage fugle- og bovidantistoffer med immunreak-. 30 tivitet over for et’givet antigen. Indgift af fugleantistoffer kan ske ad en lang række veje, men der anvendes fortrinsvis oral indgift eller parenteral-injektion, f.eks. ved intravenøs, in-traperitoneal eller intramuskulær injektion. Oral indgift af antistoffet kan også effektivt anvendes til behandlign af syg-35 domme i munden eller mave- og tarmkanalen. Den foretrukne fremgangsmåde til immunisering med bovidantistoffer er ved intramus- 11 UK Ibbyub Bl kulær eller intravenøs injektion i tilstrækkelig lang tid til at give effektiv behandling af den pågældende lidelse. Antistoffet indgives direkte eller kombineret med konventionelle farmaceutisk acceptable flydende eller faste bærere. Det heterolo-5 ge antistof indgives mest almindeligt ved parenteral injektion som en flydende formulering til et individ.

Immuntolerance, som forud er fremkaldt i individet på grund af indtagelse af æg, gør den passive immunisering sikker og effektiv 10 under anvendelse af fugle- og bovidantistoffer. Antistofferne renses fortrinsvis på i teknikken velkendt måde, f.eks. ved udfældning, ekstraktion, kromatografi, fraktionering og lignende. Ved "renset" skal der forstås et hvilken som helst fugle- eller bovidantistof/som er i alt væsentlig fri for andre muligvis immu-15 nogene protein- eller ikkeproteinkomponenter af fugle- eller bovidoprindelse. Sådanne komponenter kan omfatte, men er ikke begrænset til andre proteiner, f.eks. antistoffer, celler, cellulær fragmenter, membran fragmenter, lipider, nucleinsyrer, organeller og lignende.

20

Fugleantistoffet, der skal indgives til pattedyret efter udvikling af tolerance, kan fås fra æg fra den domesticerede fugl ·, " ' . Antistoffet indgives direkte som det er eller kombineret med en almindeligt 25 farmaceutisk acceptabel flydende eller fast bærer. Det er mest almindeligt, når det indgives ved parenteral injektion, at det indgives som en flydende formulering. Antistoffet kan også fremstilles i form af mikropartikler i et organisk matrixmateriale og derpå indsprøjtes direkte i et individ.

30

Indgift af antistoffet skal foregå med en mængde, som er immunologisk effektiv over for -en given lidelse hos pattedyret. Fagfolk på dette område kan f.eks.’let bestemme mængden af passivt administreret fugleantistof til et pattedyr, som er angrebet af en lidelse, er er forårsaget af 35 en given lidelse, sasom/et slangebid eller bistik eller andre insekt- eller reptilbid. Typiske passive immuniseringer af denne DK 166905 B1 12 type ligger i intervallet fra 0,25 mg/kg til 1,00 mg/kg pr. indgift. Varighed og intensitet af behandlingen vil afhænge af individets særlige lidelse. Det drejer sig ikke blot om lindrende behandlinger, såsom behandlingen af en given infektionssygdom eller forgiftningstilstand,men også om forebyggende behandlinger, 5 såsom cariesbekæmpelse. Typiske indgivelser til forebyggende be handling af infektionssygdomme vil udgøre fra ca. o,25 mg/kg til 1,00 mg/kg, fortrinsvis 0,5 mg/kg ~ 0,75 mg/kg.

Æg kan opnås fra et ikke-immuniseret fjerkræ og kan gives som 10 føde til et individ for at tilvejebringe immunologisk tolerancen over for ægkomponenterne. Æg kan også opnås fra et immuniseret fjerkræ og indgives som føde til et individ med en sådan immunologisk tolerance. Det fjerkræ, der leverer æggene, der indgives som føde til individet for at tilvjebringe tolerance 15 behøver ikke at være det samme fjerkræ, som er immuniseret og som giver de antistoffrie æg.

Det følgende er et eksempel på anvendelsen, som blev anvendt til at bringe en domesticeret fugl eller bovid i et 20 immunitetstilstand.

1) Antigen udvælgelse.

