DD240669C2

DD240669C2 - Verfahren zur herstellung von praeparaten zur biologischen kariesprophylaxe

Info

Publication number: DD240669C2
Application number: DD28039485A
Authority: DD
Inventors: Klaus Linde; Olaf Lehmann
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1985-09-06
Filing date: 1985-09-06
Publication date: 1987-11-18
Also published as: DD240669A1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Präparaten zur biologischen Kanesprophylaxe, welche bei lokaler bzw oraler Applikation von Konzentrationen, die eine meßbare Attachment Kompetition auslosen

- einerseits Str mutans aus dem Biotop verdrangen und damit kurzfristig die Karies unterbinden und

- andererseits, über den zeitweilig hohen „eine Monokolonisierung simulierenden" Antigenspiegel, die lokale durch Boosterung reaktivierbare Immunität stimulieren, wodurch die Kanesinzidenz signifikant reduziert wird

Charakteristik der bekannten technischen Losungen

Karies ist eine durch Ernahrungsgewohnheiten manifest werdende Infektionskrankheit Die durch mehrere Serotypen insbesondere von Str mutans verursachten Zerstörungen am Zahnschmelz betreffen das Milchgebiß (mit Nachfolgeschaden bei der Dention) und die permanenten Zahne des Adulten mit einem Maximum zwischen dem 10 und 20. Lebensjahr (LEHNER, Bnt dental J 149, [1980], 318-325)

Mutans Streptokokken verankern sich (Attachment) offensichtlich mit Hilfe von Proteinrezeptoren (VAN HOUTE, in Dental Plaque and Surface Interactions in the Oral Cavity, IRL Press Ltd , [1980], 69-100, McGHEE u MICHALEK Ann Rev Microbiol 35 [1981], 595-638, GIBBONS, J Dent Res 63, [1984], 378-385) an komplementären Strukturen von Glykoproteinen, welche sich aus Speichel dem Zahnschmelz auflagern

Andere Publikationen sehen in Glucanen bzw Lipoteichonsauren das Attachmentpnnzip Insgesamt ist jedoch von den zur irreversiblen Keim und Plaqueverankerung fuhrenden molekularen Vorgangen wenig bekannt, eine wichtige Rolle soll die feste Bindung der Glucosyltransferase (GTF) an Glucan (FIGURES u EDWARDS, Carbohydr Res 88 [1981], 107-117, KOGA u INOUE, Infect & Immun 19, [1978], 402-410, HAMADA et al J Dent Res 63, [1984], 407-411, TSUMORI et al Microbiol Immunol 26, [1982], 677-688, STINSON et al Infect Immun 32, [1981], 583-591) und Kokken sowie die Adharenz des Glucan an den Erregerund Schmelz spielen Die nunmehr am Zahnschmelz haftenden und zur Mikrokolonie auswachsenden Kokken synthetisieren aus Saccharose mit Hilfe hauptsächlich der (evtl Plasmid codierten (ELWELL, Ann Rev Microbiol 34, [1980] 465-496) GTF ein hochverzweigtes Glucan (Mutan) Polymer, welches als Plaque dem Zahnschmelz aufliegt (McGHEE u MICHALEK, Ann Rev Microbiol 35 [1981], 595-638) und von weiteren zuckerspaltenden Mundhohlenkeimen besiedelt wird Diese Plaqueflora verursacht durch Kohlenhydratabbau eine im Plaquebereich wirksam werdende Senkung der H* lonenkonzentration unterhalb des kritischen Schwellenwertes von pH 5,5 welcher zur Entminerahsierung des Schmelzes fuhrt Demzufolge korreliert die quantitative Bildung unlöslicher Glucane mit der kanogenen Aktivität bzw Virulenz der verschiedenen Str mutans Stamme (MICHALEK et al Proc Soc Exp Biol Med 150, [1975], 498-502) Derzeit diskutierte bzw praxiswirksame Kanesprophylaxe

- Saccharosearme bzw freie Ernährung Eine solche Prophylaxe scheitert an unseren Ernahrungsnormen

- Zahnpflegemittel mit Plaque-auflosenden Enzymen (DE 3 248 541, DT 2 265 327) oder dem baktenel ι Zellwande bzw deren Mureingerust spaltenden Lysozym (DE 2 852 792)

- Fluoridierung des Trinkwassers bzw Nahrung oder/und lokale Applikation von Fluor (Übersicht HOROWITZ, Bnt dental J 149 [1980] 311-318) Diese Prophylaxe bedingt eine Remineralisierung des Schmelzes (außerdem steht eine sich im Grenzbereich zur Enzymhemmung akkumulierende Fluoranreicherung im Plaque zur Diskussion (MARQUIS J dental Res 56, [1977], 6, 704) Die Leistungsgrenze dieser Prophylaxe liegt bei etwa 40% Kariesreduktion

- Vorwiegend tierexperimentelle Studien zur Immunprophylaxe, um über eine durch sekretorische Antikörper bedingte Attachmentblockade· (BROWN et al J dental Res 57, [1978], 882-893, MICHALEK et al Infect & Immun 19, [1978], 217-224), oder/und GTF Hemmung die Plaquebildung zu unterbinden

• Parenterale Applikation von inaktivierten Mutans Streptokokken bedingt eine nachweisbare lokale Immunantwort und Kariessenkung (OE Patentschrift Nr 320 848, LINZER et al Infect & Immun 31, [1981], 345-351, CALDWELL, J Med Microbiol

