DK169422B1

DK169422B1 - Anvendelse af heparin, N-desulfateret, N-acetyleret heparin eller O-desulfateret, N-acetyleret heparin til fremstilling af et farmaceutisk præparat, som er effektivt over for autoimmune sygdomme, til lindring af sådanne sygdomme og til behandling af autoimmune sygdomme i pattedyr, herunder mennesker, og til hindring eller forsinkelse af allotransplantatudstødelse

Info

Publication number: DK169422B1
Application number: DK331287A
Authority: DK
Inventors: Irun Cohen; Israel Vlodavsky; Amiram Eldor; Yaakov Naparstek
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1986-06-26
Filing date: 1987-06-26
Publication date: 1994-10-31
Also published as: DE3782686T2; JPS6388127A; JP2527749B2; ATE82502T1; NO872675D0; GR3006814T3; ES2052514T3; AU608228B2; EP0251134B1; IL79254A0; EP0251134A3; DE3782686D1; AU7470687A; EP0251134A2; DK331287D0; NO872675L; DK331287A

Description

i DK 169422 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af heparin, N-desulfateret, N-acetyleret heparin eller O-desulfateret, N-acetyleret heparin til fremstilling af et farmaceutisk præparat, som er effektivt over for autoimmune sygdomme, til lin-5 dring af sådanne sygdomme og til behandling af autoimmune sygdomme i pattedyr, herunder mennesker, og til hindring eller forsinkelse af allotransplantatudstødelse., hvilke præparater som aktiv bestanddel indeholder fra 1 til 10% af den dosis af heparin, som kræves til opnåelse af en antikoagulerende virk-10 ning.

Der kan ligeledes anvendes andre derivater og modificerede former af heparin, der tilvejebringer den ønskede virkning. Ikke alle sådanne derivater er virksomme,* f.eks. er fuldstændigt desulfateret heparin helt uden virkning ved de til-15 sigtede formål.

Ud over dens vitale rolle ved beskyttelse af individet mod fremmede stoffer, kan immunsystemet angribe individets egne væv, hvorved der opstår autoimmune sygdomme. Andre uønskede virkninger af immunsystemet er udstødelse af livsvigtige 20 transplanterede organer. Immunsystemets evne til at forårsage autoimmune sygdomme eller udstødelse af fremmede transplantater afhænger af lymfocytternes evne, navnlig aktiveret Τ'-lymfocytter, til at komme frem til målorganet eller transplanteret væv. Henføring til målet sker via blodkar og de ak-25 tiverede T-lymfocytter skal være i stand til at indtrænge eller komme ud af blodkarvæggene. Derfor er det oplagt, at formode, at lymfocytternes deltagelse ved autoimmunødelsggelse eller transplantatudstødelse kunne forhindres ved at indvirke på deres bevægelighed.

30 Ingen af de tidligere studier viste, at intakt heparin eller kemisk modificerede hepariner, der er fri for antikoagulerende virkning, har en gunstig virkning ved autoimmune sygdomme eller fremmed transplantatudstødelse.

DK 169422 B1 2

Horvath et al. beskriver i Aust.N.Z.J med. bind. 5, nr. 6, 1975, side 537-539 en undersøgelse af, om subantikoagulante doser af heparin har virkning mod afstødelse af nyre-transplantater. Ved undersøgelsen viste det sig, at subantikoagu-5 lånte doser på 5000 enheder heparin pr. dag ikke viste nogen virkning på allotransplantatfunktion eller transplantatoverlevelse hos mennesker.

For nylig har man fundet frem til, at T-lymfocytter udtrykker et heparanaseenzym, som specifikt angriber glycosaminglycan-^ delen af den ekstracellulære matrix, og som udskilles af en-dotheliale celler, der· beklæder blodkarrene (Naparstek, Y., Cohen, I.R., Fuks, Z. og I. Vlodavsky. Aktiverede T-lymfocytter danner en matrixnedbrydende heparansulfatendoglycosidase. Nature 310:241 (1984)). Tilstedeværelsen af dette enzym var for-15 bundet med autoimmune T-lymfocytternes evne til at gennemtrænge blodkarvæggene og til at angribe hjernen i en modelsygdom, som kaldes experimental autoimmunencephalomyelitis.

Endvidere har man fundet frem til, at heparanaseenzymet kunne inhiberes af heparin og nogle af de modificerede heparinmole-20 kyler, såsom N-desulfateret, N-acetyleret heparin, men ikke af andre, såsom fuldstændigt desulfateret heparin (se tabel 1).