2) Sensibilisering af den domesticerede fugl eller bovidet ^ ved primær immunisering.

3) Undersøgelse af serum eller æg fra fuglen eller serum fra bovidet til bekræftelse af, at der er fremkaldt følsomhed.

30 4) . Indgift af boostere af passende dosis til fremkaldelse og opretholdelse af en antistofproducerende tilstand.

5) Undersøgelse.af antistofkoncentrationen i æggeblommen eller mælken.

3 5 6) Opsamling af æg fra fuglen eller mælk fra bovidet i den immuniserede tilstand.

Der vil nu blive givet særlige kommentarer vedrørende forskellige af disse trin.

DK 166905 B1 13 I trin 1 kan der anvendes et hvilket som helst antigen eller en hvilken som helst kombination af antigener. Antigenerne kan være bakterielle, virale, cellulære eller ethvert andet stof, som en fugls eller et bovids immunsystem vil reagere overfor. Det kri-5 tiske punkt i trin 1 er, at antigenet skal være i stand til at fremkalde en tilstand af immun følsomhed i dyret. Antigenet kan indgives ved hjælp af en hvilken som helst metode, som forårsager sensibilisering. Der anvendes fortrinsvis polyvalente antigener .

10 I trin 2 er den foretrukne immuniseringsmetode ved hjælp af in-tramuskulær injektion. Andre metoder, såsom intravenøs injektion, intraperitoneal injektion, oral indgift, rectal stikpilleindgift og lignende, kan imidlertid lige så vel anvendes, forudsat at an-15 vendeisen er tilstrækkelig til at fremkalde følsomhed. I virkeligheden er en foretrukket immuniseringsmetode en metode, hvor et antigenisk stof inkorporeres i en mikropartikel af et bionedbrydeligt og bioforligeligt matrixmateriale og indgives ved in-tramuskulær injektion i fuglen eller bovidet. Dosen er normalt 20 1x10^ til 1x10^ celler, fortrinsvis 10^ celler-10*^ celler og 8 særligt fordelagtigt 2x10 celler.

Trin 3 går ud på at bestemme, hvorvidt eller ej fuglen eller bovi-det er blevet følsom over for antigenet. Der findes en række me-25 toder, som kendes af fagfolk på immunologiområdet til undersøgelse for følsomhed (se Methods in Immunology and Immunochemistry, Willian, C.A,. WM Academic Press, London (Vol. 1-5) (1977)). Ek sempler på disse omfatter hudfølsomhedsprøver, serumprøver for nærværelsen af antistoffer til de stimulerende antigener og prø-30 ver, der er beregnet til at vurdere evnen for immune celler fra værten til at reagere på antigenet. Den anvendte type prøve vil i stor udstrækning afhænge af arten af det anvendte antigen.

Den foretrukne metode er at anvende en polyvalent vaccine, der består af multiple materialearter, som antigenet, og at prøve 35 for nærværelsen af agglutinerende antistoffer i serum fra fuglen eller bovidet før og efter påvirkning med vaccinen. Fore- DK 166905 B1 14 komsten af ægge- eller mælkeantistoffer efter immunisering med en vaccine er tegn på følsomhed, og ved dette punkt er det muligt at gå videre til trin 4. Den mindste dosis antigen, som er nødvendig for at fremkalde følsomhed, afhænger af 5 det anvendte antigen.

Trin 4 omfatter fremkaldelsen og opretholdelsen af det anti-stofpro ducerende stadium. Når en fugl eller et bovid først har vist sig at være blevet sensibiliteret, fremkaldes dette 10 stadium ved gentagne boosterindgifter af en passende dosis med bestemte tidsintervaller. Afstanden mellem indgivelserne afhænger af antigenets karakter. Et boosterinterval på to u-ger er optimalt for polyvalente antigener. Boosterindgifterne må ikke fremkalde en tilstand med immun tolerance. Dette ville 15 få fuglen eller bovidet til at gå fra en antistofproducerende tilstand til en tilstand med immun tolerance over for antigenet, i hvilket tilfælde dyret vil ophøre med at'producere antistoffet.

