JPH09503644A - 部位特異的変異誘発のための化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 変異原性の三重鎖形成性オリゴヌクレオチドおよびそれを使用する方法であって、このオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されて突然変異原を取込み、そして標的DNA分子の特異的DNAセグメントを有する三本鎖核酸分子を形成する。三重鎖の形成に際し、突然変異原は、標的分子に近接し、そして標的分子の特定部位で変異を引き起こす。この変異は、標的分子の活性および機能を活性化し、不活性化し、または改変する。

Description

【発明の詳細な説明】 部位特異的変異誘発のための化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド 発明の背景 本発明は、遺伝学の分野に関し、そしてより詳細には目的の遺伝子の部位特異 的変異誘発に関する。遺伝子療法 遺伝子療法とは、欠陥遺伝子の完全な置換コピーを細胞に導入して、ヒト、動 物、および植物の遺伝子疾患を治療することである。遺伝子組換えにより導入さ れた遺伝子は、内因性遺伝子を置換する。このアプローチは、遺伝子操作された ウイルス、またはウイルスベクターのような、置換遺伝子を細胞に導入するため の複合送達システムを必要とする。 遺伝子療法は、例えば、網膜細胞種、嚢胞性繊維症、および鎌型赤血球貧血の ような周知のヒトの遺伝子疾患を治療するために実験的に用いられている。しか し、実際には欠損遺伝子の置換に至る制限された数の組換え事象のためにインビ ボの効率は低い。三重鎖DNA 何年も前にFelsenfeldら、J．Am．Chem．Soc．79：2023(1957)によって三重鎖 DNAが最初に観察されてから、オリゴヌクレオチド特異的(oligonucleotide-dire cted)三重らせん(triple helix)形成が、分子生物学において価値ある手段とし て出現した。現在の知識は、オリゴヌクレオチドが、二重鎖DNAにおいてポリプ リン(polypurine)／ポリピリミジン(polypyrimidine)ストレッチ(stretch)の主 溝に、配列に特異的な様式でDNAの三重鎖として結合し得ることを示唆している 。１つのモチーフでは、ポリピリミジンオリゴヌクレオチドは、MoserおよびDer van、Science 238：645(1987)、Praseuthら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA85：1 349(1988)、およびMergnyら、Biochemistry 30：9791(1991)に記載されるように 、二重鎖においてプリン鎖に平行な方向で結合する。別なプリンのモチーフでは 、ポリプリン鎖は、BealおよびDervan、Science 251：1360(1991)に記載される ように、プリン鎖と逆平行に結合する。三重鎖(triplex)形成の特異性 は、水素結合により形成される塩基三重鎖(プリンモチーフにおけるAATおよびGG C)から生じ；Mergnyら、Biochemistry 30：9791(1991)およびBealおよびDervan 、Nuc．Acids Res．11：2773(1992)により記載されるように、ミスマッチが三重 らせんを不安定にする。 三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、いくつかの分子生物学技術に有用なこと が見出された。例えば、遺伝子プロモーター中の部位に結合するように設計され た三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、DNA結合性タンパク質をブロックするた めおよびインビトロおよびインビボの両方の転写をブロックするために用いられ ている。（Maherら、Science 245：725(1989)、Orsonら、Nucleic Acids Res．1 9：3435(1991)、Postalら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：8227(1991)、Coon eyら、Science 241：456(1988)、Youngら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：10 023(1991)、Maherら、Biochemistry 31：70(1992)、Duval-Valentinら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 89：504(1992)、Blumeら、Nucleic Acids Res．20：1777( 1992)、Durlandら、Biochemistry 30：9246(1991)、Grigorievら、J.of Biologi cal Chem．267：3389(1992)、およびTakasugiら、Proc．Natl．Acad.Sci．USA 8 8：5602(1991)）。DNAの部位特異的開裂は、EDTA-Fe(II)のような反応性部分に 連結した三重鎖形成性オリゴヌクレオチドを用いることによって、またはDNA修 飾酵素と共に三重鎖形成性オリゴヌクレオチドを用いることによって達成された （Perrouaultら、Nature 344：358(1990)、Francoisら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 86：9702(1989)、Linら、Biochemistry 28：1054(1989)、Peiら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 87：9858(1990)、Strobelら、Science 254：1639(1991)、 およびPosvicおよびDervan、J．Am．Chem．Soc．112：9428(1992)）。三重鎖親 和性捕獲を用いる配列特異的DNA精製もまた示されている（Itoら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 89：495(1992)）。アクリジン(acridine)のような挿間剤、また はp-アジドフェナシル(p-azidophenacyl)およびプソラレン(psoralen)のような 架橋剤に連結した三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが利用されるが、三重鎖結合 の安定性を高めるためだけに利用されている。(Praseuthら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 85：1349(1988)、Grigorievら、J．of Biological Chem．267：3389 (1992)、Takasugiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：560 2(1991))。 標的DNA分子の部位特異的変異誘発の方法は、遺伝子療法または抗ウイルス療 法の成功を達成するために有用である。このような方法はまた、遺伝子工学のた め、またはDNA修復のような遺伝的メカニズムを研究するための有用な研究手段 である。 従って、本発明の目的は、標的DNA分子のインビボおよびインビトロ部位特異 的変異誘発の方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、高度に特異的で効果的である標的DNA分子の変異誘 発の方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、ウイルスベクターの必要性なく遺伝子療法によって 遺伝子疾患を処置する方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、癌を処置するための方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、療法および研究に使用するための変異原性オリゴヌ クレオチドを提供することである。 発明の要旨 変異原性の三重鎖形成性オリゴヌクレオチドおよびそれを使用する方法を本明 細書に開示する。標的遺伝子DNAの特異的DNAセグメントと三本鎖を形成し得るオ リゴヌクレオチドは、突然変異原を取込むために化学的に修飾される。この修飾 されたオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の選択された部位にハイブリダイズし て、三重鎖領域を形成し、それによって付着した突然変異原を標的遺伝子に近接 させ、そしてこの遺伝子内の特定部位で変異を引き起こす。この変異は、標的遺 伝子の活性および機能を活性化し、不活性化し、または改変する。 標的遺伝子が遺伝子疾患の原因である変異を含む場合、そのときは変異誘発オ リゴヌクレオチドは、標的遺伝子のDNA配列を正常に復元し得る変異誘発修復に 有用である。標的遺伝子がウイルス生存または繁殖のために必要なウイルス遺伝 子、あるいは癌細胞におけるように非調節増殖を引き起こす癌遺伝子である場合 、そのときは変異誘発オリゴヌクレオチドは、これらの遺伝子を不活性化する変 異を引き起こして、ウイルスの再生を無能力化するまたは妨げる、あるいは癌細 胞 の無制御増殖を終結するまたは減少させるために有用である。変異誘発オリゴヌ クレオチドはまた、増殖を抑制するその能力を失ったリプレッサー遺伝子を活性 化するための有用な抗癌剤である。 変異原性の三重鎖形成性オリゴヌクレオチドはまた、部位特異的変異誘発また は標的変異誘発を引き起こすための分子生物学の研究手段として特に有用である 。部位特異的変異誘発は、正常遺伝子を標的にするためおよびDNA修復のような メカニズムの研究のために有用である。マウス卵母細胞のような動物卵母細胞に おける特異的遺伝子の標的変異誘発は、研究および療法のための遺伝子工学にと って、ならびに研究および農業のための「導入変異(transmutated)」動物および 植物の新種の生成に有用でかつ強力な手段を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、λゲノムの標的変異誘発のためのプソラレン連結三重鎖形成性オリゴ ヌクレオチドを示す概略図である。λゲノムsupFゲノムのマップが示され、部位 特異的変異誘発のための標的遺伝子、supFサプレッサーtRNA遺伝子を含んでいる 。supF遺伝子（149位〜183位）の部分配列の上に、167位〜176位の三重鎖形成の 部位が、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドであるpso-AG10（4'ヒドロキシメチル -4,5',8-トリメチルプソラレン-^5'AGGAAGGGGG^3'）の配置により示されている。 矢印は、プソラレン部分が167位のA:T塩基対に標的されていることを示している 。supF遺伝子に加えて、λベクターは、非標的変異誘発を評価するために用いら れるcIλリプレッサー遺伝子を有する。 図2aおよび図2bは、プソラレン連結三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（pso-AG 10）によるsupF遺伝子における標的変異誘発の配列分析を示す。図2aでは、pro- AG10およびUVAにより生成された変異を各塩基対の上に示し、記入された塩基は 、上部鎖における配列からの変化を示している。配列の下の＋のサインは、その 変異が検出可能な表現型の変化を生成することが知られている部位であり、この アッセイ中におけるsupFの使用が、任意の特定部位で検出を偏らせないことを示 す。星印は、167位の標的塩基対を示す。DNA配列のデータは、Connellら、Biote chniques 5：342(1987)の方法に従ってλファージプラーク由来のsupF遺伝子を ポ リメラーゼ連鎖反応増幅後、自動化方法により得た。図2bは、プソラレンなしでsupF 中に生成された変異を、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドAG10により生成さ れた変異と比較するために、図１のλsupFベクターを用いてマウスＬ細胞中で、 8-メトキシプソラレン(8-methoxypsoralen)およびUVAによりsupFで誘発された、 またはBredbergおよびNachmansson、Carcinogenesis８：1923(1987)の方法に従 って、サルVero細胞におけるプラスミドシャトルベクターを用いて生成された、 変異の編集(compilation)である。 図３は、SV40 DNAの標的変異誘発の戦略を示す概略図である。10塩基の三重鎖 形成性オリゴヌクレオチドのプソラレンAG10（4'ヒドロキシメチル-4,5',8-トリ メチル-5'AGGAAGGGGG3'）を、SV40ベクターのpSP189内に含まれるsupF遺伝子中 の標的配列（167〜176塩基対）の上に直接示す。