* Neben Attachment blockierenden spezifischen und unwirksamen s IGA anderer Spezifitat kommen im Speichel weitere die Anheftung (fordernde und) hemmende Komponenten vor (GAHNBERG et al. Infect & Immun. 37,(1982],401—406), wie z.B. daß das Wachstum-hemmende Lactofernn (ARNOLD et al Infect & Immun 28 [1980) 893-898)

10, [1977], 213-224) In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, daß bei Immunisierung mit lebenden Keimen andere Antikorperspektren auftreten (BRATHALL u PETTERSON J dental Res 55, [1976], 60-64)

• Immunisierung mit dem Enzym GTF vermittelt eine Serotyp-unabhangige Schutzwirkung gegen Kanesbefall (SMITH et al Infect & Immun 37, [1982], 656-661, TAUBMAN, United States Patent [19], 4, 150, 116, Apr 17 1979 McGHEEu MICHALEK Ann Rev Microbiol 35 [1981], 595-638)

• Orale Immunisierung mit Vollkeimen oder/und im Kulturuberstand stimuliert lokal - bzw über ,homing', d h durch Einwanderung von s IgA bildenden Zellen aus der Peyerschen Plaques in Speichel- etc. -Drusen (MONTGOMERY et al. in McGHEE et al Proceedings of the International Symposium on the Secretory Immune System and Caries Immunity, Plenum Press, New York and London 1978 ρ 113-122, HANSON et al ebenda ρ 165-176, MONTGOMERY et al ebenda ρ 113-122, LEHTONEN et al Infect Immun 43, [1984], 308-313) - im Oralbereich protektive sekretorische Antikörper wobei nach Boosterung eine rasche und hohe IgA-Synthese eintritt (McGHEE u MICHALEK, Ann Rev Microbiol 35 [1981], 505-638, LINZER et al Infect & Immun 31, [1981], 345-351, MESTECKY et al J elin Invest 61, [1978], 731-737, McGHEE et al in Mc GHEE et al Procedings of the International Symposium on the Secretory Immune System and Canes Immunity, Plenum Press, New York and London 1978 ρ 177-184)

• Neuerdings wird als Immunogen eine „Ribosomen-Praparation" (EVERHART et al Med Microbiol Immunol 172 [1984], 215-222) vorgestellt, welche als Antigen mit den Seren von allen Str mutans Serotypen reagiert Von dieser „Ribosomen Vaccine' erwarten die Autoren dreierlei

- Eine alle Serotypen erfassende Karies-protektive Wirkung (wobei u a übersehen wird, daß im Zellinnern liegende Antigene fur eine Antikörper vermittelte Attachmentblockade keine Rolle spielen)

- Keine Bildung von kreuzreagierenden Antikörpern gegen humanes Herz und Muskelgewebe

- Keine Bildung von Antikörpern gegen Lipoteichonsauren grampositiver Bakterien, wodurch evtl unerwünschte immunologische Reaktionen auftreten können Interessant ist der Hinweis, daß der Titer humoraler Prazipitine gegen Teichonsauren oraler Bakterien - als Ausdruck der von der Normalflora ausgehenden permanenten Immunstimulation - mit einer zumindest nicht erhöhten bis signifikanten verminderten Kanesanfalligkeit korreliert (LEVINE et al Arch oral Biol 29, [1984], 191-194)

Diese bisher noch nicht zur Praxisrelevanz entwickelte aktive Immunprophylaxe fuhrt im Prinzip nur zu einer Erhöhung bzw zeitlichen Vorverlegung* der natürlichen lokalen Grundimmunitat, welche ζ B beim Menschen durch > 10"/Tag verschluckte Mundhohlenkeime stimuliert wird (Mc GHEE u MICHALEK, Ann Rev Microbiol 35 [1981], 595-638) und vermutlich die mit zunehmendem Alter abnehmende Kariesinzidenz bedingt Diese korreliert mit der Beobachtung, daß sich Menschen mit geringer von solchen mit hoher Kanesanfalligkeit durch ihren erhöhten Antigen-spezifischen IgA im Speichel unterscheiden (LEHTONEN et al Infect Immun 43, [1984], 308-313, CLANCY u BIENENSTOCK, in Ferguson et al Immunological aspects of the liver and gastrointestinal tract pp 121-152, Baltimore, Univ Park Press, 1976, Mc NABB, Ann Rev Microbiol 35, [1981], 477-496, LAMM, Advances Immunol 22, [1976], 223-290, MESTECKI et al J CIm Invest 61, [1978], 731-737) Die beim Versuchstier gefundene Immunantwort gegen ein kolonisierendes Antigen (FITZGERALD u BIRDSELL, J pendontal Res 17, [1982], 237-246) gilt somit sinngemäß auch fur den kolonisierenden - oder zusatzlich in hohen Dosen verabreichten - Str .mutans beim Menschen Schwierig bzw nur mit Vorsicht interpretierbar ist in diesem Zusammenhang der mitgeteilte Befund (MICHALEK et al Infect & Immun 19, [1978], 217-224), daß bei Ratten 10⁷ und 10⁸ Formalin-inaktivierte Str mutans CFU/Gramm Futter einen signifikanten S-IgA Titer auslosen, jedoch 10⁹/CFU des gleichen Antigens offenbar zu keiner Immunantwort im Speichel fuhren Die momentanen Schwerpunkte in der mikrobiologischen Kariesforschung bzw Prophylaxe (Abstracts of Papers 62^nd General Session International Association for Dental Research, March 15-18, 1984 in J. Dental Research 63, [1984], Special Issue), orientieren auf

