JP2013539363A - アデノウイルスの構築方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2010年8月16日に出願された米国仮出願第61/374,198号の利益を主張する。米国仮出願第61/374,198号は、その全体が、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
異なるヒト組織に感染する52種のヒトアデノウイルス、および魚類から霊長類までにわたる他の種に感染する数百のアデノウイルスが存在する。これらのウイルスは、感染後1時間以内にそれらのゲノムのペイロードを核に送達する非常に効率的なナノマシンである。DNAウイルスと同様に、これらは宿主DNA内には組み込まれず、確立されたGMPプロトコールを使用して高力価に産生させることができ、また、異所性遺伝子を発現させることに関して、研究およびヒト遺伝子治療への適用において安全性が実証されている。しかし、現在まで、これらの潜在的な適用は、ほぼ1つの変種、Ad5またはAd2/5キメラのみが用いられていること、および急速かつ系統的に複数の遺伝子改変を工学的に作り出し、組み合わせることができないことによって妨げられてきた。したがって、アデノウイルスベクターのレパートリーをAd2/5のそれを越えて広げる必要性および構成要素の部分から新規のアデノウイルスゲノムを急速に新規に構築することを容易にする科学技術的なプラットフォームを開発し、複数の改変および異種性エレメントの系統的な組み入れを可能にする必要性が高い。そのような系は、36遺伝子(スプライスバリアントを含めず)の送達および発現の両方において非常に効率的な天然のウイルスの構築様式(architecture)を利用する。この系により、異なる腫瘍試料において調節解除された経路活性の複合的かつ定量的な測定を組み入れる有力な診断薬および治療薬がもたらされ得る。
定義
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそのポリマー、ならびにその相補物を指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合(linkage)を含有する核酸、合成核酸、天然に存在する核酸、天然に存在しない核酸、参照核酸と同様の結合特性を有する核酸、および参照ヌクレオチドと同様に代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート(phosphoramidate)、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)が挙げられる。
I.Adsembly法
一態様では、組換えアデノウイルスを作製するための方法(本明細書では「Adsembly」とも称される)が提供される。当該方法は、E1モジュール、E2−L2モジュール、L3−L4モジュール、E3モジュール、E4モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュール(または下記のその変異体)から選択される2種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、E1モジュール、E2−L2モジュール、L3−L4モジュール、E3モジュール、E4モジュールまたはアデノウイルスマクロモジュールから選択される3種、4種または5種のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。上記核酸は、アデノウイルスゲノム構築物であってよい。アデノウイルスゲノム構築物は、発現されると(例えば、哺乳動物の細胞に導入されると)、組換えアデノウイルスを形成することができる核酸である。上記核酸は、追加的なウイルス(例えば、ヘルパーウイルス)と一緒に、発現されると(例えば、哺乳動物の細胞に導入されると)組換えアデノウイルスを形成することができる部分的なアデノウイルスゲノム構築物であってもよい。そのように形成されたアデノウイルスは、複製し、パッケージングして後代ウイルスを生じさせることができる。したがって、本明細書において提供される方法は、単独で、補完的細胞系中で、またはヘルパーウイルスと一緒に、のいずれかで哺乳動物の細胞にトランスフェクションすると、複製され、パッケージングされて後代ウイルスを生じさせる2つ以上のゲノムのモジュールまたは異種性エレメントから、in vitroでアデノウイルスゲノムを構築するステップを含むことができる。ゲノムのモジュールは、進化的に保存された配列、転写単位または機能単位に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、当該方法は、E1モジュール、E2−L2モジュール、L3−L4モジュール、E3モジュール、およびE4モジュールから選択される3種以上のアデノウイルス遺伝子のモジュールから核酸を構築するステップを含む。生じた核酸(本明細書では「構築された核酸」とも称される)は、構築した後に発現させ(例えば、複製、転写、翻訳、およびパッケージング)、それにより、組換えアデノウイルスを形成することができる。上記核酸の発現は、in vitroで、in situで、細胞内で(例えば、上記核酸を細胞にトランスフェクトすることによって)、またはin vivoで実施することができる。ある特定の実施形態では、その発現を細胞内で実施し、それにより、ウイルスの産生を導く。
E1−L2マクロモジュール(すなわち、E1モジュールおよびE2−L2モジュールを組み合わせて含む核酸);
E1−L4マクロモジュール(すなわち、E1モジュール、E2−L2モジュールおよびL3−L4モジュールを組み合わせて含む核酸);
E1−E3マクロモジュール(すなわち、E1モジュール、E2−L2モジュール、L3−L4モジュールおよびE3モジュールを組み合わせて含む核酸);
E2−L4マクロモジュール(すなわち、E2−L2モジュールおよびL3−L4モジュールを含む核酸、本明細書では「コアマクロモジュール」とも称される);
E2−E3マクロモジュール(すなわち、E2−L2モジュール、L3−L4モジュールおよびE3モジュールを組み合わせて含む核酸);
E2−E4マクロモジュール(すなわち、E2−L2モジュール、L3−L4モジュール、E3モジュールおよびE4モジュールを組み合わせて含む核酸);
L3−E3マクロモジュール(すなわち、L3−L4モジュール、およびE3モジュールを組み合わせて含む核酸)
L3−E4マクロモジュール(すなわち、L3−L4モジュール、E3モジュールおよびE4モジュールを組み合わせて含む核酸);および
E3−E4マクロモジュール(すなわち、E3モジュールおよびE4モジュールを組み合わせて含む核酸)