20 Det kan også f.eks. være muligt at anvende en kombinatién af forskellige immuniseringsmetoder , dvs. intramuskulær injektion til primær immunisering og intravenøs injektion til booster injektioner etc. Mange forskellige kombinationer af immuniseringsmetoder kan anvendes af fagfolk på dette område til 25 1) sensibilisering og 2) fremkaldelse af den antistofprodu cerende tilstand.

Trin 5 omfatter undersøgelse af levnedsmiddelproduktprøver fra det immuniserede dyr, medens dyret er i den antistofproducerende 30 tilstand, med henblik på at bestemme antistofkoncentrationen i levnedsmiddelproduktet. Antistofkoncentrationen kan bestemmes ved hjælp af velkendte radioimmunoprøve- og enzymbundne teknikker.

35 Trin 6 er opsamlingen af æg eller mælk fra det immuniserede dyr. Æggene kan anvendes på fortæringsstadiet ifølge opfindelsen, eller som kilde for det rensede antistof på indgiftstrinet ifølge opfindelsen.

DK 166905 B1 15 Når antistof/ der skal indgives i administrationsfasen, stammer fra fugl eller bovid, kan der anvendes venkendte isolerings- og rensningsmetoder.

Efter sterilisering af antistoffet ved filtrering gives patte-5 dyret ved hjælp af fremgangsmåder, der er tidligere beskrevet antistof, i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at give effektiv behandling for den pågældende lidelse. Injektionsstedet bør ikke svulme op eller vise andre tegn på en immunreaktion mod det injicerede antistof.

10 Madning/fodrings- og/eller indgiftstrinene gennemføres med en kombination af stoffer. Madning/fodring kan f.eks. foregå med et stof eller en blanding af et stof med en forøget antistofti ter mod et givet antigen og som er opnået fra æg af en dome-sticeret fugl, der er blevet immuniseret mod antigenet, samt 15 et stof med en forøget antistoftiter mod antigenet og som er opnået fra mælken fra et bovid, der er blevet immuniseret mod antigenet. (Vedrørende fremstillingen af immunmælk, der indeholder forøgede antistoftiterkoncentrationer kan der f.eks. henvises til Herinbach, US patentskrift 3.128.230 og Peterson US 20 patentskrift 3.376.198). Midler eller blandinger, som omfatter sådanne materialer, som er beskrevet ovenfor, falder også inden for den foreliggende opfindelses omfang.

Alternativt kan til pattedyret indgives en kombination af rensede antistoffer, hvor den ene komponent af et sådant mid-25 del er et antistof, som blev opnået fra en domesticeret fugl, der blev immuniseret mod et givet antigen, og den anden komponent er et antistof, som blev opnået fra et bovid·, der blev immuniseret mod et givet antigen.

Et middel, som omfatter en immunologisk effektiv mængde af en 30 kombination af antistoffer, et første således opnået antistof og evt. i alt væsentligt renset fra ægget fra en domesticeret fugl, der blev immuniseret mod et givet antigen, og et andet opnået antistof og evt. i alt væsentiligt renset fra mælken af et domesticeret bovid, som er blevet immuniseret mod antigenet.

DK 166905 B1 16

De beskrevne midler anvendes terapeutisk. Ved en udførelsesform kan dehydratiseret immunmælk og dehydratiseret immunæg-gemateriale blandes og anvendes i indgiftstrinet.

5 Efter denne almene beskrivelse af opfindelsen vil den lettere kunne forstås ved henvisning til visse specifikke eksempler.

10

Eksempel 1 15 Fremgangsmåderne, som blev anvendt til at immunisere høns til fremstilling af antistoffer i æggene, svarer til den, der blev anvendt til at immunisere pattedyr, og er velkendte for fagfolk på området. Den almindelige fremgangsmåde er at indgive vaccinen ved injektion i brystmusklen. En foretrukket metode er at 20 indgive 1-5 mg af antigenet i 1 cm^ saltvand. Injektionen gentages en gang om ugen i fire uger. Maksimale antistoftitere forekommer efter den fjerde injektion. Antistoftitere kan opretholdes ved at give boosterinjektioner af antigenet med en eller to ugers mellemrum.