プソラレン-AG10は、SV40ベク ターDNAとインキュベートされて、部位特異的三重鎖を形成する。長波長紫外線 （320〜400nm）を用いた照射によりプソラレンの光活性化が、矢印で示されるよ うな、標的塩基対（167）で付加物を生成するように設計されている。次いで、 オリゴプラスミド複合体を、サルCOS-7細胞にトランスフェクトし、そして48時 間の間複製させる。Hirtの溶解手順（Hirtら、J．Mol．Biol．26：365-369(1967 )）によるベクターDNAの精製の後、このDNAを用いて、E．coli SY204 lacZ125(A m)を形質転換する。形質転換体は、supF遺伝子が変異により不活性化されている 変異体（白色コロニー）の検出および単離のためにX-galおよびイソプロピルチ オ-β-D-ガラクトシド(isopropylthio-β-D-galactoside)（IPTG）を含有するア ンピシリンプレート上で選択される。 図４は、Hinf I切断を用いて、supF遺伝子内の部位特異的三重鎖形成を検出す るための、制限酵素保護アッセイの基礎を示す概略図である。その標的部位(sup F 遺伝子のbp 167〜176)でプソラレン-AG10による三重鎖の形成は、bp 164〜168 （適切な塩基対のまわりをボックスにより図中に示した）でHinfＩ制限部位と重 複している。未保護の250bp supF PCRフラグメントのHinfＩを用いた切断により 、150bp、65bp、および35bpのサイズの３つのフラグメントが生じることが予想 される。対照的に、bp 167〜176での三重鎖形成によりブロックされるbp 164〜1 68のHinfＩ部位を用いると、150bpおよび100bpのサイズのフラグメントが予 想される。 図5Aおよび5Bは、プソラレン連結三重鎖形成性オリゴヌクレオチドのプソラレ ン-AG10によるpSP189 SV40ベクター内のsupF遺伝子における標的変異誘発の配列 分析である。図5Aでは、プソラレン-AG10およびUVAにより生成される点変異を各 塩基対の上に示し、記入された塩基は上部鎖における配列からの変化を示す。欠 失変異をsupF配列の下に、破線で示す。明らかな塩基変化を伴う１つの欠失につ いて示された塩基は、上部鎖の配列からの変異を示す。配列の下の＋のサインは 、その変異が検出可能な表現型の変化を生成することが知られている部位であり 、このアッセイにおけるsupFの使用が、任意の特定部位での検出を偏らせないこ とを示す。星印は、167位の標的塩基対を示す。図5Bは、λファージシャトルベ クターを用いてマウスＬ細胞中で8-メトキシプソラレンおよびUVAによりsupFに おいて誘発された、またはSV40シャトルベクター（pZ189）を用いてサルVero細 胞中で生成された変異の編集である。この編集は、プソラレンなしでsupF中で生 成され得る変異を比較して示すために本研究で用いた編集とほぼ同一である。 図６は、サルCOS細胞におけるSV40 DNAの標的変異誘発の戦略を示す概略図で ある。プソラレンを、プソラレンホルホルアミダイト(psoralen phosphoramidit e)として三重鎖形成性オリゴヌクレオチド中に合成によって取り込んだ。SV40シ ャトルベクターpSupFG1は、pSP189の誘導体であり、そしてsupF遺伝子中に設計 された三重鎖結合部位を有していた。このプラスミドをサルCOS-7細胞にトラン スフェクトする。その後、このオリゴヌクレオチドを、この細胞に添加し、48時 間の間複製させる。長波長紫外線（320〜400nm）を用いた照射によるプソラレン の光活性化は、変異を生成するように設計されている。Hirt溶解手順(Hirtら、J .Mol．Biol．26：365-369(1967))によるベクターDNAの精製の後、このDNAを用い て、E．coli SY204 lacZ125（Am）を形質転換する。形質転換体は、supF遺伝子 が変異により不活性化された変異体（白色コロニー）の検出および単離のために X-galおよびIPTGを含有するアンピシリンプレート上て選択される。 図７は、supFGlaと命名された修飾supF遺伝子のヌクレオチド配列および２次 元構造である。成熟tRNAのアミノ酸アクセプターステムにおいて塩基の対合を維 持するための、bp 101でT:AからG:Cへの補償的な変化と共に、A:TからC:Gへの 塩基変換が配列中に取り込まれ、それによって、ポリプリン／ポリピリミジンの 並びにおいてbp 167での中断が除去された。さらに、13bpのポリプリン／ポリピ リミジン配列を、bp 183と184との間に挿入して、この遺伝子におけるポリプリ ン／ポリピリミジンの並びを30bpまで伸長した。この構築物は、２つの中断を有 する30bpのポリプリン部位を含んでいる。 図８は、supFG2と命名された修飾supF遺伝子のヌクレオチド配列および２次元 構造である。この配列は、43bpのポリプリン部位および２つの中断を含む。 図９は、変異誘発オリゴヌクレオチドpso-AG10（白四角）およびpso-AGT30（ 菱形）のオリゴヌクレオチド濃度(Ｍ)に対する最大結合パーセントのグラフであ る。 図10は、pso-AGT30およびUVAを有するCOS細胞の処理によってSV40ベクター(pS upFGla)内のsupF遺伝子を標的にした変異の配列の配列分析である。 発明の詳細な説明 変異原性の三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、および遺伝子療法、抗ウイルス 治療学、科学的研究、ならびに細胞、動物、および植物の遺伝子工学に使用する 方法が提供される。変異誘発オリゴヌクレオチドは、標的DNA分子中の選択部位 に特異性を有して結合して、三重鎖領域を形成し、それによって、付着される突 然変異原を標的部位に近接させ、そしてその中に変異を引き起こす。好ましくは 、この変異は、標的部位を含む遺伝子の活性および機能を活性化し、不活性化し 、または改変する。オリゴヌクレオチド 本発明のオリゴヌクレオチドは、二本鎖DNA分子の所定の領域に特異性を有し て結合またはハイブリダイズして三本鎖構造を形成し得る、合成のまたは単離さ れたオリゴヌクレオチドである。好ましくは、二本鎖分子の所定の領域は、遺伝 的欠陥を引き起こす変異の部位、癌遺伝子活性化を引き起こす部位、または癌遺 伝子サプレッサーの阻害もしくは不活性化を起こす部位のような、標的遺伝子の 欠損または必須部分を含むか、または近接している。最も好ましくは、この遺伝 子はヒト遺伝子である。 好ましくは、オリゴヌクレオチドは、７ヌクレオチドと40ヌクレオチドとの間 の長さ、最も好ましくはインビトロ変異誘発には10〜20ヌクレオチドの長さ、お よびインビボ変異誘発には20〜30ヌクレオチドの長さの一重鎖DNA分子である。 塩基組成は、好ましくは、ホモプリン(homopurine)またはホモピリミジン(homop yrimidine)である。あるいは、塩基組成は、ポリプリンまたはポリピリミジンで ある。しかし、他の組成もまた有用である。 三本鎖構造を形成する好ましい条件および第３の鎖の所望のヌクレオチド組成 は、当業者に周知である。（例えば以下を参照のこと、MoserおよびDervan、Sci ence 238：645（1987）；Praseuthら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：1349（ 1988）；Mergnyら、Biochemistry 30：9791（1991）；BealおよびDervan、Scien ce251：1360（1991）；Mergnyら、Biochemistry 30：9791（1991）；ならびにBe alおよびDervan、Nuc．Acids Res．11：2773(1992)、これらは本明細書中で参考 として援用する。） 好ましくは、変異誘発オリゴヌクレオチドは、高緊縮度(stringency)および高 特異性の条件下で標的核酸分子にハイブリダイズする。最も好ましくは、オリゴ ヌクレオチドは、二重鎖DNAの主溝において配列特異的な様式で結合する。核酸 配列に対するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのインビトロ三重ら せん形成のための反応条件は、オリゴヌクレオチドの長さ、G:C塩基対およびA:T 塩基対の数、ならびにハイブリダイゼーションにおいて利用される緩衝液組成の ような因子に依存して、オリゴヌクレオチドごとに変化する。第３番目の鎖の結 合コードに基づき、二本鎖核酸分子の標的領域に対して実質的に相補的な変異誘 発オリゴヌクレオチドが好適である。 三重らせん形成の有用な測定は、三重鎖の平衡解離定数、Ｋ_dである。この平 衡解離定数は、三重鎖形成が最大値の半分(half-maximal)のときの変異誘発オリ ゴヌクレオチドの濃度として評価し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、 生理的相互作用の範囲で標的配列に対して結合親和性を有する。好ましい変異誘 発オリゴヌクレオチドは、約８×10^-7Ｍに等しいかそれ以下のＫ_dを有する。最 も好ましくは、Ｋ_dは、有意な細胞間相互作用を達成するために、８×10^-9Ｍに 等しいかそれ以下である。突然変異原 オリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されて5'末端、3'末端、または内部の部 分で突然変異原を含み、その結果、突然変異原が、修飾を必要な遺伝子内の部位 に近接する。好ましくは、突然変異原は、ヌクレオチド合成の間にオリゴヌクレ オチド中に取り込まれる。例えば、プソラレンC2ホスホルアミダイト(psoralen C2 phosphoramidite；Glen Research，Sterling，VA)は、Takasugiら、Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A．88:5602-5606(1991)、Giaら、Biochemistry 31：11818- 11822(1992)、Giovannangeliら、Nucleic Acids Res．20：4275-4281(1992)、お よびGiovannangeliら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:8631-8635(1992)(こ れらのすべては、本明細書に参考として援用される)の方法に従って、オリゴヌ クレオチド配列内の特定の位置に挿入される。 突然変異原はまた、共有結合によりオリゴヌクレオチドに結合され得る。例え ば、突然変異原は、Liuら、Biochem．18：690-697(1979)、ならびにKitagawaお よびAilawa、J．Biochem．79：233-236(1976)(両方とも本明細書に参考として援 用される)の方法に従って、スルホ-m-マレイミドベンゾリ-N-ヒドロキシスクシ ンイミドエステル(sulfo-m-maleimidobenzoly-N-hydroxysuccinimide ester；su lfo-MBS、Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)のようなリンカーにより、オリ ゴヌクレオチドに結合する。あるいは、突然変異原は、プソラレンのような突然 変異原をオリゴヌクレオチドに結合させる光活性化によりオリゴヌクレオチドに 結合される。 突然変異原は、二本鎖DNA分子の所望される部位で突然変異を引き起こし得る 任意の化学薬品であり得る。好ましくは、この変異は、遺伝子の正常な機能的配 列を回復させ、癌遺伝子を不活性化しまたは癌遺伝子サプレッサーを活性化し、 もしくは機能を改変しまたはウイルス遺伝子を不活性化する。 化学的突然変異原は、自発的に、または、例えば光への暴露によるなどの突然 変異原の活性化の後のいずれかで変異を引き起こす。 好適な突然変異原は、UVA照射による活性化を必要とするプソラレン、UVA照射 により活性化され得そして光の非存在下において有効であり得るアクリジンオレ ンジ、およびアルキル化剤、cis-プラチナアナログ(platinum analog)、ヘマト ポルフィリン(hematoporphyrin)およびヘマトポルフィリン誘導体、マイトマイ シンC、¹²⁵I、³⁵Sおよび³²Pのような放射性核種、および放射線と相互作用して 突然変異原になる分子(例えば、中性子(neutron)捕捉して相互作用するホウ素、 およびオージェ電子と相互作用するヨウ素)を包含する。特に、アクリジンオレ ンジを用いて、遺伝子不活性化に有用なフレームシフト突然変異を引き起こし得 る。 突然変異原の活性化に必要な場合、皮膚細胞のような身体表面上の細胞に、処 置を必要とするこの領域を通常の光源に曝すことにより光を送達し得る。身体内 の細胞に対しては、当業者に公知の方法を用いて光りファイバー(fiber optics) またはレーザーにより光を送達し得る。