を指す。
いくつかの実施形態では、上記アデノウイルスマクロモジュールは、E2−L4マクロモジュール(すなわち、コアマクロモジュール)またはE3−E4マクロモジュールである。あるアデノウイルスマクロモジュールを、上記核酸を構築するための2種以上の選択されたアデノウイルスのモジュールの1つとして使用する場合、他の選択されたアデノウイルスのモジュール(複数可)は、そのアデノウイルスマクロモジュール内に含有される個々のアデノウイルス遺伝子モジュールではない。言い換えれば、個々のアデノウイルス遺伝子モジュールは各々、別々であろうと、マクロモジュール内であろうと、構築される核酸内に1回のみ存在する。例えば、上記核酸を構築するための2種以上の選択されたアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種がコアマクロモジュールである場合、上記E2−L2モジュールもL3−L4モジュールも、構築される核酸に含まれるための別のモジュールとして選択されない。同様に、3種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールを選択する場合、そのアデノウイルスマクロモジュールは、E1−E3マクロモジュールでもE2−E4マクロモジュールでもない。
(1)遺伝子機能を解析するためのアデノウイルス遺伝子の変異誘発。
(2)アデノウイルス遺伝子機能が損失することにより、通常の細胞において複製することができなくなるが、それらの機能が補完される腫瘍細胞において選択的な溶解性複製を行う、アデノウイルスの変異体。
(3)複製欠損ベクターまたは複製コンピテントなウイルスいずれかとしての標的化遺伝子の発現。
(4)当該方法により、遺伝子を発現させるための新規の複製欠損アデノウイルスを提供することができる。この目的のために、本明細書の方法を用いて構築されたアデノウイルスを最適化することができる。ヒトAd5の場合では、E1モジュールのライブラリーは、例えば、いくつかのE1A欠失モジュールまたはE1B欠失モジュールを含んでよく、かつ/または、それぞれが、異なる哺乳動物プロモーターを含有し、それにより、その使用者が、対象の遺伝子を発現させるための最良のプロモーターを選択することが可能になる。
別の態様では、複数のアデノウイルス遺伝子モジュール(例えば、マクロモジュール)を含むライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE1モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE2−L2モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるL3−L4モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE3モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE4モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるコアマクロモジュールを含む。いくつかの実施形態では、上記の方法に従って上記アデノウイルスゲノムライブラリーを調製する。
別の態様では、本明細書において提供される方法およびライブラリーにおいて使用するための、E1モジュール、E2−L2モジュール、L3−L4モジュール、E3モジュール、E4モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュール(または下記のその変異体)から選択される2種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む核酸を含むキットが提供される。上記キットの適切な構成成分は、上のセクションIおよび/またはIIに記載されている組成物および構成成分を含む。
以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求された発明を限定するものではない。
1.次世代のウイルスベクターおよび、反復溶解がん療法を開発するために化学的性質を「組み合わせること」およびウイルスゲノムを「組換えること」
本発明者らは、複数の改変および異種性エレメントを系統的に組み合わせることを可能にする、構成要素の部分からウイルスゲノムを急速に新規に構築するための組換え戦略の使用を開発した。
追加的な組み合わせ、例えば、CD46細胞受容体に結合し、Ad2/5ウイルスに対して産生される中和抗体から逃れるアデノウイルス34線維を組み込む。
上記の手引きを使用して、以下の参照構成成分を用いて改変アデノウイルスを作製した。ゲートウェイDONRベクターを使用した。ヒトAd5の例では、PCRによって上記E1モジュールを得、SLICを用いてベクターpDONR P1P4に挿入した。attL1組換え部位およびattL4組換え部位を含むpDONR P1P4ベクターの骨格を、PCRを使用して増幅し、SLICによってAd5のE1モジュールと組み合わせた。代替の対抗選択カセットを生成するために、ベクターpDONR P1P4を改変した。attP1組換え部位およびattP4組換え部位を含むこのベクター骨格を、PCRを使用して増幅し、PheSA294G変異およびテトラサイクリン抵抗性カセット(pENTR L3−pLac−Tet−L2由来のpLac−Tetカセット)と組み合わせて、新しいDONRベクターを創製した。次いで、新しいDONRベクター由来のattR1−PheSA294G−Tet(r)−attR4断片をPCRによって増幅し、Adsembly DESTベクターに挿入した。「MultiSite Gateway(登録商標)Pro Plus」、カタログ番号12537−100;およびSone、T.ら J Biotechnol. 2008年9月10日;136巻(3〜4号):113〜21頁を参照されたい。
アデノウイルスは、遺伝子移入の適用のために頻繁に使用される。例えば、アデノウイルスは、遺伝子治療のために、培養物中の細胞に、in vivoで動物組織に、またはin vivoでヒト細胞に、導入遺伝子を送達するために使用される。アデノウイルスのこのような使用における1つの限定因子は遺伝子発現が一過性であることである。アデノウイルスは非組み込み型のウイルスであり、したがって、細胞分裂に際して上記導入遺伝子の発現は失われる。組み込み型の他のウイルスの系、例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスが、これらの同じ遺伝子移入の目的で使用される。しかし、これらの天然で組み込み型であるウイルスは小さく、したがって、発現させることができる導入遺伝子の量が限られ、高力価まで成長させることが難しく、それから複数の導入遺伝子を発現させることが難しく、また、ゲノム内のランダムな位置に組み込まれる。