25

Som et særligt eksempel blev der fremstillet en vaccine ud fra de i tabel I anførte bakteriearter.

Tabel I

30 ATCC nr.

1. Strep, mutans 27351 2. " " - 27352 3. " 27607 4. " ” 27947 35 5. " 31341 6. n " 31377 17 DK 166905 B1 0 1. American Type Culture Collection (ATCC) bakteriekulturen blev rekonstitueret med 15 ml medier og inkuberet natten over ved 37°C.

5 2. Efter opnåelse af god vækst blev omtrent halvdelen af bak teriesuspensionen anvendt til at pode en liter suppe, som blev inkuberet ved 37°C. Den resterende suspension blev overført til sterile glycerolrør og lagret ved -20°C i indtil seks måneder.

10 3. Efter at der blev konstateret god vækst i literkulturen, blev bakteriecellerne høstet ved centrifugering af suspensionen i tyve minutter ved 14.000 x til fjernelse af medierne. Bundfaldet blev suspenderet igen i sterilt saltvand og centrifugeret 15 tre gang til udvaskning af medierne fra cellerne. Efter den tredje centrifugering med saltvand blev bundfaldet suspenderet igen i en ringe mængde dobbeltdestilleret vand.

4. Den mediumfri bakteriesuspension blev varmedræbt ved anbrin-20 gelse i en glaskolbe i et 80° varmt vandbad natten over. En ringe mængde af de varmedræbte bakterier blev podet i en suppekultur til bestemmelse af vækstens levedygtighed. Bakterierne skal dræbes til anvendelse i vaccinen.

25 5. Varmedræbte bakterier blev lyofiliseret og lagret i sterile hætteglas ved -20°C.

6. Den blandede bakteriestamme blev anvendt til at immunisere 10 fuldtudviklede høner. Immuniseringsmetoden var som følger: 30 350 mg tørre bakterier blev blandet med en liter sterilt salt- 8 vand til en koncentration på 2,2 x 10 bakterieceller/ml saltvand (1,0 optiske densitetsaflæsning ved 660 nm). En milliliter af denne blanding blev to gange om ugen indsprøjtet i hønernes bryst.

Æg, der var opsamlet fra de immuniserede høner, blev forarbejdet 35 18 DK 166905 B1 rv

V

ved hjælp af de følgende trin til opnåelse af antistof fra æggeblommerne: 1. Æggeblommen blev skilt fra hviden og blommehinden 5 skåret igennem og fjernet. 200 ml blomme blev op- målt og fortyndet med 800 ml Tris-pufferet saltvand (TBS) TBS: Tris hydrcxyunethylaminomethan-pufferet saltvand: 0714MNaCl7 0 701M Tris HC17 pH7747 071%

NaN3· 10 2. Opløsningen blev omrørt langsomt ved stuetemperatur i tyve minutter. (Hele behandlingen blev gennemført ved stuetemperatur).

15 3. Blommesuspensionen blev centrifugeret ved 14.000 x ved 20°C i 30 minutter. Bundfaldet blev fjernet.

4. Et hundrede ml dextransulfat 10% (vægt/volumen) (Sigma) i TBS blev sat til supernatanten og omrørt 20 langsomt i fem minutter.

5. Tohundredeoghalvtreds ml 1M CaCl2 blev tilsat7 og opløsningen blev inkuberet i 30 minutter for at bevirke udfældning af overskydende dextransulfat.

25 6. Suspensionen blev centrifugeret og supernatanten henstillet til reserve. Bundfaldet blev vasket med 2000 ml TBS til ekstraktion af eventuelt medført protein.

De to supernatanter blev derefter forenet.

30 7. Supernatanterne blev dialyseret omhyggeligt mod af·’· ioniseret vand-til fjernelse af salt samt lyofilise-ret.

35 Ægantistoffet7 som blev opnået fra æg før og efter immunisering, blev omsat mod bakterievaccinen under anvendelse af en enzym- DK 166905 B1 19 bundet immunoprøvemetode til bestemmelse af nærværelsen i hønseæggene af antistoffer,som reagerer specifikt med S. mutans-bakterierne.