光活性化突然変異原を活性化するに十分 な光を提供する標的発蛍光団(fluorogen)がまた、有用な光源を提供し得る。投与方法 好ましくは、変異誘発オリゴヌクレオチドは、水溶液のような生理学的に受容 可能なキャリア中に溶解され、またはリポソーム中に取り込まれ、そしてこのキ ャリアまたはリポソームは、遺伝子療法または抗ウイルス治療を必要とする動物 のような、遺伝子操作を受ける生物中に注入される。哺乳動物における好ましい 注入ルートは静脈内である。特別の送達方法、ビヒクルまたは溶液を用いないで 、マウスのような動物中の細胞および組織によりオリゴヌクレオチドが摂取され ることは当業者により理解される。 インビトロ研究試験には、変異誘発オリゴヌクレオチドを含む溶液が、当業者 に周知でそして以下の実施例により詳細に記載される方法に従って、目的のDNA 分子を含む溶液に直接添加される。インビボ研究試験は、プラスミドDNAで細胞 をトランスフェクトし、そして変異誘発オリゴヌクレオチドを、成長培地のよう な溶液中で、このオリゴマーが細胞に入りそして三重鎖形成のために十分な時間 、トランスフェクト細胞とインキュベートすることにより実施される。このトラ ンスフェクト細胞は、懸濁液または固相に付着した単層中に存在し得、またはオ リゴヌクレオチドが細胞外体液中にある組織内の細胞であり得る。次いで細胞を 照射しプソラレンを活性化して光付加物(photoadduct)を、そしてその結果標的 部位に変異を形成する。使用方法 標的遺伝子が遺伝子疾患の原因である変異を含む場合、そのときは変異誘発オ リゴヌクレオチドは、標的遺伝子のDNA配列を正常に回復し得る変異誘発修復に 有用である。例えば、変異誘発オリゴヌクレオチドは、鎌状細胞貧血、サラセミ アおよびその他の異常ヘモグロビン症におけるヒトβ-ヘモグロビン遺伝子のよ うな欠陥遺伝子の変異誘発修復に有用であり得る。標的遺伝子が、癌細胞におけ るような非調節増殖を引き起こす癌遺伝子の場合、そのときは変異誘発オリゴヌ クレオチドは、この遺伝子を不活性化する変異を引き起こし、そして細胞の非制 御増殖を終結または減少させるために有用である。この変異誘発オリゴヌクレオ チドはまた、増殖を抑制するその能力を失ったリプレッサー遺伝子を活性化する ための抗癌剤である。さらに、変異誘発オリゴヌクレオチドが、ウイルスの適切 な増殖または機能に必要なウイルスゲノムの一部分に特異的である場合、この変 異誘発オリゴヌクレオチドは、抗ウイルス剤として有用である。 変異誘発三重鎖形成性オリゴヌクレオチドはまた、分子生物学研究手段として 使用され得、例えば、DNA修復のようなメカニズムの研究のために任意の遺伝子 において部位特異的変異誘発を引き起こす。オリゴヌクレオチドはまた、DNAに 付加物を送達し、そしてこの付加物が種々の実験条件下でどのように変異にプロ セスされるかを試験することによりDNA修復を試験するために使用され得る。 変異誘発三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、以下の非限定的な実施例を考慮 してさらに理解され得る。実施例１： λファージゲノムのsupF遺伝子の部位特異的標的変異誘発 5'末端でプソラレン(psoralen)に連結した三重鎖形成オリゴヌクレオチドを用 いて、完全な二重鎖λファージゲノム中の特異的遺伝子における部位特異的標的 変異誘発を達成した。プソラレン連結オリゴヌクレオチドを、Oligos Etc．(Wil sonville，OR)またはM.Talmor(Yale University，New Haven，CT)からGlen Rese arch(Sterling，VA)からの材料と共に入手した。製造業者により提供された指示 に従い、プソラレンをオリゴヌクレオチド合成の際にプソラレンホスホルアミダ イト(psoralen phosphoramidite)として組み込んだ。 図３に図示されるように、プソラレンをλDNAの標的部位に送達するために部 位特異的な三重鎖形成を設計し、UVA照射を用いてプソラレンを活性化して付加 物を形成させ、それによりその部位で変異を誘導した。標的遺伝子における変異 の配列解析は、ほとんど全てが標的領域にあることを示し、56％が、標的塩基対 での同一のT:AからA:Tへのトランスバージョンであることが見出された。標的変 異誘発と非標的変異誘発との比を、三重鎖を形成しない（がプソラレンと連結し ている）オリゴヌクレオチドの解析を伴う、λゲノム内の非標的遺伝子における 変異誘発の同時解析により推定した。標的変異は、非標的変異の頻度より少なく とも500倍高い頻度で生成されたことが見出された。 選択された標的遺伝子は、図１に示されるように、λファージベクターである λ supFのゲノム内に含まれているsupFであった。ここで、supFはE．coliのアン バーサプレッサーチロシン(tyrosine)tRNA遺伝子の１つである。supF遺伝子の16 7位−176位で三重鎖を形成し得る10塩基のホモプリン(homopurine)オリゴヌクレ オチドAG10（5’AGGAAGGGGG3'）を同定した。AG10がsupF遺伝子に結合する能力 を、supF遺伝子全体を含む250 bpフラグメントとのインビトロ結合反応において³² Ｐ標識AG10を用いて例証した。 標的した部位特異的三重鎖形成を変異誘発の研究の序段階として例証するため に、10％ショ糖(sucrose)、20mMのMgCl₂、10mMのTris（pH8.0）、および１mMの スペルミジン(spermidine)中(容量10μl)で結合アッセイを２時間37℃で行った 。250 bp supF標的を、ポリメラーゼ（polymerase）連鎖反応を用いてλsupFか ら生成した。各オリゴ(200ng)を、50μCiのγ^-32Ｐ-ATP（Amersham，Arlington Heights，IL）で標識し、そしてG-25スピンカラム（Boehringer Mannheim，Indi anapolis，IN）を通すことにより未反応のγ^-32Ｐ-ATPから分離した。反応混合 物中のオリゴマーの濃度は、６×10-8Mであり、そしてオリゴマー：supF比はモ ル基準で約１：１であった。競合物（competitor）は、存在する場合には、200 倍モル過剰で用いた。 ２時間の結合工程の後、90mMのTris塩基、90mMのホウ酸（boric acid）、20mM のMgCl₂中の４％アクリルアミド（acrylamide）ゲル上に20％のアクリルアミド （acrylamide）プラグを用いて、反応混合物を流した。オリゴマーについて記載 したように、100bpラダー（BRL，Bethesda，MD）を末端標識し、サイズの参照 としてゲル上に流した。定電圧(150V)で４時間流した後、Kodak X-ARフィルムを 用いて１時間、オートラジオグラフィーによりゲルを視覚化した。電気泳動ゲル は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド「AG10」のsupF遺伝子標的への結合を示した 。三重鎖形成をアッセイするために、³²Ｐ標識オリゴヌクレオチド、すなわちAG 10（^5'AGGAAGGGGG^3'）または逆配列オリゴマー(GA10)のいずれかを、完全supF遺 伝子を含む240 bp二重鎖フラグメントと共にインキュベートした。結合反応の生 成物を、ポリアクリルアミド（polyacrylamide）ゲル電気泳動およびオートラジ オグラフィーにより視覚化した。 電気泳動ゲルにおいて、添加したsupF DNA（レーン２）への標識AG10の結合を 、250 bp supFフラグメントに適切な位置での新たなバンド移動(migrating)によ り示した。supF標的DNAが存在しない場合には、この位置にはバンドは観測され なかった（レーン１）。過剰の未標識AG10は、³²Ｐ標識したAG10と競合した（レ ーン３）が、過剰の逆配列オリゴマー（GA10、5’GGGGGAAGGA3'）は、AG10と競 合しなかった（レーン４）。レーン５〜８では、³²Ｐ標識したAG10のsupFへの結 合は検出されなかった：（レーン５）supFを有さないGA10のみ；（レーン６）GA 10およびsupF；（レーン７）GA10およびsupFならびに過剰の未標識GA10；（レー ン８）GA10およびsupFならびに過剰のAG10。 逆配列オリゴマーであるGA10は、supFに結合せず、結合に関してAG10と競合も しなかった。２炭素リンカーアーム(pso-AG10)を介して4'ヒドロキシメチル-4,5 ',8-トリメチルプソラレン（4'hydroxymethyl-4,5',8-trimethylpsoralen）に連 結したAG10は、UVA照射後、標識した二重鎖supF DNAへの共有結合を形成したが 、逆オリゴマー(pso-GA10)は形成しなかった。 標的変異誘発を、pso-AG10をλsupF DNAと共にインビトロでインキュベートし 、supF遺伝子の167位−176位で三重鎖を形成させ、そして係留した(tethered)プ ソラレンを表１に示すように167位の標的塩基対の近傍に入れることにより達成 した。表中の数字は、示された処理後のλsupFゲノム中のsupF遺伝子またはcI遺 伝子のいずれかにおいて認められた変異の頻度を表す。３nMのλDNAを、1000倍 モル過剰の示されたオリゴヌクレオチド（３μM）と共にまたはなしでインキュ ベートした。 選択したサンプルのUVA(365nm)照射を1.8J/cm²の線量で行った。ラジオメータ ーを用いてランプ出力を測定した（320〜400nmで５〜７mW/cm²の典型的なUVA照 射量）。Hohn、Methods in Enzymology 68:299-309(1979)の方法を用いてDNAを インビトロでファージ粒子内にパッケージし、そしてファージ粒子をE．coliに 吸収させ、個別のプラークとして増殖させてsupFおよびcI遺伝子の遺伝子解析を 行った。AG10はsupF遺伝子に特異的に結合したが、逆配列GA10は結合しなかった 。 CT8（列３）は、AG10の3'側の８個のヌクレオチドに相補的であるが、これを 、プソラレン−AG10と共に30分間１：１の比で予めインキュベートして、二重鎖 DNAを形成し、そしてプソラレン−AG10がsupF遺伝子中の標的部位で三重鎖を形 成する能力を部分的に阻害した。 プソラレンの光活性化により、DNA付加物を生成し、そしてプソラレン−AG10- λsupF DNA複合体をインビトロでパッケージングすることにより細菌中でファー ジを増殖させ、付加物を変異内に固定した。ファージ粒子を個別のプラークとし て細菌菌叢上で増殖させて、supF遺伝子中の標的変異誘発を検出し、そして関連 のない遺伝子（λレプレッサー(cI)遺伝子の機能についてスクリーニングするこ とにより、非標的変異誘発の程度を測定した。これらの遺伝子における変異は、 青色のプラーク中の無色のプラークと、濁ったプラーク中の透明なプラークとを それぞれ生じる。 λDNAのPso-AG10およびUVAによる処理により、supFにおいて0.233％の変異頻 度が生じたが、cIにおいては約100倍少ない0.0024％の頻度であった。cI(765 bp )がsupF(184 bp)より大きな変異誘発標的であり、そして変異が検出可能である これら２つの遺伝子中の塩基対のパーセントが同程度であることを考慮すると、 標的変異誘発の特異性は、この100倍の差よりもさらに大きく、恐らく500倍程度 である可能性が極めて高い。この標的サイズの差異は、逆オリゴマーであるpso- GA10により誘導されるsupF変異体対cI変異体の５倍の差異により例証された。さ らに、逆オリゴマーは、pso-AG10よりも582倍低い頻度（0.0004％）のsupF変異 を与えたが、cI変異については同様な頻度であった。実際、逆オリゴマーによる 変異誘発は、バックグラウンド（未処理のλDNA）をわずかに超えた。 三重鎖の形成を部分的に阻害するために、AG10の10塩基のうちの８個に相補的 な８塩基オリゴマー(CT8)（5’CCCCCTTC 3'）を１：１の比でpso-AG10と予めイ ンキュベートし、二重鎖複合体を形成した。この予め形成された複合体をλsupF と共にインキュベートし、UVAで照射したときには、この複合体は、0.016％のsu pF 変異しか生じなかった。これは、プソラレン-AG10のみを用いる場合よりも15 倍低い。顕著な変異誘発は、pso-AG10の欠如下ではUVAのみ(1.8J/cm²)によって は生じず、UVAを行わないpso-AG10によっても生じなかった。このことは、UVAに よるプソラレンの活性化の重要性を示し、そして三重鎖形成自体は、変異誘発性 でなかったことを示す。このデータは、pso-AG10によるsupF遺伝子の標的変異誘 発の遺伝子的な証拠を提供した。 実施例２： 三重鎖形成オリゴヌクレオチドを用いた標的変異誘発により得られ る変異体の配列解析 標的変異誘発の直接的な証拠を得るために、pso-AG10およびUVAによりλベク ターのsupF遺伝子において生成される一連の独立した変異体を配列決定した。