KR20170036118A - 아데노바이러스 조립 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에서 변형된 아데노바이러스를 조립하는 방법, 아데노바이러스 유전자 모듈로 이루어진 라이브러리 및 그의 조성물을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2010년 8월 16일에 출원된 미국 가출원 제61/374,198호의 이점을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
상이한 인간 조직을 감염시키는 인간 아데노바이러스로 52종이 존재하며, 범위가 어류에서부터 영장류까지에 이르는 다른 종을 감염시키는 아데노바이러스로는 수백 종이 존재한다. 이러한 바이러스는 감염 후 1시간 이내에 그의 게놈 페이로드를 핵으로 전달하는 고도로 효율적인 나노기기이다. DNA 바이러스인 상기 바이러스는 숙주 DNA로 통합되지 않기 때문에, 확립된 GMP 프로토콜을 사용하여 고역가로 생산될 수 있고, 이소성 유전자의 발현에 대한 연구 및 인간 유전자 요법 적용에서 안전한 것으로 입증되었다. 그러나, 현재까지는 한 변종, Ad5 또는 Ad2/5 키메라가 거의 전용적으로 사용되고 있다는 점, 및 다중 유전적 변형을 빠르고 체계적으로 조작하고 조합할 수 없는 무능력으로 인해 그의 잠재적인 적용은 이루어지지 못했다. 따라서, Ad2/5 이외의 레퍼토리 아데노바이러스 벡터를 확장시키고, 구성 성분부로부터 신규의 아데노바이러스 게놈을 신속하게 새로 조립하는 것을 촉진시킬 수 있는 기술적 플랫폼을 개발함으로써 다중 변형 및 이종성 요소가 체계적으로 혼입될 수 있도록 하는 것이 크게 요구되고 있다. 그러한 시스템은 36개의 유전자(스플라이스 변이체 포함하지 않음)를 전달하고 발현시키는 것, 둘 모두를 수행하는 데 있어 고도로 효율적인 천연 바이러스 구조를 이용할 것이다. 상기 시스템은 상이한 종양에서 탈조절된 경로 활성의 다중 정량적 측정을 도입한 강력한 진단제 및 치료제를 제공할 수 있다.
여러 적용에 있어 아데노바이러스 벡터의 잠재능은 36 kb의 바이러스 게놈을 빠르고 체계적으로 조작할 수 있는 능력으로 인해 저지된다. 추가로, 기본 연구, 동물 모델, 유전자 요법 및 종양살상형 요법에서 사용되는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스(Ad: Adenovirus) 혈청형 2 및 5로 제한된다. Ad2 및 Ad5가 그중 발견된 최초의 것이며, 따라서, 특히 E1 영역에서 그의 게놈을 조작할 수 있게 만드는 벡터/도구의 유산이 존재한다. Ad2/5 섬유 단백질은 수용체, CAR에 결합함으로써 상피 세포를 감염시킨다. 불행하게도, CAR은 모든 세포 유형에서 발현되지 않고, 많은 전이에서는 하향조절된다. 추가로, 인간 집단 중 대략 80%는 Ad2/5에 대한 기존 중화 항체를 가지고 있는데, 이는 오프 타겟(off-target) 간 흡수 및 염증과 함께 전신 적용을 제한한다. 따라서, 유전자 전달 및 요법을 위해 Ad2/5 벡터를 사용하는 것만이 반드시 최적의 선택이 되는 것은 아니며, 그와는 정반대로, 대개는 역사적 우연이다.
본 발명자들의 궁극적인 목적은 종양 선택적 용해 복제가 진행될 뿐만 아니라, 치료 회차를 반복하여 전신으로 수행될 수 있고, 간 독성을 회피하고, 구불구불한 종양 혈관구조를 효율적으로 표적화하고 통과하고, 비대응 수용체를 통해 세포를 감염시키고, 종양내 프로드럭 활성화 효소/독소를 국소적으로 발현시킴으로써 종양 방관자 효과를 발생시키고, 유익한 숙주 항종양 면역 반응을 다시 불러 일으키는, 효능이 있는 바이러스 암 요법을 조작하고자 하는 것이다. 이는 마우스에서는 복제가 불가능한 인간 아데노바이러스의 무능력에 의해 추가로 복합화되는 중요한 도전 과제이다. 이는 이종이식 모델에서 많은 이점을 가지고 있는, 면역 수행 능력이 있는, 암을 앓는 유전공학처리된 마우스 모델(GEMM: genetically enginecred mouse model)에서 인간 종양살상형 바이러스 평가를 불가능하게 만든다.
52종의 인간 아데노바이러스가 존재하는데, 이는 상이한 숙주 조직 환경에서 감염 및 복제될 수 있도록 고도로 분화적으로 적합화되어 있다는 것을 시사하는 것이다. 상기 바이러스 다수가 상이한 조직을 감염시키고, CAR 이외의 세포 수용체에 결합하는 섬유 단백질 뿐만 아니라, 상이한 'E3' 면역 조정 유전자 코호트를 가진다. 그의 게놈을 변형을 시키는 데 필요한 도구가 부족하기 때문에 그에 관한 독특한 특성은 광범위하게 연구되지도 사용되지도 못하였다. 유사하게, 다른 종을 감염시키는 아데노바이러스 또한 존재하는데, 그 예로 마우스 아데노바이러스(MAV-1: mouse adenovirus)를 포함한다.
본원에서는 상기와 같은 문제 및 당업계의 다른 문제들에 관한 해결안을 제공한다.
본 발명의 간단한 요약
한 측면에서, 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법(본원에서는 "Ad셈블리(Adsembly)"로도 지칭된다)을 제공한다. 본 방법은 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈, 또는 아데노바이러스 마크로모듈(하기 기술되는 바와 같은, 그의 돌연변이체)로부터 선택되는 2개 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 복수개의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 라이브러리를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서 제공하는 방법을 실행하기 위한 키트를 제공한다.
도 1은 현존 아데노바이러스 벡터 방법과 Ad셈블리를 비교한 비교 차트이다. 현 시스템에 존재하는 수개의 한계는 Ad셈블리를 통해 극복될 수 있다.
도 2는 아데노바이러스를 치료제로서 추가로 개발하기 위해서는 극복하여야 하는 도전 과제를 나타내는 것이다. 본 분야에서 극복되어야 할 필요가 있는 주된 문제들 중 일부를 간략하게 도시한 다이어그램이다.
도 3은 4가지의 상이한 아데노바이러스 속을 열거하고 있는 계통수이다. 공지되어 있는 아데노바이러스 모두가 열거되어 있는 것은 아니다. 이는 아데노바이러스과의 종의 다양성을 입증한다.
도 4는 52종의 공지된 인간 아데노바이러스에 대한 수용체 및 향성(tropism)을 나타낸 것이다. 수용체 및 향성은 혈청형과 서브군 사이에 차이가 있으며, 따라서, 이는 특정 바이러스를 재표적화하는 데 사용될 수 있다.
도 5는 아데노바이러스 속 간의 "코어" 게놈 영역의 보존에 관한 것이다. 최상단의 도면은 인간 Ad5 게놈(서열 번호: 137)에 대한 간략화된 지도이며, 코어 영역은 점선 박스로 강조하여 표시되어 있다. 상기 코어 영역은 하단 도면에서 유전자 주변이 흰색 박스로 표시되어 있는 바와 같이, 모든 아데노바이러스 속에 걸쳐 보존된다. 모든 속은 상기 코어 영역을 공유하며, 코어 오픈 리딩 프레임 거의 모두가 IVa2(좌측 말단)에서부터 pVIII(우측 말단)까지 존재한다. 게놈의 변이성은 게놈의 말단에 존재한다. 모듈의 함량이 종간에 다소 차이가 있을 수 있기는 하지만, 그의 코어에 대한 상대적인 위치에는 차이가 없기 때문에, 출원인들은 본 발명자들의 모듈 명칭을 E1 모듈(이는 또한 본원에서 E1 유사 모듈로도 지칭된다)(이들 모두는 코어의 좌측에 위치, 막대로 표시되어 있다), 코어 모듈(막대로 표시되어 있다), 및 E3 모듈(이는 또한 본원에서 E3 유사 모듈로도 지칭된다)(이들 모두는 코어의 우측에 위치, 막대로 표시되어 있다)로 나누었다. 일부 경우에, 섬유 단백질은 코어 바로 옆에 위치하지만, 다른 경우에는 (인간 Ad), 코어 바깥쪽에 위치한다.
도 6은 아데노바이러스 종 간에는 전사 단위가 보존된다는 것을 보여주는 다양한 아데노바이러스 속으로부터의 전사 지도를 나타내는 것이다. 1 또는 2개의 속에서 발견되는 유전자인 코어 유전자가 제시되어 있다. 상기 도는 속 간의 게놈 말단의 변이성을 보여주는 도면을 제공한다. 여기서 인용된 ["Davison, Benko, Harrach"]은 문헌 [Benkoe M et al., (2005) Family Adenoviridae. Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA (eds): Virus Taxonomy. VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. E1sevier, New York pp 213-228]을 나타내는 것이다.
도 7a-7c는 서열 번호: 32에 기재되어 있는 인간 Ad5 폴리머라제 단백질의 아미노산 966-1103(하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 폴리머라제 단백질 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 폴리머라제 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 45% 이상이다. 좌측의 표지는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 1-32에 상응한다.
도 7d-7g는 서열 번호: 73에 기재되어 있는 인간 Ad5 헥손 단백질의 아미노산 501-747(하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 헥손 단백질 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 헥손 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 45% 이상이다. 황색으로 강조 표시된 잔기는 종 간에 100% 보존되는 것이다. 좌측의 표지는 진뱅크 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 33-73에 상응한다.
도 7h-7i는 서열 번호: 103에 기재되어 있는 인간 Ad5 DNA 결합 단백질의 아미노산 408-475(DBP: DNA-binding protein, 하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 DBP 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 DBP 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 35% 이상이다. 황색으로 강조 표시된 잔기는 종 간에 100% 보존되는 것이다. 좌측의 표지는 진뱅크 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 74-103에 상응한다.
도 7j는 서열 번호: 135에 기재되어 있는 인간 Ad5 pVIII 단백질의 아미노산 6-43(하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 pVIII 단백질 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 pVIII 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 35% 이상이다. 좌측의 표지는 진뱅크 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 104-135에 상응한다.
도 8은 아데노바이러스 게놈 조작에 관한 초기 개념을 개략적으로 설명한 것이다.
도 9는 4개의 DNA 단편을 사용한 다중 부위 게이트웨이에 관한 예를 나타낸 간략형 다이어그램이다. 다중 부위 게이트웨이는 게놈 재조립을 위해 본 발명자들이 제안한 시스템이었다. 제안된 시스템은 좌측에 있다.
도 10a는 게이트웨이 att 재조합 부위의 명칭 및 조직을 상세하게 설명해주는 다이어그램이다. 게이트웨이 클로닝으로부터 생성된 4개의 상이한 att 재조합 부위가 존재한다. 4개 모두 실제 재조합이 이루어지는 위치인, 21 bp의 중앙 attB 영역을 함유한다. 특이 효소 믹스(BP)를 사용하여 attP 부위는 attB 부위와 함께 재조합된다. 생성 반응을 통해 attL 및 attR 부위가 형성된다. 상기 반응은 또 다른 효소 믹스(LR)를 통해 가역화될 수 있는데, 여기서는, attL 및 attR의 조합으로 attP 및 attB가 형성된다.
도 10b는 6개의 상이한 att 부위 사이의 서열 차이를 나타내는 것이다. 각 부위는 특이적으로 그의 매치와 재조합된다. attB1 부위는 오직 attP1 부위와만 재조합하게 될 것이며, attB2는 오직 attP2와만 재조합하게 될 것이고, 그 외의 재조합이 이루어질 것이다.
도 11은 A) 재조립을 위해 인간 Ad5 게놈(서열 번호: 137)을 모듈로 나누는 것에 관한 예를 나타낸 것이다. B)는 다중 부위 게이트웨이 기술을 사용하여 제안된 모듈의 재조립 후의 attB 부위 삽입 위치를 나타낸 것이다.
도 12는 인간 Ad5 게놈(서열 번호: 137) 내의 잠재적인 attB 삽입 부위에 관한 예를 나타낸 것이다. 표적화된 영역 내의 다양한 아데노바이러스 서열을 정렬하고, 비보전 서열 주변의 위치를 선택함으로써 삽입 부위가 결정될 수 있다. 화살표 표시가 Ad5에 대해 선택된 부위를 나타낸다. A) E1과 E2 모듈 사이의 attB4 삽입. B) E2와 L3 모듈 사이의 attB6 삽입 부위. C) L3과 E3 모듈 사이의 attB5 삽입. D) E3과 E4 모듈 사이의 attB3 삽입 부위. 이러한 특정한 삽입을 위해, 섬유 폴리A/종결과 E4 폴리A 사이의 Ad5 서열을 중복시킴으로써 재조합 부위를 버퍼링시키기로 결정하였다. 따라서, attB 삽입과 함께 상기 두 요소 사이에 위치하는 27 bp에 대한 중복이 이루어진다.
도 13은 PCR에 의해 5개의 Ad5 모듈을 수득하기 위해 시도하는 것에 관한 도전과제 및 결과를 나타낸 것이다. 하단의 표에는 PCR에 의해 수득된 각 단편의 서열 분석 결과 및 공개된 Ad5 서열과의 차이가 열거되어 있다. 모든 오류의 재현성이 100%이기 때문에, 이는 본 발명자가 사용한 주형이 공개된 Ad5 서열과는 상이하며, PCR 정확도가 높다는 것을 제안한다.
도 14는 Ad5 아데노바이러스 유전자 모듈이 정제된 바이러스로부터 직접 수득된 DNA로부터 PCR에 의해 수득될 수 있다는 것을 보여주는 것이다. Ad5 게놈 DNA를 정제된 바이러스로부터 직접 단리시키고, Ad5 모듈 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 5개의 PCR 모두 성공적이었다. 좌측 패널: 4중으로 E2 및 L3 모듈 PCR. 우측 패널: 2중으로 E1, E3, 및 E4 모듈 PCR. 적색 화살표 표시는 원하는 PCR 생성물을 나타낸다. 우측에서는 원하는 생성물이 매우 뚜렷이 나타났는 바, 화살표 표시를 생략하였다.
도 15는 게이트웨이 BP 반응에서의 Ad5 아데노바이러스 유전자 모듈의 효율을 나타낸 것이다. E1, E2, 및 L3 모듈은 표준 반응에서는 효율적이지 못한 반면, E3 및 E4 모듈은 효율적인 것으로 나타났다.
도 16은 서열 및 결찰 독립 클로닝(SLIC: sequence and ligation independent cloning)에 관한 다이어그램을 나타낸 것이다. 좌측은 단일 단편 SLIC에 대한 것인 반면, 우측은 다중 (9개의) 단편 SLIC의 예를 나타낸 것이다.
도 17은 SLIC를 사용하여 게이트웨이 클로닝 효소를 사용하지 않고 게이트웨이 엔트리 벡터를 생성하는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 18은 Ad5 E1 영역이 박테리아에 대하여 중간 정도의 독성을 띤다는 것을 나타내는 것이다. SLIC를 사용하여 Ad5 E1 영역 또는 대조군(lacZ)을 게이트웨이 DONR 벡터 내로 삽입하였다. lacZ 대조군 상의 콜로니들 모두 "정상" 크기였고, lacZ 삽입에 대하여 양성을 띠었다. E1 플레이트 상에서는 "정상" 크기를 가진 콜로니 단 2개만이 출현하였고, 그 둘 모두 E1에 대하여 음성을 띠었다. 그러나, 그보다 작은 수개의 콜로니들도 존재하였는데(화살표 표시), 그들 모두 E1에 대하여 양성을 띠었다. 따라서, Ad5 E1 영역은 박테리아의 성장을 저속화시킨다. 이는 본 발명자들이 게이트웨이 재조합 반응을 이용하여 E1을 삽입하는 데 있어서 문제를 겪게 되는 이유를 설명한다.
도 19는 5개의 모듈 엔트리 벡터로부터 Ad5 게놈을 재조립하기 위한 초기 다중 부위 게이트웨이 전략법을 나타낸 것이다. 먼저, 5개의 엔트리 벡터 중 3개를 스터퍼 벡터와 함께 조합하였다. 이어서, 스터퍼를 제거하여 역선택 카세트를 삽입하였다. 이어서, 최종 2개의 엔트리 벡터를 조합하여 완전한 게놈을 형성하였다. 이러한 특정의 전략법은 E1 모듈 및 크기가 큰 E2 및 L3 모듈과 관련된 독성을 보여주었다.
도 20은 인간 Ad5 Ad셈블리 이중 DEST 벡터 형성에 관한 것이다. E2 및 L3 모듈을 그의 각각의 엔트리 벡터로부터 PCR에 의해 수득하고, SLIC를 사용하여 벡터 골격과 함께 조합한다. 이어서, 모듈 말단에서 공학처리된 독특한 제한 부위로 벡터를 분해시킨 후, SLIC에 의해 모듈 측면 위치에 게이트웨이 역선택 카세트를 삽입한다.
도 21은 인간 Ad5에 대한 Ad셈블리 과정을 나타낸 것이다. 게이트웨이 LR 반응에서 코어 모듈 이중 DEST 벡터를 남은 3개의 엔트리 벡터 각각 하나씩과 함께 조합하여 완전한 바이러스 게놈를 재조립한다.
도 22는 Ad셈블리 방법으로 시도된 수개의 역선택 마커의 효율을 나타낸 것이다. PheS+ccdB를 사용하였고, 콜로니의 블라인드 스크린에 의해, 또는 먼저 콜로니 PCR을 사용하여 삽입을 확인한 후, 표준 제한 분해 스크리닝에 의해 수행하였을 때 효율적인 것으로 나타났다.
도 23은 Ad셈블리 벡터 골격이 본 방법의 실시양태에 대한 2가지 독특한 특징을 포함한다는 것을 보여주는 것이다. 벡터 골격은 p15A 복제 기점을 사용하는데, 이는 플라스미드의 카피수를 낮춰주며, 이로써, Ad5 E1 모듈에 의해 매개되는 독성은 감소하게 된다. 추가로, 벡터는 포유동물 I-SceI 발현 카세트를 함유하는데, 이를 통해 형질감염시 바이러스 게놈을 벡터 골격으로부터 자가 절제시킬 수 있다.
도 24는 Ad셈블리 반응의 효율을 보여주는 것이다. A) 20 fmol의 코어 이중 DEST 벡터 및 각각의 E1 모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈 엔트리 벡터 10 fmol씩을 사용하여 Ad5에 대한 Ad셈블리 반응을 수행하였다. 상기 반응을 실온에서 밤새도록 수행하고, 그 다음날 NEB10-β 세포로 형질전환시켰다. EcoRV 분해에 의한 스크리닝을 위해 16개의 클론을 성장시키고, 제조하였다. 16개의 클론 중 2개가 정확한 제한 분해 패턴(별표 표시, 클론 4 및 8)을 보였다. "L"은 DNA 래더이다. "(-)"는 자체적으로 분해된 코어 이중 DEST 벡터인 음성 대조군이다. "(+)"는 분해된 완전한 Ad5 게놈인 양성 대조군이다. B) E1 엔트리 벡터 양 증가가 Ad셈블리 효율을 개선시킨다는 것을 보여주는 것이다. 20 fmol의 코어 이중 DEST 벡터, 50 fmol의 E1 모듈 엔트리 벡터 및 각각의 E3, 및 E4 모듈 엔트리 벡터 10 fmol씩을 사용하여 Ad5에 대한 Ad셈블리 반응을 수행하였다. 상기 반응을 실온에서 밤새도록 수행하고, 그 다음날 NEB10-β 세포로 형질전환시켰다. EcoRV 분해에 의한 스크리닝을 위해 10개의 클론을 성장시키고, 제조하였다. 10개의 클론 중 7개가 정확한 제한 분해 패턴(적색 별표 표시)을 보였다. "L"은 DNA 래더이다. "(-)"는 분해된 Ad5 E2-E4 벡터인 음성 대조군이다. "(+)"는 분해된 완전한 Ad5 게놈인 양성 대조군이다.
도 25는 인간 Ad5에 대한 AdSlicR 방법을 보여주는 것이다. 우선, Ad셈블리를 위해 생성된 E2-L3 코어 모듈을 시작으로 하여, SwaI 분해에 의해 벡터를 선형화시킨다. 이어서, SLIC를 사용하여 E3 및 E4 모듈을 상기 벡터 내로 삽입한다. 후속 벡터를 PacI로 선형화시킨 후, SLIC에 의해 E1 모듈을 삽입함으로써 완전한 게놈을 형성한다.
도 26은 인간 Ad5 AdSlicR 방법의 효율을 나타낸 것이다. 콜로니 PCR을 제1선 스크리닝으로서 사용한 후, 이어서, PCR 양성 클론의 제한 분해를 수행하였다.
도 27은 Ad셈블링된 바이러스가 조직 배양물 중에서 성장하였다는 것을 보여주는 것이다. A) Ad셈블리에 의해 조립된 복제 아데노바이러스에 의해 생성된 플라크. Ad셈블링된 게놈을 293 세포에 형질감염시키고, 7일째까지 뚜렷한 플라크가 나타났다. B) Ad셈블링된 Ad5를 계대접종하고, 계속 성장시켰다. Ad셈블링된 Ad5의 형질감염으로부터 전체 바이러스를 수집하고, 새로운 293 세포에 다시 플레이팅하였다. 3일째까지 전체 플레이트 전역에 걸쳐 뚜렷한 세포 변성 효과가 시각적으로 나타났다.
도 28은 293 세포에서 성장시켰을 때 Ad셈블링된 Ad5의 역가는 단지 약간 감소하였다는 것을 보여주는 것이다. 293 세포를 야생형 Ad5, Ad셈블링된 Ad5, 또는 attB 삽입을 함유하지 않거나, 또는 4개의 attB 삽입들 각각을 개별적으로 함유하는 AdSLIC Ad5를 이용하여 MOI=10으로 감염시켰다. 48시간 경과 후 전체 바이러스를 수집하고, ELISA에 의해 역가를 측정하였다. 임의의 결함을 보이는 유일의 바이러스는 Ad셈블링된 바이러스 및 attB3 삽입만을 함유하는 AdSLIC 바이러스였다. 상기 둘은 모두 야생형 수준과 비교하였을 때 중간 정도의 2배 감소를 나타내었다. 상기 데이터는 또한 AdSLIC를 사용하여 생성된 바이러스는 293 세포에서 어떤 복제 결함도 가지고 있지 않음을 입증한다. 모든 바이러스에 대한 입력 수준을 적정하였고, 이는 대략 1e7 IU/mL(제시하지 않음)에 가까웠다.
도 29. 도 29A에는 본원에 기술된 Ad셈블리 엔트리 벡터 라이브러리 중의 벡터가 기술되어 있다. 모듈이 유래된 Ad 혈청형이 먼저 열거되어 있고, 이어서, 벡터에 대한 임의의 변이가 열거되어 있다. 어떤 변이도 없다면, 엔트리는 "야생형"으로 언급된다. 도 29B에는 본원에 기술된 Ad셈블리 및 AdSLIC에 대한 마크로모듈 벡터가 기술되어 있다. 마크로모듈이 유래된 Ad 혈청형이 먼저 열거되어 있고, 이어서, 마크로모듈을 포함하는 모듈, 이어서, 벡터에 대한 임의의 변이가 열거되어 있다. 어떤 변이도 없다면, 이는 "야생형"으로 언급된다. 도 29C에는 본원에 기술된 Ad셈블리 또는 AdSLIC를 사용하여 조립된 아데노바이러스 게놈이 기술되어 있다. 게놈의 기초가 되는 Ad 혈청형이 먼저 열거되어 있고, 이어서, 벡터에 대한 임의의 변이가 열거되어 있다. 어떤 변이도 없다면, 이는 "야생형"으로 언급된다.
도 30은 SLIC를 사용하여 전체 게놈을 플라스미드로 삽입하는 것에 관해 나타낸 것이다. A)는 방법을 개략적으로 나타낸 것으로서, 상기 방법을 통해 삽입시키고자 하는 바이러스 게놈의 말단에 대해 상동성인 단쇄부(~20 bp)를 함유하는 플라스미드 벡터를 PCR에 의해 수득하였다. 이어서, 게놈 및 벡터 둘 모두를 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, 일반 방식으로 SLIC에 사용하였다. B)는 전체 Ad5 게놈을 플라스미드 골격 내로 삽입하는 것에 관한 일례를 나타낸 것이다. 스크리닝된 6개의 클론 모두 전체 게놈을 함유하였다. 게놈은 정방향 또는 역방향으로 삽입될 수 있기 때문에, 이러한 경우, 4개는 한 방향으로(클론 1, 4, 5, 및 6), 2개는 다른 방향으로(클론 2 및 3) 위치하였다.
도 31-33은 아데노바이러스 게놈 변형 방법을 도시한 것이다.