以下の戦略を用い、Adsemblyを用いて、野生型に近い型(version)のAd5を構築した。ゲートウェイ対抗選択カセットが隣接する野生型コア配列を、野生型Ad5のE1モジュール、野生型Ad5のE3モジュール、および野生型Ad5のE4モジュールと混合した(図21)。完全に構築されたゲノムを含有するクローン単離し、293細胞にトランスフェクトした。7日後にプラークが明らかとなった。そのウイルスを回収し、さらなる293細胞において増大させた。成長分析により、この野生型に近いウイルス(真の野生型ウイルスと比較して3種のattB挿入を含有する)が真の野生型ウイルスよりもほんのわずかだけ低下した力価まで成長したことが明らかになった(図28)。
本発明者らは、Adsemblyを用いて変異体Ad5を創製した。上記Ad5のE1モジュールを、そのE1A領域およびE1B領域が欠失し、したがって、この新しいベクターを用いて作製されるウイルスのいずれにも複製欠損するように変化させた。E1AおよびE1Bを除去した後、CMV IEプロモーターおよびGFP遺伝子を含有する哺乳動物の発現カセットを挿入した。上記Ad5のE3モジュールを、上記Ad5の線維遺伝子がAd34由来の線維遺伝子で置き換えられるように変化させた。これらの変異体E1線維モジュールおよびE3−線維モジュールを、標準のAdsembly反応において、野生型Ad5のE4モジュールおよびゲートウェイ対抗選択カセットが隣接する野生型Ad5のコアモジュールと組み合わせた(図21)。完全に構築されたゲノムである生じたクローンを単離し、293細胞にトランスフェクトした。7日後にプラークが明らかとなった。そのウイルスを回収し、さらなる293細胞において増大させた。このウイルスの成長により、この戦略が、Ad5バックグラウンドにおける1)導入遺伝子の発現、2)蛍光遺伝子の発現、3)複製欠損ウイルスの構築、4)キメラアデノウイルスの創製、および5)代替の線維の発現のために使用することができることが示される。
表1〜9には、本明細書において提供される方法を用いて調製したアデノウイルス遺伝子モジュールベクター、デスティネーションベクターおよびエントリーベクターの例が開示されている。
Claims (37)
- 組換えアデノウイルスを作製する方法であって、E1モジュール、E2−L2モジュール、L3−L4モジュール、E3モジュール、およびE4モジュールからなる群から選択される3種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む方法。
- 前記核酸が前記E1モジュールを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸が前記E4モジュールをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記核酸が、前記E2−L2モジュール、前記L3−L4モジュール、または該E2−L2モジュールと該L3−L4モジュールの両方をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記核酸を構築する前に、前記3種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの2種を組み合わせることによってマクロモジュールを形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記マクロモジュールがE2−L4マクロモジュールである、請求項5に記載の方法。
- 前記E2−L4マクロモジュール、および前記E1モジュール、前記E3モジュール、または前記E4モジュールから選択される1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記E1モジュール、前記E2−L2モジュール、前記L3−L4モジュール、前記E3モジュール、および前記E4モジュールから選択される少なくとも4種のアデノウイルス遺伝子モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記E1モジュール、前記E2−L2モジュール、前記L3−L4モジュール、前記E3モジュール、および前記E4モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記核酸が少なくとも12kbである、請求項8に記載の方法。
- 前記核酸が、欠失しているアデノウイルス核酸配列、変異したアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したE4−ORF3遺伝子産物をコードする、請求項11に記載の方法。
- 前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したE1B−55k遺伝子産物をコードする、請求項11に記載の方法。
- 前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したアデノウイルスの線維遺伝子産物をコードする、請求項11に記載の方法。
- 前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したウイルスコートタンパク質をコードする、請求項11に記載の方法。
- 前記異所性のアデノウイルス核酸配列が、プロドラッグ変換酵素をコードする、請求項11に記載の方法。
- 前記非アデノウイルス遺伝子産物がレポータータンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 前記非アデノウイルス遺伝子産物が標的化タンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 前記標的化タンパク質が腫瘍標的化タンパク質または脈管構造標的化タンパク質である、請求項18に記載の方法。
- 前記核酸を転写させ、それにより組換えアデノウイルスを形成するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えアデノウイルスが複製コンピテントである、請求項20に記載の方法。
- 前記組換えアデノウイルスが複製インコンピテントである、請求項20に記載の方法。
- in vitroで実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記構築するステップが、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターと、1種または複数種のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールとをハイブリダイズさせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターが、