25 種のこのような変異体の配列を図2aに示す。pso-AG10により生成された25種の変 異のうちの１つ以外は全て167位の標的T:A塩基対にあるかまたはその付近にある 。変異の56％は、まさに標的塩基対(#167)での同一のT:AからA:Tへのトランスバ ージョンから構成される。このことは、pso-AG10による標的の特異性と再現性と を示す。167位でのA:T塩基対は、プソラレンがAG10において係留する5'アデニン (adenine)と三重鎖を形成し、そのためにこの塩基対は、プソラレンに最も近接 した塩基対である。この部位におけるT:AからA:Tへのトランスバージョンが圧倒 的に支配的であることは、ピリミジン(pyrimidine)、および特にチミジン(thymi dine)と付加物を形成する傾向があるプソラレンの変異誘発作用と一致する。こ れらの変異は独立であり、そしてどの変異もシブリング(sibling)を表さないこ とに留意すべきである。なぜなら、各パッケージングされたλ粒子は、単一の別 個のλプラークを細菌菌叢上で生じるからである。 変異は、Glazerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:1041(1986)ならびにBred bergおよびNachmansson、Carcinogenesis 8:1923（1987）（これらを本明細書中 で参考として援用する）により記載されているように、シャトルベクターを用い る他の実験系において、遊離8-メトキシプソラレン(8-methoxypsoralen)およびU VAによりsupF遺伝子中で誘導されることが見出された。この編纂データは、遊離 プソラレンが付加物を形成し、そして167位の塩基対から離れたsupF中の多数の 異なる部位で変異を誘導し得ることを示す。分散した変異分布は、三重鎖を形成 するpso-AG10により誘導される特異的な変異誘発とは対照的である。図2bに列記 した幾つかの変異は、167位−176位でのホモプリン(homopurine)／ホモピリミジ ン(homopyrimidine)連続(run)の領域にあるが、それらのいずれも167位では生じ ない。逆オリゴマーであるpso-GA10により誘導される２つの変異はいずれも167 位の塩基対では生じないことが見出された。 pso-AG10により生成される変異のスペクトルは、ほとんど全てが三重鎖を形成 するオリゴヌクレオチドにより標的されたことを示す。大部分の変異は、標的16 7位であり、同一のT:AからA:Tへのトランスバージョンから構成されていたが、 幾つかの変異は、167位の付近の塩基対であった。２炭素リンカーアーム上のAG1 0に係留されているプソラレン部分は、時折167位のT:A塩基対を超えて、ピリミ ジン(pyrimidine)の付近で付加物を形成し、変異を起こす可能性がある。付加物 が167位にあったとしても、付加物を変異内に固定する細菌のポリメラーゼおよ び修復酵素は修復および複製の間に付近の部位で変異を生成するが、同時に167 位で付加物を修復およびバイパスする可能性もある。２つの近接塩基対（３つの 例全てにおいて166位および167位）での塩基変化を含む幾つかの変異の発生は、 167位の付加物が付近の位置での変化を引き起こし得るという考えを支持する。p so-AG10による希な非特異的変異誘発（およびバックグラウンドを超える、pso-G A10による非常に少量の変異誘発）は、オリゴヌクレオチドに係留されているに も関わらずプソラレン分子がDNA内のランダムな部位に付加物を挿入および形成 し得る潜在的な能力に起因し得る。この非特異的な活性の低減は、より短い係留 鎖(tether)（例えば、１炭素リンカーアーム）により、プソラレンを三重鎖を形 成するオリゴヌクレオチドに付着するか、または遊離のプソラレンを直接光活性 化してオリゴヌクレオチドに結合させることによってプソラレンを三重鎖を形成 するオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドに直接連結することにより、プソラレ ンを三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドに結合させ、そして所望の生成物を精 製することにより、プソラレンの到達および自由度を低減することにより達成さ れ得る。 この実験では、0.233％の標的変異頻度が得られた。実施例３： プソラレンとオリゴヌクレオチドとの共有結合 変異原である5-アミノメチル-8-メトキシプソラレン(5-aminomethyl-8-methox ypsoralen)をオリゴヌクレオチドに共有結合した。 5-アミノメチル-8-メトキシプソラレン(5-aminomethyl-8-methoxypsoralen)(5 am8mop、HRI Associates，Emeryville，CA)を、0.05Mのリン酸(phosphate)緩衝 液、pH８中でのリンカーであるスルホ-m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシ スクシンイミドエステル(sulfo-m-mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide es ter)(スルホ-MBS、Pierce Chemical Co.、Rockville，IL)と、１:40の5am8mop対 スルホーMBSのモル比で混合した。Liuら、Biochem．18:690-697(1979)およびKit agawaおよびAilawa、J．Biochem．79:233-236(1976)、ならびにPierce Immunote chnology Catalog and Handbook，1992-93版、A16-A17頁の指示に従って、遮光 しながら混合物を室温で30分間撹拌した。１mlの総容量および１mMの5am8mopを 用い、必要に応じて反応をスケールアップしそして最適化しながら、初回の作業 (run)を行った。 Gasparroら、J．Invest．Derm．90:234-236(1988)に記載されているように、8 -メトキシプソラレン(8-methoxypsoralen)の分析に用いられる標準条件の変法を 用いるHPLCにより、修飾した5am8mopを精製した。初期条件は、以下の通りであ った：アセトニトリル(acetonitrile)と水または0.05M、pH4.5の酢酸アンモニウ ム(ammonium acetate)緩衝液のいずれかとの間の勾配をかける(running)Regis R exchrom^TMフェニル15cm HPLCカラム。10％アセトニトリル(acetonitrile)から60 ％アセトニトリル(acetonitrile)まで50分かけて直線勾配をかけた。最初の精製 作業を実施する際に緩衝液が必要とされたときには、試料をHPLCから回収し、脱 水し、そしてアセトニトリル(acetonitrile)：水の勾配混合物を用いて再度HPLC を通すことにより脱塩した。検出器は、SpectraFocus^TM走査型UV検出器であり、 220〜360の波長をサンプリングした。検出器をPharmacia Frac-100^TMフラクショ ンコレクターに接続した。 次いで、0.05Mのリン酸(phosphate)緩衝液、pH 7〜7.5中で、当モル量の修飾5 am8mopをオリゴヌクレオチドと室温にて３時間遮光しながら混合することにより 、精製し修飾された5am8mopを、-SH係留鎖を有するオリゴヌクレオチドと反応さ せた。 次いで、Gasparroら、Antisense Res．Dev．1:117-140(1991)の方法の変法を 用いるHPLCにより、5am8mopに係留されたオリゴヌクレオチドを精製した。アセ トニトリル(acetonitrile)と0.2M、pH 5.9の酢酸トリエチルアンモニウム（trie thylammonium acetate）緩衝液との間で40分かけて５％〜20％のアセトニトリル (acetonitrile)の直線勾配をかけるNest Group MRPH 10cmHPLCカラムを用いた。実施例４：三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを用いた、SV40 DNAの標的 変異誘発 サル細胞内にトランスフェクトされたSV40 DNAの標的変異誘発を調べるために 、以下を行った。これらの実験において、SV40 DNA中の標的部位にプソラレンを 送達するために、部位特異的三重鎖形成を設計し、UVA照射を用いてプソラレン を活性化し、その部位に付加物を形成させ、そしてサル細胞におけるウイルスゲ ノムの修復および複製により、付加物を変異に固定した。これらの結果は、標的 変異誘発が哺乳動物細胞において、細菌における（0.2％）よりもさらに一層効 率的に起こる（６％の標的変異を受けたSV40ゲノム）ことを示す。 材料および方法 オリゴヌクレオチドおよびベクター。プソラレン(psoralen)連結オリゴヌクレオ チドを、Oligos Etc．(Wilsonville，OR)またはM．Talmor(Yale University，Ne w Haven，CT)のいずれかから、Glen Research(Sterling，VA)からの材料と共に 得た。プソラレン(psoralen)を、プソラレンホスホルアミダイト(psoralen phos phoramidite)としてオリゴヌクレオチド合成の際に組込み、図３に示すように、 オリゴヌクレオチドの５'末端で、２炭素リンカーアームを介して4'-ヒドロキシ メチル-4,5',8-トリメチルプソラレン(4'-hydroxymethyl-4,5',8-trimethylpsor alen)に結合するオリゴヌクレオチドを生じる。本研究で用いたオリゴヌクレオ チドの配列は、AG10(5'AGGAAGGGGG3')およびGA10(5'GGGGGAAGGA3')を含む。SV40 シャトルベクターpSP189は、Dr．Michael Seidman(Otsuka Pharmaceuticals，Be thesda，MD)により構築され、そして彼から得た。 三重鎖結合アッセイ。結合アッセイを、10μl容量の10％庶糖(sucrose)、20mM M gCl₂、10mM Tris(pH8.0)、および１mMスペルミジン(spermidine)中37℃で２時間 行った。250bp supF標的を、λsupFからポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成した 。 PCR増幅したsupF標的を用いる保護アッセイ。250bp supF標的(70nM)を、結合ア ッセイについて記載したように、100倍モル過剰なプソラレン-AG10(psoralen-AG 10)と共にインキュベートした。サンプルの放射線照射を1.8J/cm²の線量で行っ た。ラジオメーターを用いて、ランプ出力を測定した(320-400nmで５〜７mW/cm² の代表的なUVA照射量)。結合および照射工程に続いて、サンプルを37℃で２時間 HinfIで切断した。負荷(loading)緩衝液を添加して、そしてサンプルを、55℃で 10分間加熱し、そしてTAE緩衝液中4.5％Nusieveゲル上て80V(10V/cm)にて１時間 流した。種々の条件下で、250bp supF遺伝子PCRフラグメントのHinfI切断物のア ガロースゲル電気泳動による分析を行った。150kDaのサイズに相当する薄いバン ドがレーン１に存在したが、それは、プソラレン-AG10(psoralen-AG10)もUVAも 含んでいなかった；150kDaのサイズに相当するバンドがレーン２に存在したが、 それは、UVAのみを含んでいた(プソラレン-AG10(psoralen-AG10)がない)；150kD aのサイズに相当するバンドがレーン３に存在したがそれはプソラレン-AG10(pso ralen-AG10)およびUVAを含んでいた；150kDaのサイズに相当するバンドがレーン ４に存在したが、それは、プソラレン-AG10(psoralen-AG10)のみを含んでいた(U VAなし)；約300kDaのサイズに相当しているバンドがレーン５に存在したが、そ れは切断されていないsupF PCRフラグメントである；レーン６はサイズマーカー (100bpラダー)を含み、そしてバンドは、100、200、および300kDaに存在した。 SV40ベクターDNA標的を用いる保護アッセイ。結合および照射を、pSP189を50nM の濃度でsupF標的として用い、そしてプソラレン-AG10(psoralen-AG10)を１：１ 〜1000：１のオリゴマー対ベクターの比で添加したことを除いて、上記のように 行った。照射およびゲルの条件は、上記のとおりである。 コロニーハイブリダイゼーション。supF遺伝子変異を含むシャトルベクタープラ スミドを有するSY204のアンピシリン耐性コロニーを、適切なコントロールコロ ニーと共に、LB/アンピシリンプレート上で生育し、そしてさらなる生育および 標準的な方法によるコロニーハイブリダイゼーションを可能にするインサイチュ における溶解のために、レプリカのナイロンフィルター上に移した。