Man har derfor undersøgt, om heparin eller modificerede hepa-riners indgift til forsøgsdyr kunne anvendes til behandling af autoimmune sygdomme eller til forhindring af transplantatud-25 stødelse.

1. N-desulfateret, N-acetyleret modificeret heparin, eller en lav dosis af intakt heparin viste ingen antikoagulerende effekt i rotter. Tabel 2 viser, at intakt heparin ved en dosis på dagligt 2 mg pr. rotte (10 mg/kg) forårsagede en forøget pro- thrombintid i behandlede rotter, mens en dosis af intakt heoa-30 rin på 0,02 mg (0,1 mg/kg) eller 2 mg N-desulfateret, N-acetyleret heparin (10 mg/kg) ikke havde en antikoagulerende virkning. Således kunne den potentielle fare for medfølgende blødning efter indgivelse af 10 mg/kg intakt heparin undgås ved at anvende intakt heparin i en lav dosis på 0,1 mg/kg eller et kemisk modificeret heparin, der er fri for antikoagulerende virkning.

TABEL 1 DK 169422 B1 3

Inhibering af heparanaseakti vitet

Undersøgelses- Inhibering af heparansu1fat- 5 inhibitor nedbrydningvedheparanase

Heparin: intakt forekommer

Heparin: fuldstændigt ingen virkning desulfateret

Heparin: N-desu1 fateret, forekommer N-acetyleret

Heparanasevirkning fremkaldtes i det ekstracel1 ulære medium ved hjælp af aktiverede T-1ymfocytter og undersøgtes ved at inkubere mediet med ekstracel1ulær matrix, hvis heparansulfat var mærket med 35S, som beskrevet (Naparstek, Y.f Cohen, I.R., 15

Fuks, Z. og I. Vlodavsky. Aktiverede T-lymfocytter danner en matrixnedbrydende hepraransulfatendoglycosidase. Nature 310:241 (1984)). Heparanseaktivi tetinhibering undersøgtes ved at tilsætte forskellige koncentrationer af heparin eller modi-20 ficerede hepariner til nævnte reaktionsblanding og ved at måle virkningen på nedbrydning af mærket heparin-sul fat, som beskrevet (Naparstek, Y., Cohen, I.R., Fuks, Z. og I. Vlodavsky. Aktiverede T-lymfocytter danner en matrixnedbrydende heparansul fatendoglycosidase. Natur 310:241 (1984)). Fulstændigt de- __ sulfateret heparin og N-desulfateret, N-acetyleret heparin

i. O

fremstilledes, som beskrevet (Ayotte, L., A.S. Perlin: NMR- spektroskopiske undersøgelser angående virkningen af heparin-sulfatgrupper. Calciumbinding versus biologisk virkning. Carbohydrate Res. 145:267 (1986)).

30 2. Mo.dificeret eller lav,heparin inhiberér hudtransplantatudstø-delse. Fig. 1 viser overlevelsen af SJL/J hudtransplantater i (BALB/cxC57BL/6)Fl mus. Over level sest idsmed i anen af hudtransplantater i kontrolmus, der er behandlet med saltopløsning, varer 14 dage, mens den hos mus, der var behandlet med 0,05 35 mg/kg heparin dagligt, varede 26 dage med en maksimal overlevelse på 32 dage. Fig. 2 viser, at behandling med 10 mg/kg N-desulfateret, N-acetyleret heparin dagligt forøger overlevelsesmedianen af fremmed hudtransplantater fra 10 til 20 dage.

DK 169422 B1 4

Disse resultater viser, at en lav, subanti koagulerende dosis heparin eller en modificeret, ikke antikoagulerende heparindo-sis, signifikant kan forøge overlevelsestiden af fremmede hud-transplantanter i mus.

5 TABEL 2

Hepariners virkning på prothrombintid

Injiceret Dosis Prothrombin- Antikoagulerende materiale (mg) tid (min) virkning

Ingen 0 19

Heparin 20 25 ingen

Heparin 0,2 17 ingen

Hepar i n: N-desulfateret 15 N-acetyleret 20 19 ingen

Lewisrotter, 10 uger gamle med en vægt på 250 g, fik injiceret subcutant den viste dosis af heparin en gang dagligt i 2 dage. Prothrombintiden undersøgtes herefter som beskrevet i anvis-20 ningerne til "Pathromtin kit - 0TX80" (Hoechst-Behring, Marburg, FRG) .