도 34의 상단 패널은 AdSLICr 시스템을 사용한 비인간 아데노바이러스인 마우스 아데노바이러스 1형(서열 번호: 104)의 게놈 조립에 관한 예이다. (SwaI 또는 PmeI로) 선형화된 코어 벡터로 서열 및 결찰 독립 클로닝(SLIC)하는 데 필요한 정확한 오버행이 남게 하는 제한 효소로 절제될 수 있도록 E1, E3-섬유, 및 E4 모듈 플라스미드를 디자인하였다. SLIC하는 데 필요한 선형 단편을 수득하기 위해서는 PCR을 수행할 필요가 없으며, 이에 오류가 도입될 잠재성은 삭제된다. 또한 어떤 외래 서열도 최종 게놈 구성체 내로 삽입되지 못하도록 디자인한다. 전형적인 방법은 E3-섬유 및 E4 모듈을 절제하고, PmeI로 선형화된 코어 벡터와 조합하는 것을 포함한다. 이를 통해 E2-E4 마크로모듈이 생성되고, 이어서, 이를 SwaI로 절단하고, 절제된 E1 모듈과 함께 조합함으로써 완전한 게놈이 생성될 수 있다. 하단 패널: 상기 전략법을 사용하여 야생형 마우스 아데노바이러스 1형을 조립하고, 마우스 3T6 세포 형질감염 후, 감염성 바이러스 형성 플라크를 수득하였다.
도 35는 성장을 방해하는 삽입 부위를 확인하기 위해 수행된, 단일 attB 재조합 부위 삽입을 함유하는 바이러스에 관한 성장 분석을 나타내는 것이다. Ad셈블리를 사용하여 생성된 바이러스는 야생형 바이러스와 비교하였을 때, 약간의 성장 결함을 보유하였는 바(도 28), Ad셈블리를 사용하여 생성된 바이러스에 존재하는 각각의 attB 삽입 중 단 하나씩만을 함유하도록 AdSLIC를 사용하여 바이러스를 생성하였다. 293 세포(상단의 그래프)를 MOI=10으로 감염시켰다. U20S 세포(하단의 그래프)는 MOI=50으로 감염시켰다. 48시간 경과 후 전체 바이러스를 수집하고, 역가를 측정하였다. U20S 세포에서의 야생형 바이러스와 비교하였을 때, 모듈 [L3]과 [E3] 사이의 attB5 삽입은 성장을 방해하지 않은 반면, 다른 나머지 3개의 접합부에서의 attB 삽입은 야생형과 비교하였을 때, 성장을 억제시키는 것으로 나타났다.
도 36은 E1과 E2-L2 모듈 사이의 초기 attB4 삽입 부위가 성장 결함을 일으키는 바(도 35), 대체 배치 옵션을 디자인하였다는 것을 보여준다. 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다.
도 37은 E3과 E4 모듈 사이의 초기 attB4 삽입 부위가 성장 결함을 일으키는 바(도 35), 대체 배치를 디자인하였다는 것을 보여준다. 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다.
도 38은 U20S 세포를 바이러스를 이용하여 MOI=50으로 감염시키고, 48시간 경과 후 전체 바이러스를 수집하고, 역가를 측정하여 얻은 결과를 나타낸 것이다. Ad셈블리를 사용하여 생성된 3가지 바이러스를 야생형 바이러스와 비교하였다. 대체 attB 부위 삽입(검은색 다이아몬드 표시 및 삼각형 표시)을 함유하는 바이러스는 원래의 attB 부위 배치(검은색 X 표시)와 비교하였을 때, 성장을 개선시켰다. 상기의 모든 바이러스는 L2와 L3 모듈 사이에 위치하는 attB 부위를 포함하지 않고, 성장에 영향을 미치지 않는 L3과 E3 모듈 사이에 attB 삽입을 함유한다.
도 39은 Ad셈블리를 사용하여 트랜스진이 E1 모듈로부터 발현되는 바이러스를 생성할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 이러한 경우, Ad5의 E1A 및 E1B 유전자는 E1 모듈 중 GFP 발현 카세트로 치환되었다. Ad셈블리를 사용하여 바이러스를 조립하고, 생존가능한 GFP 발현 바이러스를 수득하였다.
도 40은 Ad셈블리를 사용하여 트랜스진이 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 E3 모듈로부터 발현되는 바이러스를 생성할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. E3 모듈을 변형시켜 11.6 K 단백질(Ad5 뉴클레오티드 29491-29772)을 결실시키고, 그 위치에 mCherry를 배치시켰다. 이어서, E3 전사체는 천연적으로 mCherry 유전자로 스플라이싱되고, 단백질이 발현된다. Ad셈블리를 사용하여 바이러스를 생성하고, U20S 세포의 형질도입을 제시한다. 이는 1) E3 모듈로부터의 트랜스진 발현, 및 2) 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 외래 유전자를 발현시키는 것에 관한 예이다.
도 41은 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 E4 모듈로부터 다중 트랜스진을 발현하는 것을 보여주는 것이다. 천연 E4 프로모터를 CMV 프로모터로 치환하고, 3개의 천연 E4 유전자를 트랜스진으로 치환하였다. 이어서, Ad셈블리를 사용하여 바이러스를 생성하였다. 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다.
도 42는 Ad셈블리를 사용하여 다중 트랜스진이 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 E4 모듈로부터 발현되는 바이러스를 생성할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 도 41에서 생성된 바이러스를 24 hr 동안 U20S 세포로 형질도입시키고, 전체 RNA를 수집하고, 무작위 프라이밍을 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하여 mCherry 유전자에 대한 스플라이싱에 대해 테스트하였다. 검은색 화살표 표시는 GFP를 발현하게 되는 스플라이싱되지 않은 전사체를 나타낸다. 흰색 화살표 표시는 mCherry를 발현하게 되는 스플라이싱된 전사체를 나타낸다. 이는 다중 외래 유전자가 단일 모듈로부터 발현될 수 있다는 것을 입증한다. 레인 1 및 2는 각각 형질도입되지 않은 세포의 음성 대조군 또는 야생형 Ad5로 감염된 세포이다.
도 43은 Ad셈블리를 사용하여 이루어진 단일 게놈 조립체 중 다중 모듈 간의 다중 유형의 변이 도입을 나타낸 것이다. Ad5 게놈의 5개의 모듈을 나타내는 다이어그램으로, 여기서, 수직 화살표 표시는 전체 게놈 조립 이전에 각 모듈에 대해 이루어진 변이를 나타내는 것이다. E1 모듈을 루시퍼라제-GFP 융합 단백질에 대한 트랜스진 발현 카세트로 전환시켰다. L3 모듈 중 헥손 단백질을 점 돌연변이에 의해 Glu 451에서 Gln으로 변경시켰다. E3 모듈 중 천연 Ad5 섬유 부분은 다른 인간 아데노바이러스 혈청형으로부터의 수개의 섬유 부분 중 하나로 치환하였다. Ad셈블리를 사용하여, 각각이 대체 섬유 단백질을 포함하는 것인 6개의 바이러스를 생성하였다. Ad5에 대해 열거된 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다. 수탁 번호 DQ086466, AJ854486, BK001453, NC_001460, 및 AY_737797은 각각 서열 번호: 139-143에 상응한다.
도 44는 Ad셈블리를 사용하여 생성된 섬유 키메라 바이러스를 통해 인간 배아 줄기 세포(hESC: human embryonic stem cell)에서의 형질도입 능력이 일반 Ad5 섬유와 비교하였을 때 개선되었다는 것을 나타내는 것이다. 24 또는 48시간 동안 인간 ESC를 다양한 MOI로 형질도입시키고, GFP 발현에 대해 현미경으로 측정하였다. 상단 패널은 바이러스를 포함하지 않는 음성 대조군이다. 두번째 패널은 "Ad5 CMV-GFP"로서, 이는 CMV 프로모터하에 GFP를 발현하는 것이다. 테스트된 바이러스 섬유 키메라는 좌측에 명시되어 있다(즉, Ad5/3은 Ad3 섬유 놉을 포함하는 Ad5이다). 모든 영상은 5X 확대 배율로 촬영된 것이다.
도 45는 아데노바이러스 혈청형 간의 코어 모듈 교환을 통해 생존가능한 바이러스가 생산된다는 것을 보여주는 것이다. Ad11로부터의 코어 모듈을 생성하였다. 각각 Ad11 pIX 및 U 엑손-섬유를 보유하도록 Ad5 E1 및 E3 모듈을 변형시켰다. AdSLIC를 사용하여 전체 바이러스를 조립하고, 293 세포 상에서 바이러스를 재구성하였다. "최종 바이러스" 목록에 기록되어 있는 염기쌍 위치는 서열 번호: 137(Ad5) 및 서열 번호: 141(Ad11)에 기재되어 있는 것으로부터의 것이다.
도 46은 바이러스 감염과 관련하여 바이러스의 작용 연구를 위해 바이러스 유전자를 돌연변이시키기 위해 AdSLIC를 사용하는 것을 보여주는 것이다. E1 모듈에서, E1B-55K 유전자를 His 260 위치에서 Ala로 돌연변이시켰다. 다른 모듈 모두는 야생형이었다. AdSLIC를 사용하여 상기 바이러스를 조립하였다. 인간 소기도 상피 세포를 복제 결함이 있는 Ad5(레인 1), 야생형 Ad5(레인 2), 또는 Ad5 H260A(레인 3)를 이용하여 MOI=10으로 감염시켰다. 감염 후 36시간 경과하였을 때, 전체 단백질을 수집하고, p53(상단 패널), mdm2, Ad5 후기 단백질, 및 액틴에 대한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 야생형 Ad5와 달리, Ad5-H260A 바이러스는 p53을 분해하지 못했고, 후기 단백질 생산에 있어서도 결함이 있었다.
도 2는 아데노바이러스를 치료제로서 추가로 개발하기 위해서는 극복하여야 하는 도전 과제를 나타내는 것이다. 본 분야에서 극복되어야 할 필요가 있는 주된 문제들 중 일부를 간략하게 도시한 다이어그램이다.
도 3은 4가지의 상이한 아데노바이러스 속을 열거하고 있는 계통수이다. 공지되어 있는 아데노바이러스 모두가 열거되어 있는 것은 아니다. 이는 아데노바이러스과의 종의 다양성을 입증한다.
도 4는 52종의 공지된 인간 아데노바이러스에 대한 수용체 및 향성(tropism)을 나타낸 것이다. 수용체 및 향성은 혈청형과 서브군 사이에 차이가 있으며, 따라서, 이는 특정 바이러스를 재표적화하는 데 사용될 수 있다.
도 5는 아데노바이러스 속 간의 "코어" 게놈 영역의 보존에 관한 것이다. 최상단의 도면은 인간 Ad5 게놈(서열 번호: 137)에 대한 간략화된 지도이며, 코어 영역은 점선 박스로 강조하여 표시되어 있다. 상기 코어 영역은 하단 도면에서 유전자 주변이 흰색 박스로 표시되어 있는 바와 같이, 모든 아데노바이러스 속에 걸쳐 보존된다. 모든 속은 상기 코어 영역을 공유하며, 코어 오픈 리딩 프레임 거의 모두가 IVa2(좌측 말단)에서부터 pVIII(우측 말단)까지 존재한다. 게놈의 변이성은 게놈의 말단에 존재한다. 모듈의 함량이 종간에 다소 차이가 있을 수 있기는 하지만, 그의 코어에 대한 상대적인 위치에는 차이가 없기 때문에, 출원인들은 본 발명자들의 모듈 명칭을 E1 모듈(이는 또한 본원에서 E1 유사 모듈로도 지칭된다)(이들 모두는 코어의 좌측에 위치, 막대로 표시되어 있다), 코어 모듈(막대로 표시되어 있다), 및 E3 모듈(이는 또한 본원에서 E3 유사 모듈로도 지칭된다)(이들 모두는 코어의 우측에 위치, 막대로 표시되어 있다)로 나누었다. 일부 경우에, 섬유 단백질은 코어 바로 옆에 위치하지만, 다른 경우에는 (인간 Ad), 코어 바깥쪽에 위치한다.
도 6은 아데노바이러스 종 간에는 전사 단위가 보존된다는 것을 보여주는 다양한 아데노바이러스 속으로부터의 전사 지도를 나타내는 것이다. 1 또는 2개의 속에서 발견되는 유전자인 코어 유전자가 제시되어 있다. 상기 도는 속 간의 게놈 말단의 변이성을 보여주는 도면을 제공한다. 여기서 인용된 ["Davison, Benko, Harrach"]은 문헌 [Benkoe M et al., (2005) Family Adenoviridae. Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA (eds): Virus Taxonomy. VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. E1sevier, New York pp 213-228]을 나타내는 것이다.
도 7a-7c는 서열 번호: 32에 기재되어 있는 인간 Ad5 폴리머라제 단백질의 아미노산 966-1103(하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 폴리머라제 단백질 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 폴리머라제 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 45% 이상이다. 좌측의 표지는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 1-32에 상응한다.
도 7d-7g는 서열 번호: 73에 기재되어 있는 인간 Ad5 헥손 단백질의 아미노산 501-747(하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 헥손 단백질 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 헥손 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 45% 이상이다. 황색으로 강조 표시된 잔기는 종 간에 100% 보존되는 것이다. 좌측의 표지는 진뱅크 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 33-73에 상응한다.
도 7h-7i는 서열 번호: 103에 기재되어 있는 인간 Ad5 DNA 결합 단백질의 아미노산 408-475(DBP: DNA-binding protein, 하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 DBP 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 DBP 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 35% 이상이다. 황색으로 강조 표시된 잔기는 종 간에 100% 보존되는 것이다. 좌측의 표지는 진뱅크 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 74-103에 상응한다.
도 7j는 서열 번호: 135에 기재되어 있는 인간 Ad5 pVIII 단백질의 아미노산 6-43(하단, 컨센서스 바로 위)과, 비인간 아데노바이러스로부터의 수개의 pVIII 단백질 중의 상응하는 영역을 함께 정렬해 놓은 것이다. 비인간 Ad 서열 중 임의의 것은 Ad5 pVIII 서열과 개별적으로 비교하였을 때, 상기 영역내에서의 동일성이 35% 이상이다. 좌측의 표지는 진뱅크 수탁 번호를 나타내고, 이는 각각 위에서부터 아래로 서열 번호: 104-135에 상응한다.
도 8은 아데노바이러스 게놈 조작에 관한 초기 개념을 개략적으로 설명한 것이다.
도 9는 4개의 DNA 단편을 사용한 다중 부위 게이트웨이에 관한 예를 나타낸 간략형 다이어그램이다. 다중 부위 게이트웨이는 게놈 재조립을 위해 본 발명자들이 제안한 시스템이었다. 제안된 시스템은 좌측에 있다.
도 10a는 게이트웨이 att 재조합 부위의 명칭 및 조직을 상세하게 설명해주는 다이어그램이다. 게이트웨이 클로닝으로부터 생성된 4개의 상이한 att 재조합 부위가 존재한다. 4개 모두 실제 재조합이 이루어지는 위치인, 21 bp의 중앙 attB 영역을 함유한다. 특이 효소 믹스(BP)를 사용하여 attP 부위는 attB 부위와 함께 재조합된다. 생성 반응을 통해 attL 및 attR 부위가 형성된다. 상기 반응은 또 다른 효소 믹스(LR)를 통해 가역화될 수 있는데, 여기서는, attL 및 attR의 조합으로 attP 및 attB가 형성된다.
도 10b는 6개의 상이한 att 부위 사이의 서열 차이를 나타내는 것이다. 각 부위는 특이적으로 그의 매치와 재조합된다. attB1 부위는 오직 attP1 부위와만 재조합하게 될 것이며, attB2는 오직 attP2와만 재조합하게 될 것이고, 그 외의 재조합이 이루어질 것이다.
도 11은 A) 재조립을 위해 인간 Ad5 게놈(서열 번호: 137)을 모듈로 나누는 것에 관한 예를 나타낸 것이다. B)는 다중 부위 게이트웨이 기술을 사용하여 제안된 모듈의 재조립 후의 attB 부위 삽입 위치를 나타낸 것이다.
도 12는 인간 Ad5 게놈(서열 번호: 137) 내의 잠재적인 attB 삽입 부위에 관한 예를 나타낸 것이다. 표적화된 영역 내의 다양한 아데노바이러스 서열을 정렬하고, 비보전 서열 주변의 위치를 선택함으로써 삽입 부위가 결정될 수 있다. 화살표 표시가 Ad5에 대해 선택된 부위를 나타낸다. A) E1과 E2 모듈 사이의 attB4 삽입. B) E2와 L3 모듈 사이의 attB6 삽입 부위. C) L3과 E3 모듈 사이의 attB5 삽입. D) E3과 E4 모듈 사이의 attB3 삽입 부위. 이러한 특정한 삽입을 위해, 섬유 폴리A/종결과 E4 폴리A 사이의 Ad5 서열을 중복시킴으로써 재조합 부위를 버퍼링시키기로 결정하였다. 따라서, attB 삽입과 함께 상기 두 요소 사이에 위치하는 27 bp에 대한 중복이 이루어진다.
도 13은 PCR에 의해 5개의 Ad5 모듈을 수득하기 위해 시도하는 것에 관한 도전과제 및 결과를 나타낸 것이다. 하단의 표에는 PCR에 의해 수득된 각 단편의 서열 분석 결과 및 공개된 Ad5 서열과의 차이가 열거되어 있다. 모든 오류의 재현성이 100%이기 때문에, 이는 본 발명자가 사용한 주형이 공개된 Ad5 서열과는 상이하며, PCR 정확도가 높다는 것을 제안한다.
도 14는 Ad5 아데노바이러스 유전자 모듈이 정제된 바이러스로부터 직접 수득된 DNA로부터 PCR에 의해 수득될 수 있다는 것을 보여주는 것이다. Ad5 게놈 DNA를 정제된 바이러스로부터 직접 단리시키고, Ad5 모듈 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 5개의 PCR 모두 성공적이었다. 좌측 패널: 4중으로 E2 및 L3 모듈 PCR. 우측 패널: 2중으로 E1, E3, 및 E4 모듈 PCR. 적색 화살표 표시는 원하는 PCR 생성물을 나타낸다. 우측에서는 원하는 생성물이 매우 뚜렷이 나타났는 바, 화살표 표시를 생략하였다.
도 15는 게이트웨이 BP 반응에서의 Ad5 아데노바이러스 유전자 모듈의 효율을 나타낸 것이다. E1, E2, 및 L3 모듈은 표준 반응에서는 효율적이지 못한 반면, E3 및 E4 모듈은 효율적인 것으로 나타났다.
도 16은 서열 및 결찰 독립 클로닝(SLIC: sequence and ligation independent cloning)에 관한 다이어그램을 나타낸 것이다. 좌측은 단일 단편 SLIC에 대한 것인 반면, 우측은 다중 (9개의) 단편 SLIC의 예를 나타낸 것이다.
도 17은 SLIC를 사용하여 게이트웨이 클로닝 효소를 사용하지 않고 게이트웨이 엔트리 벡터를 생성하는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 18은 Ad5 E1 영역이 박테리아에 대하여 중간 정도의 독성을 띤다는 것을 나타내는 것이다. SLIC를 사용하여 Ad5 E1 영역 또는 대조군(lacZ)을 게이트웨이 DONR 벡터 내로 삽입하였다. lacZ 대조군 상의 콜로니들 모두 "정상" 크기였고, lacZ 삽입에 대하여 양성을 띠었다. E1 플레이트 상에서는 "정상" 크기를 가진 콜로니 단 2개만이 출현하였고, 그 둘 모두 E1에 대하여 음성을 띠었다. 그러나, 그보다 작은 수개의 콜로니들도 존재하였는데(화살표 표시), 그들 모두 E1에 대하여 양성을 띠었다. 따라서, Ad5 E1 영역은 박테리아의 성장을 저속화시킨다. 이는 본 발명자들이 게이트웨이 재조합 반응을 이용하여 E1을 삽입하는 데 있어서 문제를 겪게 되는 이유를 설명한다.
도 19는 5개의 모듈 엔트리 벡터로부터 Ad5 게놈을 재조립하기 위한 초기 다중 부위 게이트웨이 전략법을 나타낸 것이다. 먼저, 5개의 엔트리 벡터 중 3개를 스터퍼 벡터와 함께 조합하였다. 이어서, 스터퍼를 제거하여 역선택 카세트를 삽입하였다. 이어서, 최종 2개의 엔트리 벡터를 조합하여 완전한 게놈을 형성하였다. 이러한 특정의 전략법은 E1 모듈 및 크기가 큰 E2 및 L3 모듈과 관련된 독성을 보여주었다.
도 20은 인간 Ad5 Ad셈블리 이중 DEST 벡터 형성에 관한 것이다. E2 및 L3 모듈을 그의 각각의 엔트리 벡터로부터 PCR에 의해 수득하고, SLIC를 사용하여 벡터 골격과 함께 조합한다. 이어서, 모듈 말단에서 공학처리된 독특한 제한 부위로 벡터를 분해시킨 후, SLIC에 의해 모듈 측면 위치에 게이트웨이 역선택 카세트를 삽입한다.
도 21은 인간 Ad5에 대한 Ad셈블리 과정을 나타낸 것이다. 게이트웨이 LR 반응에서 코어 모듈 이중 DEST 벡터를 남은 3개의 엔트리 벡터 각각 하나씩과 함께 조합하여 완전한 바이러스 게놈를 재조립한다.
도 22는 Ad셈블리 방법으로 시도된 수개의 역선택 마커의 효율을 나타낸 것이다. PheS+ccdB를 사용하였고, 콜로니의 블라인드 스크린에 의해, 또는 먼저 콜로니 PCR을 사용하여 삽입을 확인한 후, 표준 제한 분해 스크리닝에 의해 수행하였을 때 효율적인 것으로 나타났다.
도 23은 Ad셈블리 벡터 골격이 본 방법의 실시양태에 대한 2가지 독특한 특징을 포함한다는 것을 보여주는 것이다. 벡터 골격은 p15A 복제 기점을 사용하는데, 이는 플라스미드의 카피수를 낮춰주며, 이로써, Ad5 E1 모듈에 의해 매개되는 독성은 감소하게 된다. 추가로, 벡터는 포유동물 I-SceI 발현 카세트를 함유하는데, 이를 통해 형질감염시 바이러스 게놈을 벡터 골격으로부터 자가 절제시킬 수 있다.
도 24는 Ad셈블리 반응의 효율을 보여주는 것이다. A) 20 fmol의 코어 이중 DEST 벡터 및 각각의 E1 모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈 엔트리 벡터 10 fmol씩을 사용하여 Ad5에 대한 Ad셈블리 반응을 수행하였다. 상기 반응을 실온에서 밤새도록 수행하고, 그 다음날 NEB10-β 세포로 형질전환시켰다. EcoRV 분해에 의한 스크리닝을 위해 16개의 클론을 성장시키고, 제조하였다. 16개의 클론 중 2개가 정확한 제한 분해 패턴(별표 표시, 클론 4 및 8)을 보였다. "L"은 DNA 래더이다. "(-)"는 자체적으로 분해된 코어 이중 DEST 벡터인 음성 대조군이다. "(+)"는 분해된 완전한 Ad5 게놈인 양성 대조군이다. B) E1 엔트리 벡터 양 증가가 Ad셈블리 효율을 개선시킨다는 것을 보여주는 것이다. 20 fmol의 코어 이중 DEST 벡터, 50 fmol의 E1 모듈 엔트리 벡터 및 각각의 E3, 및 E4 모듈 엔트리 벡터 10 fmol씩을 사용하여 Ad5에 대한 Ad셈블리 반응을 수행하였다. 상기 반응을 실온에서 밤새도록 수행하고, 그 다음날 NEB10-β 세포로 형질전환시켰다. EcoRV 분해에 의한 스크리닝을 위해 10개의 클론을 성장시키고, 제조하였다. 10개의 클론 중 7개가 정확한 제한 분해 패턴(적색 별표 표시)을 보였다. "L"은 DNA 래더이다. "(-)"는 분해된 Ad5 E2-E4 벡터인 음성 대조군이다. "(+)"는 분해된 완전한 Ad5 게놈인 양성 대조군이다.
도 25는 인간 Ad5에 대한 AdSlicR 방법을 보여주는 것이다. 우선, Ad셈블리를 위해 생성된 E2-L3 코어 모듈을 시작으로 하여, SwaI 분해에 의해 벡터를 선형화시킨다. 이어서, SLIC를 사용하여 E3 및 E4 모듈을 상기 벡터 내로 삽입한다. 후속 벡터를 PacI로 선형화시킨 후, SLIC에 의해 E1 모듈을 삽입함으로써 완전한 게놈을 형성한다.
도 26은 인간 Ad5 AdSlicR 방법의 효율을 나타낸 것이다. 콜로니 PCR을 제1선 스크리닝으로서 사용한 후, 이어서, PCR 양성 클론의 제한 분해를 수행하였다.
도 27은 Ad셈블링된 바이러스가 조직 배양물 중에서 성장하였다는 것을 보여주는 것이다. A) Ad셈블리에 의해 조립된 복제 아데노바이러스에 의해 생성된 플라크. Ad셈블링된 게놈을 293 세포에 형질감염시키고, 7일째까지 뚜렷한 플라크가 나타났다. B) Ad셈블링된 Ad5를 계대접종하고, 계속 성장시켰다. Ad셈블링된 Ad5의 형질감염으로부터 전체 바이러스를 수집하고, 새로운 293 세포에 다시 플레이팅하였다. 3일째까지 전체 플레이트 전역에 걸쳐 뚜렷한 세포 변성 효과가 시각적으로 나타났다.