DNAをUV架 橋によりフィルターに固定し、そしてフィルターを６×SSC、５×Denhardt溶液 、0.5％SDS、および５×10⁵cpm/mlの³²Ｐ標識オリゴヌクレオチド中42℃で18時 間インキュベートした。フィルターを１×SSCおよび0.1％SDS中て30分間25℃で 洗浄し、そして次いで、１×SSCおよび0.1％SDS中42℃で２時間洗浄した。これ らの条件は、野生型プローブ(５'GGT TCG AAT CCT TCC CCC3')の結合と167位変 異プローブ(5'GGT TCG AAA CCT TCC CCC3')の結合との間での区別を可能にする ため に経験的に決定した。オリゴヌクレオチドプローブの結合をオートラジオグラフ ィーにより決定した。 SV40変異誘発。80nMでSV40ベクターDNA(pSP189)を、プソラレン-AG10(psoralen- AG10)またはプソラレン-GA10(psoralen-AG10)(２〜1000倍モル過剰)と共にイン キュベートし、そして上記のように照射した。次いで、オリゴヌクレオチドープ ラスミド複合体を、カチオンリポソーム(DOTAP、Boehringer Mannheim、Indiana polis，IN)を用いて、培養皿中５μg/mlの最終濃度で、サルCOS-7細胞(ATCC #16 51-CRL)にトランスフェクトした。DNA/オリゴ/リポソーム混合物を、細胞培養皿 に振とうしながら滴下して加えた。翌日、リポソーム混合物を含む培地を新鮮な 培地に置き換えた。修復および複製を可能にするため48時間後、SV40ベクターDN AをHirt溶解手順によりCOS細胞から回収した。SV4Oベクター中のsupF遺伝子の遺 伝子分析を、12〜150ngのDpnI切断Hirt溶解DNAおよびPulse Controllerを装備し たBio-Rad Gene Pulser装置(Bio-Rad，Richmond，CA)を用いるエレクトロポレー ションにより、E．coli SY2O4[lacz125(Am)]をアンピシリン耐性に形質転換する ことにより実施した。変異体を、Glazerら、Mol．Cell Biol．7:218-224(1987) に記載のとおり、65μg/ml IPTGおよび80μg/ml X-Galの存在下での増殖により 同定した。これらの形質転換体をカウントし、そして変異体(白色コロニー)を単 一コロニーのために画線した。 DNA塩基配列決定。DNAを、配列決定のために、Promega Magic Miniprep kit(Pro mega，Madison，WI)を用いて、３mlの細菌培養物からDNAを単離することにより 調製した。DNA配列データを、自動化方法を用いて、プラスミドDNAの直接鎖終止 配列決定することにより得た。 結果 SV40における標的変異誘発のためのストラテジー。 SV40を基づいたシャトル ベクター(pS189)を用いて、標的変異誘発についてアッセイした。このベクター は、SV40およびpBR328の両方の複製起点、ならびにアンピシリン耐性のためのβ −ラクタマーゼ遺伝子を含み、哺乳動物細胞および細菌の両方でエピソーム複製 を可能にする(図３)。それはまた、変異誘発研究のマーカー遺伝子として、E． ｃoli のアンバーサプレッサーチロシンtRNA遺伝子の１つであるsupF遺伝子を有 す る。 このベクター系において、SV40 DNAを、適切な処理後、修復および複製が起こ り得るサルCOS細胞に導入し、哺乳動物のDNA損傷のプロセッシングを示す変異体 を生成する。小さな環状のベクターDNAを、染色体DNAから生化学的に分離するこ とにより細胞から回収する(Hirt溶解、Hirtら、J．Mol．Biol．26:365-369(1967 ))、そしてそれを用いてlacZ(アンバー)変異を有するE．coliを形質転換し、色 素原基質X-galの存在下でβ-ガラクトシダーゼ活性(lacZにおいてアンバー変異 の抑制を介して生産される)についてコロニーをスコアリングすることによりsup F 遺伝子の機能の分析が可能になる。野生型supF遺伝子を有するベクターは、青 色コロニーを生じる；supFに変異を有するベクターは、白色コロニーを生産する 。哺乳動物細胞で複製または修復されなかったウイルスDNAから生じ得る誤った データを除去するために、細菌を形質転換する前に、ウイルスDNAを酵素DpnIで 切断する。この酵素は、その認識部位で哺乳動物パターンによってメチル化され ていないDNAを制限する。 SV40 DNAに変異を標的するための最初の実験の設計を図３に示す。supF遺伝子 の10塩基対領域(bp167位−176位)を、その場のホモプリン／ホモピリミジン連鎖 (run)のために、三重鎖形成し易い部位として同定した。この連続は、Ｇに富む ので、三重鎖形態のプリンモチーフを選択した(BealおよびDervan，Science 251 :1360-1363(1991))、そしてオリゴヌクレオチドである5'AGGAAGGGGG3'(AG10)を このモチーフに基づいて合成した。プソラレン(psoralen)誘導体、4'-ヒドロキ シメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン(4'-hydroxymethyl-4,5',8-trimethylps oralen)をオリゴヌクレオチドに２炭素リンカーアームを介して５'側のアデニン でホスホジエステル(phosphodiester)結合により、bp167に変異を指向する目的 で、オリゴヌクレオチドに結合した。これは、５'側のアデニンが、推定三重ら せんにおいて結合する塩基対である。プソラレン-AG10(psoralen-AG10)オリゴヌ クレオチドは、二重らせんDNAにおけるプリンに富む鎖に対して逆並行に向いて いる。標的変異誘発を達成するために、pSP189 DNAをプソラレン（psoralen）連 結オリゴヌクレオチド(プソラレン(psoralen)-AG10)と共にインキュベートし、 プソラレン(psoralen)を活性化して塩基対167のチミジンに前変異原性付加物(pr e-mutagenic adduct)を形成するために、長波長紫外線(UVA)で処理し、そして次 いでCOS-7細胞にトランスフェクトした。修復および複製を可能にするための48 時間後、ウイルスDNAをサル細胞から単離し、DpnIの切断に供し、そしてE．coli を形質転換するために用いた。supF変異の頻度を決定し、そしてさらなる分析の ためにsupF変異体クローンの代表的なサンプルを回収した。 三重鎖DNAの部位特異的形成。この実験は、制限酵素保護アッセイを用いて、プ ソラレン-AG10(psoralen-AG10)がsupF遺伝子内の目的の部位に特異的に結合する 能力を示す。このアッセイでは、プソラレン-AG10(psoralen-AG10)が、UVA照射 後に、二重らせんsupF DNAに部位特異的に結合し、このことが三重鎖標的部位(1 67位-176位)にオーバーラップする一方のHinf I部位(塩基対164位-168位)で制限 酵素切断をブロックするが、supFの他方のHinf I部位(塩基対129位-133位)では しないことを見出された。これは、図４に図解され、そしてオリゴヌクレオチド 対SV40 DNAの比の関数としてSV40ベクター内の三重鎖DNAの部位特異的形成を示 す電気泳動ゲルにより示される(データは示さない)。supF標的遺伝子(50nM)を含 むSV40ベクターを、プソラレン-AG10(psoralen-AG10)と共に、オリゴマー対ベク ターの比が１：１〜1000：１でインキュベートし、1.8J/cm²のUVAで照射し、Hin f Iで切断し、そして4.5％ Nusieveゲル上で流した。レーン１、切断していない プラスミドDNA；レーン２、切断前のプソラレン-AG10(psoralen-AG10)がない； レーン３〜７、各レーンの上記に示されたようにプソラレン-AG10(psoralen-AG1 0)/SV40 DNAの比を増加；レーン８、100bpサイズのマーカー(BRL-Gibco)。SV40D NA中のsupF遺伝子に隣接する配列は、上記のゲルに存在するPCRフラグメント中 の配列と異なるので、そしてSV40中には多数のHinfI部位があるので、バンドの パターンは、上記のゲル中のバンドよりさらに複雑であった。しかし、このゲル は、サイズマーカー100と200との間のバンドを有する三重鎖形態により、bp164 位〜168位でのHinf I部位の保護から生じるフラグメントの位置を示す。 非保護の250bpのsupF PCRフラグメントのHinfIでの切断は、250bp非切断フラ グメント(レーン６)とは対照的にサイズ150、65、および35の３つのフラグメン トを生じ(レーン１)、プソラレン-AG10(psoralen-AG10)と共に有するsupFフラグ メントをインキュベートし同時にUVAで光活性化すると(レーン３)、65bpおよび3 5bpフラグメントの代わりに100bpフラグメントの出現により示されるように、bp 129位-133位のHinfI部位ではなく、bp164位-168位のHinfI部位の保護を生じる。 UVAが誘導する共有付加物(covalent adduct)の形成は、制限酵素保護に必要であ る。なぜなら、プソラレン-AG10(psoralen-AG10)のみは、HinfI切断を妨げるの に不充分である(レーン４)からである。プソラレン-AG10(psoralen-AG10)の非存 在下では、UVA光は、HinfI切断に影響しなかった(レーン２)。同様の実験で、Hi nfI切断からの保護は、プソラレン(psoralen)に結合した逆配列オリゴマーであ るプソラレン-GA10(psoralen-GA10)を用いた場合見られない。このデータは、プ ソラレン-AG10(psoralen-AG10)/supF複合体のUVA照射後の標的部位で起こるsupF 遺伝子フラグメントの共有結合の改変(covalent modification)による、プソラ レン-AG10(psoralen-AG10)による三重鎖DNAの部位特異的形成を示す。 同様の実験を、SV40ベクター自身内で、supF遺伝子中のbp167位-176位へのプ ソラレン-AG10(psoralen-AG10)の部位特異的結合についてアッセイするために行 った。これらの実験では、オリゴヌクレオチド対ベクターDNAの様々な比が、ウ イルスゲノムの三重鎖結合の基本的なパラメーターを試験するために使用された 。上記のゲルは、標的部位でのHinfI保護が、10：１のオリゴヌクレオチド対ベ クターの比でほぼ完成であること示す。それは、臭化エチジウム(ethidium brom ide)染色したアガロースゲルに125bp（矢印）のバンドが現れ、そして90bpのバ ンドが消失することにより判断した。100：１および1000：１の比は、完全に近 い保護を同様に生じたが、一方で、１：１および２：１というより低い比は、部 分的な保護のみを与えた。これらの結果は、下記の変異誘発実験と一致する。 COS細胞中で継代したSV40ベクターDNAの標的変異誘発。SV40ベクターDNA中で 、三重鎖形成オリゴヌクレオチドを用いて、標的変異誘発を誘導するための実験 を図３に示すように行った。プソラレン(psoralen)連結オリゴヌクレオチドを、 SV40ベクタ-DNAと共にインキュベートし、1.8J/cm²のUVA光に曝し、そしてCOS細 胞へトランスフェクトした。修復および複製が生じることが可能な２日後、ベク ターDNAを細胞から回収(rescue)し、そして細菌を形質転換するために用い、sup F 遺伝子の遺伝子解析を容易にした。ベクター中のsupF遺伝子に部位特異的に結 合するプソラレン-AG10(psoralen-AG10)のsupF変異を誘導する際の効果を、特異 的な結合を示さないプソラレン-GA10(psoralen-GA10)の効果と比較した。オリゴ ヌクレオチド対ベクターDNAの種々の比は、サル細胞において標的変異誘発のプ ロセスの特異性および効率に影響し得るパラメーターを調査するために用いた。 表２は、これらの実験からのデータを示す。supF遺伝子における標的変異を、10 00：１のオリゴヌクレオチド対ベクターDNAのモル比てプソラレン-AG10(psorale n-AG10)を用いて、7.3％程度の高い頻度で、SV40ゲノム中に生成した。これと同 じ比で、プソラレン-GA10(psoralen-GA10)は、バックグランドを超える(0.5％対 0.07％)で、少量の変異誘発を生成した。しかし、試験されたより低い比では、 逆オリゴマーは、アッセイでバックグランド頻度を超える有意な変異誘発を生じ なかった。一方、これらのより低い比で、プソラレン-AG10(psoralen-AG10)は、supF において高頻度の変異をまだ生じていた(10:1でのプソラレン-GA10(psorale n-GA10)についての0.06％および未処理DNAベクターについての0.07％に対して10 :1の比で6.4％程度の高い頻度)。