3. Modificerede eller lave doser af heparin inhiberer anti-BP T- 1ymfocytternes evne til at fremkalde experimental autoimmunen-2g cephalomyelitis (EAE).

EAE er en eksperimentel autoimmun sygdom med nogle træk, der minder om multiple sclerosis hos mennesker. Sygdommen foråsa- ges af T-lymfocytter, der er immuniseret mod basisprotein (BP) i det centrale nervesystems myelin. For at undersøge hepari-30 ners virkning på T-lymfocytters evne til at forårsage autoimmune sygdomme, anvendtes T-1ymfocytter, der er sensibiliseret mod BP, enten som T-cellelinier (Cohen, I.R. Experimental autoimmune encephalomyeti 1 is: Pathogenesis and prevention. I:

Immunoregulatory Process in Multiple Scleroses and Experimen-35 tal Allergic Encephalomyelitis. A.A. Vandenbark og J.C.M. Raus, udgivet af Elsever Biomedical Res., Amsterdam. 7:91-125 (1985)) eller som populationer af lymfeknudeceller fra BP-im- DK 169422 B1 5 muniserede rotter. Tabel 3 viser, at en sub-antikoagulerende dosis af intakt heparin (0,1 mg/kg/døgn) eller en dosis af modificeret heparin (N-desulfateret, N-acetyleret), der er fri for anti-koagulerende virkning (10 mg/kg/døgn), var i stand 5 til at markant inhibere virkningen af EAE, som fremkaldes af anti-BP T-lymfocytter. Fig. 3 viser grafisk inhiberingen af EAE, der opnås i med heparin behandlede rotter (0,02 mg/rot-te/døgn; 0,1 mg/kg).

10 TABEL 3

Inhibering af experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) ved behandling med en sub-anti-koagulerende dosis af intakt heparing eller med modificeret heparin (N-desulfateret, N-acety 1 eret ) 15 Middel Dosis Arsag %fore- Begyn- Varig- Klinisk (mg/kg) til EAE komst delses- hed point dag (dage) antal A. Intet - T-celle- 100 5,2 4,2 2,4

Modificeret linie ? heparin 10 50 6,4 1,8 0,8 1 B. Intet - T-celle- 100 5,0 5,5 3,0 linie

Heparin 0,1 20 6,5 3,6 1,0 C. Intet - Præpareret 80 4,5 5,8 2,3 lymfeknude

Modificeret 0 - - heparin 10 25 D. Intet - Præpareret 100 4,0 5,3 3,0 lymfeknude

Heparin 0,1 75 6,3 4,0 1,5 EAE frembragtes ved at inoculere Lewis rotter med en T-cellelinie af anti-BP T-lymfocytter (106 celler) med anti-BP præpa- 30 η rerede lymfeknudeceller (10' celler) intravenøst (Cohen, I.R.,

Experimental autoimmune encephalomyelitis: Pathogenesis and prevention. I: Immunoregulatory Processes in Multiple Sclerosis and Experimental Allergic Encephalomyelitis. A.A. Vandenbark og J.C.M. Raus, udgivet af Elsevier Biomedical Res., Am-35 sterdam. 7:91-125 (1985)). En dag før indpodning og dagligt i 10 dage modtog rotter enten saltopløsning eller hepariner. Rotterne observeredes med henblik på udvikling af lammelse, DK 169422 B1 6 hvor halesvækkelse sattes til 1 point; paralyse af baglemmer til 2; paralyse af bag- og forlemmer 3; og dødsstadiet til 4.

4. Modificeret eller lav dosis, heparin ihhiberer adjuvant arthri-5 tiS·

Adjuvant arthritis er en experimentel sygdom, som kan fremkaldes i nogle rottestammer ved at immunisere dem overfor antigener af Mycobacterium tuberculosis (Pearson, C.M. Development of arthritis, periarthritis and periostitis in rats given 10 adjuvant. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91:91 (1956)). Sygdommen er tænkt som en model af rheumatoid arthritis hos mennesker (Pearson, C.M. Experimental models in rheumatoid desease. Arthritis Rheum. 7:80 (1964)). Det viser sig, at arthritis forårsages af T-lymfocytter, som genkender et antigen af M.tu-15 berculosis, der er krydsreaktivt med brusk (Cohen, I.R., J. Holoshitz, W. Van Eden, A. Frenkel. T lymphocytes illuminate pathogenesis and effect therapy of experimental arthritis. Arthritis Rheum. 29:841 (1985)).