도 28은 293 세포에서 성장시켰을 때 Ad셈블링된 Ad5의 역가는 단지 약간 감소하였다는 것을 보여주는 것이다. 293 세포를 야생형 Ad5, Ad셈블링된 Ad5, 또는 attB 삽입을 함유하지 않거나, 또는 4개의 attB 삽입들 각각을 개별적으로 함유하는 AdSLIC Ad5를 이용하여 MOI=10으로 감염시켰다. 48시간 경과 후 전체 바이러스를 수집하고, ELISA에 의해 역가를 측정하였다. 임의의 결함을 보이는 유일의 바이러스는 Ad셈블링된 바이러스 및 attB3 삽입만을 함유하는 AdSLIC 바이러스였다. 상기 둘은 모두 야생형 수준과 비교하였을 때 중간 정도의 2배 감소를 나타내었다. 상기 데이터는 또한 AdSLIC를 사용하여 생성된 바이러스는 293 세포에서 어떤 복제 결함도 가지고 있지 않음을 입증한다. 모든 바이러스에 대한 입력 수준을 적정하였고, 이는 대략 1e7 IU/mL(제시하지 않음)에 가까웠다.
도 29. 도 29A에는 본원에 기술된 Ad셈블리 엔트리 벡터 라이브러리 중의 벡터가 기술되어 있다. 모듈이 유래된 Ad 혈청형이 먼저 열거되어 있고, 이어서, 벡터에 대한 임의의 변이가 열거되어 있다. 어떤 변이도 없다면, 엔트리는 "야생형"으로 언급된다. 도 29B에는 본원에 기술된 Ad셈블리 및 AdSLIC에 대한 마크로모듈 벡터가 기술되어 있다. 마크로모듈이 유래된 Ad 혈청형이 먼저 열거되어 있고, 이어서, 마크로모듈을 포함하는 모듈, 이어서, 벡터에 대한 임의의 변이가 열거되어 있다. 어떤 변이도 없다면, 이는 "야생형"으로 언급된다. 도 29C에는 본원에 기술된 Ad셈블리 또는 AdSLIC를 사용하여 조립된 아데노바이러스 게놈이 기술되어 있다. 게놈의 기초가 되는 Ad 혈청형이 먼저 열거되어 있고, 이어서, 벡터에 대한 임의의 변이가 열거되어 있다. 어떤 변이도 없다면, 이는 "야생형"으로 언급된다.
도 30은 SLIC를 사용하여 전체 게놈을 플라스미드로 삽입하는 것에 관해 나타낸 것이다. A)는 방법을 개략적으로 나타낸 것으로서, 상기 방법을 통해 삽입시키고자 하는 바이러스 게놈의 말단에 대해 상동성인 단쇄부(~20 bp)를 함유하는 플라스미드 벡터를 PCR에 의해 수득하였다. 이어서, 게놈 및 벡터 둘 모두를 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, 일반 방식으로 SLIC에 사용하였다. B)는 전체 Ad5 게놈을 플라스미드 골격 내로 삽입하는 것에 관한 일례를 나타낸 것이다. 스크리닝된 6개의 클론 모두 전체 게놈을 함유하였다. 게놈은 정방향 또는 역방향으로 삽입될 수 있기 때문에, 이러한 경우, 4개는 한 방향으로(클론 1, 4, 5, 및 6), 2개는 다른 방향으로(클론 2 및 3) 위치하였다.
도 31-33은 아데노바이러스 게놈 변형 방법을 도시한 것이다.
도 34의 상단 패널은 AdSLICr 시스템을 사용한 비인간 아데노바이러스인 마우스 아데노바이러스 1형(서열 번호: 104)의 게놈 조립에 관한 예이다. (SwaI 또는 PmeI로) 선형화된 코어 벡터로 서열 및 결찰 독립 클로닝(SLIC)하는 데 필요한 정확한 오버행이 남게 하는 제한 효소로 절제될 수 있도록 E1, E3-섬유, 및 E4 모듈 플라스미드를 디자인하였다. SLIC하는 데 필요한 선형 단편을 수득하기 위해서는 PCR을 수행할 필요가 없으며, 이에 오류가 도입될 잠재성은 삭제된다. 또한 어떤 외래 서열도 최종 게놈 구성체 내로 삽입되지 못하도록 디자인한다. 전형적인 방법은 E3-섬유 및 E4 모듈을 절제하고, PmeI로 선형화된 코어 벡터와 조합하는 것을 포함한다. 이를 통해 E2-E4 마크로모듈이 생성되고, 이어서, 이를 SwaI로 절단하고, 절제된 E1 모듈과 함께 조합함으로써 완전한 게놈이 생성될 수 있다. 하단 패널: 상기 전략법을 사용하여 야생형 마우스 아데노바이러스 1형을 조립하고, 마우스 3T6 세포 형질감염 후, 감염성 바이러스 형성 플라크를 수득하였다.
도 35는 성장을 방해하는 삽입 부위를 확인하기 위해 수행된, 단일 attB 재조합 부위 삽입을 함유하는 바이러스에 관한 성장 분석을 나타내는 것이다. Ad셈블리를 사용하여 생성된 바이러스는 야생형 바이러스와 비교하였을 때, 약간의 성장 결함을 보유하였는 바(도 28), Ad셈블리를 사용하여 생성된 바이러스에 존재하는 각각의 attB 삽입 중 단 하나씩만을 함유하도록 AdSLIC를 사용하여 바이러스를 생성하였다. 293 세포(상단의 그래프)를 MOI=10으로 감염시켰다. U20S 세포(하단의 그래프)는 MOI=50으로 감염시켰다. 48시간 경과 후 전체 바이러스를 수집하고, 역가를 측정하였다. U20S 세포에서의 야생형 바이러스와 비교하였을 때, 모듈 [L3]과 [E3] 사이의 attB5 삽입은 성장을 방해하지 않은 반면, 다른 나머지 3개의 접합부에서의 attB 삽입은 야생형과 비교하였을 때, 성장을 억제시키는 것으로 나타났다.
도 36은 E1과 E2-L2 모듈 사이의 초기 attB4 삽입 부위가 성장 결함을 일으키는 바(도 35), 대체 배치 옵션을 디자인하였다는 것을 보여준다. 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다.
도 37은 E3과 E4 모듈 사이의 초기 attB4 삽입 부위가 성장 결함을 일으키는 바(도 35), 대체 배치를 디자인하였다는 것을 보여준다. 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다.
도 38은 U20S 세포를 바이러스를 이용하여 MOI=50으로 감염시키고, 48시간 경과 후 전체 바이러스를 수집하고, 역가를 측정하여 얻은 결과를 나타낸 것이다. Ad셈블리를 사용하여 생성된 3가지 바이러스를 야생형 바이러스와 비교하였다. 대체 attB 부위 삽입(검은색 다이아몬드 표시 및 삼각형 표시)을 함유하는 바이러스는 원래의 attB 부위 배치(검은색 X 표시)와 비교하였을 때, 성장을 개선시켰다. 상기의 모든 바이러스는 L2와 L3 모듈 사이에 위치하는 attB 부위를 포함하지 않고, 성장에 영향을 미치지 않는 L3과 E3 모듈 사이에 attB 삽입을 함유한다.
도 39은 Ad셈블리를 사용하여 트랜스진이 E1 모듈로부터 발현되는 바이러스를 생성할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 이러한 경우, Ad5의 E1A 및 E1B 유전자는 E1 모듈 중 GFP 발현 카세트로 치환되었다. Ad셈블리를 사용하여 바이러스를 조립하고, 생존가능한 GFP 발현 바이러스를 수득하였다.
도 40은 Ad셈블리를 사용하여 트랜스진이 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 E3 모듈로부터 발현되는 바이러스를 생성할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. E3 모듈을 변형시켜 11.6 K 단백질(Ad5 뉴클레오티드 29491-29772)을 결실시키고, 그 위치에 mCherry를 배치시켰다. 이어서, E3 전사체는 천연적으로 mCherry 유전자로 스플라이싱되고, 단백질이 발현된다. Ad셈블리를 사용하여 바이러스를 생성하고, U20S 세포의 형질도입을 제시한다. 이는 1) E3 모듈로부터의 트랜스진 발현, 및 2) 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 외래 유전자를 발현시키는 것에 관한 예이다.
도 41은 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 E4 모듈로부터 다중 트랜스진을 발현하는 것을 보여주는 것이다. 천연 E4 프로모터를 CMV 프로모터로 치환하고, 3개의 천연 E4 유전자를 트랜스진으로 치환하였다. 이어서, Ad셈블리를 사용하여 바이러스를 생성하였다. 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다.
도 42는 Ad셈블리를 사용하여 다중 트랜스진이 천연 바이러스 전사 구조를 사용하여 E4 모듈로부터 발현되는 바이러스를 생성할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 도 41에서 생성된 바이러스를 24 hr 동안 U20S 세포로 형질도입시키고, 전체 RNA를 수집하고, 무작위 프라이밍을 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하여 mCherry 유전자에 대한 스플라이싱에 대해 테스트하였다. 검은색 화살표 표시는 GFP를 발현하게 되는 스플라이싱되지 않은 전사체를 나타낸다. 흰색 화살표 표시는 mCherry를 발현하게 되는 스플라이싱된 전사체를 나타낸다. 이는 다중 외래 유전자가 단일 모듈로부터 발현될 수 있다는 것을 입증한다. 레인 1 및 2는 각각 형질도입되지 않은 세포의 음성 대조군 또는 야생형 Ad5로 감염된 세포이다.
도 43은 Ad셈블리를 사용하여 이루어진 단일 게놈 조립체 중 다중 모듈 간의 다중 유형의 변이 도입을 나타낸 것이다. Ad5 게놈의 5개의 모듈을 나타내는 다이어그램으로, 여기서, 수직 화살표 표시는 전체 게놈 조립 이전에 각 모듈에 대해 이루어진 변이를 나타내는 것이다. E1 모듈을 루시퍼라제-GFP 융합 단백질에 대한 트랜스진 발현 카세트로 전환시켰다. L3 모듈 중 헥손 단백질을 점 돌연변이에 의해 Glu 451에서 Gln으로 변경시켰다. E3 모듈 중 천연 Ad5 섬유 부분은 다른 인간 아데노바이러스 혈청형으로부터의 수개의 섬유 부분 중 하나로 치환하였다. Ad셈블리를 사용하여, 각각이 대체 섬유 단백질을 포함하는 것인 6개의 바이러스를 생성하였다. Ad5에 대해 열거된 염기쌍 위치는 서열 번호: 137에 기재된 위치를 나타낸다. 수탁 번호 DQ086466, AJ854486, BK001453, NC_001460, 및 AY_737797은 각각 서열 번호: 139-143에 상응한다.
도 44는 Ad셈블리를 사용하여 생성된 섬유 키메라 바이러스를 통해 인간 배아 줄기 세포(hESC: human embryonic stem cell)에서의 형질도입 능력이 일반 Ad5 섬유와 비교하였을 때 개선되었다는 것을 나타내는 것이다. 24 또는 48시간 동안 인간 ESC를 다양한 MOI로 형질도입시키고, GFP 발현에 대해 현미경으로 측정하였다. 상단 패널은 바이러스를 포함하지 않는 음성 대조군이다. 두번째 패널은 "Ad5 CMV-GFP"로서, 이는 CMV 프로모터하에 GFP를 발현하는 것이다. 테스트된 바이러스 섬유 키메라는 좌측에 명시되어 있다(즉, Ad5/3은 Ad3 섬유 놉을 포함하는 Ad5이다). 모든 영상은 5X 확대 배율로 촬영된 것이다.
도 45는 아데노바이러스 혈청형 간의 코어 모듈 교환을 통해 생존가능한 바이러스가 생산된다는 것을 보여주는 것이다. Ad11로부터의 코어 모듈을 생성하였다. 각각 Ad11 pIX 및 U 엑손-섬유를 보유하도록 Ad5 E1 및 E3 모듈을 변형시켰다. AdSLIC를 사용하여 전체 바이러스를 조립하고, 293 세포 상에서 바이러스를 재구성하였다. "최종 바이러스" 목록에 기록되어 있는 염기쌍 위치는 서열 번호: 137(Ad5) 및 서열 번호: 141(Ad11)에 기재되어 있는 것으로부터의 것이다.
도 46은 바이러스 감염과 관련하여 바이러스의 작용 연구를 위해 바이러스 유전자를 돌연변이시키기 위해 AdSLIC를 사용하는 것을 보여주는 것이다. E1 모듈에서, E1B-55K 유전자를 His 260 위치에서 Ala로 돌연변이시켰다. 다른 모듈 모두는 야생형이었다. AdSLIC를 사용하여 상기 바이러스를 조립하였다. 인간 소기도 상피 세포를 복제 결함이 있는 Ad5(레인 1), 야생형 Ad5(레인 2), 또는 Ad5 H260A(레인 3)를 이용하여 MOI=10으로 감염시켰다. 감염 후 36시간 경과하였을 때, 전체 단백질을 수집하고, p53(상단 패널), mdm2, Ad5 후기 단백질, 및 액틴에 대한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 야생형 Ad5와 달리, Ad5-H260A 바이러스는 p53을 분해하지 못했고, 후기 단백질 생산에 있어서도 결함이 있었다.
본 발명의 상세한 설명
정의
"핵산"이란 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체, 및 그의 보체를 의미한다. 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사 작용하는 것인, 합성, 천연적으로 발생된, 및 비천연적으로 발생된, 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함한다. 그러한 유사체의 예로는 제한없이, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄 메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA: peptide-nucleic acid)을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 암묵적으로는, 명확하게 명시된 서열 뿐만 아니라, 그의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적인 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치의 것이 혼합형 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌 ([Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol . Chem . 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini et al., Mol . Cell. Probes 8:91-98 (1994))])). 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환적으로 사용된다.
특정 핵산 서열은 또한 암묵적으로는 "스플라이스 변이체"를 포함한다. 유사하게, 핵산에 의해 코딩된 특정 단백질은 암묵적으로는 상기 핵산의 스플라이스 변이체에 의해 코딩된 임의의 단백질을 포함한다. "스플라이스 변이체"란 그 명칭이 제안하는 바와 같이, 유전자의 선택적 스플라이싱의 생성물이다. 전사 후, 초기 핵산 전사체는 상이한(대체) 핵산 스플라이스 생성물이 상이한 폴리펩티드를 코딩할 수 있도록 스플라이싱될 수 있다. 스플라이스 변이체를 제조하는 기전은 다양하지만, 엑손의 선택적 스플라이싱을 포함한다. 연속 판독 전사에 의해 동일의 핵산으로부터 유도된 대체 폴리펩티드 또한 상기 정의에 포함된다. 재조합 형태의 스플라이스 생성물을 비롯한, 스플라이싱 반응의 임의의 생성물이 상기 정의에 포함된다. 칼륨 채널 스플라이스 변이체의 예는 문헌 [Leicher, et al., J. Biol . Chem . 273(52):35095-35101 (1998)]에서 논의된 바 있다.
*원하는 치료학적 유전자 코딩 및 제어 서열을 함유하는 적합한 벡터 구성은 당업계에서 잘 이해되고 있는 표준 결찰 및 제한 기법을 사용할 수 있다(문헌 [Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] 참조). 단리된 플라스미드, DNA 서열, 또는 합성된 올리고뉴클레오티드는 원하는 형태로 절단, 테일러링(tailor), 및 재결찰될 수 있다.
핵산이 또 다른 핵산 서열과 작용상 관련이 있도록 배치될 때, 이는 "작동가능하게 연결된다." 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현될 경우, 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향에 미칠 경우, 상기 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 원활하게 일어날 수 있도록 하기 위해 배치될 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결"이라는 것은 연결되는 DNA 서열이 서로 가깝게 위치하고, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하며, 판독 단계에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 종래 수행 방법에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다.
2종 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 "동일성(%)"이라는 용어는 하기 기술되는 디폴트 파라미터와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용함으로써, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사(예컨대, NCBI 웹사이트 등 참조)에 의해 측정된 바, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 명시된 비율(%)로 포함하는 것인(즉, 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 정렬되고, 그를 비교하였을 때, 명시된 영역에 대해 약 60%의 동일성, 바람직하게 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 가지는) 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다. 이어서, 상기 서열은 "실질적으로 동일하다"라고 언급될 수 있다. 상기 정의는 또한 테스트 서열의 보체를 의미하거나, 그에 대해 적용될 수 있다. 상기 정의는 또한 치환을 가지는 서열 뿐만 아니라, 결실 및/또는 부가를 가지는 서열도 포함한다. 하기 기술하는 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게, 동일성은 길이가 약 25개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 대해, 또는 더욱 바람직하게는 길이가 50-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 대해 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로는 한 서열이 테스트 서열과 비교되는 참조 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 테스트 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요할 경우, 서브서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게, 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 대체 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열과의 비교로 테스트 서열에 대한 서열 동일성(%)을 계산한다.
본원에서 사용되는 바, "비교창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 같은 개수의 인접한 위치로 이루어진 참조 서열과 비교될 수 있는 것인, 20 내지 600개, 일반적으로는 약 50 내지 약 200개, 더욱 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접한 위치의 개수 중 어느 하나로 이루어진 세그먼트를 언급하는 것을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 주지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예컨대, 문헌 [Smith & Waterman, Adv . Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad . Sci . USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 탐색에 의해, 이들 알고리즘(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹)에서 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터화된 이행에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사(예컨대, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 측정하는 데 적합한 알고리즘에 관한 바람직한 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있으며, 이는 각각 문헌 ([Altschul et al., Nuc . Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 [Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990)])에 기술되어 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성(%)을 측정하는 데 본원에 기술된 파라미터와 함께 BLAST 및 BLAST 2.0이 사용된다. BLAST 분석 실행용 소프트웨어는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 미국 국가 생물 공학 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 우선 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드와 함께 정렬되었을 때, 어느 정도의 양의 값의 역치 점수 T에 매치되거나, 그를 충족시키는 의문 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 고 점수화 서열 쌍(HSP: high scoring sequence pair)을 확인하는 것을 포함한다. T는 근접 워드 점수 역치(문헌 [Altschul et al., 상기 문헌 동일]) 를 나타낸다. 이들 초기 근접 워드 히트는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 탐색 개시용 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라서 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열의 경우, 파라미터 M(매칭되는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(미스매칭되는 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 점수화 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향에서 워드 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 달성된 그의 최대값으로부터 양 X 만큼 떨어지거나; 누적 점수가 하나 이상의 음의 점수화 잔기 정렬의 누적으로 인하여 0 이하가 되거나; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달한 경우에는 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X가 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이(W)=11, 기대치(E)=10, M=5, N=-4 및 두 가닥 모두의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우에 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이=3, 및 기대치(E)=10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스(문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 10915 (1989)]) 정렬(B)=50, 기대치(E)=10, M=5, N=-4 및 두 가닥 모두의 비교를 사용한다.
"폴리펩티드" "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 중합체 및 비천연적으로 발생된 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 발생된 아미노산의 인공 화학적 모방체인 것인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"아미노산"이라는 용어는 천연적으로 발생된 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체도 의미한다. 천연적으로 발생된 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라, 추후에 변형되는 아미노산, 예컨대, 하이드록시프롤린, γ- 카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체란 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 가지는, 즉, 수소에 결합된 탄소, 카복실기, 아미노기, 및 R 기를 가지는 화합물을 의미하며, 그 예로는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄이 있다. 상기와 같은 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격를 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체란 아미노산의 일반 화학 구조와는 상이한 구조를 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학 화합물을 의미한다.
본원에서 아미노산은 아미노산에 관해 보편적으로 알려져 있는 3문자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고되는 1문자 기호로 나타낼 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드도 뉴클레오티드에 관해 보편적으로 허용되는 1문자 코드로 나타낼 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열, 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체란 동일하거나, 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않을 경우, 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성에 기인하여, 다수의 작용성 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU, 모두가 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌으로 명시되는 모든 위치에서 코돈은 코딩되는 폴리펩티드는 변경시키지 않으면서, 기술된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이가 "침묵 변이"인데, 이는 보존적으로 변형된 변이 중의 한 종류이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 핵산 중의 각 코돈(단, 보통 메티오닌에 대한 유일의 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일의 코돈인 TGG 제외)을 변형시킴으로써 작용상 동일한 분자를 수득할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 실제 프로브 서열과는 상관없이, 발현 생성물과 관련하여 각 기술된 서열에 내재되어 있다.
아미노산 서열과 관련하여 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가, 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가는, 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 작용상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 주지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 추가로 본 발명의 다형태 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자를 포함하며, 배제시키지 않는다.
하기 8개의 군은 각각 서로 보존적 치환을 하는 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예컨대, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).
예컨대, 세포, 바이러스, 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, "재조합"이라는 용어는 세포, 바이러스, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입에 의해, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래된 것이라는 것을 의미하는 것이다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연(비재조합) 형태의 세포내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 발현시에 다르게 비정상적으로 발현되거나, 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
"엄격한 하이브리드화 조건"이라는 어구는 프로브가 전형적으로는 핵산의 복합 혼합물 중에서 다른 서열에는 하이브리드화하지 않지만, 그의 표적 서브서열에는 하이브리드화하게 되는 상태의 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열에 의존하며, 이는 다른 환경하에서는 달라지게 될 것이다. 보다 장쇄인 서열은 보다 고온인 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 관한 광범위한 가이드는 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the 전략법 of nucleic acid assays" (1993)]에서 살펴볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도, pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점(Tm: thermal melting point)보다 약 5-10℃ 정도 낮은 온도가 되도록 선택된다. Tm은 (표적 서열은 과량으로 존재하는 바, Tm에서 프로브의 50%가 평형 상태로 점유되기 때문에) 표적에 상보적인 프로브 중 50%가 평형 상태로 표적 서열에 하이브리드화하게 되는 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하의) 온도이다. 엄격한 조건은 또한, 탈안정화제, 예컨대, 포름아미드를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화를 위해, 양의 신호는 배경의 2배 이상, 바람직하게는 배경 하이브리드화의 10배인 것이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 하기와 같다:50%> 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 0.2x SSC 중에서, 및 65℃에서 0.1% SDS 중에서 세척.
엄격한 조건하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은, 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로는 동일할 경우, 이는 여전히 실질적으로는 동일한 것이다. 이같은 것은 예를 들어, 유전자 코드에 의해 허용되는 최대의 코돈 축퇴성을 사용하여 핵산 카피가 생성되었을 경우에 발생한다. 상기 경우에 핵산은 전형적으로는 중간 정도의 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하게 된다. 예시적인 "중간 정도의 엄격한 하이브리드화 조건"은 37℃에서 40% 포름아미드의 버퍼, 1 M NaCl, 1% SDS 중에서의 하이브리드화, 및 45℃에서 1X SSC 중에서 세척을 포함한다. 양의 하이브리드화는 배경의 2배 이상인 것이다. 대체 하이브리드화 및 세척 조건을 사용하여 유사의 엄격한 조건을 제공할 수 있다는 것을 당업계의 숙련가는 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 하이브리드화 파라미터를 결정짓는 추가의 가이드라인은 예컨대, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., John Wiley & Sons]과 같은, 많은 참고 문헌에 제공되어 있다.
PCR을 위해서는, 비록 어닐링 온도는 프라이머의 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃로 달라질 수 있지만, 낮은 엄격도의 증폭을 위해서는 약 36℃인 온도가 전형적인 온도이다. 높은 엄격도의 PCR 증폭을 위해서는, 비록 높은 엄격도의 어닐링 온도는 프라이머의 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃로 달라질 수 있지만, 약 62℃인 온도가 전형적인 온도이다. 높은 엄격도 및 낮은 엄격도의 증폭, 둘 모두를 위해 전형적인 사이클 조건으로는 90℃-95℃에서 30초-2분. 동안의 변성 단계, 30초-2분. 동안 지속되는 어닐링 단계, 및 약 72℃에서 1-2분. 동안의 신장 단계를 포함한다. 낮은 엄격도 및 높은 엄격도의 증포 반응을 위한 프로토콜 및 가이드라인은 예컨대, 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.)]에 제공되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "암"이라는 용어는 백혈병, 암종 및 육종을 비롯한, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물, 또는 악성 종양을 의미한다. 암의 예로는 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두부경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모세포종을 포함한다. 추가의 예로는 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발골수종, 신경아세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 방광암, 전암성 피부 병소, 고환암, 림프종, 갑상샘암, 신경아세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립샘암을 포함한다.