これは、変異誘発が、プソラレン-GA10(psoral en-GA10)ではなくプソラレン-AG10(psoralen-AG10)によりSV40ベクター中のsupF 遺伝子を、特異的に標的することを示す。SV40における標的変異誘発のこの頻度 (６％〜７％の範囲)は、E．coliで増殖するバクテリオファージλ中のsupF遺伝 子を標的する先の実験で見られる頻度(0.23％、Havreら、Proc．Natl．Acad．Sc i．90:7879-7883(1993))より30倍高く、そしてこのことはサル細胞が、誤りがち な修復またはバイパス(bypass)複製のいずれかを介して、プソラレン(psoralen) ／オリゴヌクレオチド付加物の変異誘発前傷害を変異へとさらに効率的にプロセ スすることを示唆する。 コントロール実験では(表２)、プソラレン(psoralen)連結オリゴヌクレオチド の非存在では、SV40 DNAのUVA照射は、バックグランドを超える変異誘発を生成 しなかった。同様に、UVA照射を伴わないオリゴマーでのSV40 DNAの処理は、変 異誘発性でなかった。 標的変異の配列解析。プソラレン-AG10(psoralen-AG10)(1000:1の比で)および UVA光によりSV40ベクター中のsupF遺伝子に生じた１セットの20変異体をDNA配列 解析にかけた。この解析の結果を図５Ａに示す。解析した20変異体のうち11が、 繰り返し起こるbp167位での同一のT:AからA:Tへのトランスバージョンからなる 。 これは、図５Ａおよび５Ｂで図解するように、変異がプソラレン-AG10(psoralen -AG10)により標的された、まさにその塩基対である。配列決定した変異の55％が 、標的塩基対で正確に同じ塩基変化からなることの発見は、目的の塩基変化(bp1 67位でT:AからA:Tへ)が全てのウイルスゲノムの４％より多くで生成されたこと を示唆する。解析した他の変異は、標的塩基対に近接した塩基対での３箇所の点 変異およびこの塩基対を含むまたはこの塩基対に隣接する６つの小さな欠失を含 む。SV40 DNAがサル細胞で複製されるので、これらは、bp167位での三重鎖特異 的傷害のプロセッシング、修復、または複製バイパスにおける変異（variation ）から生じる可能性が高い。２炭素リンカーアームによりオリゴヌクレオチドに 係留されたプソラレン(psoralen)分子は、近傍の塩基対で付加物を形成するため の十分なリーチおよび自由度を有する。改善した変異特異性は、リンカーアーム の長さを減少することにより達成され得る。図５Ｂには、遊離8-メトキシプソラ レン(8-methoxypsoralen)を用いてこの同じベクター系で生成されたsupF変異の 公開された配列を比較のために示す。これらの変異は、より散在しているだけで なく、塩基対167位には、なにも生じていなかった。 SV40ベクターにおける変異誘発の分析では、同一の変異が独立して生じたかど うか、または同一の変異が、その後のベクター複製により増幅した単一な変異事 象の結果であるかどうかを決定することは、しばしば困難である。このようなシ ブリング(sibling)変異がこれらの実験で単離される可能性を排除するために、p SP189系の有益な特徴を使用した。この系で、100,000より多くの異なったランダ ムな配列の８塩基対オリゴヌクレオチドを、supF遺伝子の隣のpSP189の領域にク ローニングした。ベクターDNAを、異なる８bp配列を含むベクタークローンのこ のライブラリーからひとまとめに調製する。このように、変異体ベクターのsupF 遺伝子の配列を確かめると同時に、特定のプラスミド分子の８塩基対のシグナル 配列もまた、配列データにさらに２、３の余分な塩基を読み取ることにより同定 され得る。このことは、同じsupF変異を有するプラスミド中の８塩基対のシグナ ル配列の間で比較を可能にし、これらが同じ変異事象由来のシブリングかどうか 、またはこれらが独立した変異かどうかを調べた。この分析に基づき、ここで示 す20の全ての変異が、独立して生じたと決定した。 これらの結果を強化しそして確認するために、プソラレン-AG10(psoralen-AG1 0)およびUVA光によりSV40ベクター中に生成するsupF変異のより大きなサンプル を、bp167位での予測される高い割合のT:AからA:Tへのトランスバージョンに基 づく他の方法により分析した。直接配列決定の代わりに、判別オリゴヌクレオチ ドハイブリダイゼーションの技術を用いた(Sidranskyら、Science 252:706-709( 1991))。変異アッセイを能率化するための努力がなされたこのアッセイでは、変 異supF遺伝子を含むアンピシリン耐性細菌コロニーを、ナイロンフィルター上で 生育し、核酸ハイブリダイゼーションを可能にさせた。２つのフィルターを、野 生型配列と一致するか、または167位のT:AからA:Tへの変異配列と一致するかの いずれかである、³²P標識した18塩基のオリゴヌクレオチドと共にインキュベー トした。ハイブリダイゼーションを、変異体および野生型の配列の間の区別を可 能にするのに十分厳しい条件であるように経験的に決定した条件下で、標準方法 により実施した。この特別な実験でアッセイした19個のコロニーのうち９個が、 変異体プローブに特異的なハイブリダイゼーションを示した。上部右角のポジテ ィブコントロールを除いては、どれも野生型プローブへのハイブリダイゼーショ ンを示さなかった。167位プローブに結合した９コロニーにとって、これは、ア ッセイの妥当性を支持する。いずれの変異体プローブに結合しない他の10コロニ ーにとって、野生型プローブへの結合性の欠如は、それらが、プローブによりカ バーされる18bpの領域内で、bp167位での別の変異(T:AからA:Tへではない)を有 するか、またはbp167位付近に変異を有するかのいずれかであり、野生型および 変異オリゴヌクレオチドの両方との不一致を引き起こすことを示唆する。プソラ レン-AG10(psoralen-AG10)により生じた合計42個の変異体を、この方法(塩基配 列分析する20個の被験体を含む)により分析し、そして22この変異体(52％)は、b p167位でT:AからA:Tへの変異を有することが見出された。残りの全ては、標的塩 基対でまたはその付近に別の変異を有すると判断された。なぜならば、変異体お よび野生型プローブのいずれもそれらにハイブリダイズしなかったからである。 このアッセイの妥当性は、配列決定のデータと100％一致することにより支持さ れた。これらの結果は、直接配列決定データを拡張し、そしてSV40ベクターDNA の標的変異誘発をさらに示す。以上をまとめると、これらのデータはプソラレン -AG10(psoralen-AG10)により生じたほぼ全ての変異が、標的塩基対に、または標 的塩基対の２、３の塩基内にあり、そして少なくとも50％が、この部位での同じ T:AからA:Tへのトランスバージョンからなることを示唆した。これらの結果は、 サル細胞において継代したSV40 DNA中の標的塩基対での特異的で、再生可能、か つ予想可能な変異の効率的な生成を示す。 実施例５：細胞内標的化変異誘発 サルCOS細胞内に細胞内三重らせんを形成することによって介在されるSV40ベ クターの標的化変異誘発を示す実験を行った。この結果により、細胞をプソラレ ン連結オリゴヌクレオチドにより処理し次にプソラレンを長波長の紫外光（UVA ）により光活性化させることにより、サル細胞で複製するウイルスゲノムにおい て特異的な再生性の変異が生成され得ることが示された。supF遺伝子内の改変標 的部位セットおよび一連のオリゴヌクレオチドを用いて、この実験により、イン ビボによるアッセイにおける標的化変異誘発は、標的部位に対する変異誘発性オ リゴヌクレオチドの特異性およびオリゴヌクレオチド結合の強さに依存すること が示された。この結果はまた、哺乳類細胞内のオリゴヌクレオチド特異的標的の 時間依存性および濃度依存性の両方の予備分析を提供する。 材料および方法 オリゴヌクレオチドおよびベクター。プソラレン連結オリゴヌクレオチドはOl igos Etc．(Wilsonville，OR)から入手した。プソラレンをプソラレンホスホル アミダイト(phosphoramidite)としてオリゴヌクレオチド合成に取り込み、図６ に示すように、２炭素リンカーアームを介してその5'末端で4'-ヒドロキシメチ ル-4',5',8-トリメチルプソラレン(4'-hydroxymethyl-4',5'.8-trimethylpsoral en)に結合したオリゴヌクレオチドが得られた。本実験で用いられるプソラレン 結合オリゴヌクレオチドの配列には以下のものが含まれる。 SV40シャトルベクターであるpSupFGlaおよびpSupFG2は、pSP189（上述）の誘 導体であり、supF遺伝子に組み込まれる新規の三重鎖結合部位を有した。改変su pF遺伝子は、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL、第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1990)（本明細書において参考 として援用）に記載されているような標準的な方法を用いて、合成オリゴヌク レオチドを、本来のsupF遺伝子内のXhoI部位からEagI部位までに挿入することに よって構築した。 三重鎖結合アッセイ。supFGlaのbp157から213までに対応する配列を含む２つ の相補的な57-merを合成した。両方のオリゴマーをγ-[³²P]-ATPで標識した。両 方の57-merを1:1の割合でTE緩衝液内で混合し、37℃で２時間インキュベートす ることにより二重鎖DNAを調製した。一定濃度の二重鎖DNA（１×10^-10M）を、10 mM Tris（pH7.4）、１mMスペルミジン（spermidine）、および20mM MgCl₂の10μ l中で37℃で２時間、プソラレン連結オリゴマーの濃度を上昇させながらインキ ュベートした。UVA照射（365nmを中心とした広帯域紫外光1.8J/cm²、放射度５mW /cm²）を用いて、光付加生成物（photoadducts）を生成し、これによりオリゴマ ーをこれらの標的に共有結合させた。サンプルを90μlのホルムアミド（formami de）と混合し、各サンプル20μlを、SDSおよび7M尿素を含有する8%ポリアクリル アミド変性ゲル上で分析した。反応生成物の定量化のために燐光体イメージャー （phosphor-image、Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）を用いた。三重鎖形 成（特異的光付加生成物の生成により示される）が半最大であるときの濃度を平 衡解離定数（Kd）とした。 変異誘発プロトコル。プラスミドによる細胞のトランスフェクションおよびプ ソラレン−オリゴヌクレオチドによる細胞処理は以下のようにして行った。サル COS-7細胞をATCC(1651-CRL)(Rockville，MD)から入手した。70%集密（confluenc e）のCOS細胞をPBS-EDTAで洗浄し、トリプシンにより処理して、37℃で５分間イ ンキュベートした。細胞をDMEM/10%FCSで再懸濁し、Sorvall RT6000D遠心分離機 を用いて５分間（４℃）900rpmで遠心分離することにより３度洗浄した。細胞を １×10⁷細胞/mlで再懸濁した。３μgのDNA/10⁶細胞でプラスミドDNAを添加し、 細胞/DNA混合物を10分間氷上に放置した。細胞のトランスフェクションは、0.4c mキュベット内に25μF/250W/250Vの設定でバイオラッド(Bio-Rad)遺伝子パルサ ーを用いてエレクトロポレーションによって行った。エレクトロポレーションの 後、細胞を氷上に10分間放置した。細胞を成長培地で希釈し、洗浄し、そして37 ℃で30分間転移させた。この時点で、細胞をさらに希釈して成長培地中でオリゴ ヌクレオチドに曝すか、または洗浄し、さらに希釈し、12時間皿に付着させ、 PBS/EDTAにより再び洗浄し、トリプシン処理し、成長培地で３度洗浄し、最後に 懸濁液中でオリゴヌクレオチドに曝した。いずれの場合でも、プソラレン結合オ リゴヌクレオチドを懸濁液中で細胞に添加し、次に15分毎に穏やかに撹拌して37 ℃でインキュベートした。指示された各時間に1.8J/cm²の線量でUVA照射を行っ た。細胞を成長培地中でさらに希釈し、15cm²の皿１枚に対して１×10⁶個の細胞 の密度でプラスチック皿に付着させた。 48時間後、改変アルカリ溶解法を用いて、ベクターDNA単離のために細胞を採 取した。細胞を100μlの細胞再懸濁溶液（50mM Tris/HCL、10mM EDTA、pH 8.0； 100μg/ml RNase A）中で再懸濁し、細胞溶解溶液（0.2M NaOH、1% SDS）100μl を添加した。室温で５分経過後、中和溶液（3M 酢酸カリウム、pH 5.5）100μl を添加した。室温で15分間インキュベートした後、10分間微量遠心分離機で遠心 分離を行った。