5 Resultaterne er vist i tabel II.

Tabel II

Høne Før immunisering Efter immunisering 10 nr. S. mutans stamme nr. S. metans stamme nr.

___1 2 3 4 5 6 7_1 2 3 4 5 6 7__ 1 _______ + + + + + + + 2 — — + + + + + + + 3 _______ + + + + + + + 12 4 _______ + + + + + + + 5 _______ + + + + + + + 6 _______ + + + + + + + 7 _______ + + + + + + + 8 ------- + + + + + + + 20 9 + + + + + + + 10 ------- + + + + + + +

Resultaterne fra dette forsøg viser, at høns, der er blevet im-25 muniseret mod faktorer, der forårsager sygdomme- i pattedyr, dvs. S. mutans, danner æg, som·indeholder antistoffer, der reagerer specifikt mod disse faktorer, og at æg, der er opnået ud fra ikke immuniserede høns, mangler de samme antistoffer.

30 Titerne af antistof mod S. mutans er mindst 100% større end baggrundstitrene fra ikke immune æg.

Eksempel 2 35 Fugleantistof, der stammer fra blommen i hønseæg, der er blevet immuniseret mod de i tabel I anførte bakteriestammer, blev ind- DK 166905 B1 20 0 givet til kaniner ved intramuskulær injektion. Fem mg af hønse- 3 blomme-IgG opløst i 1 cm fysiologisk saltvand blev injiceret i fem kaniners bagben. Injektionen blev gentaget 14 dage senere. Der blev opsamlet blodprøver fra kaninerne før og efter behand-5 lingen. Serum fra kaninprøveme blev omsat med hønseæggeblomme-IgG under anvendelse af Outcherlony-geldiffusionsmetoden til undersøgelse for nærværelsen af kaninantistof mod hønseægge-blomme-IgG. Nærværelsen af kaninantistof mod hønseæggeblomme-IgG gav immunologisk bevis for, at behandlingen forårsagede 10 immunologisk sensibilisering af kaninimmunsysternet mod hønse-IgG.

Resultaterne fra dette forsøg er vist i tabel III. Nærværelsen (+) eller fraværelsen (0) af antistof i kaninserum mod hønse-15 IgG før (uge 0) og efter behandling (uge 1, uge 2 og uge 3) .

Tabel III

Kanin nr. uge 0 uge 1 uge 2 uge 3 20 1 0 0 + + 2 0 0 + + 3 0 + + + 4 0 0 + + 25 5 0 + + +

Ingen af de fem kaniner havde antistoffer i deres blod mod hønse-IgG før behandlingen .Ved to ugers efterbehandling havde de fem kaniner høje antistoftitere i deres blod mod hønse-IgG. . 30 Dette forsøg viser, at behandling af kaninerne med hønse-IgG opnået fra immune høns forårsagede immunsensibilisering af kaninerne. Efterfølgende behandling af de fem kaniner, som havde positive titere, ved intravenøse injektioner af 5 mg af antistoffet forårsagede anafylaktisk reaktion og dødsfald hos alle fem 35 kaniner.

21 DK 166905 B1 o

Forsøget bekræftede således den moderne viden, at antistof, der er blevet opnået fra en fugleart, forårsager allergiske reaktioner, når det indgives ved gentagne injektioner til en pattedyrsart.

5

Et forsøg magen til det ovennævnte kaninforsøg blev gentaget.

I dette forsøg blev de fem kaniner fodret med fra immuniserede høns opnåede æg opløst i 50 cm i 30 på hinanden følgende dage før injektion af den identiske dosis antistof, der blev op-10 nået fra æg fra immuniserede høns. Resultaterne af dette forsøg er vist i tabel IV.

Nærværelsen (+) eller fraværelsen (0) af antistoffer i kaninserum mod æg IgG før (uge 0) og efter behandling (uge 1, uge 15 2 og uge 3).