"백혈병"이라는 용어는 광범위하게는 혈액 형성 기관의 진행성 악성 질환을 의미하는 것으로, 이는 일반적으로 혈액 및 골수 중 백혈구 및 그의 전구체의 기형적 증식 및 발생을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로는 임상적으로 (1) 질환의 지속 기간 및 특징-급성 또는 만성; (2) 관여하는 세포 유형; 골수(골수성), 림프계(림프성), 또는 단핵구성; 및 (3) 혈액 중 비정상적인 세포의 개수 증가 또는 비증가-백혈성 또는 무백혈성(아백혈성)을 기초로 분류된다. P388 백혈병 모델은 생체내 항백혈병 활성을 예측하는 것으로 광범위하게 허용되고 있다. P388 검정에서 양성인 것으로 테스트된 화합물이 일반적으로는 치료하고자 하는 백혈병 유형과는 상관없이 생체내에서 어느 정도 수준의 항백혈병 활성을 보이는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명은 백혈병을 치료하는 방법, 및 바람직하게는, 급성 비림프구성 백혈병, 무백혈성성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 무백혈성성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 무백혈성 백혈병, 백혈구 증가 백혈병, 호염기구성 백혈병, 아세포 백혈병, 소 백혈병, 무백혈성성 골수구성 백혈병, 피부 백혈병, 배아성 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스(Gross) 백혈병, 모세포 백혈병, 혈아세포 백혈병, 혈구아세포 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 백혈구감소 백혈병, 림프성 백혈병, 림프아구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프계 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵구 백혈병, 소골수아구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수아구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수 과립구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 네겔리(Naegeli) 백혈병, 형질 세포 백혈병, 다중 골수종, 형질 세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 라이더(Rieder) 세포 백혈병, 쉴링(Schilling's) 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아백혈성 백혈병, 및 미분화성 세포 백혈병을 치료하는 방법을 포함한다.
"육종"이라는 용어는 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 구성되고, 일반적드로는 섬유원성 또는 균질 물질에 포매되어 있는 빽빽하게 밀집되어 있는 세포로 이루어진 종양을 의미한다. 항신생물성 티올 결합 미토콘드리아 산화제 및 암제의 조합물로 치료될 수 있는 육종으로는 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메티(Abemethy's) 육종, 지방성 육종, 지방육종, 포상연부 육종, 법랑아 육종, 포도형 육종, 녹색종 육종, 육모 암종, 배아성 육종, 윌름즈(Wilms') 종양 육종, 자궁내막 육종, 간질 육종, 유잉 육종, 근막 육종, 섬유아세포 육종, 거대 세포 육종, 과립구성 육종, 호지킨 육종, 특발성 다중 색소침착성 출혈 육종, B 세포의 면역아세포 육종, 림프종, T 세포의 면역아세포 육종, 엔센(Jensen's) 육종, 카포시 육종, 쿠퍼(Kupffer) 세포 육종, 혈관육종, 백혈육종, 악성 중간엽종 육종, 방골성 육종, 망상적혈구 육종, 라우스 육종, 장액낭종 육종, 활액 육종, 및 모세혈관확장 육종을 포함한다.
"흑색종"이라는 용어는 피부 및 다른 기관의 멜라닌세포계로부터 유발된 종양을 의미한다. 항신생물성 티올 결합 미토콘드리아 산화제 및 암제의 조합물로 치료될 수 있는 흑색종으로는 예를 들어, 말단흑자 흑색종, 무멜라닌 흑색종, 양성 연소성 흑색종, 클라우드맨즈(Cloudman's) 흑색종, S91 흑색종, 하딩-패세이(Harding-Passey) 흑색종, 연소성 흑색종, 악성 흑점자 흑색종, 악성 흑색종, 결절성 흑색종, 조갑하 흑색종, 및 표재성 확산 흑색종을 포함한다.
"암종"이라는 용어는 주변 조직으로 침윤되고, 전이를 일으키는 경향을 지닌 상피 세포로 구성된 악성 신생 성장을 의미한다. 항신생물성 티올 결합 미토콘드리아 산화제 및 암제의 조합물로 치료될 수 있는 암종의 예로는 예를 들어, 세엽 세포 암종, 선방상 암종, 선낭 암종, 선양 낭성 암종, 선 암종, 부신 피질 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저 세포성 암종, 기저양 암종, 기저 편평 세포 암종, 기관지폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지원성 암종, 대뇌양 암종, 담관세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 면포 암종, 자궁체부 암종, 사상 암종, 갑옷암종, 피부 암종, 원주상 암종, 원주상 세포 암종, 관암종, 경성 암종, 배아성 암종, 뇌질양 암종, 표피양 암종, 상피 선양 암종, 외성장 암종, 궤양성 암종, 섬유성, 젤라틴모양 암종, 젤라틴 암종, 거대 세포 암종, 거대 세포성 암종, 선암종, 과립막 세포 암종, 모기질 암종, 헤마토이드 암종, 간세포 암종, 휘르틀레(Hurthle) 세포 암종, 유리질 암종, 유부신종, 영아 배아성 암종, 계내 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 크롬페셔즈(Krompecher's) 암종, 쿨치스키(Kulchitzky) 세포 암종, 대세포 암종, 수정체 암종, 수정체양 암종, 지방종성 암종, 림프상피 암종, 속질 암종, 수질성 암종, 멜라닌성 암종, 연성 암종, 점액 암종, 점액분비성 암종, 점액세포성 암종, 점막표피양 암종, 점액 암종, 점액성 암종, 점액종성 암종, 코인두 암종, 귀리 세포 암종, 골화 암종, 유골 암종, 유두상 암종, 문맥주위 암종, 침습전 암종, 가시 세포 암종, 풀 모양 암종, 신장의 신장 세포 암종, 예비 세포 암종, 육종성 암종, 시나이더 암종, 경화성 암종, 음낭암종, 반지 세포 암종, 단순 암종, 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 구형 세포 암종, 방추 세포 암종, 해면 암종, 편평 암종, 편평 세포 암종, 선상 암종, 모세혈관확장 암종, 모세혈관확장성 암종, 이행 세포 암종, 결절성 암종, 결절 암종, 사마귀 모양 암종, 및 유모 암종을 포함한다.
본원에서 "치료학상 유효 용량 또는 유효량"이란 효과를 일으킬 수 있는 투여 용량을 의미한다. 정확한 용량 및 제제는 치료 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기법을 사용함으로써 당업자에 의해 확인될 것이다(문헌, ([Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)]; [Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)], 및 [Pickar, Dosage Calculations (1999)]) 참조).
"약학적으로 허용가능한 염" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 본원에 기술된 화합물 상에서 발견되는 특정 치환기에 따라, 상대적으로 비독성인 산 또는 염기를 사용하여 제조된 활성 화합물의 염을 포함한다는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 산성을 띠는 관능기를 함유할 경우, 순수한 상태 그대로(neat) 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분량의 원하는 염기와 중성 형태의 상기 화합물을 접촉시킴으로써 염기 부가 염을 수득할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 염기성을 띠는 관능기를 함유할 경우, 순수한 상태 그대로 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분량의 원하는 산과 중성 형태의 상기 화합물을 접촉시킴으로써 산 부가 염을 수득할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염의 예로는 무기산, 예로서, 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 모노하이드로겐탄산, 인산, 모노하이드로겐인산, 디하이드로겐인산, 황산, 모노하이드로겐황산, 요오드화수소산, 또는 아인산 등으로부터 유도된 염 뿐만 아니라, 상대적으로 비독성인 유기산, 예로서, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤조술폰산, p-톨릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등으로부터 유도된 염을 포함한다. 아미노산, 예로서, 알기네이트 등의 염, 유기산, 예로서, 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등의 염 또한 포함한다(예컨대, 문헌 [Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)] 참조). 본 발명의 특정의 구체적인 화합물은 화합물이 염기 또는 산 부가 염으로 전환될 수 있도록 허용하는 염기성 및 산성 관능기, 둘 모두를 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 약학적으로 허용가능한 담체도 본 발명에 적합하다.
상세한 실시양태
I. Ad셈블리 방법
한 측면에서, 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법(본원에서는 "Ad셈블리(Adsembly)"로도 지칭된다)을 제공한다. 본 방법은 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈, 또는 아데노바이러스 마크로모듈(하기 기술되는 바와 같은, 그의 돌연변이체)로부터 선택되는 2개 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈 또는 아데노바이러스 마크로모듈로부터 선택되는 3, 4, 또는 5개의 아데노바이러스 유전자 모듈로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다. 핵산은 아데노바이러스 게놈 구성체일 수 있다. 아데노바이러스 게놈 구성체는 (예컨대, 포유동물 세포로 도입되었을 때) 발현시, 재조합 아데노바이러스를 형성할 수 있는 핵산이다. 핵산은 또한 (예컨대, 포유동물 세포로 도입되었을 때) 발현시, 추가 바이러스(예컨대, 헬퍼 바이러스)와 함께 재조합 아데노바이러스를 형성할 수 있는 부분 아데노바이러스 게놈 구성체일 수 있다. 그렇게 형성된 아데노바이러스는 복제 및 패킹될 수 있고, 이로써 자손 바이러스를 생산할 수 있다. 따라서, 본원에서 제공하는 방법은 포유동물 세포로 형질감염되었을 때, 단독으로 보충 세포주에서, 또는 헬퍼 바이러스와 함께 복제 및 패킹되어 자손 바이러스를 생산하는 아데노바이러스 게놈를 2개 이상의 게놈 모듈 또는 이종성 요소로부터 시험관내에서 조립하는 단계를 포함할 수 있다. 게놈 모듈은 진화상 보존되는 서열, 전사, 또는 작용 단위에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈로부터 선택되는 3개 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다. 조립 후, 생성된 핵산(이는 또한 본원에서 "조립된 핵산"으로도 지칭된다)은 발현됨으로써(예컨대, 복제, 전사, 번역 및 패킹됨으로써) 재조합 아데노바이러스가 형성될 수 있다. 핵산의 발현은 시험관내, 계내, 세포에서(예컨대, 핵산의 세포내로의 형질감염에 의해), 또는 생체내에서 실행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현은 세포에서 실행될 수 있고, 이로써 바이러스가 생산될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "아데노바이러스 유전자 모듈"이라는 용어는 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈 또는 그의 마크로모듈을 의미한다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 모듈은 핵산(예컨대, DNA)이다. 본원에서 사용되는 바, "개별 아데노바이러스 유전자 모듈"은 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, 또는 E4 모듈을 의미한다. 일부 실시양태에서, 개별 아데노바이러스 유전자 모듈 중 하나 이상의 것이 핵산을 조립하기 이전에 보다 작은 서브모듈로부터 조립될 수 있다. 아데노바이러스 마크로모듈은 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈 중 2, 3, 또는 4개로 이루어진 조합물이다. 그러므로, 마크로모듈은 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈 중 2, 3, 또는 4개를 포함하는 선형 가닥의 핵산(예컨대, DNA)이다. 본원에서 사용되는 바, "아데노바이러스 마크로모듈"이라는 용어는
E1-L2 마크로모듈(즉, E1 모듈 및 E2-L2 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산);
E1-L4 마크로모듈(즉, E1 모듈, E2-L2 모듈 및 L3-L4 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산);
E1-E3 마크로모듈(즉, E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈 및 E3 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산);
E2-L4 마크로모듈(즉, E2-L2 모듈 및 L3-L4 모듈을 포함하는 핵산, 이는 또한 본원에서 "코어 마크로모듈"로서도 지칭된다);
E2-E3 마크로모듈(즉, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈 및 E3 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산);
E2-E4 마크로모듈(즉, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈 및 E4 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산);
L3-E3 마크로모듈(즉, L3-L4 모듈, 및 E3 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산);
L3-E4 마크로모듈(즉, L3-L4 모듈, E3 모듈 및 E4 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산); 및
E3-E4 마크로모듈(즉, E3 모듈 및 E4 모듈이 조합된 것을 포함하는 핵산)을 의미한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 마크로모듈은 E2-L4 마크로모듈(즉, 코어 마크로모듈) 또는 E3-E4 마크로모듈이다. 아데노바이러스 마크로모듈이 핵산 조립을 위한 2개 이상의 선택된 아데노바이러스 모듈 중의 하나로서 사용되는 경우, 다른 나머지의 것인 선택된 아데노바이러스 모듈(들)은 상기 아데노바이러스 마크로모듈 내에 포함되어 있는 개별 아데노바이러스 마크로모듈이 아니다. 다시 말하면, 각 개별 아데노바이러스 유전자 모듈은 따로따로든 또는 마크로모듈 내에든 간에 조립된 핵산 중에는 단 한번만 존재한다. 예를 들어, 핵산 조립을 위한 2개 이상의 선택된 아데노바이러스 유전자 모듈 중 하나가 코어 마크로모듈인 경우, 조립된 핵산 중에 포함시키고자 하는 또 다른 모듈로서는 E2-L2도 L3-L4 모듈도 선택되지 않는다. 유사하게, 3개 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈이 선택되는 경우, 아데노바이러스 마크로모듈은 E1-E3 마크로모듈도 E2-E4 마크로모듈도 아니다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (i) E1 모듈, (ii) 코어 마크로모듈, 및 (iii) E3 모듈, E4 모듈 또는 E3-E4 마크로모듈로부터 선택되는 3개의 아데노바이러스 유전자 모듈로 핵산을 조립하는 단계를 포함한다. 본 방법은 또한 E1 모듈, 코어 마크로모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈로부터 선택되는 4개의 아데노바이러스 유전자 모듈로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 조립 이전에 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 조합함으로써 마크로모듈을 형성할 수 있다. 마크로모듈을 형성하는 경우, 본 방법은 마크로모듈 및 마크로모듈 내에 포함되어 있지 않은 하나 이상의 개별 아데노바이러스 유전자 모듈(즉, E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, 및/또는 E4 모듈)로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마크로모듈은 코어 마크로모듈이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법은 코어 마크로모듈, 및 E1 모듈, E3 모듈, 또는 E4 모듈로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 사용하여 핵산을 조립하는 단계를 포함한다.
아데노바이러스는 핵에서 복제되는 외피 비보유의 20면체 바이러스이다. 본원에서 제공하는 아데노바이러스 유전자 모듈은 예를 들어, 문헌 [Davison et al., Journal of General Virology, (2003), 84, 28695-2938]에 기술되어 있는 바와 같이, 아데노바이러스 게놈 중의 특정 위치를 언급한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 유전자 모듈은 인간 아데노바이러스로부터 유래된 것이다. 도 5는 본원에서 제공하는 아데노바이러스 유전자 모듈 뿐만 아니라, 그의 대략적인 크기를 킬로베이스 (kb)로 나타낸 간략화된 지도이다. 각 모듈은 다중 유전자 생성물 및 선택적 유전자 스플라이싱 정렬을 코딩할 수 있다.
*본원에서 사용되는 바, "E1 모듈"은 아데노바이러스 역위 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)를 포함하는 핵산이다. E1 모듈은 조립된 핵산의 단백질 코딩 영역에 작동가능하게 연결될 수 있는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. E1 모듈은 전형적으로 아데노바이러스 E1A 및/또는 E1B 영역으로부터 유래된 것이다. ITR 영역 이외에도, E1 모듈은 또한 아데노바이러스 게놈의 E1 말단에서부터 바이러스 폴리머라제 코딩 영역(하기 논의된다)까지에서 발견되는 임의의 바이러스 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, E1 모듈은 (예컨대, pRB 패밀리의 불활성 인자를 코딩하는) 주요 전사 활성 인자 E1A에 대한 코딩 영역, (예컨대, 아포프토시스 차단제를 포함하는) E1B-19K에 대한 코딩 영역, E1B-55K(예컨대, p53 결합, mre 결합 및 바이러스 mRNA 외수송 인자)에 대한 코딩 영역 및/또는 (예컨대, 마이너 구조 단백질 및 바이러스 캡시드 상의 헥손과 상호작용하는 단백질을 코딩하는) pIX에 대한 코딩 영역을 추가로 포함할 수 있다. E1 모듈의 길이는 대략 4 kb, 3 kb, 2 kb 또는 1 kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, E1 모듈의 길이는 대략적으로는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E1A 및 E1B 영역과 같은 크기이다(예컨대, 도 5 참조).
본원에서 사용되는 바, "E2-L2" 모듈은 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 영역 및 헥손 단백질 코딩 영역 중 1 이상을 포함하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, E2-L2 모듈은 또한 바이러스 DNA 결합 단백질 코딩 영역을 포함한다. E2-L2 모듈은 전형적으로는 아데노바이러스 E2B, L1 및/또는 L2 영역으로부터 유래된 것이다. E2-L2 모듈은 (예컨대, 후기 전사 활성 인자 및 바이러스 DNA의 바이러스 캡시드 내로의 패키징을 돕는 단백질을 코딩하는) E2B IVa2에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA 폴리머라제를 코딩하는) E2B Pol에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 게놈의 말단에 부착되고, 바이러스 복제 및 패키징에 필요한 말단 단백질을 코딩하는) E2B pTP에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA의 캡시드 내로의 패키징에 필요한 단백질을 코딩하는) L1 52K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 캡시드를 안정화시키는 데 도움을 주는 마이너 구조 단백질을 코딩하는) L1 IIIa에 대한 코딩 영역, (예컨대, 섬유가 돌출되어 있는 캡시드의 두정을 형성하는 메이저 구조 단백질을 코딩하는) L2 III(펜톤)에 대한 코딩 영역, (예컨대, 히스톤 H3과 상동성을 가지고 있고, 캡시드 중에서 바이러스 DNA와 회합하는 코어 구조 단백질을 코딩하는) L2 pVII에 대한 코딩 영역, (예컨대, DNA와 바이러스 캡시드 사이의 회합을 형성하는 코어 구조 단백질을 코딩하는) L2 V에 대한 코딩 영역, 및 (예컨대, 바이러스 게놈에 결합하여, 응축시키는 코어 구조 단백질을 코딩하는) L2 pX에 대한 코딩 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, E2-L2 모듈의 길이는 대략적으로는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E2B, L1 및 L2 영역과 같은 크기이다(예컨대, 도 5 참조).
본원에서 사용되는 바, "L3-L4" 모듈은 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 영역 및 헥손 단백질 코딩 영역 중 1 이상을 포함하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, L3-L4 모듈은 또한 바이러스 DNA 결합 단백질 코딩 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, E2-L2 모듈이 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 영역을 포함할 경우, L3-L4는 바이러스 DN코딩 영역을 포함하지 않고, 그 반대의 경우도 해당된다. 유사하게, E2-L2 모듈이 헥손 단백질 코딩 영역을 포함할 경우, L3-L4는 헥손 단백질 코딩 영역을 포함하지 않을 수 있고, 그 반대의 경우도 해당된다. 유사하게, E2-L2 모듈이 바이러스 DNA 결합 단백질 코딩 영역을 포함할 경우, L3-L4는 바이러스 DNA 결합 단백질 코딩 영역을 포함하지 않을 수 있고, 그 반대의 경우도 해당된다. 다시 말하면, 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 영역, 헥손 단백질 코딩 영역, 및 바이러스 DNA 결합 단백질 코딩 영역은 전형적으로는 조립된 핵산 중에 단 한번만 출현한다. L3-L4 모듈은 또한 (예컨대, 두정에서 캡시드와 바이러스 게놈 DNA 사이의 회합을 형성하는 마이너 구조 단백질을 코딩하는) L3 pVI에 대한 코딩 영역, (예컨대, 캡시드의 삼각형을 형성하는 마이너 구조 단백질을 코딩하는) L3 II(헥손)에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 단백질을 완전한 캡시드 조립체로 프로세싱하는 바이러스 프로테아제를 코딩하는) L3 23K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA에 결합하여 복제를 촉진시키는 DNA 결합 단백질을 코딩하는) E2A DBP에 대한 코딩 영역, (예컨대, 세포 단백질 합성을 억제시키고, 바이러스 후기 단백질의 번역을 촉진시키는 단백질을 코딩하는) L4 100K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 후기 바이러스 유전자의 스플라이싱을 촉진시키는 단백질을 코딩하는) L4 33K에 대한 코딩 영역, 하나 이상의 섬유 단백질에 대한 코딩 영역, 및 (예컨대, 후기 바이러스 유전자 발현을 촉진시키고, 바이러스 DNA 패키징을 돕는 단백질을 코딩하는) L4 22K에 대한 코딩 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, L3-L4 모듈의 길이는 대략적으로는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 L3, E2A 및 L4 영역 또는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 L3, E2A, L4 및 L5 영역과 같은 크기이다(예컨대, 도 5 참조).
본원에서 사용되는 바, "코어 마크로모듈"(이는 또한 본원에서 "E2-L4 마크로모듈"로도 지칭된다)은 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 영역 및 헥손 단백질 코딩 영역 중 1 이상을 포함하는 핵산을 의미한다. 일부 실시양태에서, 코어 마크로모듈은 또한 바이러스 DNA 결합 단백질 코딩 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 코어 마크로모듈은 바이러스 구조 단백질 대부분과, 그 뿐만 아니라, DNA 복제 및 패키징에 필요한 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코어 마크로모듈은 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 영역, 헥손 단백질 코딩 영역 및 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 코어는 또한 (예컨대, 두정에서 캡시드와 바이러스 게놈 DNA 사이의 회합을 형성하는 마이너 구조 단백질을 코딩하는) L3 pVI에 대한 코딩 영역, (예컨대, 캡시드의 삼각형을 형성하는 메이저 구조 단백질을 코딩하는) L3 II(헥손)에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 단백질을 완전한 캡시드 조립체로 프로세싱하는 바이러스 프로테아제를 코딩하는) L3 23K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA에 결합하여 복제를 촉진시키는 DNA 결합 단백질을 코딩하는) E2A DBP에 대한 코딩 영역, (예컨대, 세포 단백질 합성을 억제시키고, 바이러스 후기 단백질의 번역을 촉진시키는 단백질을 코딩하는) L4 100K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 후기 바이러스 유전자의 스플라이싱을 촉진시키는 단백질을 코딩하는) L4 33K에 대한 코딩 영역, 및 (예컨대, 후기 바이러스 유전자 발현을 촉진시키고, 바이러스 DNA 패키징을 돕는 단백질을 코딩하는) L4 22K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 후기 전사 활성 인자 및 바이러스 DNA의 바이러스 캡시드 내로의 패키징을 돕는 단백질을 코딩하는) E2B IVa2에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA 폴리머라제를 코딩하는) E2B Pol에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 게놈의 말단에 부착되고, 바이러스 복제 및 패키징에 필요한 말단 단백질을 코딩하는) E2B pTP에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA의 캡시드 내로의 패키징에 필요한 단백질을 코딩하는) L1 52K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 캡시드를 안정화시키는 데 도움을 주는 마이너 구조 단백질을 코딩하는) L1 IIIa에 대한 코딩 영역, (예컨대, 섬유가 돌출되어 있는 캡시드의 두정을 형성하는 메이저 구조 단백질을 코딩하는) L2 III(펜톤)에 대한 코딩 영역, (예컨대, 히스톤 H3과 상동성을 가지고 있고, 캡시드 중에서 바이러스 DNA와 회합하는 코어 구조 단백질을 코딩하는) L2 pVII에 대한 코딩 영역, (예컨대, DNA와 바이러스 캡시드 사이의 회합을 형성하는 코어 구조 단백질을 코딩하는) L2 V에 대한 코딩 영역, 하나 이상의 섬유 단백질에 대한 코딩 영역 및 (예컨대, 바이러스 게놈에 결합하여, 응축시키는 코어 구조 단백질을 코딩하는) L2 pX에 대한 코딩 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, L3-L4 모듈의 길이는 대략적으로는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E2B, L1, L2, L3, E2A 및 L4 영역 또는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E2B, L1, L2, L3, E2A, L4 및 L5 영역과 같은 크기이다(예컨대, 도 5 참조).
바이러스 DNA 폴리머라제 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열 번호: 32(도 7a-c)에 기재된 인간 Ad5 DNA 폴리머라제 또는 또 다른 종으로부터 유래된 그의 상동체의 아미노산 996-1103 중 50개 이상의 인접한 아미노산(예컨대, 상기 아미노산 모두)와 45% 이상(예컨대, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 헥손 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열 번호: 73(도 7d-g)에 기재된 인간 Ad5 헥손 또는 또 다른 종으로부터 유래된 그의 상동체의 아미노산 501-747 중 50개 이상의 인접한 아미노산(예컨대, 상기 아미노산 모두)와 45% 이상(예컨대, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 바이러스 DNA 결합 단백질 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열 번호: 103(도 7h-i)에 기재된 인간 Ad5 DNA 결합 단백질 또는 또 다른 종으로부터 유래된 그의 상동체의 아미노산 408-475 중 50개 이상의 인접한 아미노산(예컨대, 상기 아미노산 모두)와 35% 이상(예컨대, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "E4 모듈"은 아데노바이러스 역위 말단 반복부(ITR)을 포함하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, E4는 하나 이상의 섬유 단백질에 대한 코딩 영역을 추가로 포함한다. E4 모듈은 (예컨대, 바이러스 전사의 E2F 전사활성화를 매개하는 단백질을 코딩하는) E4 orf 6/7에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA 합성을 촉진시키고, 바이러스 후기 mRNA를 안정화시키고, 외수송하고, 스플라이싱을 촉진시키는 단백질을 코딩하는) E4 orf 6에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 전사 및 스플라이싱을 조절하고, PP2A를 조정하는 단백질을 코딩하는) E4 orf4에 대한 코딩 영역, (예컨대, p53 매개 전사를 차단하고, MRN DNA 수복 복합체를 파괴시키고, 콘카테머화를 막는 단백질을 코딩하는) E4 orf3에 대한 코딩 영역, E4 orf2에 대한 코딩 영역, 및 (예컨대, PI3 키나제를 통한 신호 전달을 촉진시킴으로써 단백질 합성 및 세포 생존을 유도하는 단백질을 코딩하는) E4 orf1에 대한 코딩 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, E4 모듈의 길이는 대략적으로는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E4 영역, 또는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E4 및 L5 영역과 같은 크기이다(예컨대, 도 5 참조).