20 Tabel 4 viser, at sub-anti-koagulerende doser af heparin markant inhiberer adjuvant arthritis. En dosis heparin på 0,001 mg dagligt havde en marginal virkning på arthritis. Doser på 0,005 og 0,01 mg var mere effektive, mens en dosis på 0,02 mg viste en maksimal virkning ved inhibering af arthritis. Imid-25 lertid havde højere doser på 0,04 mg ingen inhiberende virkning. Således er dosis-responskarakteristikaene ved behandling særdeles skarp; en fordobling af den mest virksomme dosis førte til et fuldstændigt tab af virkning. Skarpheden af do-sisresponsekurven fører let til at man overser den gunstige 30 virkning af heparin på autoimmune sygdomme og transplantatudstødelse, og er sandsynligvis skyld i, at den ikke er blevet observeret af andre forskere. Modificerede hepariner, såsom N-desulfateret, N-acetyleret heparin viser ligeledes en lignende skarp dosisresponsekurve, med en maksimal virkning ved 0,02 mg 35 pr. rotte (0,1 mg/kg). En højere dosis (0,04 mg) var uvirksomt (se fig. 4).

Fig. 5 viser, at modificeret heparin (N-desulfateret, N-acetyleret) i en dosis på 0,1 mg/kg/døgn, der gives fra dag 21 til DK 169422 B1 7 51, frembringer en tidlig remission af etableret adjuvant arthritis. Således var en behandling virksom, selv om arthritis allerede var klinisk alvorligt. Histologisk undersøgelse af leddene viste tegn på betændelse i kontrolrotterne og sunde 5 led i de behandlede rotter.

TABEL 4

Behandling af adjuvant arthritis med sub-anti-koagulerende doser heparin.

10

Heparin _Adjuvant arthritis_ dosis varighed maksimal (mg) (døgn) klinisk pointantal 0 >20 10 15 0,04 >20 10 0,02 8 2 0,01 15 5 0,005 16 4 0,001 20 6 20 Rotterne blev immuniseret med M. tuberculosis (1 mg) i olie, for at fremkalde adjuvant arthritis (Pearson, C.M., Development of arthritis, periarthritis and periostitis in rats given adjuvant. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91:91 (1956)). På dag 9 inkuberedes rotterne subcutant en gang dagligt i 5 dage med 25 forskellige doser heparin og bedømtes med henblik på arthritis udvikling på en skala fra 0-16, som beskrevet (Holoshitz, Y., Y. Naparstek, A. Ben-Nun, I.R. Cohen. Lines of lymphocytes mediate or vaccinate against autoimmune arthritis. I Science 219:56 (1983)).

30

Tabel 5 viser pointantallene af kommercielt tilgængelig heparin, som undersøgtes for dets virkning, til at fremkalde lang-tidsinhibering (ved dag 60) af adjuvant arthritis, efterfulgt af en daglig subcutan behandling i 5 dage ved at begynde på dag 8 efter induktion af arthritis. Heparin, der blev leveret fra 3 af de 4 kilder, var særdeles virksomt, mens heparin fra en kilde alene viste en delvis virkning (Organon). Således kan heparin fra forskellige kilder anvendes som virksomt materiale.

DK 169422 B1 TABEL 5 8

Heparin fra forskellige kilder, som undersøgtes for inhibering af adjuvant arthritis.

Heparin Firma_Arthritis tilfalde Inhibering af arthritis 5 _(dag 601_

Leo Leo Pharmaceutical

Ballerup, Danmark 0 ja

Sigma Sigma Chemical Co.

(kvæg- lunge) St. Louis; HI, USA 0 ja BDH BDH Chemicals,

Poole, England 0 ja

Thrombo- liquine Organon Teknika,

Boxtel, Holland 2,5 delvis ubehandlet ------- 5

Adjuvant arthritis blev fremkaldt i Lewis rotter, og rotterne 15 behandlet med heparin fra de anførte kilder, som beskrevet under tabel 4. Det gennemsnitlige pointantal bestemtes på dag 60 og anvendtes til bedømmelse af heparinbehandlingens virkning.