(i)デスティネーションベクターを切断し、それにより線状デスティネーションベクターを形成するステップ、および
(ii)該線状デスティネーションベクターをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、該ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを形成するステップ、
により形成される、請求項24に記載の方法。 - 1種または複数種の前記ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールが、
(i)1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを含むエントリーベクターをエンドヌクレアーゼと接触させ、それにより、放出された1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ、および
(ii)該放出された1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、前記1種または複数種の該ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ、
により形成される、請求項24に記載の方法。 - 構築するステップが、組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび前記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する1種または複数種の組換えコンピテントなエントリーベクターを、インテグラーゼと接触させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する前記組換えコンピテントなエントリーベクターが、1種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールおよび組換えコンピテントなドナーベクターをインテグラーゼと接触させ、それにより、該アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する該組換えコンピテントなエントリーベクターを形成するステップにより形成される、請求項27に記載の方法。
- 構築するステップが、
(i)ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターとハイブリダイゼーションコンピテントな第1のアデノウイルス遺伝子モジュールとをハイブリダイズさせ、それにより、第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップ;および
(ii)該第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターおよび組換えコンピテントな第2のアデノウイルス遺伝子モジュールエントリーベクターをインテグラーゼと接触させ、それにより、第2のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップ
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールが前記E2−L2モジュール、前記L3−L4モジュール、またはE2−L4マクロモジュールであり、第2のアデノウイルス遺伝子モジュールが前記E1モジュール、前記E3モジュール、または前記E4モジュールである、請求項29に記載の方法。
- 複数の異なるE1モジュール、複数の異なるE2−L2モジュール、複数の異なるL3−L4モジュール、複数の異なるE3モジュール、複数の異なるE4モジュール、または複数の異なるE2−L4マクロモジュールを含むライブラリー。
- 前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2−L2モジュール、前記複数の異なるL3−L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2−L4マクロモジュールが、複数のアデノウイルスの種由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む、請求項31に記載のライブラリー。
- 前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2−L2モジュール、前記複数の異なるL3−L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2−L4マクロモジュールが、2種以上のヒトアデノウイルス血清型由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む、請求項32に記載のライブラリー。
- 前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2−L2モジュール、前記複数の異なるL3−L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2−L4マクロモジュールが、欠失しているアデノウイルス核酸配列、置換されたアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、請求項31に記載のライブラリー。
- 前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2−L2モジュール、前記複数の異なるL3−L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2−L4マクロモジュールが組換えコンピテントである、請求項31に記載のライブラリー。
- 前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2−L2モジュール、前記複数の異なるL3−L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2−L4マクロモジュールがハイブリダイゼーションコンピテントである、請求項31に記載のライブラリー。
- 請求項1から20までのいずれか一項に記載の方法に従って調製したアデノウイルスゲノムライブラリー。
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