- Imputations (Kolonisierung) Versuche am Tiermodell mit nichtkariogenen Streptokokkenstammen zwecks kompetetiver Verdrängung von Str mutans im Biotop und dem Ziel Senkung der Karieshaufigkeit (In diesem Sinn lassen sich auch die Untersuchungen zur Ansiedlung von definierten Str mutans bzw sanguis Stammen in der Mundhohle interpretieren (SVANBERG et al Infect Immun 43, [1984], 817-821, WESTERGREN u SVANBERG Arch Oral Biol 28, [1983], 729-733)}

- Untersuchungen zur Korrelation zwischen dem Titer Antigen-spezifischer sekretorischer IgA im Speichel und der Kanesanfalligkeit des Menschen, inclusive von entsprechenden Immunisierungsversuchen bei Ratten Dieser Gesetzmäßigkeit wird die Patentschrift (DE 3 427 477) gerecht, welche den Zusatz von - durch Immunisierung von Tieren hergestellten Antikörpern gegen die sauren Glykoproteine der Str mutans Zelloberflache zu Zahnpflegemitteln vorschlagt

- Studien über das Substrat des Attachments, wobei die mitgeteilten Daten auf Proteine bzw Glykoproteine (Fussy coat) hinweisen

Der Objektivität halber soll erwähnt werden, daß bei parenteral hyperimmunisierten Kaninchen humorale Antikörper mit Kreuzreaktivitat zum Herzgewebe gefunden wurden (FERRETTI et al Infect & Immun 30, [1980], 69-73), jedoch andererseits solche Tiere weniger anfällig waren fur eine experimentell auszulosende Streptokokken-Endocarditis (McGHEE u MICHALEK, Ann Rev Microbiol 35, [1981], 595-638)

Des weiteren finden sich Angaben (HUGHPS et al Infect Immun 27, [1980], 576-588, VAN DE RIGN et al J Dent Res 55, [1976], 59-14, STINSON et al Infect Immun 27, [1980], 604-613), wobei nach Immunisierung des Menschen mit Str mutans Vollkeim-Vaccinen mit Herz und Muskelgewebe kreuzreagierende Antikörper auftreten können In diesem Zusammenhang ist der Hinweis notwendig, daß das gesetzmäßige Auftreten humoraler Antikörper gegen oral zugefuhrte bzw kolonisierende Antigene (u a PIERCE, J exper Med 148, [1978], 195-205 CUSHING, Develop Biol Standard VoI 53, pp 107-111) nicht als klinisch bedenklich einzustufen ist, da etwa 70% aller Jugendlichen im Serum Antikörper gegen Milcheiweiß besitzen (zitiert in ROTHBERG et al J Immunol 98, [1967], 386-395)

Wurde man den Gedanken „mögliche Nebenwirkungen" mit aller Konsequenz verfolgen, durfte dies zu einer Infragestellung letztlich jeglicher Therapie bzw Immunprophylaxe fuhren

Beispielsweise

- fuhren Penicillingaben stets zu einer Resorption von großen Mengen der biologisch vielschichtig wirksamen Peptidoglycane aus grampositiven Kokken (PARK et al Infect. Immun 43, [1984], 139-142)

* Vergleichbare Verhaltnisse werden bei den Meningokokken, Pneumokokken und Hamophilus influenzae Polysaccarid Impfstoffen angetroffen, die protektive Titer ab Ende 2 Lebensjahr induzieren Ungeimpfte Populationen erwerben solche Titer erst mit dem 5 Lebensjahr über mapparente Infektionen bzw Kolonisierung (Linde et al Zschr arztl Fortbild 75 [1981] 669-674)

vermitteln Virusimpfungen in Einzelfallen die allergische Reaktionsbereitschaft fur eine spatere naturliche Infektion (KARZON, in Human Immunity to Viruses Symp on Human Immune Responses to Viruses Recent Developments, ed Orlando, F A, Academic Press 1983, ρ 111-130)

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, etn Verfahren zur Herstellung solcher Präparate zur biologischen Kariesprophylaxe zu entwickeln, die ohne die Forderung nach unrealistischen Ernahrungsgewohnheiten eine hohe Effektivität in der Kanesprophylaxe besitzen und schon im Kindes und Jugendalter zu einer Immunitat fuhren, wodurch sich bei konsequenter Anwendung ein hoher gesundheitspolitischer und ökonomischer Nutzen ergibt

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Präparaten zur biologischen Kanesprophylaxe zu schaffen, in dessen Resultat Präparate entstehen, welche geeignet sind, eine lokale Immunisierung gegen Karies herbeizufuhren durch lokale bzw orale Applikation dieser Präparate in Konzentrationen, die eine Monokolonialisierung simulieren (Verdrängung von Str mutans aus dem Biotop) und daher das immunologische switch on auslosen Erfmdungsgemaß werden dazu Streptokokkus mutans Wildstamme bzw GTF Mutanten eingesetzt Es wurde gefunden, daß eine verbesserte Kanesprophylaxe durch temporare Applikation von und zeitweilige Boosterung mit attachmentaktiven inaktivierten Streptokokkus mutans Praparationen oder der lebenden GTF Mutanten in Konzentrationen erreicht wird, welche zu einer kompetetiven Verdrängung (simulierte ein immunologisches switch on auslosende Monokolonisierung) der Str mutans Wildstammpopulation im Biotop fuhren

Das erfindungsgemaße Verfahren ist durch die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet Streptokokkus mutans Wildstamme bzw GTF Mutanten werden mittels an sich bekannter, eine hohe Ausbeute garantierender Verfahren in Massenkultur vermehrt Das so gewonnene Bakterienmatenal wird als resuspendiertes Sediment oder als Milchpraparat entweder