Tabel IV

Kanin nr. uge 0 uge 1 uge 2 uge 3 20 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0

Ingen af de fem havde i deres blod antistof mod hønseæggeblommeantistof, hverken før eller efter behandling. Der var desuden ingen sygdomsvirkninger i disse kaniner, når hønseantistof, der 30 stammede fra immuniserede høns, blev indgivet ved intravenøs injektion. Disse forsøg·førte til den konklusion, at kaninernes orale indtagelse af immune hønseæg gjorde kaninerne tolerante over for immunhønse-IgG.

35 22 DK 166905 B1

Eksempel 3

Formålet med det foreliggende forsøg er at påvise, at behandlingen af et pattedyr med fugleantistof sandelig kan tje-5 ne et gavnligt formål. Til denne påvisning blev rotten valgt som et eksempel på en pattedyrsart og hønen som et eksempel på fugleantistofproducent. I Beck et al., US patent 4.324.782 blev der anvendt et rottemodel til påvisning af anvendeligheden af et antistof af pattedyrsoprindelse (komælk) til be- 10 kæmpe Ise af Streptococcus mutansinfektioner hos rotter. Formålet med det foreliggende forsøg er at påvise, at hønseæg-antistof har samme anvendelighed til behandlingen af de samme sygdomme som koantistof.

15 Til det foreliggende forsøg blev der anvendt en serotypestamme af Streptococcus mutans og tre grupper af kimfri forsøgsrotter {10 rotter/gruppe). Gruppe 1 blev fodret regelmæssigt med en ' cariogenisk diæt nr. 305, gruppe 2 blev fodret med diæt nr.

305 plus immunhønse-IgG, og gruppe 3 blev fodret med diæt nr.

OO

305 plus æggeblomme fra ikke-immuniserede høns. Gruppe 4 (se eksempel 6) blev fodret med diæt nr. 305 plus 1% af en lige stor mængde af immunægge-IgG og immunmælke-IgG. I dette forsøg blev rotter, der lige var vænnet fra (20 dage gamle), overført til et forsøgskammer, inficeret med virulent S. mutans, og gi-vet diæt ad libitum. Dyrene blev fjernet fra forsøget i en alder af 45 dage (samlet tid 25 dage). Ved forsøgets afslutning blev rotterne udtaget fra isolationen og vejet. Kæbekindtænderne blev udtaget og renset aseptisk. De blev straks anbragt i rør, som indeholdt phosphat-pufret saltvand (PBS), behandlet 30 ved lydbehandling, fortyndet og udpladet in duplo (tre forskellige fortyndinger) på blod og Mitis Salivarius (en bakterieart, der er almindeligt forekommende i munden). Resultaterne fra dette forsøg er vist i tabel V.

35 DK 166905 B1 co iT> cn

r*H

23 - Γ- Γ" o

i—H

O

Ό S . ΐ 5 3 y ,-Ι I— r\) ro ro ro ^ U3 n 2 h ~ X o ' X o - X o * X o CJrHrHrorHCOrH'-H'-l · wi £ - ~ -s ' c υ u s tt lo o o (ygjJO Γ- Γ-· VD D<cn

C 0 1? H ri r-H τ' o -Ti O Ή >n O

j-£-J B·—I ^ i If) f—I LD ^ 4J pi ø o > £ ^ ø o

x c o O C W -U

Q - - - ' - c C O O O 0

ro Q

•5Γ d E o o o o £ ~ r-H i—ϊ Q ** ** * *" ^t-!m

OD o O O O

Jj p H · *H

ω -H 2 Cm -P

mv U} CO ID T Γ0 N VD'T ro *P

•H O O * +1 *+!» - +1 * * +1 - W

Li L_- -<3· o *3* *—1 ro O N O 3 CO P

OL· G O X

π lo -q· ^ ro ro co -)->>i

> ej - -ri ' - +1 - * +1 » «· +i ·· 3 O C

<y | 1- O Γ' O t"· O"» c EX-H

θ' -η x N roro NO r>N ro - -h c

r r-4 O * H-l * «· +1 ·» ' +1 - - Ti * W OJ

i® 2j ^o^ono^o

^ C (1) > X

W 5 α Q

= gvo mo'S’cs ^ co τ , h CL) —i Q *· -H *· -+|s -.-I - *·+'* '

r-ia co o ^ o^r o in o ojcn-P

7- η P o « 5 " o λ n é 3 o o m W ·=? t" C0 LO ->3· IN "3· -3· Ή U ·3 c » " - - ή o o O H +1 O CM 4*1 O O r·« O C £