Tabel 6 viser forskellige modificerede hepariner, som under-20 søgtes for deres evne til at fremkalde langtidsinhibering af adjuvant arthritis på dag 60, som beskrevet ovenfor. Fuldstændig desulfaterede og N-desulfaterede hepariner havde ingen virkning ved behandling af arthritis. Imidlertid var N-desul-faterede, N-acetylerede og O-desulfaterede, N-acetylerede he-25 pariner lige så virksomme som nativ heparin. Som vist i tabel 2 havde modificerede hepariner en ringe antikoagulerende virkning. Således kan man hæmme uønskede immunologiske reaktioner med forskellige hepari npræparater, der er fri for faren af antikoagulerende virkning.

30 35 DK 169422 B1 9 TABEL 6

Modificerede hepariner, undersøgt for inhibering af adjuvant arthritis.

5 Heparin Arthritis antal Inhibering af arthritis _(da g ....6.0)_

Intet 6

Intakt 0 ja N-desulfateret 0 ja N-acetyleret in O-desulfateret 0 ja N-acetyleret

Fuldstændig desulfateret 5 nej N-desu1 fateret 5 nej

Adjuvant arthritis blev induceret i Lewis rotter, og rotterne behandledes med modificerede hepariner, som beskrevet i tabel 4 og 5. Heparinerne bl ev modificeret som beskrevet (Ayotte, L., A.S. Perlin. NMR spectroscopic observations related to the function of sulfate groups in heparin. Calcium binding vs. biological activity. Carbohydrate Res. 145:267 (1986)).

20 5.. Modificeret heparin inhiberer indtrængning og udtrængning af aktiverede T-lymfocytter gennem blodkarrene.

For at undersøge virkningen af modificeret heparin på T-lymfo-cytters færdsel, mærkedes lymfocytterne med 51Cr og optagelsen 25 af de mærkede lymfocytter fra en subcutan side og deres for-bliven i blodet måltes. Man har fundet frem til, at de mærkede lymfocytter forbliver på injektionssiden i rotte- eller musehaler i 5-6 dage i behandlede dyr (N-desulfateret, N-acetyleret heparin; 0,05 mg/kg), mens de mærkede lymfocytter bevæger 30 sig væk fra injektionssiden i løbet af 1-2 dage i kontroldyr.

Endvidere førte behandling med modificeret heparin til en forbi iven af mærkede lymfocytter i blodet i 4-5 dage, mens ubehandlede rotter eller mus fjernede de mærkede lymfocytter fra 35 blodet på 1 dag. Således inhiberede behandling med modificeret heparin lymfocytternes evne til at indtrænge i blodkarrene, og når de er i blodekarrene, deres udtrængning derfra. Dette kan tilskrives inhibering af heparanaseenzymaktivi teten, som er 10 DK 169422 B1 nødvendig for gennemtrængning af den ekstracellulære matrix af blodkarvæggen. I overensstemmelse hermed var T-lymfocytterne mindre i stand til at forårsage autoimmun sygdom eller transplantatudstødelse.

5

Resultaterne viser, at en inhibitor af heparanase, såsom heparin eller N-desulfateret, N-acetyleret heparin kan anvendes til forhindring af autoimmunitet og fremmed transplantatudstødelse. Den effektive dosis af heparin i størrelsesordenen på 0,1 mg/kg er ca. 1% eller mindre af det, hvad der anvendes for at frembringe en antikoagulerende virkning (10 mg/kg) og derfor kan forebyggelsen af uønskede immunreaktioner adskilles fra antikoagulation. N-desulfaterede, N-acetylerede og 0-de-sulfaterede, N-acetylerede hepariner er i sig selv fri for an-tikoagulerende virkning, og kan anvendes i højere doser i størrelsesordenen på 10 mg/kg, selv om lavere doser (0,1 mg/-kg) af disse materialer er mere virksomme ved forhindring af uønskede immunreaktioner. Disse doser er afgørende, idet 0,02 mg/rotte (0,1 mg/kg), som vist i tabel 4, optimalt kan inhibe-2Q re sygdom, mens en højere dosis på 0,04 mg/rotte (0,2 mg/kg) kan være uvirksom. Den samme følsomhed i virkning versus dosis blev også observeret med de modificerede hepariner, såsom N-desulfaterede, N-acetylerede (fig. 4).