본원에서 사용되는 바, "E3 모듈"은 하나 이상의 섬유 단백질에 대한 코딩 영역 및/또는 아데노바이러스 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, E3 모듈은 (도 5에 제시된 바와 같이) pVIII의 단백질 코딩 영역의 말단에서부터 게놈의 우측 말단에 위치하는 ITR까지의 임의의 공지된 아데노바이러스 서열을 포함한다. pVIII 코딩 영역은 135(도 7j)에 기재된 인간 Ad5 pVIII 단백질의 아미노산 6-43 중 50개 이상의 인접한 아미노산(예컨대, 상기 아미노산 모두)와 35% 이상(예컨대, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 임의의 유전자이다. E3 모듈은 (예컨대, 마이너 구조 단백질을 코딩하는) L4 pVIII에 대한 코딩 영역, E3 12.5K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 아포프토시스를 차단하는 단백질을 코딩하는) E3 CR1α에 대한 코딩 영역, (예컨대, MHC-I 항원 제시를 억제하는 면역조절성 단백질을 코딩하는) E3 gp19K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 방출을 위해 세포를 효율적으로 용해시키는 작용을 하는 단백질을 코딩하는) E3 ADP에 대한 코딩 영역, (예컨대, 세포 표면으로부터 아포프토시스 촉진성 FasL 및 TRAIL을 제거하는 면역조절성 단백질을 코딩하는) E3 RIDα에 대한 코딩 영역, (예컨대, 세포 표면으로부터 아포프토시스 촉진성 FasL 및 TRAIL을 제거하는 면역조절성 단백질을 코딩하는) E3 RIDβ-에 대한 코딩 영역, (예컨대, 아포프토시스를 차단하는 단백질을 코딩하는) E3 14.7K에 대한 코딩 영역, 및 (예컨대, 펜톤 염기로부터 연장되고, 수용체 결합을 담당하는 메이저 구조 단백질을 코딩하는) L5 IV(섬유)에 대한 코딩 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, E3 모듈의 길이는 대략적으로는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E3 영역, 또는 자연 상태에서 발견되는 아데노바이러스의 E3 및 L5 영역과 같은 크기이다(예컨대, 도 5 참조).
본원에서 사용되는 바, "E3-E4 마크로모듈"은 아데노바이러스 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산이다. E-3-E4 마크로모듈은 (도 5에 제시된 바와 같이) pVIII의 단백질 코딩 영역의 말단에서부터 게놈의 우측 말단에 위치하는 ITR까지의 임의의 공지된 아데노바이러스 서열을 추가로 포함할 수 있다. E3-E4 마크로모듈은 (예컨대, 바이러스 전사의 E2F 전사활성화를 매개하는 단백질을 코딩하는) E4 orf 6/7에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 DNA 합성을 촉진시키고, 바이러스 후기 mRNA를 안정화시키고, 외수송하고, 스플라이싱을 촉진시키는 단백질을 코딩하는) E4 orf 6에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 전사 및 스플라이싱을 조절하고, PP2A를 조정하는 단백질을 코딩하는) E4 orf4에 대한 코딩 영역, (예컨대, p53 매개 전사를 차단하고, MRN DNA 수복 복합체를 파괴시키고, 콘카테머화를 막는 단백질을 코딩하는) E4 orf3에 대한 코딩 영역, E4 orf2에 대한 코딩 영역, (예컨대, PI3 키나제를 통한 신호 전달을 촉진시킴으로써 단백질 합성 및 세포 생존을 유도하는 단백질을 코딩하는) E4 orf1에 대한 코딩 영역, (예컨대, 마이너 구조 단백질을 코딩하는) L4 pVIII에 대한 코딩 영역, E3 12.5K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 아포프토시스를 차단하는 단백질을 코딩하는) E3 CR1α에 대한 코딩 영역, (예컨대, MHC-I 항원 제시를 억제하는 면역조절성 단백질을 코딩하는) E3 gp19K에 대한 코딩 영역, (예컨대, 바이러스 방출을 위해 세포를 효율적으로 용해시키는 작용을 하는 단백질을 코딩하는) E3 ADP에 대한 코딩 영역, (예컨대, 세포 표면으로부터 아포프토시스 촉진성 FasL 및 TRAIL을 제거하는 면역조절성 단백질을 코딩하는) E3 RIDα에 대한 코딩 영역, (예컨대, 세포 표면으로부터 아포프토시스 촉진성 FasL 및 TRAIL을 제거하는 면역조절성 단백질을 코딩하는) E3 RIDβ-에 대한 코딩 영역, (예컨대, 아포프토시스를 차단하는 단백질을 코딩하는) E3 14.7K에 대한 코딩 영역, 및 (예컨대, 펜톤 염기로부터 연장되고, 수용체 결합을 담당하는 메이저 구조 단백질을 코딩하는) L5 IV(섬유)에 대한 코딩 영역을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈은 아데노바이러스 유전자 모듈이 유래된 천연(예컨대, 야생형) 아데노바이러스에서 발견되는 모듈 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 핵산의 치환, 부가 또는 결실)을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공하는 핵산은 특정 세포 조건하에서의 핵산의 세포로의 형질감염을 통해 복제 수행 능력이 있는(복제 적격)(replication competent) 아데노바이러스가 형성될 수 있도록 하기 위해 충분한 개수의 아데노바이러스 유전자 모듈을 코딩할 수 있다. 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈 중의 돌연변이를 통해 생성된 아데노바이러스는 일부 세포(예컨대, 이환 세포, 예로서, 암 세포)에서는 복제가 가능할 수 있지만, 다른 세포(예컨대, 비이환 세포, 예로서, 건강한 세포)에서는 복제가 불가능할 수 있다. 돌연변이는 또한 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 부가(예컨대, 하나 이상의 외인성 또는 이종성 단백질 코딩 영역, 예로서, 비바이러스 단백질 코딩 영역의 부가)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 단백질의 부가가 추가의 바이러스 기능성을 제공할 수 있거나, 바이러스 기능성(예컨대, 복제)을 상실시킬 수 있거나, 바이러스 검출 방법(예컨대, 형광성 마커)을 제공할 수 있거나, 바이러스 정제 방법(예컨대, His 태깅된 캡시드 단백질)을 제공할 수 있거나, 또는 추가 사용을 위해 후속하여 단리되고/거나 정제되는, 관심의 대상이 되는 단백질을 생산할 수 있는 바이러스를 제공할 수 있다. 따라서, 돌연변이는 바이러스의 작용을 추가할 수 있거나, 바이러스의 작용을 감축시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 제공하는 재조합 아데노바이러스는 외인성(예컨대, 이종성) 핵산의 도입에 의해, 또는 천연 핵산 서열의 변경에 의해 변형된 아데노바이러스를 포함한다. 변경은 상기 기술된 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈에서의 돌연변이화를 통해, 또는 천연 아데노바이러스 게놈에 존재하는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈의 절제에 의해 이루어질 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 핵산은 돌연변이된 아데노바이러스 핵산 서열을 포함한다. 아데노바이러스 핵산 서열은 천연 상태의 또는 천연 아데노바이러스(예컨대, 야생형)에서 발견되는 서열이다. 돌연변이된 아데노바이러스 핵산 서열은 상기 기술된 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈에서의 돌연변이화로부터, 또는 천연 아데노바이러스 게놈에 존재하는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈의 절제에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 결실된 아데노바이러스 핵산 서열, 이소성 아데노바이러스 핵산 서열, 또는 (예컨대, 비아데노바이러스 유전자 생성물을 코딩하는) 외인성(예컨대, 이종성) 핵산 서열을 포함한다. 돌연변이된 아데노바이러스 핵산 서열은 변경된 기능성을 부여하는 돌연변이된 E4-ORF3 유전자 생성물, 돌연변이된 E1B-55k 유전자 생성물, 돌연변이된 아데노바이러스 섬유 유전자 생성물, 돌연변이된 바이러스 코트 단백질, 프로드럭 전환 효소, 리포터 단백질, 돌연변이된 헥손 단백질, pIX에 융합된 단백질, 특정 세포에 독성을 띠는 단백질, 핵산이 수득된 유형 이외의 다른 아데노바이러스로부터 유래된 완전한 또는 부분 섬유 유전자, 및/또는 표적화 단백질(예컨대, 종양 표적화 단백질 또는 혈관구조(vasculature) 표적화 단백질)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 E1 모듈을 포함한다. 핵산은 또한 E1 모듈 및 E4 모듈, 둘 모두를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 E1 모듈 및 E2-L2 모듈을 포함한다. 핵산은 또한 E1 모듈 및 L3-L4 모듈을 포함할 수 있다. 핵산은 또한 E1 모듈, E2-L2 모듈 및 L3-L4 모듈을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 E1 모듈, 코어 모듈, E3 모듈 및/또는 그의 유도체 또는 구성 성분으로부터 선택되는 3가지 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다. 관련된 실시양태에서, 인간 Ad5의 일례에서, 본 발명은 E1 모듈, E2- L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈로부터 핵산을 조립하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 형성된 핵산의 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 kb 이상이다. 일부 실시양태에서, 형성된 핵산의 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 kb 이상이다. 일부 실시양태에서, 형성된 핵산의 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15 kb 이상이다. 일부 실시양태에서, 형성된 핵산의 길이는 10, 11, 12 kb 이상이다. 일부 실시양태에서, 형성된 핵산의 길이는 12 kb 이상이다.
본원에서 제공하는 방법에 의해 형성된 핵산은 임의의 발현이 가능한 핵산일 수 있다. 핵산은 발현됨으로써 아데노바이러스를 생산할 수 있다. 아데노바이러스는 감염성일 수 있고/거나, 자가 복제가 가능한(예컨대, 복제 수행 능력이 있는) 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, 조립 단계는 아데노바이러스 유전자 모듈(또는 마크로모듈)을 함께 조립하여 핵산을 형성하는 단계를 포함하는데, 여기서, 아데노바이러스 모듈 또는 마크로모듈이 배향은 세포 내로의 도입시(예컨대, 세포에서의 바이러사의 발현 또는 형성시) 복제가능한 아데노바이러스를 형성하는 데 도움이 된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 마크로모듈)은 배향 특이 방식으로 조립된다. 예를 들어, 소위 "게이트웨이"라는 기술 및/또는 서열 및 결찰 독립 클로닝 기술("SLIC")을 비롯한, 임의의 적용가능한 클로닝 기법이 사용될 수 있다. 게이트웨이 기술 또는 유사한 기술은 부위 특이 재조합을 사용하여 핵산(예컨대, DNA) 단편을 한 조각의 핵산으로부터 또 다른 것으로 교환한다. 최종 결과는 핵산 서열의 목적 벡터 또는 플라스미드 내로의 삽입이다. 본원에서 이러한 기술 및 방법을 총칭하여 "부위 특이 재조합 방법" 또는 "SSR(site specific recombination) 방법"이라고 지칭한다. SSR 방법의 상기와 같은 적용에 있어서, DNA 단편을 엔트리 벡터로부터 목적 벡터로 이동시키면, 그 결과, 목적 벡터는 증식될 수 있(도 9). 엔트리 벡터 및 목적 벡터는 전형적으로 재조합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔트리 벡터는 재조합 수행 능력이 있는 것이다. 다른 실시양태에서, 엔트리 벡터는 하이브리드화 수행 능력이 있는 것이다. 하이브리드화 수행 능력이 있는 엔트리 벡터는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함할 수 있는데, 이는 효소적 제한에 의해 엔트리 벡터로부터 유리될 수 있고, 이로써, 아데노바이러스 유전자 모듈이 유리될 수 있다. 본원에서는 아데노바이러스 유전자 모듈을 목적 벡터 내로 삽입하여 핵산(예컨대, 핵산 플라스미드)을 형성하는, 게이트웨이 기술을 적합화시킨 SSR 방법을 제공한다. 게이트웨이 기술의 일반 사용 방법은 예를 들어, 문헌 ([Sone et. al., J Biotechnol. (2008) Sep 10; 136(3- 4): 113-21]; [Hartley, et al., Genome Res. (2000), 10, 1788-1795]; 및 [Sasaki, et al., J. Biotechnol. (2004), 107, 233-243])에 기술되어 있다.
예를 들어, SSR 방법을 사용할 경우, 조립 단계는 재조합 수행 능력이 있는 목적 벡터(예컨대, 재조합 부위 핵산 서열을 포함하는 목적 벡터) 및 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 인터그라제(예컨대, 람다 파지 인터그라제, 람다 파지 엑시지오나제, 또는 박테리아 숙주 통합 인자)와 접촉시켜 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성하는 것을 포함한다. 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈은 재조합 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 재조합 부위 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 유전자 모듈)이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈은 재조합 부위 핵산 서열을 아데노바이러스 유전자 모듈에 첨가하여 하나 이상의 재조합 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈을 형성함으로써 형성이 된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈은 재조합 수행 능력이 있는 엔트리 벡터의 일부이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 재조합 수행 능력이 있는 엔트리 벡터는 하나 이상의 재조합 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈 및 재조합 수행 능력이 있는 도너 벡터를 인터그라제와 접촉시켜 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 재조합 수행 능력이 있는 엔트리 벡터를 형성함으로써 형성이 된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재조합 수행 능력이 있는 목적 벡터 및 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 하나 이상의 재조합 수행 능력이 있는 엔트리 벡터를 인터그라제 활성과 접촉시켜 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성한다.
도 20-21은 인간 Ad5에 대해 개발된, 본원에서 제공하는 본 발명의 실시양태를 다이어그램으로 나타낸 것이다. 조립 단계는 각각 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 것인 목적 벡터 및 하나 이상의 엔트리 벡터를 람다 파지 인터그라제, 람다 파지 엑시지오나제, 또는 박테리아 숙주 통합 인자 중 하나 이상과 조합하여 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔트리 벡터는 재조합 부위를 아데노바이러스 유전자 모듈에 첨가한 후, 도너(donor) 벡터, 및 람다 파지 인터그라제, 람다 파지 엑시지오나제, 또는 박테리아 숙주 통합 인자 중 하나 이상과 조합하여 아데노바이러스 유전자 모듈 엔트리 벡터를 형성함으로써 형성이 된다.
목적 벡터는 아데노바이러스 유전자 모듈을 그에 연결시키고자 하는 것인 핵산, 예컨대, 플라스미드이다. 연결은 목적 벡터 내에 포함시키고자 하는 (예컨대, 삽입시키고자 하는) 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 하나 이상의 엔트리 벡터의 교환에 의해 이루어질 수 있다. 목적 벡터는 재조합 수행 능력이 있는 목적 벡터 및 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 인터그라제(예컨대, 인터그라제, 엑시지오나제, 및/또는 숙주 통합 인자)와 접촉(예컨대, 조합)시키기 전에 존재하고 있는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 가질 수 있다.
본원에서는 "att" 부위로도 지칭되는 재조합 부위 핵산 서열은 두 핵산 사이의 시험관내 부위 특이 재조합을 촉진시키는 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 재조합 부위 핵산 서열의 길이는 대략 21 bp이다. 예를 들어, 재조합 부위 핵산 서열은 게이트웨이 재조합 신호, 예컨대, 도 10에 제시되어 있는 것 및/또는 문헌 ([Sone et. al., J Biotechnol . (2008) Sep 10;136(3-4): 113-21]; [Hartley, et al., Genome Res. (2000), 10, 1788- 1795]; 및 [Sasaki, et al., J. Biotechnol. (2004), 107, 233-243])에 기재되어 있는 것(예컨대, attB 부위, attL 부위, attR 부위, attP 부위, attBr 부위, attPr 부위 등)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈은 도너 벡터의 일부를 형성한다(또는 도너 벡터 내에 존재한다). 도너 벡터는 게이트웨이 기술 또는 유사한 유형의 클로닝 기술과 화합성이 플라스미드일 수 있다.
일부 실시양태에서, DEST 벡터는 상이한 역선택 카세트를 포함한다. 역선택 카세트는 특정 조건하에서는 박테리아 세포의 성장을 방해하는 임의의 DNA 단편이다. 도 22에는 본원에서 제공하는 본 발명에서 사용된 다양한 역선택 카세트의 효능이 기술되어 있다.
도 19는 다중 부위 게이트웨이 전략법을 사용하여 Ad5 아데노바이러스 유전자 모듈을 재조립하기 위한 원래의 제안을 상세하게 설명해 놓은 것이다. 이러한 특별한 전략법은 4개의 엔트리 벡터를 조합하는 것을 포함하는데, 상기 2개의 엔트리 벡터 중 3개는 아데노바이러스 유전자 모듈이었고, 4번째 것은 비관련 스터퍼 모듈이었다. 일단 상기 4개의 모듈을 조합하고 나면, 게이트웨이 반응에 의해 스터퍼 모듈을 제거함으로써 새로운 목적 벡터를 형성한다. 마지막으로, 남은 두 아데노바이러스 유전자 모듈을 게이트웨이 반응에 의해 삽입하여 바이러스 게놈을 완성한다. 이러한 원래의 제안은 게이트웨이 반응에서 보다 큰 아데노바이러스 유전자 모듈을 사용할 경우에는 비효율적이었고, 이와 함께 Ad5 E1 모듈로부터 독성에 관한 문제도 있었다. 조합 방법(예컨대, SLIC 및 SSR 방법)을 통해 더욱 용이하게 모듈로부터 게놈을 조립할 수 있었다(예컨대, 수행 단계는 감소시키고, 각 단계별 효율은 증가시켰다).
SLIC 기술은 두 핵산(예컨대, DNA 단편) 중의 엑소뉴클레아제에 의해 생성된 단일 가닥 핵산(예컨대, DNA) 오버행에 의존하여 단일 가닥 상동성 서열을 어닐링시키는 것을 사용한다(도 16). 따라서, SLIC 기술은 삽입된 핵산(예컨대, DNA) 및 목적 벡터 중의 엑소뉴클레아제에 의해 생성된 단일 가닥 핵산(예컨대, DNA) 오버행에 의존하는 상동성 재조합 및 단일 가닥 어닐링(예컨대, 하이브리드화)을 사용한다. 본원에서는 아데노바이러스 유전자 모듈을 목적 벡터로 삽입시켜 핵산(예컨대, 핵산 플라스미드)을 형성하는, SLIC 기술을 적합화시킨 방법을 제공한다. 본원에서 상기 과정은 또한 AdSlic 또는 AdSlicR로도 지칭될 수 있다. SLIC 기술의 일반 사용 방법은 예를 들어, 문헌 [Li et al., Nature Methods (2007), 4, 251-256]에 기술되어 있다. 도 25는 인간 Ad5에 대해 확립되어 있는 AdSlicR의 일례를 다이어그램으로 나타낸 것이다. 도 26은 AdSlicR 방법에서 상기 반응의 효율을 상세하게 설명해 놓은 것이다.
예를 들어, SLIC 기술(또는 유사한 클로닝 기술)이 사용될 경우, 조립 단계는 (예컨대, 각 말단 상에) 단일 가닥 핵산(예컨대, DNA) 오버행을 가지는 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터(예컨대, 목적 벡터(예컨대, 선형 벡터))를 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈에 하이브리드화(예컨대, 어닐링)시킴으로써 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성하는 것을 포함한다. 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터는 또한 본원에서 SLIC 수행 능력이 있는 벡터로서도 지칭될 수 있다. 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈은 (예컨대, 엄격한 조건하에서의) 하이브리드화를 촉진시킬 수 있을 만큼 목적 벡터의 단일 가닥 핵산(예컨대, DNA) 오버행에 대해 충분한 상보성을 지닌, (예컨대, 각 말단 상에) 1 이상의 단일 가닥 핵산(예컨대, DNA) 오버행을 가지는 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 선형 아데노바이러스 유전자 모듈))일 수 있다. 일부 실시양태에서, 목적 벡터 오버행 및 아데노바이러스 유전자 모듈 오버행의 길이는 각각 약 20 내지 25 bp이다. 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터는 임의의 적절한 방법을 사용함으로써 형성될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 목적 벡터가 환형일 경우(예컨대, 플라스미드), 목적 벡터는 (예컨대, 엔도뉴클레아제로) 절단되고, 이로써 선형 목적 벡터가 형성된다. 이어서, 선형 목적 벡터를 엑소뉴클레아제(즉, 엑소뉴클레아제 활성을 가진 효소, 예컨대, T4 DNA 폴리머라제)와 접촉시킴으로써 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터를 형성한다. 유사하게, 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈은 아데노바이러스 유전자 모듈을 엑소뉴클레아제와 접촉시켜(예컨대, 처리하여) 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈을 형성함으로써 형성이 될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터를 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈에 하이브리드화시키는 것은 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터 및 아데노바이러스 유전자 모듈(들)을 DNA 폴리머라제와 조합시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 유전자 모듈이 환형이거나, 또는 환형 플라스미드 내에 포함되어 있는 경우, 아데노바이러스 유전자 모듈은 엑소뉴클레아제 처리 이전에 엔도뉴클레아제로 처리함으로써 선형화된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈은 하나 이상의 엔트리 벡터 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 엔트리 벡터를 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 하나 이상의 유리된(released) 엔트리 벡터 아데노바이러스 유전자 모듈을 형성함으로써 형성이 된다. 하나 이상의 유리된 엔트리 벡터 아데노바이러스 유전자 모듈을 엑소뉴클레아제와 접촉시켜 하나 이상의 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈을 형성할 수 있다. 본원에서 지칭되는 바와 같이 엔트리 벡터 아데노바이러스 유전자 모듈은 엔트리 벡터의 일부인 아데노바이러스 유전자 모듈이다. 본원에서 지칭되는 바와 같이 유리된 엔트리 벡터 아데노바이러스 유전자 모듈은 예를 들어, 제한 효소에 의해 엔트리 벡터로부터 유리된 아데노바이러스 유전자 모듈이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 유전자 모듈은 환형이 아니고(예컨대, PCR 또는 유전자 합성에 의해 수득된 것이고), 엑소뉴클레아제 처리에 앞서 선형화될 필요가 없다. 일부 실시양태에서, SLIC 수행 능력이 있는 벡터를 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈에 어닐링시키는 것은 LIC 수행 능력이 있는 벡터 및 아데노바이러스 유전자 모듈(들)을 DNA 폴리머라제와 조합시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, SLIC 수행 능력이 있는 벡터는 SLIC 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈과의 어닐링 이전에 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 다중 SLIC 반응은 다중 아데노바이러스 유전자 모듈을 삽입하기 위해 순차적으로 수행된다.
일부 실시양태에서, 주형으로서 사용하고자 하는 플라스미드 중의 아데노바이러스 게놈을 수득하여 아데노바이러스 유전자 모듈을 생성하기 위해, SLIC를 사용하여 전체 아데노바이러스 게놈을 플라스미드 골격 내로 삽입할 수 있다. 일부 실시양태에서, SLIC 수행 능력이 있는 아데노바이러스 게놈은 정제된 바이러스 스톡으로부터 수득된다. 도 30은 상기 과정에 관한 실시양태를 다이어그램으로 나타낸 것으로서, 인간 Ad에 대한 일례를 제공한다.
아데노바이러스 유전자 모듈 벡터는 1 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 가지는 핵산이다. 적절한 클로닝 기술을 사용하여, 원하는 개수의 아데노바이러스 유전자 모듈을 목적 벡터에 첨가함으로써 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성한다. 예를 들어, 일단 형성되고 나면, 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)을 적절한 클로닝 기술(예컨대, 게이트웨이 클로닝 기술 및/또는 SLIC 클로닝 기술)을 사용하여 추가로 변형시킴으로써 아데노바이러스 유전자 모듈을 추가로 첨가하여 핵산을 형성할 수 있으며, 이 핵산은 (예컨대, 세포에서) 발현됨으로써 아데노바이러스(예컨대, 복제가능한 아데노바이러스)가 형성될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 적절한 클로닝 기법을 사용하여 제1 아데노바이러스 유전자 모듈을 추가로 변형시켜 제2, 제3, 및/또는 제4의 아데노바이러스 유전자 모듈이 각각 벡터에 첨가되어 있는 것인 제2, 제3, 및/또는 제4의 아데노바이러스 모듈을 형성할 수 있고, 이로써 핵산을 형성할 수 있으며, 이 핵산은 발현되어 아데노바이러스(예컨대, 복제가능한 아데노바이러스)를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 핵산은 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터이다.
실제로, 상이한 클로닝 기술을 사용하여 핵산 또는 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 조립할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조립 단계는 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터를 제1 아데노바이러스 유전자 모듈에 하이브리드화시켜((예컨대, 어닐링시켜) 제1 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성하는 것을 포함한다. 제1 아데노바이러스 유전자 모듈은 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈일 수 있다. 제1 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터 및 제2 아데노바이러스 유전자 모듈 엔트리 벡터를 인터그라제(예컨대, 인터그라제, 엑시지오나제, 또는 통합 숙주 인자)와 접촉시켜(예컨대, 조합하여) 제2 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성할 수 있다. 제2 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터는 재조합 수행 능력이 있는 제2 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터(예컨대, 목적 벡터)일 수 있고, 제2 아데노바이러스 유전자 모듈은 재조합 수행 능력이 있는 제2 아데노바이러스 유전자 모듈일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노바이러스 유전자 모듈은 E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, 또는 E2-L4 마크로모듈이다. 제2 아데노바이러스 유전자 모듈은 E1 모듈, E3 모듈, 또는 E4 모듈일 수 있다. 클로닝 방법을 조합하여 아데노바이러스 유전자 모듈을 조립하는 것에 관한 예는 SLIC를 게이트웨이와 조합한 것을 나타낸 도 20-21에 제공되어 있다.