H+irH Η H * o C

co r-tro r-'a· γ» ro J-ι Ώ ή

y *p p p - ·· ρ -ρ ρ 0 X

CO -r' pH LO -Pi o ro -i o co -H o -(-1 ' - i—i i—1 i—I pH *pJ 0 0 O -3 Ό

U O

x co ro in in r» n lo π* ji.

C ρ ^ p p. -r! p - -. ^-r- o 0 E

ro o cn o τ ο·-ι σ ί-ίΕΟ

pH

-< te · p-' I >1 -1-1

r Eo ro o ro cm ro i-h lo · U

£ jol p p p p -: * -i LO X o o lo o ro o r~ o ro o o ~ \ ro Ή in 7. ' c '- · ·. p- p pj PPP3· *T coco CO EL· Ή

^p. p p p p p *rH i—i OJ

ro-^co+.o pH -pi o ro *1 o Ό E3

pH i—l pH -ro O

X. Ό ro coco coo o ro r- yp P p p p ΌΙΙ

ro -! O ΓΊ +' o lo -H pH -i O re 0 JO

pH pH pH jy > O

t -> * g U -o α 5

Ό O

m U E

0,-4. > tfo 3 0 .

CL, pH fM ro -σ- H > 3 11 U + O S3 DK 166905 B1 24

Den i tabellen angivne vægt er rotternes vægt før aflivning og fjernelse af tænder.

)

Diæten, som indeholdt hønse-IgG-antistof mod S. mutans /forårsagede en reduktion i både tallet for dentalcaries og tallet for dentalplaque (CFU). Fugleantistoffet (hønse-IgG), der blev opnået fra normale hønseæg, havde en ringere virkning 5 på tallene for caries og/eller plaque. Dette forsøg påviser anvendelsen af æg, som stammede fra høns, der blev immuniseret mod Streptococcus mutans ,til reduktion af dental caries og plaque i rottemodellen.

10 Eksempel 4

Renset igG, der blev opnået af komælk og serum ved hjælp af sædvanlige biokemiske metoder, blev steriliseret ved hjælp af Millipore filtrering. Tre mennesker , som plejede at drikke 15 mælk, blev i løbet af en periode på tre til fire måneder in- tramuskulært injiceret med steriliseret IgG antistof i en dosis varierende fra 5 til 100 mg IgG. Efter injektion var der ikke på nogen af injektionsstederne tegn på opsvulmning eller andre tegn på immunreaktioner. Serumprøver, som blev udtaget fra de 20 behandlede personer, gav desuden ingen tegn på serumsyge.

Eksempel 5

For at fremkalde en tilstand me.d antistoftolerance i en patte-25 dyrs art gav man til fire kaniner mælk i 90 dage plus foder og vand. De resterende fire kaniner fik kun foder og vand. Hver kanin, som fik mælk, fik 300 ml vand dagligt. Alle kaniner fik en 5 mg dosis af renset bovinmælk-IgG ved intramuskulær injektion i 90 dage efter forsøgets start. Blodprøver blev udtaget fra 30 ørevenen i hver kanin 1, 2 og 3 uger.efter injektion af bovin-IgG. Kaninernes immunreaktion mod bovin-IgG-antistoffet blev undersøgt ved anvendelse- af Ouchterlony-geldiffu s i ons teknikken, som påviste reaktionen af antistoffer i kaninernes sera mod bovin-IgG, som blev anvendt til at immunisere kaninerne. Re-35 sul taterne er vist i den efterfølgende tabel VI. En positiv reaktion, som viser antistoffer til bovin-IgG, blev set med 25 DK 166905 B1 0 seraene, som blev opnået fra alle fire kaniner, som ikke fik mælk. På den anden side var seraene, som blev opnået fra de fire kaniner, som fik mælk, negative.

s Immunologisk undersøgelse (Ouchterlony-geldiffusion).