等量のフェノール／クロロホルム（1:1）で一度、清澄な上清を 抽出し、2.5容量のエタノールを用いて-70℃で10分間、DNAを沈殿させた。10分 間の遠心分離によりDNAを回収し、70%のエタノールで一度洗浄し、室温で５分間 風乾した。DNAをDpn IおよびRNase Aにより37℃で２時間消化し、フェノール／ クロロホルムにより抽出し、エタノールを用いて沈殿させた。DNAペレットを10 μlのTE緩衝液（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）中で溶解し、１μlのベクターD NAを用いて、E.coli SY204またはMBM7070をエレクトロポレーションによって形 質転換した。形質転換されたE.coli細胞を、50μg/mlのアンピシリン、100μg/m lのX-gal、および1MのIPTGを含有するLBプレート上にのせ、37℃で一晩インキュ ベートした。変異コロニーおよび全コロニーを計数した。DNA配列分析のために 、変異コロニーを精製し、プラスミドを単離した。 DNA配列決定。精製された変異体の単独コロニーを取り出して、アンピシリン （50μg/ml）を含有する5mlのＬブロスとし、37℃で16〜20時間、250rpmで振盪 することによりインキュベートした。３ミリリットルの培養物由来の細胞を遠心 分離によって採集した。プラスミドDNAの単離は、ウィザードプラスミドミニプ レップDNA精製システム（Wizard plasmid miniprep DNA purification system； Promega，Madison，WI）を用いて行った。1.5μgのプラスミドDNAを用いて、標 準的な方法を用いて、製造業者（Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA） の使用説明書に従ってABIサイクル配列決定キット（ABI cycle-sequencing kit ）を用いてDNA配列決定を行った。ベクター中のsupF遺伝子の直上流側のβ-ラク タマーゼ（lactamase）遺伝子に結合させるために、配列プライマーを選択した 。 結果 変異誘発アッセイ。サルCOS細胞のインビボにおけるSV40ベクターの標的化変 異誘発を研究するために用いられるアッセイシステムの設計を図６に示す。哺乳 類細胞内での複製を可能にするために必要なSV40配列に加えて、SV40シャトルベ クターは、supF遺伝子、E.coliのサプレッサ-tRNA遺伝子を変異誘発のための標 的遺伝子として含む。また、細菌中での成長および選択のためにpBR327複製起点 およびβ-ラクタマーゼ遺伝子の一部を含む。エレクトロポレーションによりベ クターDNAをCOS細胞に導入した後、プソラレンがbp166-167で意図した挿入部位 に送達されるようにsupF遺伝子配列に結合するように設計されているプソラレン 連結オリゴヌクレオチドの存在下で細胞をインキュベートした。オリゴマーを細 胞内に入れ三重鎖形成を行うために可変時間を与えた後、細胞をUVAで照射して 、プソラレンを活性化させて光付加生成物を形成させ、そしてこの結果supF遺伝 子内の標的部位に変異体を形成させた。さらに48時間かけて修復および／または 複製を行った。アルカリ溶解法によりベクターDNAを細胞から採取し、これを用 いてlacZ（アンバー）E.coliを形質転換させて、COS細胞内で生じるsupF遺伝子 における変異を検出した。形質転換の前に、ベクターDNAのDpn I消化を用いて、 哺乳類のメチル化パターンを欠く複製されないベクター分子を除去し、これによ り未処理の投入分子から生じるデータの誤りを防止した。 10-merによる不十分なインビボによる標的。インビトロにおける実験に関する 上述の実験においては、supF遺伝子の10塩基対領域であるbp167〜176が、10ヌク レオチドのプソラレン連結オリゴマーであるpso-AG10を用いる逆平行モチーフに おける三重鎖形成について標的された。これらの実験では、三重鎖形成は、最適 化されたMg²⁺含有緩衝液中のインビトロにおける２時間のインキュベーション、 その後のインビトロにおけるUVA照射、および次の上述のベクター／オリゴヌク レオチド複合体の細胞へのトランスフェクションの間に起こった。変異は標的遺 伝子内約６〜７％の頻度で生成された。引き続いての実験では、SV40ベクターお よびpso-AG10を細胞に共トランスフェクトした後、２時間、細胞にUVA照射した 。このプロトコルにより、ベクター分子の2.1%に標的化変異が生じた。これは、 上述のインビトロにおける作業で観察された範囲内の頻度であった。しかし、上 記に概略を示したプロトコル（図６）において、pSP189ベクターにより既に予め トランスフェクトされた細胞を処理することによってsupF遺伝子に対する変異を 標的するためにpso-AG10を用いる試みは、バックグラウンド（0.02%）を超える 変異誘発がほとんど検出されない結果（0.05%）に終わった。 新規のsupF遺伝子の構築。この結果に基づいて、および様々な長さのオリゴヌ クレオチドに対して報告された結合定数に基づいて、三重鎖形成に順応性の30塩 基対ポリプリン／ポリピリミジンセグメントを含有する改変supF遺伝子を構築し た。理由は、10-mer（pso-AG10）による三重らせん形成に対する結合親和性が、 インビボにおける十分な相互作用を実現するには不十分であり得ると考えられた からである。新規の遺伝子配列をsupF遺伝子に取り込んで、bp166〜167を標的プ ソラレン挿入部位として用いて一連の潜在三重鎖形成オリゴヌクレオチドを試験 した。 インビボにおける三重鎖形成に影響を与える要因を特徴付け、そして細胞内変 異標的化の可能性を調べるために、アッセイシステムを開発した。 pSP189ベクターは、独特のXhoI部位とEagI部位との間の成熟tRNAをコードする 配列を包含する93bpセグメントを含む。合成オリゴヌクレオチドを用いて、この 93bpストレッチを新規の配列で置換した。新規のsupF遺伝子であるsupFG1aの設 計を図７に示す。ポリプリン／ポリピリミジン伸長におけるbp167での１つの中 断を除去するために、A:TからC:Gへのトランスバージョンを、成熟tRNAのアミノ 酸受容体ステム内に塩基対形成を維持するためのbp101での補償的なT:AからG:C への変化と共に、合成フラグメントに取り入れた。さらに、13bpのポリプリン／ ポリピリミジン配列をbp183と184との間に挿入し、遺伝子におけるポリプリン/ ポリピリミジン伸長の長さを30bpに延長した。181〜183位での5'CCA配列は、tRN Aの3'末端アミノ酸受容体部位を含むため、183位の3'側にある新規の配列は成熟 tRNA分子に影響を与えず、従って遺伝子の表現型を変更しない。合成オリゴヌク レオチドのベクターへのアニーリングおよび連結の後、機能的サプレッサー遺伝 子を含有する構築物をlacZ（アンバー）細菌の形質転換によって同定した。新規 のsupFG1a遺伝子の配列をベクターDNAの直接DNA配列決定によって確認した。新 規の構築物はちょうど２つの中断を有する30bpポリプリン部位を含有した。同様 の方法によって、図８に示すように、同じくちょうど２つの中断を有する43bpポ リプリン部位を含有する、supFG2もまた構築された。 三重鎖結合。supF、supFG1a、およびsupFG2におけるポリプリン部位での三重 鎖形成を比較するために、ゲル移動度シフトアッセイを用いた。このアッセイで は、24bp（supF遺伝子のbp160〜183に適合）、57bp（supFG1aのbp157〜213に適 合）、または59bp（supFG2のBP159〜217に適合）のいずれかの合成DNAフラグメ ントを、一連のオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成のための二重鎖標的として 用いた。対応するオリゴヌクレオチドであるpso-AG10、pso-AGT30、およびpso-A GT43を、逆平行モチーフにおいて、これらの遺伝子の10、30、および43bp部位に 結合するように設計した。supFG1aのbp167〜186に結合するように設計されたPso -AGT20もまた試験した。一定の濃度の放射性標識された二重鎖標的DNAをプソラ レン結合オリゴマーの濃度を上昇させてインキュベートし、濃度の範囲にわたっ て三重鎖形成をアッセイした。UVA照射（1.8J/cm²）を用いて、光付加生成物を 生成させ、これにより、変異誘発オリゴヌクレオチドをこれらの標的に共有結合 させ、サンプルの以後の操作により見かけの結合が変更されないことを確実にし た。次に変性ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによりサンプルを分析 した。 pso-AG10およびpso-AGT30のsupFおよびsupFG1a遺伝子中のそれらの各部位への 結合を分析すると、1.8J/cm²のUVAによる三重鎖分子の光活性化により、高い割 合の架橋（プソラレン鎖間架橋を介して二重鎖標的の両鎖に共有結合したプソラ レン−変異誘発オリゴヌクレオチド−XLバンド）および低い割合のプソラレンモ ノ付加生成物（プソラレンモノ付加生成物形成を介して二重鎖の一方の鎖にだけ 共有結合したプソラレン−変異誘発オリゴヌクレオチド−MAバンド）が得られる ことが示された。XLバンドとMAバンドとの合計を構成するサンプルの割合は、三 重らせん形成の程度に比例する。標的部位に三重鎖を形成し得ないオリゴヌクレ オチドがこのアッセイで用いられるとき、XLバンドもMAバンドも視覚的に認識さ れないので（不図示）、三重鎖形成を示すものとして付加生成物が得られ得る。 三重鎖形成オリゴヌクレオチドの濃度が増加すると、MAまたはXLとしての結合標 的二重鎖の非結合標的二重鎖に対する割合が増加する。図９のグラフ分析から理 解され得るように、pso-AG10およびpso-AGT30による三重鎖形成の濃度依存性は 全く異なる。三重らせん形成の有用な測定値は、三重鎖形成が最大値の１／２と なる変異誘発オリゴヌクレオチドの濃度として見積もられ得る平衡解離定数K_dで ある。pso-AG10では、K_dは、８×10^-7Mであり、pso-AGT30では、K_dは、３×10^-9 Mであり、270倍の差がある。pso-AGT30の三重鎖形成の親和性が高いことは、オ リゴヌクレオチドの長さおよび結合親和性に相互関連する他の研究の結果と一致 し、pso-AGT30のsupFG1aへの結合親和性は、生理学的相互作用の範囲内である。 同様の分析によって、supFG2へのpso-Agt43の結合では、１×10^-9MのK_d、supFG1 aへのpso-AGT20への結合では、８×10^-9MのK_dが示された。 インビボにおける標的化変異誘発。pSupFG1aを標的ベクターとして用いて、３ つのプソラレン連結オリゴヌクレオチドによって細胞内変異標的づけを研究する ために実験を行った。これらのオリゴヌクレオチドはすべて、supFG1a内の配列 と三重らせんを形成し、係留プソラレンをbp166-167に送達するように設計され た。しかし、オリゴマーは、以下の表３に示されるように、長さおよび三重鎖形 成に対する結合親和性が異なっていた。これらの実験において、オリゴマーを、 ベクターDNAを用いたエレクトロポレーション後約１時間細胞に添加した。次に 、オリゴヌクレオチドを添加後、２時間または８時間、細胞にUVAを照射した。 ２時間目および８時間目に、supF1a遺伝子内の変異誘発の程度を見たところ、各 変異誘発オリゴヌクレオチドによる三重鎖形成の測定強度に依存していた。２時 間目に、pso-AG10は、バックグランドを上回る変異誘発をほとんど示さなかった のに対して、pso-AGT30は、ベクター分子の１〜２％で変異を誘発した。８時間 目で、pso-AG10は、変異誘発を幾分か誘発しているのが見られたが、psoAGT30は 、標的遺伝子の５％で変異誘発を生じた。pso-AGT20によって生じられた変異誘 発のレベルは、これら２つの中間であった。これらの結果は、効率的なインビボ における三重鎖形成および変異標的化に対する要件を規定するのに役立つ。 UVA照射のタイムコース。変異誘発オリゴヌクレオチドによって仲介された細 胞内標的化変異誘発の速度論を調べた。このプロセスは、オリゴヌクレオチドの 細胞への侵入、核への移入、および三重鎖標的部位への特異的結合に依存する。 プソラレン光付加生成物の部位特異的生成を介して標的化変異誘発を成し遂げる ためには、これらの工程は、UVA照射が与えられる時間までに行われなければな らない。UVA照射の最適時間を決定するために、タイムコース実験を実施した。 このタイムコース実験では、pso-AGT30の細胞培地への添加後のUVA照射時間を変 化させた。この結果を表４に示す。UVA照射前の細胞内三重鎖形成のための時間 が増加するにつれて、標的化変異の量も増加し、８時間目で5.3%ほどの頻度とな った。