다른 실시양태에서, 조립 단계는 재조합 수행 능력이 있는 목적 벡터 및 제1 아데노바이러스 유전자 모듈을 인터그라제(예컨대, 인터그라제, 엑시지오나제, 또는 통합 숙주 인자)와 함께(예컨대, 그의 존재하에서) 접촉시켜(예컨대, 조합하여) 제1 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성하는 것을 포함한다. 제1 아데노바이러스 유전자 모듈은 재조합 수행 능력이 있는 제1 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 엔트리 벡터)이다. 제1 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 제2 아데노바이러스 유전자 모듈에 하이브리드화시켜 제2 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터를 형성한다. 제1 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터는 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터(예컨대, 목적 벡터)이다. 제2 아데노바이러스 유전자 모듈은 하이브리드화 수행 능력이 있는 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 엔트리 벡터)이다. 일부 실시양태에서, 제2 아데노바이러스 유전자 모듈은 E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, 또는 E2-L4 마크로모듈이다. 제1 아데노바이러스 유전자 모듈은 E1 모듈, E3 모듈, 또는 E4 모듈일 수 있다.
일부 실시양태에서(예컨대, 인간 Ad5의 일례에서), E2-L2 모듈 및 L3-L4 모듈은 각각 대략 14 kb 및 10 kb이다. 본원에서 제공하는 발견 내용 중 하나는 일부 실시양태에서, E2-L2 및 L3-L4 모듈의 크기가 너무 크기 때문에 표준 또는 게이트웨이(예컨대, 다중 부위 게이트웨이) 클로닝 기술을 사용하여 핵산으로 효율적으로 조립할 수 없다는 것이다. 일례는 도 15에 제공되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, SLIC 클로닝 기술(또는 유사한 클로닝 기술)을 사용하여 상기 모듈을 목적 벡터(예컨대, 엔트리 벡터) 내로 삽입한다. 다른 아데노바이러스 유전자 모듈은 예를 들어, 게이트웨이 클로닝 기술의 사용으로 첨가될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, E2-L2 모듈 및 L3-L4 모듈이 핵산으로 조립될 경우, 조합된 SLIC 및 게이트웨이(예컨대, 다중 부위 게이트웨이) 클로닝 전략법을 사용하여 핵산을 조립하는 것이 바람직할 수 있다. 조합된 SLIC 및 게이트웨이(예컨대, 다중 부위 게이트웨이) 클로닝 전략법에 관한 특정 실시양태는 도 20-21에 기술되어 있다.
본원에서 제공하는 본 발명의 특정의 실시양태는 신속하고 효율적인 아데노바이러스 게놈 구성체 조리법을 제공한다. 일부 경우에, 아데노바이러스 게놈 구성체를 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1시간(들) 미만의 시간에 조립된다. 본원에서 제공하는 본 방법을 통해 추가로 아데노바이러스 단편을 벡터 내로 삽입시킬 수 있고, 개별 벡터내에서 용이하게 독립적으로 돌연변이시킬 수 있고/거나, 다중 부위 특이 시험관내 조립을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 유전자 모듈 중 하나 또는 그 모두는 하기 기술하는 바와 같이, 재조합 아데노바이러스 유전자 모듈로 이루어진 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 따라서, Ad셈블리 공정의 특정 실시양태를 통해 아데노바이러스 유전자 모듈의 최적의 조합에 기초하여 맞춤형 아데노바이러스 기능성을 신속하게 최적화시킴으로써 매우 다양한 재조합 아데노바이러스를 신속하고 효율적으로 구성할 수 있다. 따라서, 본 방법은 다양한 아데노바이러스 혈청형으로부터의 일부를 혼합하고 매치시킴으로써 신규한 아데노바이러스 혈청형 키메라를 형성할 수 있는 능력을 제공한다. 이를 통해 각 혈청형의 독특한 특성을 부여할 수 있도록 조합시킬 수 있을 뿐만 아니라, 혈청형의 다양한 향성을 사용할 수 있고, 우세한 혈청형에 대한 기존의 면역을 잠재적으로 회피할 수 있도록 그를 사용할 수 있다.
본원에서 제공하는 본 발명의 특정 실시양태를 통해 제한된 제한 효소 부위 클로닝 기술에 대해 의존할 필요가 없게 된다. 본 방법을 통해서는 또한 아데노바이러스 혈청형 5에 대한 배타적인 의존을 피할 수 있다. 실제로는, 인간 Ad5의 일례에서, E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈, 5개 모두가 사용될 경우, 돌연변이체 옵션은 이전 공지 방법에 비해 실질적으로 증가한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공하는 본 방법을 통해 게놈을 동시에 복합적으로 변이시킬 수 있다.
본 방법을 통해서는 또한, 대개는 수개월이 소요될 수 있는, 분화된 박테리아 균주에서, 또는 포유동물 세포 배양물(예컨대, MAGIC)에서의 비효율적 상동성 재조합에 배타적으로 의존하는 것인 이전 공지된 게놈 조립법을 회피할 수 있다. 또한, 본원에서 제공하는 본 발명의 특정 실시양태는 분화된 박테리아를 사용할 필요없이 상업적으로 이용가능한 시약(예컨대, ccdB-내성)을 사용하는 간단한 프로토콜을 제공한다.
본원에서 제공하는 본 방법 및 라이브러리의 유용성은 예를 들어, 하기를 포함한다:
(1) 유전자 작용 분석을 위한 아데노바이러스 유전자의 돌연변이유발.
(2) 아데노바이러스 유전자 작용의 상실로 인해 정상 세포에서는 복제가 불가능하지만, 그의 작용이 보완되는 종양 세포에서는 선택적 용해 복제가 이루어지는 아데노바이러스 돌연변이체.
(3) 복제 결함이 있는 벡터 또는 복제 수행 능력이 있는 바이러스로서의 표적화된 유전자 발현.
(4) 본 방법은 유전자 발현용의 신규한 복제 결함이 있는 아데노바이러스를 제공할 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 조립된 아데노바이러스는 상기 목적을 위해 최적화될 수 있다. 인간 Ad5의 경우, E1 모듈의 라이브러리는 예를 들어, 수개의 E1A 또는 E1B 결실 모듈을 포함할 수 있고/거나, 각각은 상이한 포유동물 프로모터를 포함함으로써 사용자가 최상의 프로모터를 선택할 수 있도록 하여 관심의 대상이 되는 유전자를 발현시킬 수 있다.
(5) 아데노바이러스 게놈의 현존 전사 구조를 사용하는 다중유전자 발현.
일부 실시양태에서, 각각의 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈이 사용될 경우, 돌연변이는 오직 E4 모듈에만 존재하지 않는다.
E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈 ?? 그의 마크로모듈은 임의의 적절한 방법(예컨대, PCR 기법 또는 유전자 합성)을 사용하여 임의의 적절한 아데노바이러스로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 정제된 바이러스로부터 수득된 바이러스 게놈 DNA로부터의 PCR(도 14)을 사용할 수 있다. 도 13은 인간 Ad5 아데노바이러스 유전자 모듈에 대해 얻은 PCR 효율을 상세하게 나타낸 것이다. 일부 실시양태에서, E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, 및 E4 모듈의 조합, 또는 그의 마크로모듈은 완전한, 또는 실질적으로 완전한 아데노바이러스 게놈을 구성한다. 본원에서 제공하는 교시를 사용하면, 당업계의 숙련가는 모듈 사이의 절단부의 정확한 위치를 결정할 수 있다. 예를 들어, 생물정보학적 접근법을 사용함으로써 재조합 부위 핵산 서열에 대한 최적의 삽입 부위(예컨대, 게이트웨이 재조합 신호 또는 게이트웨이 재조합 부위)를 결정할 수 있다. 수개의 아데노바이러스 혈청형을 정렬할 수 있고, 아데노바이러스 유전자 모듈 사이의 게놈 영역을 보존성에 대하여 분석할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청형간의 뉴클레오티드 보존성은 회피되는 반면, 축퇴성 영역은 허용되는 삽입 부위이다. 예를 들어, 인간 Ad5에서 재조합 부위 핵산 서열에 대한 삽입 부위로서 특정의 적절한 위치는 도 12, 도 35, 도 36, 도 37 및 도 38에서 화살표로 표시되어 있다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 유전자 모듈 사이의 서열은 단쇄일 수 있고, 이로써 서열 복제가 필요할 수 있다. 그 예는 도 12에 제공되어 있는데, 여기서, Ad5 섬유 폴리A 및 E4 폴리A 사이의 서열량이 부족하기 때문에, Ad5 서열의 27 bp의 중복부를 attB 부위 삽입과 함께 삽입하였다.
일부 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 하나 이상의 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 도 35-39에는 제한하고자 하는 것은 아니지만, 재조합 아데노바이러스 내의 재조합 부위 핵산 서열의 핵산 서열 위치가 재조합 아데노바이러스의 성장 속도에 어떻게 영향을 미치는지를 나타내는 것에 관한 일례가 개시되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 부위 핵산 서열(예컨대, att 부위)을 포함하는 재조합 아데노바이러스는 하나 이상의 재조합 부위 핵산 서열을 포함하지 않는 재조합 아데노바이러스보다 더 느리게 성장할 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 부위 핵산 서열(예컨대, att 부위)을 포함하는 재조합 아데노바이러스는 적어도, 하나 이상의 재조합 부위 핵산 서열을 포함하지 않는 재조합 아데노바이러스 만큼 빠르게 성장할 수 있다. 다른 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 E3 모듈 및 E4 모듈 사이에 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, E3 모듈 및 E4 모듈 사이의 재조합 부위 핵산 서열은 attB3 재조합 부위 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 서열 번호: 137에 기술된 뉴클레오티드 32904 또는 그의 상동체 중의 등가의 뉴클레오티드 다음에 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 E1 모듈 및 E2-L2 모듈 사이에 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 서열 번호: 137에 기술된 뉴클레오티드 4035 또는 그의 상동체 중의 등가의 뉴클레오티드 다음에 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 서열 번호: 137에 기술된 뉴클레오티드 3608 또는 그의 상동체 중의 등가의 뉴클레오티드 다음에 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 L3-L4 모듈 및 E3 모듈 사이에 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, L3-L4 모듈 및 E3 모듈 사이의 재조합 부위 핵산 서열은 attB5 재조합 부위 핵산 서열이다. 다른 실시양태에서, 핵산(예컨대, 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터)은 E1 모듈 및 E2 모듈 사이에 제1 재조합 부위 핵산 서열을, L3-L4 모듈 및 E3 모듈 사이에 제2 재조합 부위 핵산 서열을, 및 E3 모듈 및 E4 모듈 사이에 제3 재조합 부위 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 재조합 부위 핵산 서열은 핵산 중 서열 번호: 137에 기술된 뉴클레오티드 4035 또는 그의 상동체 중의 등가의 뉴클레오티드 다음에 포함되어 있고, 제3 재조합 부위 핵산 서열은 핵산 중 서열 번호: 137에 기술된 뉴클레오티드 32904 또는 그의 상동체 중의 등가의 뉴클레오티드 다음에 포함되어 있다.
Ad5 게놈(서열 번호: 137) 내로의 4개의 삽입을 보여주는, 시행된 삽입 전략법의 일례가 하기에 열거되어 있다. 번호는 공개된 Ad5 게놈 서열 내의 뉴클레오티드 위치를 나타내는 것으로서, 여기서, 삽입 부위는 재조합 부위 핵산 서열의 삽입을 위해 위치하는 것이다. 하기 일례에서, attB 서열(즉, 재조합 부위 핵산 서열)은 밑줄로 표시되어 있고, 최종 삽입을 위한 Ad5 서열 중의 중복부는 굵게 표시되어 있다. 당업계의 숙련가는 유사한 콘텐츠 또는 상동성 바이러스 서열 중의 적절하고/거나 등가의 삽입 부위를 바로 이해할 수 있을 것이다.
도 21의 조립 전략법을 17회 사용하여 감염성 인간 Ad5 바이러스를 수득하였다. 도 24에는 본원에서 제공하는 본 발명의 효율이 상세하게 설명되어 있다. 4회에 걸쳐 야생형 Ad셈블링된 아데노바이러스를 세포에 형질감염시키고, 바이러스를 생산하였다. 추가로, 상기 프로토콜을 통해 13개의 돌연변이체 아데노바이러스가 생성되었고, 그들 모두 감염성 바이러스를 생산하였다. 도 27은 단일 플라크로서 형질감염으로부터 얻은 재조립된 야생형 Ad5, 및 또한 293 세포 상에 계대접종된 것에 관한 영상을 제공한다. 도 20-21 및 도 25의 전략법으로부터 생산된 바이러스를 도 28에 제시된 바와 같이, 293 세포에서의 복제 효율에 대하여 테스트하였다.
또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 아데노바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스는 복제 수행 능력이 있는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 아데노바이러스는 복제 수행 능력이 없는(replication incompetent) 것이다.
II. 아데노바이러스 유전자 모듈 및 마크로모듈 라이브러리
또 다른 측면에서, 복수개의 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, 마크로모듈)을 포함하는 라이브러리를 제공한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 E1 모듈을 포함한다. 다른 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 E2-L2 모듈을 포함한다. 다른 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 L3-L4 모듈을 포함한다. 다른 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 E3 모듈을 포함한다. 다른 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 E4 모듈을 포함한다. 다른 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 코어 마크로모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈 라이브러리는 상기 기술된 방법에 따라 제조된다.
다른 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 E1 모듈, 복수개의 상이한 E2-L2 모듈, 복수개의 상이한 L3-L4 모듈, 복수개의 상이한 E3 모듈, 복수개의 상이한 E4 모듈, 및/또는 복수개의 상이한 코어 마크로모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 복수개의 상이한 마크로모듈을 포함하는데, 여기서, 마크로모듈은 복수개의 상이한 E1-L2 마크로모듈, 복수개의 상이한 E2-L4 마크로모듈(즉, 코어 마크로모듈) 및/또는 복수개의 상이한 E3-E4 마크로모듈을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수개의 상이한 아데노바이러스 유전자 모듈 및/또는 마크로모듈은 그들이 상이한 유형의 아데노바이러스(예컨대, 상이한 종 또는 상이한 혈청형)로부터 유래되었다는 점에서 상이한 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수개의 상이한 E1 모듈, 복수개의 상이한 E2-L2 모듈, 복수개의 상이한 L3- L4 모듈, 복수개의 상이한 E3 모듈, 복수개의 상이한 E4 모듈, 및/또는 복수개의 상이한 마크로모듈(예컨대, 코어 마크로모듈)은 복수개의 아데노바이러스 유형(예컨대, 1 초과의 인간 아데노바이러스 혈청형)으로부터 유래된 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수개의 상이한 아데노바이러스 유전자 모듈 및/또는 마크로모듈은 그들이 상이한 돌연변이체 모듈 또는 마크로모듈(예컨대, 결실된 아데노바이러스 핵산 서열, 치환된 아데노바이러스 핵산 서열, 이소성 아데노바이러스 핵산 서열, 또는 비아데노바이러스 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열)을 코딩한다는 점에서 상이한 것이다. 예를 들어, 라이브러리는 결실된 아데노바이러스 핵산 서열, 치환된 아데노바이러스 핵산 서열, 이소성 아데노바이러스 핵산 서열, 또는 비아데노바이러스 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 비롯한, 복수개의 상이한 E1 모듈, 복수개의 상이한 E2-L2 모듈, 복수개의 상이한 L3-L4 모듈, 복수개의 상이한 E3 모듈, 복수개의 상이한 E4 모듈, 또는 복수개의 상이한 마크로모듈(예컨대, 코어 마크로모듈)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 복수개의 상이한 아데노바이러스 유전자 모듈 및/또는 마크로모듈은 재조합 수행 능력이 있는(예컨대, 엔트리 벡터 내에 포함되어 있는) 것이다. 예를 들어, 라이브러리는 재조합 수행 능력이 있는, 복수개의 상이한 E1 모듈, 복수개의 상이한 E2-L2 모듈, 복수개의 상이한 L3-L4 모듈, 복수개의 상이한 E3 모듈, 복수개의 상이한 E4 모듈, 및/또는 복수개의 상이한 E2-L4 마크로모듈 모듈을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 복수개의 상이한 아데노바이러스 유전자 모듈 및/또는 마크로모듈은 하이브리드화 수행 능력이 있는(예컨대, SLIC 수행 능력이 있는, 예컨대, 선형화 이후에 SLIC 수행 능력이 있는) 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 라이브러리는 하이브리드화 수행 능력이 있는, 복수개의 상이한 E1 모듈, 복수개의 상이한 E2-L2 모듈, 복수개의 상이한 L3-L4 모듈, 복수개의 상이한 E3 모듈, 복수개의 상이한 E4 모듈, 및/또는 복수개의 상이한 E2-L4 마크로모듈을 포함한다.
본원에서 제공하는 라이브러리의 일부는 다른 사용자가 생성할 수 있고, 다른 사용자 간에 공유할 수 있다. 다양한 아데노바이러스 유전자 모듈을 혼합하고, 매치시킴으로써 원하는 기능성을 가진, 또는 기능성이 없는 신규한 아데노바이러스 구성체를 구성할 수 있다. 따라서, 본원의 방법 및 라이브러리는 다양한 아데노바이러스 혈청형으로부터의 일부를 혼합하고 매치시킴으로써 신규한 아데노바이러스 혈청형 키메라를 형성할 수 있는 능력을 제공한다. 아데노바이러스 유전자 모듈의 라이브러리는 그의 이상적인 아데노바이러스 벡터 구성을 위한 다중의 옵션을 사용자에게 제공한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 유전자 모듈은 박테리아에 대해 독성을 띨 수 있다. 예를 들어, 도 18은 인간 Ad5 E1 모듈의 독성을 입증하는 것이다. 일부 실시양태에서, 보다 낮은 카피수로 유지되는 아데노바이러스 유전자 모듈(예컨대, p15A 복제 기점)은 플라스미드 내에 포함되어야 있어야 할 수도 있다.
일부 실시양태에서, SSR 방법(예컨대, 게이트웨이 반응)에서 아데노바이러스 유전자 모듈 독성, 크기, 또는 다른 인자가 그의 사용을 방해할 수 있다. 예를 들어, 도 15에는 5개의 인간 Ad5 아데노바이러스 유전자 모듈에 대한 표준 게이트웨이 BP 반응 효율이 상세하게 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, SSR 방법(예컨대, 게이트웨이 반응)을 사용하였을 때 비효율적인 아데노바이러스 유전자 모듈은 대체 클로닝 방법(예컨대, SLIC)에 의해 조작될 수 있다. 도 17은 엔트리 벡터를 생성하기 위해 (예컨대, 게이트웨이 클로닝 효소를 사용하는) SSR 방법 대신 SLIC 를 사용하는 전략법에 관한 것을 다이어그램으로 나타낸 것이다.
III. 키트
또 다른 측면에서, E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈, 또는 아데노바이러스 마크로모듈(또는 하기 기술하는 바와 같은 그의 돌연변이체)로부터 선택되는 2개 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 핵산을 포함하는, 본원에서 제공하는 본 방법 및 라이브러리에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 키트의 적절한 구성 성분은 상기 섹션 I 및/또는 II에서 논의된 조성물 및 구성 성분을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 키트는 E1 모듈, E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E3 모듈, E4 모듈 또는 아데노바이러스 마크로모듈로부터 선택되는 3, 4, 또는 5개의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 상기 논의된 바와 같은 벡터(예컨대, 플라스미드)(예컨대, 목적 벡터 또는 도너 벡터)의 일부를 형성할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에서 제공하는 키트는 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하거나, 포함하지 않는 벡터를 포함할 수 있다. 키트에서 유용한 키트는 하나 이상의 재조합 부위 핵산 서열 및/또는 단일 가닥 핵산 오버행(또는 적절한 효소와의 접촉시 단일 가닥 핵산 오버행을 형성할 수 있는 핵산 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 상기 기술된 바와 같은 하이브리드화 수행 능력이 있는 목적 벡터, SLIC 수행 능력이 있는 벡터 또는 도너 벡터이다. 벡터는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 역선택 카세트를 포함한다.
본원에서 제공하는 본 방법을 수행하기 키트의 추가의 구성 성분(예컨대, 엑소뉴클레아제, 인터그라제, 프로모터 서열 등)은 본 발명의 Ad셈블리 방법 및 라이브러리에 관한 설명과 관련하여 쉽게 자명해질 것이다.
IV. 실시예
하기 실시예는 청구되는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라, 설명하기 위해 제공되는 것이다.
A. 바이러스 조립 방법
1. 차세대 바이러스 벡터 및 복제 용해 암 요법 개발을 위한 화학법 '조합' 및 바이러스 게놈 '재조합'
본 발명자들은 다중 변형 및 이종성 요소가 체계적으로 조합될 수 있도록 허용하는, 구성 성분 일부로부터의 바이러스 게놈의 신속하고 새로운 조립을 위한 유용한 재조합 전략법을 개발하였다.
여러 적용에서 아데노바이러스 벡터의 잠재적 능력은 다중 유전자 변형을 빠르고 체계적으로 조작하고 조합할 수 있는 능력으로 인해 저지되었다. 주로 사용되는 주된 방법은 게놈 중 적절한 위치에서의 적합한 제한 효소 부위의 독특한 이용가능성에 따라 달라지고, 일반적으로는 체계적인 사용을 따르지 않거나, 신속한 단일 단계로 정확한 복합 변형을 일으킨다. 거대 게놈 DNA 단편의 조작 및 독특한 제한 부위의 부족으로 인해 상기 방법은 기술상 도전 과제가 되었으며, 한계에 이르게 되었다. 또 다른 방법에서는 변형시키고자 하는 게놈 영역을 포함하는 보다 작은 '셔틀' 벡터, 및 바이러스 게놈을 포함하는 '골격(backbone)' 벡터를 생성하여야 한다. 이러한 벡터의 경우 주요 속도 제한 단계는 재조합인데, 이는 포유동물 세포에서의 상동성 재조합에 의해(이는 빈도가 극도가 낮은 이벤트이며, 무작위 부위에서 발생하고, 원하는 재조합체를 단리시키기 위해서는 다회에 걸친 플라크 정제가 수행되어야 한다), 또는 특별한 박테리아 균주에서의 상동성 재조합에 의해 발생한다. 이러한 방법에는 한계가 있다.
현 기술의 한계를 극복하기 위해, 본 발명자들은 밤새도록 복합 바이러스 돌연변이체를 신속하고 체계적으로 생성할 수 있는 신규한 아데노바이러스 게놈 조립 전략법을 개발하였다. 이러한 전략법을 통해 포유동물 세포에서의 비효율적이고 부정확한 재조합, 이용가능한 BAC 또는 셔틀 벡터에 대한 필요성, 시간이 소비되고, 힘이 드는 플라크 정제는 수행할 필요가 없다. 상기 전략법은 1) 바이러스 유전자에 대한 다중 돌연변이/변형, 2) 다른 바이러스 서브유형으로부터의 유전자, 예컨대, 상이한 수용체에 결합하고, 혈청형을 교환하는 바이러스 코트 단백질, 3) 이소성 유전자, 예컨대, 강력한 종양 방관자 효과를 유도하는 프로드럭 전환 효소, 4) 생체내 영상화 및 진단을 위한 형광성 리포터 또는 태그 첨가, 및 5) 지정된 시험관내 바이러스 진화를 비롯한, 구성 성분 일부로부터 신속하게 신규의 바이러스 게놈을 시험관내에서 조립할 수 있는 능력을 제공한다. 추가로, 상기 기술은 인간 Ad5의 경우, 36개의 유전자를 코딩하는(스플라이스 변이체 미포함) 천연 바이러스 전사 구조를 이용하며, 이로써 아데노바이러스 감염을 통해 다중 단백질 복합체 및 전체 경로가 조립될 수 있고, 전달될 수 있고, 공발현될 수 있다.