For antistoffer mod bovin-IgG._

Gruppe I kaniner fik mælk i 90 dage før immunisering med bovin-IgG.

10

Gruppe II fik ingen mælk før immunisering med bovin-IgG.

Tabel VI

Antistof, der findes i

15 Gruppe nr. Kanin serum mod bovin-IgG

I A nej B nej C nej D Intet definitivt forsøgsre- 20 sultat (grænselinie) II A ja B ja C ja ' D ja 25

Eksempel 6

Fugleantistofvirkning i pattedyr kan forbedres ved samtidigt at indgive et antistof af pattedyrsoprindelse. Anvendelsen af 30 fugleantistof i kombination med komælkantistof er således mere virksom ved behandlingen af en infektion i et pattedyr end anvendelsen af fugleantistof alene.

Det normale interval for antistofkoncentration i en liter immunmælk er 0,05-1 g IgG. Tilsætningen af et æg til en liter mælk forøger den samlede antistoffaktor til 1-2 g.

35 DK 166905 B1 26

Idet der henvises til de forsøg, der er beskrevet i eksempel 3, behandledes en 4. gruppe med kost nr. 305 plus 0,05¾ immun-ægge-IgG og 0,05% immunmælke-IgG. Resultaterne er vist i tabel V, gruppe 4.

5 Kombinationen af hønse- og koantistof gav en større virkning end enten koantistof eller ægantistof alene.

Eksempel 7

Der er gennemført et 1aboratorieforsøg til at påvise synergis-me mellem bovint mælkeantistof og hønse-ægge-antistof. Der anvendtes en almindelig procedure, som anvendes af fagfolk inden for immunologien, til at karakterisere indvirkningen mellem et antistof og et antigen i form den enzymbundne i mmunbestemmel -se. Denne bestemmelse måler bindingsstyrken for antistoffet 15 til antigenet. En række fortyndinger af antistoffet omsættes med en fast mængde af antigenet. På denne måde kan der fastlægges en antistof/antigen-bindingskurve. Jo større antistoffets styrke er, jo mere kan antistoffet fortyndes og stadig binde antigenet. Bindingskurvens form er visende for titeren 20 og/eller affiniteten hos antistoffet til at binde antigenet. Det er velkendt for fagfolk, at hvis man fastlægger en bindingskurve for en specifik antistofformulering og derefter tilsætter en yderligere mængde af det samme antistof til hver af fortyndingerne, vil den resulterende kurve blive parallel 25 med den oprindelige kurve. Forskellen mellem de to kurver er proportional med forskellen i mængden af tilsat antistof. Med andre ord er antistofbindingen for forskellige koncentrationer af antistof parallelle og additive.

Ved nærværende forsøg immuniseredes malkekøer mod antigen 30

Streptococcus pyrogenes under anvendelse af de metoder, der er beskrevet tidligere. En serie fortyndinger af en sammenblandet prøve af mælk opnået fra immuniserede køer reageredes med en fast mængde af antigenet for at fastlægge en typisk antistof/ antigen-bindingskurve for mælkeantistofpræparatet. Ligeledes

Claims

2. Middel ifølge krav l, kendetegnet ved, at den domesticerede fugl er en høne og at bovidet er en ko.
3. Middel ifølge krav l, kendetegnet ved, at det omfatter stofferne fra æg og fra mælk i dehydratiseret form.
4. Middel, der er anvendeligt til heterolog passiv immunise ring af et pattedyr mod en lidelse, der er forårsaget af et antigen, kendetegnet ved, at det omfatter en forenet, effektiv mængde af: a) et antistof, der er blevet renset, fra en domesticeret 20 fugl, der er blevet immuniseret mod antigenet, og b) et antistof, der er blevet renset, fra et bovid, der er blevet immuniseret mod antigenet.
5. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den domesticerede fugl er en høne, og at bovidet er en ko.
6. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at fugleantistoffet er renset og stammer fra ægget fra en domesticeret fugl, og at bovidantistoffet er renset og stammer fra mælken fra et bovid.