従って、十分な時間が与えられると、プソラレン連結オリゴヌクレオチド は、細胞に侵入し、部位特異的三重らせんを形成し、５％の範囲の頻度でSV40ベ クターの標的化変異誘発を仲介する。 後の時点では、分子が分析のために細菌に形質転換される前に、続いて複製も 修復もされないベクターに対して遺伝的欠陥が標的されることが、理論的に考え られる。従って、COS細胞内に生成された永続性遺伝的欠陥の細菌プロセシング が生じ得る。このようなベクター分子は、それらが三重鎖形成およびUVA照射の 前にすでに複製されていた場合には、COS細胞内で複製されていない投入ベクタ ー分子を除去するように設計されたDpn I制限工程を免がれ得る。しかし、この 可能性に対処するために、我々は、pso-AGT30およびpSupFG1aにインビトロで三 重鎖を形成させ、その複合体に1.8J/cm²のUVA照射を行い、そのサンプルを用い て、COS細胞を通過させすにE.coliを直接形質転換した。わずか0.03%（4/15,000 ）の変異頻度が見られた。従って、この実験で観察された標的化変異誘発は、CO S細胞からの非プロセシングベクター分子の奪回によって説明され得ない。 オリゴヌクレオチド処理のタイムコース。上記の実験において、SV40ベクター DNAをエレクトロポレーションによって導入してから１時間以内に、細胞を変異 誘発オリゴヌクレオチドに曝した。トランスフェクトされたSV40ベクターは、サ ル細胞に導入されると、染色質中で覆われるが、このプロセスは、このような初 期の時点では、不完全であり得る。細胞をpSupFG1aでトランスフェクトし、成長 培地で皿に付着させ、12時間インキュベートするすべての実験を行った。次いで 、細胞をトリプシン処理によって脱離させ、成長培地中で３回洗浄し、そしてUV Aで照射する前に２時間、２μMのpso-AGT30の存在下でインキュベートした。こ の実験において、変異は、1.5%（150/10,175）の頻度でsupFG1a遺伝子内で生成 さ れ、これは、同一濃度のオリゴヌクレオチドに対する初期の時点での頻度(2.1%) と同一の範囲である。従って、SV40ベクターDNAにおける染色質アセンブリに十 分な時間より多い時間が当てられても、プソラレン結合オリゴヌレオチドは、ベ クター内のsupFG1a遺伝子において標的化変異を生成し得る。このことにより、 三重鎖形成が染色質についても生じ得ることが分かる。 この実験において標的化変異を検出することによって、観察される標的化変異 誘発が細胞内三重鎖形成によって仲介されることも確認される。12時間にわたる 細胞の増殖、トリプシン処理、希釈、および大がかりな洗浄の後では、いかなる ベクターDNAもオリゴヌクレオチド処理の時点で細胞外培地内で存続しないと思 われる。 濃度依存性。標的化変異誘発の濃度依存性もまた調べた。その結果を以下の表 ５に示す。SV40ベクターDNAを用いたCOS細胞のエレクトロポレーション後、細胞 を、0.1nMから２μMの濃度でpso-AGT30の存在下でインキュベートした。UVA照射 を８時間後に与えた。理解され得るように、ナノモル範囲の細胞外オリゴヌクレ オチド濃度で、低いが検出可能な頻度の変異誘発が観察された。このことは、ps o-AGT30およびsupFG1aの三重鎖形成のK_dが３×10^-9Mであることと一致する。細 胞内オリゴヌクレオチド濃度は、これらの実験では直接測定されなかったが、他 の研究で、オリゴヌクレオチドでの哺乳類細胞の処理によって、所定の細胞外濃 度と同一の範囲である濃度が細胞内で生成されることが報告されている。有意な レベルの標的化変異誘発は、１μMの細胞外変異誘発オリゴヌクレオチド濃度で 見られたが、これは、表３および４において示されるデータと一致していた。 配列分析．２時間目および８時間目にpso-AGT30によってsupF遺伝子内に誘導 された一連の36個の変異をDNA配列決定によって分析した。その結果を図10に示 す。これらのうち、28個(78％)は、bp166（予想されるプソラレン挿入部位）で のT:AからA:Tへのトランスバージョンであったのに対して、６個（17%）は、三 重鎖標的部位に広がる種々の部位の欠失であった。観察された欠失の頻度は、過 小評価であり得る。なぜなら、supFG1a遺伝子を取り巻く配列を含むより大きな 欠失が、ベクター複製に不可欠な遺伝子を不活性化し得るからである。従って、 このような欠失を受けた分子は、アッセイでは検出され得ない。これらの結果は 、細胞内変異標的化の特異性を示し、プソラレン付加生成物が標的部位での特異 的な点変異または欠失を生成し得ることを示唆している。 特異性：三重鎖形成の部分相同性の効果．変異誘発オリゴヌクレオチド仲介の 標的化変異誘発の特異性は、いくつかの要因によって影響され得る。その１つは 、プソラレン結合変異誘発オリゴヌクレオチドによる三重鎖形成に対する部分的 な 相同性を有するDNAにおける交互部位の存在である。この問題を、pso-AGT43によ るsupFG1aおよびsupFG2遺伝子の標的化変異誘発を比較することによって調べた 。Pso-AGT43は、supFG2の塩基対167-209で三重らせんを形成するように設計され ている。逆平行モチーフでは、pso-AGT43は、塩基対180および183での２つのT中 断を除いて、supFG2において43bp部位と正確に一致する（95％相同性）。対照的 に、pso-AGT43は、三重鎖形成に対してsupFG1aとわずか65％の相同性しか有さな い。pso-AGT43の最初の30個のヌクレオチドは、pso-AGT30のヌクレオチドと正確 に適合するため、pso-AGT43は、（180および183での避けがたい不適合を考慮す ると）、三重鎖形成に対して、supFG1aと28／43のヌクレオチド相同性を有する 。pso-AGT30については、pso-AGT43中の係留プソラレンは、塩基対166-167に挿 入するように標的される。概念的に同様の実験において、supFG1a遺伝子（これ に対しては、三重鎖を形成するように設計されている）と、元来のsupF遺伝子（ これに対しては、三重鎖形成に対して、わずか10／30のヌクレオチド相同性を有 している）との両方の標的化におけるpso-AGT30の比較を行った。これらの実験 において、エレクトロポレートされたCOS細胞を、UVA照射が行われる前に２時間 、２μM濃度の変異誘発オリゴヌクレオチド中でインキュベートした。 以下の表６に示されるように、pso-AGT43は、supFG1aに対して変異を効果的に 標的した。しかし、pso-AGT43は、バックグランド頻度を越えてsupFG1a遺伝子内 に変異を誘導しなかった。このことは、三重鎖形成に対するsupFG1aとの部分相 同性が有意なインビボ相互作用を仲介するには不十分であることを示唆している 。同様に、pso-AGT30は、supFG1aに対して変異を標的し得るが、pso-AGT30は、 非改変supF内に変異を誘導するには有効でない。これらの結果は、細胞内標的化 の特異性を示している。 pso-AGT43によってsupFG2内に誘導された標的化変異の頻度は、pso-AG10からp so-AGT20、pso-AGT-30へと増加が観察される（表３）のに対して、pso-AGT30お よびsupFG1aで見られるのよりも高くなかった。43ヌクレオチド長のGが豊富なオ リゴヌクレオチド（pso-AGT43）は、K⁺駆動自己会合を受けて、G-四分体を形成 し得、細胞内においてその有効性を制限することが考えられる。 上記の結果は、標的化変異を哺乳類細胞内に生成するための、オリゴヌクレオ チドを形成する三重らせんの使用を示している。変異源であるプソラレンに対す るオリゴヌクレオチドの連結は、プソラレンの作用に対する配列特異性を提供し 、これは、細胞内三重らせん形成を介して選択された部位に送達される。10^-9M 以上の範囲のK_dを有するオリゴマーは、有意な細胞内相互作用において好ましい 。オリゴヌクレオチド塩基組成およびバックボーン構造のような、生理学的な条 件下で三重鎖形成に影響を与え得る他の要因が、このタイプのアッセイを用いて 試験され得る。supF遺伝子内およびsupF遺伝子に近接した選択配列は、サプレッ サー活性をこわすことなく操作され得るので、細胞内三重鎖形成の他の局面を特 異的に調べるように設計された他の標的部位が構築され得る。 pso-AGT30によって標的された変異の配列を分析すると、予想されたプソラレ ン挿入部位（bp166）でT:AからA:Tへのトランスバージョンに対して高い特異性 を示した。タイムコース実験の結果は、オリゴヌクレオチドの細胞への侵入プロ セスおよび三重らせんの細胞内形成のプロセスが数時間にわたって起こることを 示している。後の時点で見られる変異体の増加した頻度は、一部には、これらの プロセスに必要な時間、および標的されたDNAの遺伝的欠陥を変異に形成する際 の修復および複製の相互作用を反映している。 本発明、すなわち、変異誘発三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびその使用 方法の変更および改変は、上記の詳細な説明から当業者に明らかである。このよ うな改変および変更は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．二本鎖核酸分子の部位特異的変異誘発のための変異誘発オリゴヌクレオチ ドであって、該二重鎖核酸分子の標的領域と三本鎖核酸分子を形成する配列を有 する一重鎖オリゴヌクレオチドに取り込まれる突然変異原を含む、変異誘発オリ ゴヌクレオチド。 ２．前記突然変異原が、プソラレン、アクリジンオレンジ、アルキル化剤、ci s-プラチナアナログ、ヘマトポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体、マイト マイシンＣ、放射性核種、および放射線と相互作用して突然変異原になる分子か らなる群から選択される、請求項１に記載の変異誘発オリゴヌクレオチド。 ３．前記突然変異原が、光の存在下で二本鎖核酸分子に変異を引き起こす、請 求項１に記載の変異誘発オリゴヌクレオチド。 ４．前記変異誘発化学物質が、4'ヒドロキシメチル-4,5',8-トリメチルプソラ レンである、請求項３に記載の変異誘発オリゴヌクレオチド。 ５．前記オリゴヌクレオチドが、20ヌクレオチド塩基と30ヌクレオチド塩基と の間の長さを有する、請求項１に記載の変異誘発オリゴヌクレオチド。 ６．核酸分子の部位特異的変異誘発の方法であって： a）変異誘発オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸分子の標的領域にハイブリダイ ズする工程、 ここで該変異誘発オリゴヌクレオチドは、該標的領域と三本鎖核酸分子を形成 する、一重鎖核酸中に取り込まれる突然変異原を含むオリゴヌクレオチドである ；および b）該二本鎖核酸分子を変異する工程 を包含する方法。 ７．前記変異工程の前に、前記突然変異原を活性化する追加の工程を包含する 、請求項６に記載の方法。 ８．前記突然変異原が、プソラレンおよびアクリジンオレンジからなる群から 選択され、そして光によって活性化される、請求項６に記載の方法。 ９．前記突然変異原が、アクリジンオレンジ、アルキル化剤、cis-プラチナア ナログ、ヘマトポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体、マイトマイシンＣ、 放射性核種、および放射線と相互作用して突然変異原になる分子からなる群から 選択される、請求項６に記載の方法。 １０．前記突然変異原が二本鎖核酸分子の活性を改変する、請求項６に記載の 方法。 １１．前記二重鎖核酸分子が遺伝子である、請求項６に記載の方法。 １２．前記遺伝子が癌遺伝子である、請求項６に記載の方法。 １３．前記遺伝子が欠陥遺伝子である、請求項６に記載の方法。 １４．前記遺伝子が欠陥ヒトβ-ヘモグロビン遺伝子である、請求項１３に記 載の方法。 １５．前記二本鎖核酸分子がウイルスゲノムの全てまたは一部分である、請求 項６に記載の方法。 １６．変異誘発オリゴヌクレオチドを生成する方法であって： a）第３鎖の結合コードに基づいて二本鎖核酸分子の標的領域に実質的に相補 的なオリゴヌクレオチドを合成する工程;および b）該オリゴヌクレオチド中に突然変異原を取込む工程、 を包含する方法。 １７．前記突然変異原が前記オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結する、請 求項１６に記載の方法。 １８．前記突然変異原が、前記オリゴヌクレオチドの合成の間に該オリゴヌク レオチド中に取り込まれる、請求項１６に記載の方法。 １９．前記突然変異原が、光活性化により前記オリゴヌクレオチドに結合する 、請求項１６に記載の方法。 ２０．前記突然変異原が、プソラレン、アクリジンオレンジ、アルキル化剤、 cis-プラチナアナログ、ヘマトポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体、マイ トマイシンＣ、放射性核種、および放射線と相互作用して突然変異原になる分子 からなる群から選択される、 請求項１９に記載の方法。