Ad2/5 및 현 방법이 가진 한계를 극복하기 위해, 본 발명자들은 게놈 구성 성분 일부와 이종성 요소로부터 아데노바이러스 게놈을 시험관내에서 신속하게 새로 조립될 수 있는 Ad셈블리 방법을 개발하였다. 생물정보학적 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 진화적으로 보존되는 서열, 전사 및 작용상 모듈에 기초하여 상이한 아데노바이러스 게놈(36-38 kb)을 5개의 유니트로 나누었다. 이들 5개의 유니트는 각각 "일부 라이브러리"을 구성하는 게놈의 화합성 부분을 포함하고, 그의 작용 및 다양성은 돌연변이 또는 이종성 요소의 공학처리를 통해 변경되고, 이질성 아데노바이러스 혈청형, 돌연변이체 및 종으로부터의 등가인 유니트를 첨가함으로써 추가로 확장된다. 독특한 특성을 가진 새로운 아데노바이러스를 생성하기 위해, 각 유니트들은 하나씩 라이브러리로부터 선택되고, 시험관내에서 Ad셈블리(예컨대, Ad-SlicR)를 사용함으로써 신속하게 완전한 게놈으로 재조립된다. Ad셈블리를 사용하여 다중-부위 특이 재조합을 통해 신규한 게놈을 조립할 수 있고, 이는 형질감염시, 플라스미드 골격으로부터 자가 절제되고, 복제됨으로써 신규한 바이러스를 생산하게 된다. Ad-SlicR은 (필요한 경우) 보다 강력한 바이러스 복제 및 임상적 용도를 위해 삽입된 재조합 서열을 삭제시키는 데 사용될 수 있는 전략법이다. 본원에 개시된 전략법은 Ad2/5에 대해 상이한 향성 및 다른 바람직한 특성을 가지거나, 변경된 기능성을 부여하도록 유전적으로 변형된 인간 및/또는 동물 아데노바이러스로부터 생성된 라이브러리 게놈 구성 블록을 사용할 수 있다.
이를 달성하기 위해, 본 발명자들은 '게이트웨이'로도 알려져 있는, 특이성 및 효능이 개선되어 있는 변형된 λ 파지 부위 특이 재조합 시스템을 사용하였다. 상이한 파지 효소에 의해 재조합되는 재조합 부위에는 attB, attP, attL, 및 attR로 불리는 4가지 부류가 존재한다. 최근, 신규한 att 부위 특이성이 확인되었고, 이를 통해 정의된 순서 및 배향으로 다중 DNA 단편을 동시에 재조합을 할 수 있게 되었다. 본원에서는 게놈 구성 성분 일부로부터 신규한 전체 바이러스 게놈을 조립할 수 있는 상기 시스템의 새로운 적용을 개시한다. 놀랍게도, 상기 기술은 아데노바이러스 벡터의 개발 및 잠재적인 적용에 있어서 일대의 혁신을 일으켰다.
(1-6번으로 번호매김된) attB 부위의 독특한 쌍을 도입하는 프라이머 세트를 사용하여 매치되는 인접한 기 중의 바이러스 게놈을 증폭시켰다. Ad5 아데노바이러스 게놈은 36 kb이고, 이는 일시적으로는 '조기'(E: early) 및 '후기'(L: late) 전사 유니트로 나뉘는데, 이는 함께 36-40개의 유전자를 코딩한다.
야생형 Ad5/2, Ad5/2의 돌연변이체 및 이질성 아데노바이러스 서브타입 또는 동물 바이러스를 DNA 주형으로서 사용하였다. PCR 단편을 '엔트리' 벡터 내로 재조합하여 아데노바이러스 게놈의 구성 요소를 가진 라이브러리를 생성하였다. 목적 벡터로의 LR 재조합은 개별 요소를 신규한 바이러스 게놈으로 다중 치환 방식으로 조립한다(도 1B). 이는 목적 벡터의 항생제 내성에 대한 양성 선택, 및 독성 유전자에 의해 제공되는, E. 콜라이에서의 비반응 목적 벡터의 음성 선택에 의해 촉진된다(문헌 [Hartley et al., 2000]). 단편의 개수 또는 크기가 재조합 효율을 제한하는 경우, 중간 목적 벡터가 생성되고, 여기서, 제2 BP/LR 반응으로 모듈의 치환 또는 완전한 조립이 이루어진다. 상기와 같이 신속하고 신규한 바이러스 DNA 조작 방법은 DNA 재조합 본래의 화학적 성질을 이용함으로써 신규한 바이러스의 조작을 변환시킨다.
예를 들어, CD46 세포 수용체에 결합하고, Ad2/5 바이러스에 대해 생산된 중화 항체를 회피하는 아데노바이러스 34 섬유와 같이, 추가 조합이 통합된다.
2. 물질 및 방법
상기 가이드라인을 사용하여 하기의 참조 구성 성분을 이용함으로써 변형된 아데노바이러스를 제조하였다. 게이트웨이 DONR 벡터를 사용하였다. 인간 Ad5의 일례에서, PCR에 의해 E1 모듈을 수득하고, SLIC를 사용하여 상기 E1 모듈을 벡터 pDONR P1P4 내로 삽입하였다. attL1 및 attL4 재조합 부위를 포함하는 pDONR P1P4 벡터 골격을 PCR을 사용하여 증폭시키고, SLIC에 의해 Ad5 E1 모듈과 함께 조합하였다. 대체 역선택 카세트를 생성하기 위해, 벡터 pDONR P1P4를 변형시켰다. attP1 및 attP4 재조합 부위를 포함하는 상기 벡터 골격을 PCR을 사용하여 증폭시키고, PheSA294G 돌연변이 및 테트라사이클린 내성 카세트(pENTR L3-pLac-Tet-L2로부터의 pLac-Tet 카세트)와 조립함으로써 새로운 DONR 벡터를 생성하였다. 이어서, 새로운 DONR 벡터로부터 attR1-PheSA294G-Tet(r)-attR4 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, Ad셈블리 DEST 벡터 내로 삽입하였다. 문헌 (["MultiSite Gateway® Pro Plus", Cat# 12537-100]; 및 [Sone, T. et al. J Biotechnol. 2008 Sep 10; 136(3-4): 113-21])을 참조할 수 있다.
인간 Ad5의 일례에서, 게이트웨이 BP 반응에 의해 E3 모듈을 pDONR P5P3r 벡터 내로 삽입하였다. 게이트웨이 BP 반응에 의해 E4 모듈을 pDONR P3P2 벡터 내로 삽입하였다. pDONR P5P2 벡터로부터 attR5-ccdB-Cm(r)-attR2 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, Ad셈블리 DEST 벡터 내로 삽입하였다. 문헌 (["MultiSite Gateway® Pro Plus", Cat# 12537-100]; 및 [Sone, T. et al. J Biotechnol. 2008 Sep 10;136(3-4): 113-21])을 참조할 수 있다.
Ad셈블리 DEST 벡터에 대한 벡터 골격은 3개의 상이한 공급원으로부터의 일부분으로 구성되어 있다. Amp(r) 카세트 및 lacZ 유전자를 플라스미드 pUC19로부터 증폭시켰다. 이를, 바이오브릭시GEM 2007(BioBricksiGEM 2007) 부품 유통의 일부인 플라스미드 pSB3K5-I52002로부터 수득된 p15A 복제 기점과 조합하였다. 보다 낮은 (10-12개) 카피수로 플라스미드를 유지시키는 p15A ori는 E1 독성을 감소시키는 데 필요하다. 마지막으로, 자가 절제 바이러스를 생성하기 위해 효소 I-SceI에 대한 포유동물 발현 카세트에 대해 플라스미드 pAdZ5-CV5-E3+로부터 PCR을 수행하였다. 상기 카세트를 벡터 골격으로 클로닝하여 p15A-SceI로 명명되는 벡터를 생성하였다. 이는 게놈 조립을 개시하는 데 사용되는 벡터이다. 인간 Ad5의 일례에서, 유전자 모듈을 모두 야생형 Ad5 바이러스로부터의 DNA 또는 플라스미드 pAd/CMV/V5/DEST(인비트로겐(Invitrogen))로부터 수득하였다.
인간 Ad5의 일례에서, DEST 벡터와 관련하여, E2 및 L3 모듈을 3-단편 SLIC에 의해 플라스미드 p15A-SceI 내로 삽입하였다. attR5 및 attR2 부위 측면에 위치하는, ccdB 및 Chlor(r)을 발현하는 역선택 마커는 플라스미드 pDONR P5P2로부터 PCR에 의해 수득하였다. 제2 역선택 마커(PheS-Tet)는 벡터 pDONR P1P4 PheSA294G-Tet로부터 PCR에 의해 수득하였다(상기 참조). E2 및 L4 모듈의 말단에 대해 공학처리된 독특한 제한 효소를 사용하여 절단한 후, 2개의 역선택 마커를 SLIC에 의해 p15A-SceI E2-L4의 우측(ccdB/Cm) 및 좌측(PheS/Tet) 상에 삽입하여 DEST 벡터를 생성하였다.
인간 Ad5의 일례에서, 아데노바이러스 유전자 모듈을 포함하는 다중 부위 게이트웨이 엔트리 벡터와 관련하여, E1 모듈을 SLIC에 의해 pDONR P1P4 내로 삽입하였다. E3 모듈을 게이트웨이 BP 반응에 의해 pDONR P5P3R 내로 삽입하였다. E4 모듈을 게이트웨이 BP 반응에 의해 pDONR P3P2 내로 삽입하였다.
Amp(r) 카세트: 플라스미드 pUC19와 관련하여, p15A ori: 플라스미드 pSB3K5-I52002는 바이오브릭시GEM 2007 부품 유통의 일부였다. 아데노바이러스 아데노바이러스 유전자 모듈과 관련하여, 이는 Ad5 입자로부터 정제된 DNA 또는 플라스미드 pAd/CMV/V5/DEST(인비트로겐)로부터의 것이었다. DONR 벡터 pDONR P1P4, P5P2, P5P3R, P3P2를 존 체스넛(Jon Chesnut)(인비트로겐)으로부터 입수하였다. DH5 알파 박테리아 게놈 DNA으로부터 PheS 유전자를 유도시킨 후, 신속 변이에 의해 돌연변이시킴으로써 PheSA294G 돌연변이체를 생성하였다. Tet(r) 유전자와 관련하여, 플라스미드 pENTR L3-pLac-Tet-L2를 존 체스넛(인비트로겐)으로부터 입수하였다.
Ad셈블리 방법의 실시양태와 관련하여, 전형적으로는 두 역선택 카세트 측면에 위치하는 코어 모듈을 포함하는 이중 DEST 벡터 20 fmol을 유전자 모듈을 포함하는 각각의 남은 엔트리 벡터 10 fmol과 조합하였다. Ad5의 일례에서, 이는 20 fmol의 E2-L3 이중 DEST 벡터를 10 fmol의 각 E1 모듈 엔트리 벡터, E3 모듈 엔트리 벡터, 및 E4 모듈 엔트리 벡터와 조합하는 것을 포함하였다. 일부 경우에, 하나 이상의 엔트리 벡터의 양을 증가시키면 (예컨대, Ad5에 대한 E1 모듈 엔트리 벡터 50 fmol을 사용하여) 효율을 증가시킬 수 있었다. 상기 벡터를 최종 부피 10 ㎕로 2 ㎕의 LR 클로나제(Clonase) II(인비트로겐)와 함께 조합하였다. 반응물을 25℃에서 밤새도록(12-16시간 동안) 인큐베이션시켰다. 1 ㎕의 프로테이나제 K(인비트로겐)를 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시킴으로써 반응을 종결시켰다. 이어서, 5 ㎕의 반응물을 ccdB 유전자 생성물에 대해 감수성인 고도한 수행 능력을 가진 박테리아(>1e9 cfu/㎍)로 형질전환시키고, YEG-C1 아가 플레이트(문헌 [Kast, P. Gene, 138 (1994) 109-114]에 기술되어 있는 것; PheSA294G 역선택을 사용하는 경우), 또는 벡터에서 사용되는 역선택을 위해 적절한 다른 배지 상에 플레이팅시켰다. 이어서, 콜로니를 단리시키고, 완전한 게놈에 대해 스크리닝하였다.
PCR과 관련하여, 모든 PCR은 퓨전(Phusion) 효소(NEB)를 사용하여 수행하였다. Ad5로부터 아데노바이러스 유전자 모듈을 수득하기 위해 1x HF 버퍼, 200 μM의 각 dNTP, 0.5 μM의 각 프라이머, 및 10 ng의 주형을 이용하여 PCR을 수행하였다. E2-L2 모듈의 경우, 3% DMSO도 또한 첨가하였다. 주형은 플라스미드 pAd/PL-DEST(인비트로겐; E2-L2, L3-L4, 및 E4 모듈인 경우) 또는 Ad5 게놈 DNA(E1 및 E3 모듈인 경우)였다. PCR 조건은 하기와 같았다. E2-L2 및 L3-L4: 98℃에서 30 초 - 98℃에서 10 초, 65℃에서 30 초(매 2 사이클마다 온도를 1℃씩 강하시킴), 72℃에서 7 분인 것으로 10 사이클 - 98℃에서 10 초, 60℃에서 30 초, 72℃에서 8 분인 것으로 29 사이클 - 72℃에서 10 분 - 4℃에서 유지. E3: 98℃에서 30 초 - 98℃에서 10 초, 70℃에서 30 초(매 사이클마다 온도를 0.5℃씩 강하시킴), 72℃에서 2분 30초인 것으로 10 사이클 - 98℃에서 10 초, 68℃에서 30 초, 72℃에서 2분 30초인 것으로 25 사이클 - 72℃에서 10분 - 4℃에서 유지. E4: 98℃에서 30초 - 98℃에서 10초, 63℃에서 30초(매 사이클마다 온도를 0.5℃씩 강하시킴), 72℃에서 2분인 것으로 6 사이클 - 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분인 것으로 29 사이클 - 72℃에서 5분 - 4℃에서 유지.
정제된 바이러스로부터 바이러스 게놈 DNA를 수득하는 것과 관련하여, 최대 100 ㎕의 정제된 바이러스를, 10 mM 트리스(Tris)(pH 8), 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 및 0.2% SDS를 함유하는 300 ㎕의 용해 버퍼에 첨가하였다. 믹스를 60℃에서 5 min 동안 인큐베이션시킨 후, 5 ㎕의 프로테이나제 K 스톡(~20 mg/mL)을 첨가하고, 60℃에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 이어서, 시료를 5 min 동안 얼음상에 놓은 후, 15 min 동안 15K x g로 회전시켰다. 상청액을 제거하고, 동량의 이소프로판올에 첨가하고, 잘 혼합하고, 4℃에서 15 min 동안 15K x g로 회전시켰다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고, 4℃에서 15 min 동안 다시 회전시켰다. 펠릿을 건조시키고, 사용을 위해 재현탁시켰다.
SLIC와 관련하여, 선형 단편을 하기 20 ㎕의 반응물: 50 mM 트리스(pH 8), 10 mM MgCl2, 50 ㎍/mL BSA, 200 mM 우레아, 5 mM DTT, 및 0.5 ㎕ T4 DNA 폴리머라제 중 실온에서 20분 동안 엑소뉴클레아제로 처리하였다. 1 ㎕의 0.5M EDTA를 첨가한 후, 75℃에서 20분 동안 인큐베이션시켜 반응을 종결시켰다. 이어서, T4로 처리된 동량의 DNA를 새 튜브에서 약 20 ㎕ 부피로 혼합하였다. 2개의 단편을 조합하는 SLIC의 경우, 각 반응물을 10 ㎕씩 사용하였다. 3개의 단편을 조합하는 SLIC의 경우, 각 반응물을 7 ㎕씩 사용하였다. 10 min 동안 65℃로 가열한 후, 매 5초마다 온도를 0.5℃씩 강하시켜 25℃가 될 때까지 천천히 냉각시켜 어닐링시켰다. 어닐링 후, 5 ㎕의 반응물을 형질전환시키고, 클론을 스크리닝하였다.
예를 들어, Ad5의 AdSlicR과 관련하여, 100 ng의 (PCR에 의해 선형화된) T4로 처리된 p15A-SceI, 및 E2 및 L3 모듈 각각 300 ng씩(그의 각각의 엔트리 벡터로부터 PCR에 의해 수득된 것)을 사용하여 3-단편 SLIC 반응을 수행하였다. 이를 통해 벡터 p15A-SceI E2-L4가 생성되었다. 5 ㎍의 p15A-SceI E2-L4를 SwaI로 절단하고, 퀴아젠 퀴아엑스II(Qiagen QiaexII)를 사용하여 겔 정제하였다. E3 및 E4 모듈은 그의 각각의 엔트리 벡터로부터 PCR에 의해 수득하였다. 각각의 선형화된 벡터(450 ng) 및 PCR 생성물(200 ng)을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, 150-200 ng의 벡터 및 ~100 ng의 각 모듈 PCR을 사용하여 일반적인 방식으로 SLIC를 수행하였다. 양성 클론을 단리시킨 후, 5 ㎍의 새 벡터를 PacI로 절단하고, 겔 정제한 후, 새 SLIC 반응에서 E1 PCR 생성물(T4로 처리된 것, 100 ng)과 조합하였다. 이를 통해 게놈 조립은 완성되고, 플라스미드는 바이러스 재구성을 위한 형질감염시킬 준비가 되었다.
B. 변형된 아데노바이러스
*아데노바이러스는 유전자 전달 적용을 위해 빈번하게 사용된다. 예를 들어, 이는 트랜스진을 배양물 중의 세포로, 생체내에서 동물 조직으로, 또는 유전자 요법을 위해 생체내에서 인간 세포로 전달하는 데 사용된다. 이러한 방식으로 아데노바이러스를 사용하는 데 있어서 한가지 제한 인자는 유전자 발현이 일시적이라는 점이다. 아데노바이러스는 비통합성 바이러스이고, 따라서, 트랜스진 발현은 세포 분열시에 상실된다. 예컨대, 레트로바이러스 및 렌티바이러스처럼 통합성인 다른 바이러스 시스템을 유전자 전달이라는 같은 목적을 위해 사용하였다. 그러나, 이처럼 천연적으로 통합성인 바이러스는 소형인 바, 발현될 수 있는 트랜스진의 양에는 한계가 있고, 고역가로의 성장이 어려우며, 그로부터 다중 트랜스진을 발현시키기가 어렵고, 게놈 중의 무작위 위치에 통합시키는 것도 어렵다.
PhiC31 인터그라제가 ~280 bp attB 서열을 포함하는 외래의 환형 DNA를 위(pseudo) attP 부위로 알려져 있는 특이 위치에 숙주 세포 염색체 내로 통합시키는 것을 매개할 수 있다는 것이 입증되었다. 이러한 과정은 환형 플라스미드 DNA를 사용하여 입증되었지만, 예컨대, 아데노바이러스와 같은 바이러스의 사용으로는 입증된 바 없는데, 그 이유는 아데노바이러스 게놈이 선형이고, 염색체 절단을 일으키면서 통합을 수행하거나, 또는 통합을 수행하지 못하기 때문일 가능성이 높다. 이에, 본 발명자들은 형질도입시 게놈의 일부가 loxP 부위의 cre 매개 재조합을 통해 환형으로 되고, 이로써, PhiC31 인터그라제/attB를 통해 표적화된 통합이 이루어지도록 하는 방식으로 재조합 아데노바이러스 게놈이 생성되게 하는 시스템을 제공한다.
상기 기술을 위해, 아데노바이러스 게놈을 여러 방식으로 변형시켰다(도 31-33 참조). 먼저, E1 및 E3 영역을 결실시켜 다중 트랜스진이 발현되도록 하였다. E4 영역을 cre 리콤비나제 및 PhiC31 인터그라제를 발현하는 카세트로 치환하였다. tet 반응성 프로모터 또는 다른 유사한 조절가능 요소를 사용하여 상기 효소의 발현을 조절하였다. 2개의 loxP 부위를 게놈에 배치시켰는데, 하나는 트랜스진이 발현되는 E1 영역의 좌측 말단에 놓고, 나머지 하나는 섬유와 E4 영역 사이에 놓았다. 따라서, 이 두 loxP 부위 사이에 존재하는 것이 모두 세포 염색체 내로 삽입되는 것이었다. 마지막으로, PhiC31 attB 부위는, 비록 상기 짧은 서열의 특정 배치가 그가 loxP 부위 사이에 위치하는 한은 다른 위치에 존재할 수 있기는 하지만, E3 영역 내에 배치시켰다(본 실시예에서, 비록 cre 리콤비나제 및 PhiC31 인터그라제가 loxP 부위 및 트랜스진을 포함하는 동일의 아데노바이러스로부터 발현되기는 하지만, 본 발명자는 또한 별개의 바이러스로부터 상기 효소를 발현시킬 수 있었다).
아데노바이러스의 세포로의 형질도입시, cre 리콤비나제 및 PhiC31 인터그라제는 유도되고, cre는 아데노바이러스 게놈 중 loxP 부위의 재조합을 촉진시킨다. 이를 통해 loxP 부위 사이에 위치하는 DNA의 폐환화가 이루어진다. 이어서, 이로써, 인터그라제는 단편 중의 attB 부위를 사용하여 환형 단편을 세포 염색체로 재조합시킨다(도 33 참조). 최종 결과로 제한된 개수의 위치 중 한 위치에서 아데노바이러스 게놈의 선택된 일부의 숙주 세포 염색체 내로의 안정적인(비가역적인) 통합이 이루어진다. 트랜스진은 상기 통합으로부터 안정적으로 발현된다. 상기 공정으로 1) E1 영역이 결실되었고, 2) 바이러스 게놈의 말단이 결실되었기 때문에, 아데노바이러스 복제 또는 재활성화의 위험은 없었다. 상기 두 영역 모두가 바이러스 전사 및 복제에 필요한 것이었다.
현존 레트로바이러스 및 렌티바이러스 시스템에 비하여 본 시스템이 가지는 이점으로는 1) 무작위적이라기보다는 게놈 내의 제한된 개수의 위치에서 통합이 이루어진다는 점, 2) 트랜스진 발현을 위해 허용되는 크기가 증가되었다는 점, 3) 섬유 변형을 통해(도 39-42) 또는 다른 아데노바이러스 혈청형 및 종의 사용을 사용함으로써(도 45) 특이 세포 또는 조직에 아데노바이러스를 재표적화시킬 수 있는 능력이 있다는 점, 4) Ad셈블리 시스템을 사용한 조작이 용이하다는 점, 5) 바이러스를 고역가로 생산하기가 용이하다는 점, 및 6) 단일 벡터로부터 다중유전자를 발현시키기가 용이하다는 점을 포함한다.
본 시스템은 바이러스 매개 DNA 전달을 사용함으로써 ("점프-인(Jump-In)" 라인의 제품으로써 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)에 의해 시판되는) 현 PhiC31 통합 기술을 발전시켰다. 현존 기술은 오직 플라스미드에만 기반을 둔 것이며, 따라서, 효율적으로 형질감염될 수 있거나, 전기천공될 수 있는 세포로만 제한된다. 또한, 특이 트랜스진 마우스가 생성되지 않는다면, 이는 사용될 수 없다. 생체내에서 트랜스진을 전달하는 데에는 통상 아데노바이러스가 사용되는 바, 따라서, 본 시스템을 통해 현존 기술의 수행 능력은 크게 확장되었다. 한가지 구현 방법은 변형된 아데노바이러스의 특이 조직으로의 적정가능하고 표적화된 전달을 통해 다중-유전자 발현 카세트를 사용하여 마우스 모델을 생성하는 것이 될 것이다. 또 다른 구현 방법은 표적화된 넉인(knock-in)을 위해 att 부위를 포함하는 마우스 계통에 대한 것이 될 것이다. 또 다른 구현 방법은 iPS에 대한 것이 될 것이다.
C. Ad셈블리를 사용한 완전하게 거의 야생형인 아데노바이러스 5형의 생성
Ad셈블리를 사용하여 하기 전략법을 이용함으로써 거의 야생형인 버전의 Ad5를 구성하였다. 게이트웨이 역선택 카세트 측면에 위치하는 야생형 코어 서열을 야생형 Ad5 E1 모듈, 야생형 Ad5 E3 모듈, 및 야생형 Ad5 E4 모듈과 혼합하였다(도 21). 완전하게 조립된 게놈을 포함하는 클론을 단리시키고, 293 세포로 형질감염시켰다. 7일 경과 후, 플라크가 시각적으로 관찰되었고, 바이러스를 수거하고, 추가의 293 세포 상에서 증폭시켰다. 성장 분석을 통해 거의 야생형인 바이러스(이는 실제로 야생형인 바이러스와 비교하였을 때, 3개의 attB 삽입을 포함한다)는 실제로 야생형인 바이러스처럼 단지 약간 감소된 역가로 성장한 것으로 밝혀졌다(도 28).