Denne fremgangsmåde er hidtil ukendt og undgår de sædvanlige 2 5 , toksiske virkninger af de hidtil anvendte immunosuppressive midler. Anvendelsen af en hvilken som helst heparin eller modificeret heparin» som inhiberer T-lymfocytters heparanaseaktivi-tet, kan benyttes til behandling af autoimmune sygdomme hos mennesker, både i nervesystemet, leddene, muskler, nyrer, lever, 30 hud, fordøjelsestragten, lever, blodbestanddele, endocrine organer og kønsorganer; eller til forhindring af fremmed transpi antatudstødel se.

35 DK 169422 B1 11 INHIBERING AF DTH TYPE HUDREAKTIONER Undersøgelsessystem:

Mus sensibiliseredes mod 4-ethoxymethy!en-2-pheny1oxazo!on 5 (OX) ved at påføre deres hud to gange, med 5 dages interval, ca. 0,1 ml af 3% OX i et grundlag af 4:1 acetone:ol ivenol ie (volumenforhold). Deres immuniserede af løbslymfeknudecel 1 er (I-LNC) overflyttedes herefter (5xl07) til modtagermus intravenøst. I-LNC's evne til at nå antigensiden og frembringe en 10 DTH-reaktion undersøgtes ved at udsætte modtagermusene 1 time efter I-LNC overføring for 0,02 ml 0,5% 0X, som pensles på ørerne. DTH blev konstateret ved måling af øretykkelsen 24 timer senere ved hjælp af et præcisionsmikrometer.

15 Evnen af de overflyttede I-LNC til at nå ørerne undersøgtes ved at mærke I-LNC før overflytning med radioaktivt 51ør (jo7 celler/ml inkuberet med 0,1 mCi Slør-natriumchromat og herefter skyllet) og ved at måle antallet af cpm, der når ørerne til den tid, hvor DTH indsættes.

20

Lave doser af heparin inhiberer vandring til DTH-side.

Fig. 6 viser, at en dosis på 5 pg heparin dagligt, forhindrer I-LNC både i at nå ørerne (nedsat cpm) og i at fremkalde en DTH-reaktion (nedsat ørehævelse). En højere dosis heparin (20 25 pg daglig) inhiberede hverken I-LNC vandring til ørerne eller DTH reaktivitet.

Lave doser af heparin ophæver ekspression af heparanase i I-LNC.

30

De førnævnte resultater viser, at behandling med den lave dosis (5 pg) heparin undertrykker DTH's evne til at formidle I-LNC's indtrængning i blodkar og til ophobning ved det deponerede antigen. For at sikre om disse virkninger var forbundet 35 med inhibering af endogen heparanase, behandledes mus med høje doser af heparin (25 pg) eller lave doser af heparin (5 pg), musene var sensibiliseret overfor 0X og deres I-LNC blev herefter undersøgt for heparanaseaktivitet in vitro. Fig. 7 vi- 12 DK 169422 B1 ser, at I-LNC af mus, der er behandlet med den lave dosis (5 pg) af heparin, manglede heparanaseaktivitet. I modsætning hertil udviste musene, der var behandlet med den høje dosis (25 pg) heparin, heparanaseaktivitet, som lignede den af ube-5 handlede kontrolmus. Således forårsager behandling med 5 pg heparin in vivo en i alt væsentlig nedsættelse af enzymakti-viten i sensibiliserede lymfocytter.

Lavdosis heparin modvirker ikke en in situ DTH-reaktion.

10

Hvis inhibering af heparanase og heparanseafhængig færdsel er hovedmekanismen, hvorved lavdosisheparin undertrykker DTH, så skulle det være muligt, at omgå inhiberingen af DTH ved at omgå nødvendigheden til vaskulær færdsel af sensibiliserede T-lymfocytter. I overensstemmelse hermed behandledes modtager-15 mus med en inhibitorisk dosis (5 pg) heparin og injiceredes herefter med donor I-LNC direkte i ørerne, i stedet for intravenøst. Tabel 7 viser, at anbringelsen af sensibiliserede lymfocytter in situ omgår den inhiberende virkning af 5 μg heparin på DTH. Således viser det sig, at en lavdosisbehandl ing 20 med heparin inhiberer DTH kun, når DTH-formidlende T-lymfocytter nåede frem til antigensiden ved hjælp af cirkulation.

Konklus ion: 25 Heparin i lave doser inhiberer DTH-reaktion samt transplantud-stødelse og autoimmune sygdomme i forsøgsdyr.