- mit an sich bekannten Verfahren in der Weise schonend inaktiviert, daß die Attachmentaktivitat nicht beeinträchtigt wird, oder

- das Attachmentprinzip aus Erreger und/oder Kulturuberstand extrahiert oder

- die GTF Mutante als Lebendantigen belassen

Es wird ein fur die lokale bzw orale Applikation oder Immunisierung attachmentaktives Präparat erhalten Dieses ist erforderlichenfalls zu konzentrieren Anschließend wird es in fur die Applikation bzw Immunisierung zweckmäßigen Formen mittels an sich bekannter Techniken weiterverarbeitet

Das fur die lokale bzw orale Applikation oder Immunisierung erhaltene Präparat wird in vorteilhafter Weise in solchen Konzentrationen angewendet, bis die Mutans-Streptokokken der Mundhohle über eine Attachment Kompetitton aus dem Biotop verdrangt werden und als Folge dieser „simulierten Monokolonialisierung" ein immunologisches switch on eintritt Das erhaltene und entsprechend konzentrierte Präparat wird weiter dadurch charakterisiert, daß es in einer Grundimmunisierung sowie in zeitlichen Abstanden als Boosterung verabreicht wird Die Grundimmunisierung kann etwa 4 Wochen betragen Daran schließen sich in turnusmäßigen Abstanden die Boosterungen an Beispielsweise konnen diese in 2 bis 4 Wochen Abstand über jeweils einen Tag erfolgen Zur lokalen bzw oralen Applikation wird das Präparat in Form von Zahnpflegemitteln, Gelen, Bonbons, Milchpraparaten usw zubereitet

Die Vermehrung durch Massenkultur erfolgt zweckmaßigerweise dadurch, daß wahrend der Inkubation auf pH neutral korregiert wird Ebenso ist es zweckmäßig, bei Vollkeim Präparaten aus Str mutans Wildstammen die schonende Inaktivierung ζ B bei 56⁰C oder mittels 0,35% Formalin vorzunehmen

Die mit dem erfindungsgemaßen Verfahren hergestellten Präparate sichern eine hohe Effektivität in der Kariesprophylaxe durch eine Vorverlegung der mit zunehmenden (Erwachsenen )Alter sich naturlich entwickelnden - mehr oder weniger protektiven Immunitat gegen Karies in das Kindes und Jugendalter Hierbei wird von folgender

Konzeption zur biologischen Kanesprophylaxe

ausgegangen

Die Standortflora der Schleimhäute, bzw die in dieses Biotop eindringenden pathogenen Erreger, verankern sich spezifisch vermittels spezieller Oberflachenstrukturen an Rezeptoren der Wirtsoberflache, wodurch ihre Ausverdunnung durch den Saftestrom verhindert und die nachfolgende Vermehrung zur Mikrokolonie (Kolonisierung) möglich wird Beispiele hierfür sind die Kolonisationsfaktorenantigene bzw Fimbrien (Plasmid oder/und chromosomal codiert) der Enterobacteriaceae, Pihstrukturen der Gonokokken, etc., etc. (ELWELL, Ann. Rev. Microbiol. 34,[198O]) 465-496, BARON u. SAZ, J. Bacteriol. 133, [1978],972-986; RABSCH et al Adhasme bei gramnegativen Bakterien, Sonderheft der Tierhygiene Information 17, [1985], ISSN 0138 1881) Vereinzelte direkte und indirekte Hinweise über die prophylaktische oder therapeutische Wirksamkeit einer^'js heutiger Sicht auf Attachment-Kompetit'on beruhender Substitutionsbehandlung u a mit Colikeimen, tauchen seit etwa 50 Jahren immer wieder in der Literatur auf Die wissenschaftliche Anerkennung eines solchen auf Attachment-Kompetition und Biotopausfullung mit apathogenen „Normalflora" Keimen beruhenden Wirkungsprinzips scheiterte bislang an einer nicht reproduzierbaren (ζ Β > 50% der Enterobactenaceae-Flora ausmachenden) „Monokolonisierung" durch solche „Substitutionsstamme" oder daran, daß durch quantitativ zu geringe Antigenmengen keine signifikante Attachment Kompetition resultiert Therapeutisch oder prophylaktisch relevante Attachment Kompetitionen implizieren jedoch Antigenkonzentrationen, welche einer unphysiologischen Monokolonisierung entsprechen und daher eine lokale Immunantwort zur Folge haben (Schroder et al unveröffentlicht)

Solche Verhaltnisse im Biotop sind etwa vergleichbar mit dem traveller disease durch enterotoxische CoIi Der empfängliche Wirt besitzt gegen den fur ihn bislang unbekannten Erreger keine spezifische lokale Abwehr, so daß es zu einer - mit entsprechenden klinischen Symptomen einhergehenden - de facto (Enterobacteriaceae) Monokolonisierung kommt Die hierbei auftretenden, einen kritischen Schwellenwert überschreitenden Antigenkonzentrationen stimulieren nunmehr eine meßbare lokale Immunitat (welche die apparente Infektion beendet)

Aus molekularbiologischer Sicht ist - innerhalb des komplexen Pathomechanismus der Kanesinfektion - das Attachment der Mutans Streptokokken an die Schmelzoberflache von essentieller Bedeutung Speziell der an die GTF Mutante hinsichtlich Kolonisierung und Kariesprevention (DE STOPPELAAR Arch Oral Biol 16 [1971], 791-975) über ,Attachment Verdrängung gestellten aber nicht erfüllten Erwartungen ist zu sagen daß als Folge von nicht mit letzter Konsequenz, bezuglich der quantitativen Aspekte der Attachmentblockade mit nachfolgender Stimulierung der lokalen Immunitat durchdachten und ausgewerteten Versuche weiterfuhrende Experimente entfielen

Gleichermaßen überraschender Weise wie folgerichtig haben wir gefunden daß eine quantitative Aspekte berücksichtigende simulierte ,Monokolonisierung' unter Verwendung eines schonend inaktivierten Attachmentaktiven Str mutans Antigens kompetetiv mit dem Attachment der Str mutans Wildstammpopulation am Zahnschmelz interferiert und nachfolgend eine lokale Immunitat erkennbar ζ B am Rattenmodell durch fehlenden Nachweis von Str mutans im Biotop Plaquereduktion und Kariesprevention wahrend der vierwochigen Antigengabe sowie dem Fortbestehen der Kariesresistenz ,nach Abschluß dieser oralen Immunisierungsperiode' bei zeitweiliger Boosterung

Entsprechend unserer Konzeption wird unter Verwendung von schonend inaktivierten Antigen (zu einem spateren Zeitpunkt ware evtl eine aktive kolonisierende GTF Mutante [mögliche Losung des Problems „reproduzierbare Kolonisierung' mit einer GTF Mutante u a siehe DD 218 834 Verfahren zur Herstellung von Bakterienmutanten mit veränderten Leistungsparametern] anzustreben) kompetetiv die Str mutans Wildstamm Population aus dem Attachmentsites verdrangt und damit im kurzfristigen Rattenexperiment die Plaquebildung beeinflußt bzw die Kariesentstehung* unterbunden Gleichzeitig wird als Folge der oraien Immunisierung mit hohen Antigengaben - welche den kritischen Schwellenwert zur Auslosung immunologischer Reaktivität überschreiten - die Prävention über Attachmentsite Verdrängung zunehmend durch sekretorische IgA vermittelte immunologische Parameter der Attachmentblockade abgelost

" Unter dem Blickwinkel einer biologischen Kariesprophylaxe waren ζ B auch Versuche mit kolonisierenden Veillonellen Mutanten als natürlicher Symbiont zu diskutieren da diese Keime über einen verstärkten Milchsäure Abbau die Kanesanfalligkeit senken können (VAN DER HOEVEN et al Caries Res 12 [1978] 142-147)

Ausfuhrungsbeispiele

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausfuhrungsbeispielen erläutert A Karies Ratten Modell

Haltung der Tiere und Auswertung der Versuche

a) Zu Beginn der Versuchsserie waren die OSBORNE MENDEL Ratten nicht alter als 21 Tage Jedes Tier erhielt täglich 15 g Futter" sowie Aqua dest ad libitum Die Tiere wurden vormittags gefuttert Die durchschnittliche Gewichtszunahme pro Tier betrug innerhalb des Versuchszeitraumes 70 Gramm

b) Die Auswertung der Fissurenkaries erfolgte nach dem modifizierten Schema von KÖNIG (Möglichkeiten der Kariesprophylaxe beim Menschen und ihre Untersuchung im kurzfristigen Rattenexpenment, Hans Huber Verlag, Bern 1966) welches den Befall der Fissuren in 4 Schweregraden einteilt'

Grad A (1) Farbreaktion auf dem Schmelz beschrankt bei intakter Schmelzoberflache und nicht angefärbter Schmelz Dentin Grenze

Grad T (2) Farbreaktion bis zur Schmelz Dentin Grenze Grad B (3) Farbreaktion an und jenseits der Schmelz Dentin Grenze beginnende Dentinbeteiligung und geringe Ausbreitung

in die Tiefe und nach okklusal Grad C (4) intensive Dentinfarbung okklusalwarts und pulpawarts, d h fortgeschrittene Karies mit beginnender Abhebung des Schmelzes und beginnende Kavitation

Beurteilt wurden 5 Fissuren (1 und 2 Molar), und fur jede Fissur die Anzahl der total durchlaufenen Stadien gewertet Auf speziellen Diagnoseblattern wurden die kariösen Lasionen eines jeden Zahnes eingetragen, die total durchlaufenen Stadien separat angegeben summiert und der Mittelwert gebildet (max 20)

B Der Plaqueindex wurde planimetnsch ermittelt Nach Entfernung der Weichteile wurde die vestibulare Unterkieferhalfte mit einer Fuchsinlosung - bestehend aus 3 Teilen Aqua dest und 1 Teil gesättigter alkoholischer basischer Fuchsinlosung - fur 15 Sekunden angefärbt, anschließend kurz mit Leitungswasser abgespult und die flachenmaßige Ausdehnung der angefärbten Plaque mit dem Stereomikroskop SMXX (VEB Carl Zeiss) im Auflichtverfahren gemessen Bewertet wurden die Stadien

0 = keine Anfarbung

1 = Anfarbung nur im unteren Drittel der vestibularen Molarflache (ν Μ )

2 = Anfarbung dehnt sich auf zwei Drittel der ν Μ aus

3 = vollständige Rotfaroung der ν Μ

Die am ersten und zweiten Molaren einer Unterkieferhalfte ermittelten Zahlen (Stadien) Werte wurden summiert und der Mittelwert (Maximalzahl = 6) gebildet (STOOKEY Plaque Scoring Evaluation in living Animals, in Proceeding Symposium on Animal Models in Biology Ed Tanzer J M Sp Supp Microb Abstracts [1981] 205-214 Int Retrieval Inc London) C Semiquantitative Bestimmung der CFU von Streptokokken insgesamt und Str mutans in etwa 1 mg Plaquematerial von bukkalen Zahnoberflachen