Disse virkninger er forbundet med en nedsat heparanaseaktivitet i T-lymfocyt og en nedsat T-lymfocyt vandring til antigenets side.

30 35 TABEL 7 5 DK 169422 B1 13

Denne tabel viser, at heparin ikke blokerer overførsel af DTH, når I-LNC direkte injiceres ved antigenudsættelsessiden.

Recipienter af I-LNC sensibiliseret mod OX

Henparinbehandl ing OX-udsæt- Ørehævelse (5 ug)_ telse_(xl0"4cm)_ ingen ja 55,9 + 8,6 ja ja 51,8 i 4,1 - ingen nej 22,9 + 2,54 1 ja nej 20,3 ± 2,54 I-LNC opnåedes fra BALB/c mus, der 5 dage tidligere blev sensibiliseret mod OX. I-LNC blev centrifugeret, resuspenderet i RPMI medium og injiceret intradermalt (3xl01 celler/20 μΐ) i 15 den dorsale overflade af ørerne hos ikke forud testede modtagermus. Ørerne behandledes med OX straks efter celleoverførelse. Omfanget af DTH ørehævelse bestemtes 24 timer senere.

Lavdosisheparin inhiberer DTH-reaktioner hos mennesker.

20

Raske frivillige unge, voksne medicinstuderende undersøgtes i 48 timer for deres spontane hud DTH-reaktioner mod tuberculin, tetanus toxoid, mumps antigen eller diphtheria toxoid og behandledes her-25 efter med en enkelt daglig subcutan injektion af 300-500 enheder heparin. To uger senere under vedvarende heparinbehandling måltes deres DTH-reaktioner igen og de positive reaktioner i hver af de 6 forsøgspersoner blev fundet mærkbart reduceret.

Heparinbehandlingerne blev afbrudt og 2 uger senere observe-30 redes DTH-reaktioner at være tilbage på deres tidligere reaktivitetsstadie. Gentagen administration af heparin foråsagede igen en mærkbar nedsættelse af DTH-reaktivitet og standsning af behandlingen førte tilbage til den oprindelige reaktivitet.

35 Patienter, der lider under multipel sclerosis

Til udførelse af et klinisk forsøg med lavdosisheparin ved multiple sclerosis behandles 12 patienter dagligt med doser på DK 169422 B1 14 300-1000 enheder heparin og, på samme måde som hos de raske frivillige, havde alle 12 patienter en nedsat DTH-reaktivitet.

Lavdosisheparin fører til en forbedring ved rheumatoid arthri-5 tis*

Da DTH-reaktioner mod selve antigenet er involveret ved autoimmune sygdomme, undersøgtes lavdosisheparin (ca. 300-500 enheder dagligt) hos patienter med rheumatoid arthritis. Tre patienter med alvorlig arthritis behandledes i en måned og alle 10 tre fik en bedring; de følte sig subjektivt bedre og havde en nedsat klinisk invaliditet og arthritis ifølge deres læger.

FigurbeskriveIser: 15 Figur 1. Behandling med heparin (0,05 mg/kg) forhindrer udstødelse af hudtransplantater. Mus fra hybridstammen (BALB/c x C57BL/6)F1 fik transplanteret hud fra allogene SJL/J mus. Musene (20 pr. gruppe) behandles dagligt med subcutane injektioner af saltopløsning ( Q ) eller raed heparin ("Leo", 2Q 0,05 mg/kg; ) og bedømtes efter hudtransplantat overle velse. Overlevelsesmedian for kontrolgruppen var 10 dage, mens den for den hepari nbehandlede gruppe var 24 dage.

Figur 2. Behandling med N-desulfateret, N-acetyleret heparin (10 mg/kg) forhindrede udstødelse af hudtransplantater. Mus 2 5 modtog en transplantat, som beskrevet i beskrivelsen til fig. 1, og blev behandlet dagligt med saltopløsning ( QJ ) eller N-desulfateret, N-acetyleret heparin (10 mg/kg; ).

Overlevelsesmedianen for hudtranspiantaten i kontrolgrupperne var 10 dage, mens den i den behandlede gruppe var 20 dage.