Das mit sterilen Myrtenblattern entnommene Plaquematerial wurde in 1 ml steriler gepufferter physiologischer Kochsalzlosung suspendiert und mittels Glaskugelchen und 15minutiger Vibrationsruttier Behandlung homogenisiert Von dieser „Keimsuspension" wurde unter Verwendung von gepufferter physiologischer Kochsalzlosung eine logarithmische Verdunnungsreihe hergestellt und je Verdunnungsstufe 0 1 ml auf Mitis Sahvarius Agar mit und ohne 0 1 % Sulfisomidin (MSA B

* Standardfutter = Negativkontrolle

reine Kanesdiat (Stephan 580 Konig et al siehe unter Ab) = Positivkontrolle Kariesdiat mit entsprechenden Konzentrationen des ,biologischen Präparats = Versuchsreihen

238, Difco) ausgespatelt und fur 24 Stunden anaerob sowie weitere 24 Stunden aerob bet 37°C bebrütet Die auf dem Medium ohne Sulfisomidin gewachsenen Kolonien wurde als Streptokokkenspecies angesprochen, wahrend die auf dem Medium mit Hemmsubstrat wachsenden Keime als Streptokokkus mutans gezahlt wurden (KLIMM, Zahn- Mund u Kieferheiikunde 66, [1978], 771-775, KLIMM, Diss Prom B Leipzig [1981]). Die auf dem Sulfisomidin Medium gewachsenen Kolonien wurden stichprobenartig hinsichtlich ihrer Str mutans Identität mit dem Str mutans Referenzstamm NCTC 10449 koloniemorphologisch und mittels Gramfarbung verglichen bzw bestätigt D Verwendete Nährboden und Modalitäten der Bebrutung

a) Handelsübliche Thioglykollat Bouillon mit 0,5% Dextrose. Bebrutung des beimpften Medium fur 24 Stunden bei 37°C und Nachregulation des pH auf 7,4 nach 10 und 24 Stunden

Die erreichte Reinausbeute betrug 2 x 10⁹ CFU/ml

b) Supplementierte H-Milch

Die mit 0,1 % Hefeextrakt (VEB Bramsch, Dresden) angereicherte und auf pH 7 4 eingestellte H Milch wurde nach Beimpfung 18 Stunden bei 37⁰C bebrütet Zu diesem Zeitpunkt wurde 0 25% Dextrose zugesetzt und unter Korrektur des pH auf 7,4 weitere 12 Stunden bei 37°C incubiert Dadurch konnte die Gesamtausbeute von 4 χ 10⁹ CFU/ml H-Milch auf 2 χ 10'° CFU/ml supplementierte und pH korregierte H Milch erhöht werden E Herstellung von wirksamen (und unwirksamen) Praparationen zur biologischen Kariesprophylaxe

a) Die wie unter D 1 in Thioglykollat Bouillon angezuchteten Keime wurden zentrifugiert, das Sediment auf ¹/₀ des Ausgangsvolumens in physiologischer Kochsalzlosung resuspendiert und anschließend fur 30 Minuten bei Kerntemperaturen von 45⁰C, 5O⁰C, 56⁰C, 65⁰C, 75⁰C und 85°C inaktiviert Eine weitere Charge wurde fur 15 Minuten bei 100⁰C abgetötet Die Inaktivierung mit 0,35% Formalin erfolgte über 24 Stunden bei 4⁰C, nachfolgend wurde durch Zentrifugieren das freie Formalin ausgewaschen Die GTF Mutante wurde als Lebendantigen eingesetzt

b) Die wie unter D 2 in supplementierter H-Milch angezuchteten Keime wurden in der Milch fur 30 Minuten bei 56⁰C inaktiviert

c) Extraktion und Aufbereitung des aktiven Prinzips nach an sich bekannten Verfahren wie ζ B in DE 3 427 477 beschrieben.

Beispiel 1

Quantitative Beziehungen zwischen lokal/oral apphzierten unterschiedlichen Konzentrationen einer Karies-prophylaktischen Präparation und der realisierten simulierten „Monokolonisierung" (als Schwellenwert fur ein immunologisches switch on), meßbar an der Kariesprevention im kurzfristigen Karies Rattenmodell

Zum Nachweis der konzentrationsabhangigen Wirksamkeit des biologischen Prinzips „kompetetive Attachment-Verdrängung" wurde das 56°C inaktivierte Str mutans Antigen - bzw die H-Milch nach partieller Anreicherung mit in Thioglykollat-Bouillon gezüchteten Antigen - in abgestuften CFU-Keimaquivalenten von 10⁸, 5 \(fi,2 10⁹und5 10⁹/Gramm Kariesfutter eingesetzt Die quantitative Abhängigkeit der Kanesreduktion von der Konzentration der aktiven biologischen Präparation ist in Tabelle 1 festgehalten

Tabelle 1 (siehe Seite 6)

Wie Tabelle 1 zeigt, nimmt mit steigenden oder sinkenden Konzentrationen des aktiven Prinzips die Kanesanf alligkeit progressiv ab bzw zu Bei 10^a CFU-Keimaquivalente/Gramm Kariesfutter sinkt die Wirksamkeit auf die „Maximalwerte der Fluorprophylaxe" (siehe Tabelle 4), 5 χ 10⁹ CFU Keimaquivalente unterbinden im Rattenmodell jeglichen Kariesbefall

Beispiel 2

Nachweis der realisierten Attachment-Kompetition im Gefolge einer simulierten Monokolonisierung über

- die spezifische Verdrängung der Str mutans Keime im Plaque im Vergleich zu den sonstigen Mundhohlenstreptokokken sowie

- den veränderten Plaqueindex

Wahrend und nach der Prophylaxe mit 2 χ 10⁹ CFU-Keimaquivalenten/Gramm Kariesfutter wurde im Vergleich zu den Kontrollen semiquantitativ die CFU von Str mutans und der sonstigen Mundhöhlen-Streptokokken wie unter C beschrieben bestimmt, sowie der Plaqueindex wie unter B beschrieben ermittelt

Die summarischen Mittelwerte sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2 (siehe Seite 6)

Tabelle 2 veranschaulicht, daß wahrend einer realisierten „Monokolonisierung" in Übereinstimmung mit dem Ausmaß der Kariesreduktion

- der Str mutans unter die Nac^weisgrenze sinkt In der Positivkontrolle und nach Absetzen der wirksamen biologischen Präparation wird dieser Erreger mit einer Häufigkeit von - 10³ CFU/~ mg Plaquematerial angetroffen, die Werte in der Negativkontrolle bewegen sicti um 10¹ CFU

Die Spezifitat dieser Attachment Verdrängung ist aus den Versuchs-unabhangigen unveränderten > 10* CFU der sonstigen Mundhohlenstreptokokken ersichtlich

- der Plaqueindex mit etwa 4,3 sich zwischen dem Negativkontrollwert von ~ 3,5 und dem Positivkontrollwert von ~ 5,0 bewegt

Beispiel 3

Indirekter Hinweis auf eine nach 4wochiger effektiver simulierter Monokolonisierung - mit bei 56⁰C inaktivierten Str mutans 2 χ 10⁹ CFU Keimaquivalenten/Gramm Kariesdiat — zusatzlich wirksam werdende kariespreventive, immunologische Komponente Zum indirekten Nachweis einer solchen immunologisch wirksam werdenden Komponente wurde die 2 , 3 und 4wochige Antigenapplikation eines 28 Tage Versuches mit einem 8 Wochen „Langzeitversuch" verglichen, bei dem nach durchgehender Kariesprevention in den ersten 4 Wochen anschließend reine Kariesdiat, bzw reine Kariesdiat mit je einer Tagesboosterung am Ende der 6 Woche, bzw zwei Tagesboosterungen verteilt auf je einen Tag am Ende der 5 und 7 Woche verabfolgt wurde Die Kanesinzidenz innerhalb dieser unterschiedlichen Versuchsgruppen ist in Tabelle 3 festgehalten Tabelle 3 (siehe Seite 7)

Wie Tabelle 3 zeigt, ist eine zwei und dreiwöchige Prophylaxe auf die Kanesinzidenz am Ende des 28 Tage Versuches de facto ohne Einfluß Bei vierwochiger durchgangiger Applikation des kariesprophylaktischen biologischen Präparates bleibt eine deutliche, nur immunologisch erklärbare, Schutzwirkung bestehen und der einmalige Booster nach 14 Tagen am Ende der 6 Woche garantiert im 8 Wochen-Versuch die optimale Kariesprevention

Beispiel 4

Vergleich der Wirksamkeiten verschiedener Praparationen von 2 x 10⁹ CFU Keimaquivalenten des Str mutans untereinander sowie mit der Effektivität einer Fluorprophylaxe am kurzfristigen Karies Rattenmodeil

Die wie unter D a und D b gezüchteten und entsprechend E a und E b aufbereiteten Praparationen wurden bei Str mutans Wildstamm als inaktiviertes Antigen bzw bei der GTF Mutante als lebende Keime in der Konzentration von 2 χ 10⁹ CFU Keimaquivalenten/Gramm Kariesfutter zugesetzt

Der Einfluß dieser Praparationen auf die Kanesreduktion im Vergleich zur Positiv- u. Negativkontrolle sowie zur Effektivität der Fluorprophylaxe ist in Tabelle 4 dargestellt

Tabelle 4 (siehe Seite 7)

Wie die Tabelle 4 ausweist,reduzieren 2 x 10⁹ CFU Keimaquivaiente der lebenden GTF Mutante bzw als inaktiviertes 56⁰C oder Formalin Antigen die Karies hochsignifikant von Faktor > 10 auf Faktor - 1 Auch gegenüber der optimalen Fluorprophylaxe ist eine signifikante Kariesreduktion zu verzeichnen Mit steigenden Inaktivierungstemperaturen sinkt die kariesprophylaktische Wirksamkeit, bei > 85 °C inaktivierte Antigene sind de facto wirkungslos

Tabelle 1

Dosisabhangigkeit der simulierten Monokolonisierung bzw biologischen Kariesprophylaxe am kurzfristigen Karies Rattenmodell, nachweisbar durch Zusatz von — bei 56⁰C inaktivierten (in H Milch und/oder Thioglykollat Bouillon angezuchteten) — abgestuften Str mutans CFU Keimaquivalent Konzentrationen („Antigen ')/Gramm Kanesdiat (KD) Versuchsdauer 4 Wochen, Versuchsgruppen jeweils 26 Ratten