30

Figur 3. Behandling med heparin (0,1 mg/kg) hæmmer EAE, der fremkaldes af autoimmune T-lymfocytter. 1 dag før inoculation med T-lymfocytterne injiceredes rotterne dagligt 0,02 mg heparin subcutant (0,1 mg/kg; Q ). Kontrol rotter injiceredes 35 saltopløsning ( ). EAE-klinisk pointantal blev estime ret som paralyse af halen -25; paralyse af baglemmer -50; paralyse af alle fire lemmer -75; dødsstadie -100.

DK 169422 B1 15

Figur 4. Behandling af adjuvant arthritis under anvendelse af modificeret heparin (N-desulfateret, N-acetyleret) i forskellige doser. Rotter blev immuniseret for at frembringe adjuvant arthritis, som beskrevet i beskrivelsen til tabel 4. På dag 9 5 fik rotterne indgivet subcutant én gang dagligt N-desu1 fateret, N-acetyleret heparin i doser på 0 mg {<», 0,001 mg (-), 0,02 mg (x) eller 0,04 mg (O). Doserne på 0,02 mg forårsagede signifikant inhibering af arthritis.

Figur 5. Behandling med N-desulfateret, N-acetyleret heparin (0,1 mg/kg) frembragte tilbagegang af etableret adjuvant arthritis (AA). Tyve Lewis rotter fik indgivet Mycobacteria tuberculosis for at frembringe AA som beskrevet (3,11). Klinisk arthritis fik et pointantal på en skala fra 0 (ingen arthri- tis) til 100 (mærkbar hævelse, ømhed og rødme i alle fire po-1 o ter). På dag 21, når alle rotter led under udpræget arthritis, modtog 10 saltopløsning ( ) og 10 behandledes med N-de- sulfateret, N-acetyleret heparin (0,1 mg/kg) indtil dag 51.

Figur 6. Venstre side: 20

Lavdosisheparin inhiberer adoptivt overflyttet DTH. I-LNC opnåedes fra OX-sensibi1iserede mus (gruppe A-C) og ubehandlet LNC fra usensibi1iserede mus (gruppe D). LNC overflyttedes intravenøst til native recipienter, som var behandlet (gruppe B-25 C) eller ubehandlede (gruppe A, D) med heparin (5 pg eller 20 pg), som blev injiceret 18 timer før og 1 time før celleoverflytning og 20 timer efter celleoverflytning. DTH ørehævelse blev udløst af 0X ved celleoverflyttelsstiden og målt 24 timer senere.

30 Højre side:

Heparin inhiberer cellevandring til DTH-udsættelsesside.

Undersøgelserne blev udført som beskrevet ovenfor (venstre 35 side), med undtagelse af, at I-LNC var radiomærket med 5*Cr før celleoverflytning til de ubehandlede modtagermus. Ophobning af I-LNC i 0X behandlede ører vises som 5lCr (cpm/øre).

16 DK 169422 B1

Figur 7. Heparin inhiberer heparanase in vivo.

Mus immuniseredes med OX på dag 0 og 5. Nogle af musene behandledes med heparin (5 μg eller 25 pg pr. injektion) 18 tim-g er før og 2, 10 og 20 timer efter immunisering på dag 5 med OX. På dag 6 fjernedes I-LNC og undersøgtes for heparanaseak-tivitet ved at inkubere den i 48 timer med mærket ECM. Hepa-ransulfats nedbrydningsprodukter vises for I-LNC fra de følgende grupper mus: Ingen heparin - #; 25 pg heparin - X; 5 pg 1Q heparin - 0. LNC af kontrolmus, der ikke var immuniseret med OX viste ingen heperanaseaktivitet (ikke vist).

15 20 25 30 35

Claims

1. Anvendelse af heparin, N-desulfateret, N-acetyleret heparin eller O-desulfateret, N-acetyleret heparin til fremstilling af 5 farmaceutiske præparater, som er effektive overfor autoimmune sygdomme, til lindring af sådanne sygdomme og til behandling af autoimmune sygdomme hos pattedyr, herunder mennesker, og til hindring eller forsinkelse af allotransplantatafstødelse, hvilke præparater som aktiv bestanddel indeholder fra 1 til 10 10% af den heparindosis, som kræves til opnåelse af en anti- koagulerende virkning.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori dosen er 0,01 til 0,2 mg/kg/dag heparin.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvori dosen er 0,05 mg/kg/dag N-15 desulfateret, N-acetyleret eller O-desulfateret, N-acetyleret heparin.

4. Anvendelse ifølge krav l, hvori dosen af 0,02 mg/kg/dag heparin er effektiv over for arthritis. 20