Futter	Konzentration	Mittelwert des	5x10⁹	Signifikanz
	des „Antigens"	Kanesbefalls	2x10⁹
	CFU Äquivalente	max 20 bei		CFU zu
		fünf Fissuren		5 xiO⁸1 χ 10⁸
KD	1 10⁸	30	α 0,1
KD	5 10⁸	1,9
KD	2 10⁹	08		α 0,01 α 0 01
KD	5 10⁹	0,0
KD	Positivkontr	12,3
Stan-	Negativkontr	01
dardf

Tabelle 2

Plaqueindices sowie semiquantitative Bestimmung der CFU von Str mutans und sonstigen Mundhohlenstreptokokken (Anzuchtung auf Mitis Sahvarius Agar mit und ohne Sulfisomidin)/~ mg Plaquematenal wahrend und nach der prophylaktischen Gabe von — bei 56 ⁰C inaktivierten — Str mutans 2 χ 10⁹ CFU Keimaquivalenten („Antigen")/Gramm Kanesdiat (KD) am kurzfristigen Karies Rattenmodell

Futter	Karies	CFU Str	mutans	-10³	sonstige Str	Plaque
	befall	wahrend	nach		mit und ohne	indices
	siehe	„Antigen'	' Gabe		„Antigen" Gabe
	Tab 4			- 10'
KD plus
„Antigen"	1,0	<10°	~10³	a 10«	-43
KD
Positiv-
kontr	12,0		a 10«	-50
Stan-
dardf
Negativ-	0,1		üiO⁴	-3,5
kontr

Tabelle 3

Indirekter Nachweis einer nach 4wöchiger Anwendung von - bei 56⁰C inaktivierten - Str.mutans 2 χ 10⁹ CFU Keimäquivalenten („Antigen")/Gramm Kariesdiät (KD) wirksam werdenden kariespreventiven immunologischen Komponente am Karies-Rattenmodell Versuchsdauer 4 bis 8 Wochen; Versuchsgruppen jeweils 26 Ratten

Dauer des Versuches

Futter

„A Ga Bo der 1

¹

ntiger :>e->i oster X.W 2

-Appl berX \ über oche 3

katior W och einen 4

te e 7

8

Positivkontrolle Negativkontrolle

L

. L

L '

Positivkontrolle Negativkontrolle

Mittelwert des Kariesbefalls: max. 20 bei fünf Fissuren

vier Wochen

KD KD KD

=?>

7,0 6,8 1,0

KD Standard!

r. Perr en bzv Tag ar 5

11,8 0,1

KD KD KD KD

2,0 1,0 1,2 1 ?

acht Wochen

nanen V. η End 6

KD Standardf.

12,0 0,1

Tabelle 4

Einfluß unterschiedlicher Inaktivierungstemperaturen sowie der Formalinabtötung auf die (Attachment-Kompetition bedingte) kariesprophylaktische Aktivität von 2 χ 10⁹ CFU Str. mutans Keimäquivalenten/Gramm Kariesdiät im Vergleich zur lebenden GTF-Mutante als „Antigen" sowie zur Effektivität einer Fluorprophylaxe am kurzfristigen Karies-Rattenmodell

Futter	biologisches	Mittelwert des	Signifikanz	zur
	Präparat	Kariesbefalls:
	2x10⁹CFU	max. 20 bei	Positiv	Fluorpro
		fünf Fissuren	kontr.	phylaxe
KD	Wildst. 56⁰C	0,8	α 0,01	a 0,01
KD	Wildst. 65⁰C	3,6
KD	Wildst. 75⁰C	3,8
KD	Wildst. 85⁰C	7,8
KD	Wildst. 100°C	8,0
KD	Wildst. Formalin	1,0	α 0,01	α 0,01
KD	GTF-Mutanten	0,7	α 0,01	α 0,01
KD	Positivkontr.	12,0
Stand-	Negativkontr.	0,2
dardf.
KD	Silica Fluor	5,0
KD	Elmex Gel	3,1

Claims

Erfindungsanspruch

1 Verfahren zur Herstellung von Präparaten zur biologischen Kanesprophylaxe gekennzeichnet dadurch, daß Streptokokkus mutans Wildstamme bzw GTF Mutanten mittels an sich bekannter eine hohe Ausbeute garantierender Verfahren in Massenkultur vermehrt und das so gewonnene Bakterienmatenal als resuspendiertes Sediment oder als Milchpraparat entweder

- mit an sich bekannten Verfahren in der Weise schonend inaktiviert wird, daß die Attachmentaktivitat nicht beeinträchtigt wird, oder

- das Attachmentpnnzip aus Erreger und/oder Kulturuberstand extrahiert oder

- die GTF Mutante als Lebendantigen belassen wird

und ein fur die lokale Applikation und Immunisierung attachmentaktives Präparat erhalten wird das erforderlichenfalls konzentriert und in fur die Applikation bzw Immunisierung zweckmäßigen Form mittels an sich bekannter Techniken weiterverarbeitet wird

2 Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das fur die lokale Applikation und Immunisierung erhaltene Präparat soweit konzentriert wird, bis die Mutans Streptokokken der Mundhohle über eine Attachment Kompetition aus dem Biotop verdrangt werden und als Folge dieser „simulierten Monokolonisierung" ein immunologisches switch on ausgelost wird

3 Verfahren nach Punkt 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß ein fur eine Periode der Grundimmunisierung und der nachfolgenden turnusmäßigen Boosterungen zu verabreichendes Präparat erhalten wird

4 Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß em fur die lokale bzw orale Applikation in Form von Zahnpflegemitteln, Gelen, Bonbons, Milchpraparaten usw zubereitbares und applizierbares Präparat erhalten wird