D. 복제 결함이 있고, GFP를 발현하며, 대체 혈청형으로부터 섬유 단백질을 포함하는 돌연변이체 Ad5의 생성
본 발명자들은 Ad셈블리를 사용하여 돌연변이체 Ad5를 생성하였다. E1A 및 E1B 영역을 결실시켜 상기의 새로운 벡터를 이용함으로써 임의의 바이러스가 복제 결함을 가지도록 Ad5 E1 모듈을 변경시켰다. E1A 및 E1B를 제거한 후, CMV IE 프로모터 및 GFP 유전자를 포함하는 포유동물 발현 카세트를 삽입하였다. Ad5 섬유 유전자가 Ad34로부터의 섬유 유전자로 치환될 수 있도록 Ad5 E3 모듈을 변경시켰다. 표준 Ad셈블리 반응에서 상기 돌연변이체 E1 및 E3-섬유 모듈을 게이트웨이 역선택 카세트 측면에 위치하는 야생형 Ad5 E4 모듈 및 야생형 Ad5 코어 모듈과 조합하였다(도 21). 완전하게 조립된 게놈인, 생성된 클론을 단리시키고, 293 세포에 형질감염시켰다. 7일 경과 후, 플라크가 시각적으로 관찰되었고, 바이러스를 수거하고, 추가의 293 세포 상에서 증폭시켰다. 상기 바이러스의 성장은 본 전략법이 1) 트랜스진 발현을 위해, 2) 형광성 유전자 발현을 위해, 3) 복제 결함이 있는 바이러스 구성을 위해, 4) 키메라 아데노바이러스 생성을 위해, 및 5) Ad5 배경에서의 대체 섬유 발현을 위해 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
E. AdSlicR을 사용한 복제 수행 능력이 있는 Ad5의 생성
AdSlicR을 사용하여 아데노바이러스 유전자 모듈로부터 야생형 Ad5를 구성하였다. 야생형 E3 및 E4 모듈은 그의 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터로부터 PCR에 의해 수득하였다. 이를 표준 SLIC 반응에서 SwaI로 절단된 야생형 Ad5 코어 모듈과 조합하였다(도 25). 성공적으로 E3 및 E4 모듈과 함께 코어 모듈을 포함하는 클론을 단리시키고, PacI로 절단하였다. 이어서, 이를 제2 SLIC 반응에서 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터로부터 PCR에 의해 수득된 야생형 Ad5 E1 모듈과 조합하였다. 완전하게 조립된 게놈을 포함하는 클론을 단리시키고, 293 세포에 형질감염시켰다. 7일 경과 후, 플라크가 시각적으로 관찰되었다. 생성된 바이러스를 추가의 293 세포 상에서 증폭시켰다. 상기 바이러스에 관한 성장 분석을 통해 이는 야생형 Ad5와 동일한 역가로 성장하였다는 것이 밝혀졌다(도 28).
V. 표
하기 표 1-9에는 본원에서 제공하는 본 방법을 사용하여 제조되는 아데노바이러스 유전자 모듈 벡터, 목적 벡터 및 엔트리 벡터의 예가 개시되어 있다.
[표 1a]
[표 1b]
[표 1c]
[표 1d]
[표 1e]
[표 1f]
[표 2a]
[표 2b]
[표 2c]
[표 2d]
[표 3a]
[표 3b]
[표 4]
[표 5]
[표 6]
[표 7]
[표 8]
[표 9]
SEQUENCE LISTING
<110> The Salk Institute for Biological Studies
O'Shea, Clodagh
Powers, Colin
<120> Adenoviral Assembly Method
<130> 92150-816208
<150> US 61/374,198
<151> 2010-08-16
<160> 143
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1149
<212> PRT
<213> Canine adenovirus 1
<400> 1
Met Ser Leu Val Gln Ser His Gly Thr Ser Gly Leu Phe Thr Glu Pro
1 5 10 15
Pro Asn Ser Ile Asn Gln Gln Glu Ser Ser Gly Pro Ser Leu Pro Ala
20 25 30
Gln Asp Ala Thr Gln Ala Ser Ala Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Thr
35 40 45
Pro Ala Ile Asn Ser Thr Lys Arg Lys Tyr Arg Gly Ala Val Val Ala
50 55 60
Gln Arg Ala Thr Leu Ser Ile Ser Ala Ile Leu Asp Asn Gly Gln Cys
65 70 75 80
Val Gln Ile Lys Tyr His Ser Asn Leu Ala Ser Ala Leu Thr Asn Leu
85 90 95
Cys Asn Thr Asn Leu Tyr Asp Leu Pro Ala Cys Leu Asn Lys Pro Ile
100 105 110
Thr Val His Asn Leu Pro Thr Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ala Ser Tyr
115 120 125
Ser Leu Ile Tyr Tyr Tyr Gln Arg Gly Thr Val Arg Lys Val Glu Phe
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Pro Leu Leu Ser Phe Pro Leu Lys Phe Leu Val Lys
145 150 155 160
His Gly Lys Val Phe Leu Ile Lys Asp Ile Ser Pro Met Gln Arg Cys
165 170 175
Glu Phe Cys Gly Ser Phe Phe Lys Val Thr His Thr Cys Thr Leu Arg
180 185 190
Arg Arg Asp Phe Tyr Phe His His Val Ala Ser His Ser Gly Asp Trp
195 200 205
Trp Glu Lys Ile Ser Phe Ser Pro Ile Gly Ala Pro Ala Asn Thr Glu
210 215 220
Arg Leu Phe Ile Val Tyr Asp Val Glu Thr Tyr Thr Trp His Gly Lys
225 230 235 240
Phe Gly Lys Gln Leu Val Pro Phe Met Leu Val Phe Gln Leu Leu Gly
245 250 255
Asp Glu His Leu Val Asn Ala Ala Lys Asn Leu Ala Thr Thr Gln Asn
260 265 270
Trp Asp Thr Trp Asn Ser Asn Glu Gln Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ile
275 280 285
Thr Pro Glu Lys Arg Ala Ile Gly Val Lys Phe Lys Thr Phe Arg Asp
290 295 300
Thr Leu Gln Gln His Phe Ala Asn Asn Leu Trp Ser His Val Leu Cys
305 310 315 320
Gln Asn Pro Lys Leu Met Glu Glu Ala Ala Ala Leu Gly Leu Glu Asn
325 330 335
Pro Glu Asp Ile Thr Ala Asn Gln Leu Lys Lys Phe Lys Leu Gln Gly
340 345 350
Thr Pro Arg Phe Ile Glu Val Tyr Val Val Gly His Asn Ile Thr Gly
355 360 365
Phe Asp Glu Ile Leu Leu Ala Ala Gln Val Val Ser Thr Arg Ala Glu
370 375 380
Ile Pro Pro Val Phe Asp Ile Ser Arg Asn Phe Met Pro Arg Ala Gly
385 390 395 400
Arg Leu Leu Phe Asn Asp Ile Thr Tyr Ser Leu Pro Asn Pro Ser Tyr
405 410 415
Val Pro Ser Lys Asp Tyr Arg His Trp Glu Gln Gly Gln Val Leu Ala
420 425 430
Ser Asp Leu Lys Thr Gln Tyr Ile Lys Phe Met Val Arg Asp Thr Phe
435 440 445
Ser Leu Thr His Thr Ser Leu Lys Asn Ala Ala Lys Ala Tyr Ser Leu
450 455 460
Thr Val Ser Lys Gly Cys Cys Pro Tyr Gln Ala Val Asn Glu Phe Tyr
465 470 475 480
Met Leu Gly Ser Tyr Gln Gln Asp Ala Asp Gly Phe Pro Asp Leu Lys
485 490 495
Tyr Trp Lys Asp Gln Glu Glu Tyr Cys Phe Asn Lys Asp Leu Trp Lys
500 505 510
Lys Glu Lys Lys Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Gln Gln Thr Leu Asp Tyr
515 520 525
Cys Ala Leu Asp Val Gln Val Thr Ala Gln Leu Val Asn Lys Leu Ile
530 535 540
Glu Ser Tyr Gln Ile Phe Ile Lys Asn Ser Val Asn Leu Pro Glu Thr
545 550 555 560
Tyr Phe Asn Val Phe Gln Arg Pro Thr Ile Ser Ser Asn Ser His Ala
565 570 575
Ile Phe Lys Gln Ile Leu Tyr Arg Ala Glu Lys Pro Asn Ala Pro His
580 585 590
Leu Asn Thr Ile Ile Met Ala Pro Ser Asn Glu Met Tyr Glu Tyr Val
595 600 605
Arg Leu Ser Ile Arg Gly Gly Arg Cys Tyr Pro Thr Tyr Ile Gly Val
610 615 620
Leu Gln Glu Pro Val Phe Val Tyr Asp Ile Cys Gly Met Tyr Ala Ser
625 630 635 640
Ala Leu Thr His Pro Phe Pro Ala Gly Ser Pro Leu Asn Pro Tyr Glu
645 650 655
Arg Ala Val Ala Ile Lys Ala Tyr Glu His Lys Met Gln Glu His Lys
660 665 670
Thr Ile Ser Tyr Phe Asp Glu Asp Leu Leu Pro Gly Ile Phe Thr Ile
675 680 685
Asp Ala Asp Pro Pro Ala Glu Glu Phe Leu Asp Val Leu Pro Pro Phe
690 695 700
Cys Ser Arg Lys Gly Gly Arg Leu Cys Trp Thr Asn Glu Pro Leu Arg
705 710 715 720
Gly Glu Val Thr Thr Ser Ile Asp Val Ile Thr Leu His Asn Arg Gly
725 730 735
Trp Lys Val Thr Leu Ile Pro Asp Thr Arg Thr Thr Val Phe Pro Glu
740 745 750
Trp Lys Cys Leu Ala Arg Glu Tyr Val Gln Leu Asn Ile Asn Ala Lys
755 760 765
Glu Lys Ala Asp Lys Ser Lys Asn Gln Thr Met Arg Ser Ile Ala Lys
770 775 780
Leu Leu Ser Asn Ala Leu Tyr Gly Ser Phe Ala Thr Lys Leu Asp Asn
785 790 795 800
Lys Lys Thr Val Phe Ser Asp Gln Ile Glu Ser Asn Ile Ala Lys Glu
805 810 815
Ile Ala Ser Gly Ala Tyr Val Val Lys Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Thr
820 825 830
Asp Asn Leu Cys Ala Glu Ile Met Pro Glu Phe Val Val Ala Tyr Pro
835 840 845
Pro Val Asn Phe Asp Val His Arg Leu Ala Pro Pro Ser Tyr Ser Glu
850 855 860
Glu Tyr Pro Thr Glu Asn Pro His Ala Glu Gly Pro Phe Met Gln Asn
865 870 875 880
Phe Asn Met Thr Ser Tyr Arg Tyr Lys Pro Ile Met Phe Ile Asp Ala
885 890 895
Glu Asp Asp Asp Phe Cys Leu His Thr Leu Glu Lys Ser Thr Pro Leu
900 905 910
Ile Thr Asn Asn Arg Tyr Ala Ser Gln Ile Ala Ser Phe Val Leu Ala
915 920 925
Trp Thr Arg Ala Phe Val Ser Glu Trp Ser Gln Phe Leu Tyr Glu Asn
930 935 940
Asp Ala Gly Ile Pro Leu Glu Lys Arg Ile Leu Lys Ser Val Tyr Gly
945 950 955 960
Asp Thr Asp Ser Leu Phe Thr Thr Met Glu Gly Tyr Arg Leu Met Glu
965 970 975
Glu Lys Gly Lys Arg Arg Leu Lys Lys Asn Gly Gly Asn Leu Val Phe
980 985 990
Asp Pro Asn Asn Pro Glu Leu Thr Trp Leu Val Glu Cys Glu Thr Lys
995 1000 1005
Cys Glu Lys Cys Gly Ala Asp Ala Tyr Ser Ser Glu Ser Val Tyr
1010 1015 1020
Leu Ala Pro Lys Leu Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Thr Cys Pro Glu
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Cys Gln Tyr Val Gly Lys Gly Lys Leu Arg Ala Lys Gly His Ala
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Thr Ser Thr Leu Ser Tyr Asp Val Leu Lys Ala Cys Tyr Tyr Ala
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Leu Arg Arg Thr Leu Thr Ser Val Gln Thr His Val Gln Pro Phe
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Pro Glu Asn Pro Ala Leu Tyr Trp Ala Cys Asp Cys Asp Ile Lys Cys
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Lys Arg Cys Gly Gly Asp Thr Tyr Ser Ser Glu Ala Ile Phe Leu Ala
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Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Lys Asp Ala Val Cys Leu Asp Pro Glu Cys
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Gly His Val Gly Ser Gly Lys Ile Arg Ser Lys Gly His Arg Gln Ala
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Arg Pro Trp Lys Asp Leu Thr Gln Tyr Arg His Gly Asp Phe Leu
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Leu Ser Ile Glu Asp Cys Asp Glu Ile Leu Asp Leu Leu Gly Asp
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Pro
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<213> Snake adenovirus 1
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Cys Gly His Ala Gly Asp Ser Phe Val Lys Ile Ile Tyr Tyr Lys Asp
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Thr Tyr Ala Leu Lys Cys Val Ile Pro Glu Lys Ile Thr Lys Asp Phe
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Gln Arg Gly Tyr Ser Pro Lys Lys Lys Glu Glu Leu Gly Gly Lys Trp
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115 120 125
Ser Ser His Gln Cys Asn Val Arg Arg Arg Glu Phe Tyr His His Ala
130 135 140
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Met Met Leu Asn Lys Ala Arg Asp Val Ile Gly His Lys Phe Lys Asp
225 230 235 240
Met Arg Val Gln Leu Gln Lys Arg Ala Ala Ser Asp Ile Trp Ser Arg
245 250 255
Tyr Arg Glu Lys His Asp Ile Leu Ser Glu Glu Gly Val Ser Tyr Ala
260 265 270
Gln Leu Glu Ala Met Ala Lys Asp Asn Leu Leu Lys Thr Asp Ala Glu
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325 330 335
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340 345 350
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Lys Lys Ser Phe Phe Asn Phe Leu Gln Leu Gln Gly Leu Gln Pro Lys
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435 440 445
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Lys Asn Leu Asn Glu Lys Ser Gly Lys Thr Ala Phe Ile Glu Lys Asn
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Leu Ile Gly Cys Lys Ser Leu Ile Lys Ile Ala Ser Lys Ile Ala Thr
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Asp Ile Gly Tyr Glu Val Asn Arg Glu Cys Phe Val Met Leu Asn Lys
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Gln Ile Ser Val Ala Lys Lys Tyr Trp Ser Thr Phe Cys Glu Asn His
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Gly Leu Glu Ser Asn Leu Ser Tyr Glu Asp Ile Met Val Leu Asn Lys
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Glu Lys Lys Leu Lys Gln Cys Glu Pro Arg Tyr Ile Glu Leu Tyr Val
275 280 285
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Leu Val Glu Lys Leu Ile Glu Gly Tyr Gln Glu Phe Cys Thr Thr Ser
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Leu Lys Leu Glu Cys Ser Phe Asn Ile Phe Gln Arg Pro Thr Ile Ser
485 490 495
Ser Asn Thr Gln Ala Leu Phe Lys Gln Ile Phe Tyr Asn Glu Glu Asp
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885 890 895
Arg Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Asn Leu Ile Phe Asp Glu Lys His Pro
900 905 910
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915 920 925
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<213> Duck adenovirus A
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165 170 175
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Gln Asp Lys Val Thr Asn Leu Ala Trp Glu Arg Phe Cys Glu Asp
245 250 255
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260 265 270
Leu Asn Lys Ser Gln Lys Leu Asn Lys Thr Ala Glu Pro Gln Phe Tyr
275 280 285
Glu Ile Ile Ile Val Gly His Asn Ile Ser Gly Phe Asp Glu Ile Val
290 295 300
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Lys Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Leu Pro Val Glu Lys Gly Cys Cys Pro
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Tyr Lys Ala Val Asn Glu Phe Tyr Met Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Asp
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Glu Lys Gly Phe Pro Ala Glu Glu Tyr Trp Lys Asp Arg Glu Glu Tyr
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Leu Leu Asn Arg Glu Leu Trp Glu Lys Lys Gln Glu Thr Ala Tyr Asn
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Leu Val Arg Glu Thr Leu Asp Tyr Cys Ala Leu Asp Val Leu Val Thr
565 570 575
Ala Ala Leu Val Asp Lys Leu Arg Glu Ser Tyr Ala Gln Phe Ile Gln
580 585 590
Asp Ser Val Gly Leu Pro Gly Ala Asn Phe Asn Val Phe Gln Arg Pro
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Thr Ile Ser Ser Asn Ser His Ala Ile Phe Arg Gln Ile Leu Tyr Arg
610 615 620
Ala Glu Lys Pro His Lys Thr His Leu Gly Asp Gly Leu Met Ala Pro
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Ser His Glu Met Tyr Asp Tyr Val Arg Ala Ser Ile Arg Gly Gly Arg
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Asp Ile Cys Gly Met Tyr Ala Ser Ala Leu Thr His Pro Met Pro Trp
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Glu Asp Ala Leu Gln Asp Thr Asp Thr Glu Ile Asp Tyr Phe Asn Lys
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Ile Leu Leu Pro Gly Ile Phe Thr Ile Asp Ala Asp Pro Pro Pro Ala
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Asn Leu Leu Asp Pro Leu Pro Pro Phe Cys Ser Arg Lys Gly Gly Arg
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Ile Lys Ser Thr Ser Phe Val Glu Thr Asp Asn Leu Ser Ala Glu Ile
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<213> Simian adenovirus 3
<400> 27
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980 985 990
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Leu Val Glu Cys Glu Thr Val Cys Ser Asn Cys Gly Gly Asp Ala
1025 1030 1035
Tyr Ser Pro Glu Ser Val Phe Leu Ala Pro Lys Leu Tyr Ala Leu
1040 1045 1050
Lys Cys Leu Leu Cys Ser Asn Cys Gly His Val Ser Lys Gly Lys
1055 1060 1065
Leu Arg Ala Lys Gly His Ala Ala Glu Ser Leu Asp Tyr Glu Leu
1070 1075 1080
Met Val Arg Cys Tyr Leu Ala Asp Leu Gln Gly Asp Glu Lys Gln
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<212> PRT
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<400> 28
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Ala Asn Ile Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Ala Trp Asp Thr Pro
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His Thr Tyr Tyr Tyr Val Ser Pro Ile Lys Gly Glu Ile Gly Lys Ala
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Phe Lys Asp Leu Arg Tyr Glu Ile Gln Lys Gln Val Thr Arg Leu Leu
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195 200 205
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245 250 255
His Asn Arg Thr Asp Val Leu Pro Ala Phe Lys Ile Asn Arg Asn Phe
260 265 270
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275 280 285
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Gly Lys Leu Thr Ala Ala Asp His Lys Tyr Gln Phe Val Lys Phe Met
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys Glu Lys Asn Gln Thr
645 650 655
Met Arg Ser Ile Ala Lys Leu Leu Ser Asn Ala Leu Tyr Gly Ser Phe
660 665 670
Ala Thr Lys Leu Asp Asn Lys Lys Ile Val Phe Ser Asp Gln Leu Glu
675 680 685
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740 745 750
Thr Tyr Lys Tyr Lys Pro Ile Thr Phe Leu Glu Thr Glu Asp Asp Asp
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770 775 780
Arg Tyr Ala Ser His Ile Ala Ser Phe Val Leu Ala Trp Thr Arg Val
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820 825 830
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850 855 860
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885 890 895
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<400> 29
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Val Glu Thr Tyr Thr Trp His Gly Lys His Gly Lys Gln Leu Val Pro
115 120 125
Phe Met Leu Val Phe His Leu Ser Gly Glu Leu Glu Leu Val Ser Leu
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Ser Ala Asn Ile Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Ala Trp Asp Thr Pro
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Met Pro Arg Asn Gly Lys Ile Leu Phe Asn Asp Ile Ser Phe Cys Leu
275 280 285
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Gly Lys Leu Thr Ala Ala Asp His Lys Tyr Gln Phe Val Lys Phe Met
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595 600 605
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645 650 655
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675 680 685
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690 695 700
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Pro Leu His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Val Tyr Gly Asp Thr Asp Ser
820 825 830
Leu Phe Val Thr Glu Glu Gly His Arg Leu Met Glu Gln Arg Gly Lys
835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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<211> 1130
<212> PRT
<213> Porcine adenovirus C
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Arg Ser Gly Pro Val Arg Gly Asn Leu Val Ala Lys Arg Ala Thr Leu
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His Ser Lys Thr Leu Glu Ala Leu Glu Asn Leu Phe His Leu His Leu
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Phe Lys Ser Phe Arg Asp Glu Leu Gln Asn Arg Val Thr Gln Asp Leu
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<213> Tree shrew adenovirus
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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450 455 460
Asn Pro Arg Ser Lys Lys Arg Thr Asp Phe Leu Leu Trp Glu Gln Gly
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580 585 590
Asn Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Ala Ser Phe Val Arg Asp Ala Val Gly
595 600 605
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Tyr Leu Gly Ile Leu Arg Glu Pro Leu Tyr Val Tyr Asp Ile Cys Gly
675 680 685
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Asn Pro Tyr Glu Arg Ala Leu Ala Ala Arg Ala Trp Gln Gln Ala Leu
705 710 715 720
Asp Leu Gln Gly Cys Lys Ile Asp Tyr Phe Asp Ala Arg Leu Leu Pro
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Leu His Asn Arg Gly Trp Arg Val His Leu Val Pro Asp Glu Arg Thr
785 790 795 800
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820 825 830
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850 855 860
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885 890 895
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<400> 33
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100 105 110
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Ser Phe Leu Tyr Ser Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Asn Leu Lys
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<213> Ovine adenovirus 6
<400> 34
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<213> Canine adenovirus 1
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Ala Gly Phe Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Ile Lys Gln Arg Glu Thr
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Asp Leu Gly Gln Asn Leu Leu Tyr Ser Asn Ser Ala His Ala Leu Asp
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<213> Ovine adenovirus 1
<400> 42
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<400> 47
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<213> Bovine adenovirus 4
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Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Val Gly Leu Met
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<212> PRT
<213> Great tit adenovirus 1
<400> 59
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Asn Val Gly Leu Ser Glu Ser Thr Met Asp His Arg Ser Ser Gly Ala
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Arg Met Gly Lys Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile
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515 520 525
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<211> 920
<212> PRT
<213> Frog adenovirus 1
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<213> White sturgeon adenovirus
<400> 61
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<213> Fowl adenovirus D
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val Gln Met Leu Ala Asn
770 775 780
Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro Glu Ser Tyr Lys Asp
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<213> Simian adenovirus 1
<400> 67
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Asp Val Gln Asn Pro Glu Leu Gln Phe Phe Ala Ser Thr Asn Val Ala
245 250 255
Asn Thr Pro Lys Ala Val Leu Tyr Ala Glu Asp Val Ser Ile Glu Ala
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Val Asn Leu Tyr Ala Asn Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser
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Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala
625 630 635 640
Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg
645 650 655
Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Ala Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly
660 665 670
Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly Thr Ile Pro Tyr Leu
675 680 685
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770 775 780
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<213> Equine adenovirus 2
<400> 72
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485 490 495
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565 570 575
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100 105 110
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500 505 510
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Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys
705 710 715 720
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725 730 735
Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu
740 745 750
Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val
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Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro
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<213> Ovine adenovirus 7
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Cys Leu Thr Leu Val Arg Lys Phe Trp Phe Glu Cys Met Gly Thr Pro
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<212> PRT
<213> Duck adenovirus A
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Ser Ser Asn Lys Tyr Gly Lys Gln Val Val Arg Ile Val Gln Glu Asn
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Tyr Gly Gly Gln Leu Ile Leu Gly Lys Gln Ile Pro Lys Met Thr Pro
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Tyr Thr Val Ser Gly Val Glu Asn Ile Ser Val Lys Asp Leu Asp Pro
260 265 270
Val Lys Ala Val Gly Val Lys Tyr Pro Ala Val Phe Val Phe Gln Cys
275 280 285
Cys Asn Phe Gln Gly Gln Lys Arg Ala Gly Asn Ala Lys Ser Cys Glu
290 295 300
Phe Lys Ile Ser Leu Pro Asp Leu Ile His Cys Leu Ile Thr Ala Arg
305 310 315 320
Asn Leu Trp Phe Glu Val Met Gly Glu Pro Met Pro Val Gln Phe Pro
325 330 335
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340 345 350
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Lys Arg Lys Arg Val Val Glu Ile Glu Ser Asp Glu Asp Glu Glu Glu
370 375 380
Asp Glu Asp
385
<210> 78
<211> 397
<212> PRT
<213> Snake adenovirus
<400> 78
Met Ser Leu Ser Lys Thr Lys Asn Pro Ala Leu Leu Ala Gly Pro Gly
1 5 10 15
Asp Glu Ala Lys Glu Lys Val Gln Ala Ala Leu Glu Leu Leu His Lys
20 25 30
Phe Gly Ser Ala Phe Lys Val Asp Thr Ala Gly Phe Ser Phe His Pro
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Glu Ser Pro Glu Cys Asp Lys Ile Phe Gly Ala Tyr Leu Lys Asn Val
50 55 60
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Asn Leu Lys Cys Tyr His Gly Glu Gly Met Cys Arg Lys Lys Asn Glu
115 120 125
Ile Glu Met Ala Ala Thr Ser Glu Ser Gly Val Ala Ala Leu Lys Glu
130 135 140
Gly Arg Gly Ala Val Glu Ile Asn Arg Trp Gly Arg Gln Val Val Lys
145 150 155 160
Ile Thr Gln Glu Asn Tyr Val Ile Cys Met Glu Asp Leu Gln Ser Arg
165 170 175
Phe Asn Gln Pro Ser Ala Asn Ser Cys Gly Leu Ser Phe Ser Asp Ser
180 185 190
Asp Lys Ala Arg Ser Ala Met Glu Asn Ala Thr Glu Leu Thr Arg Ser
195 200 205
Ile Phe Ser Gln Ala Lys Met Asp His Leu Leu Phe Met Pro Ile Cys
210 215 220
Cys Tyr Cys Asn Tyr Gly Gly Lys Met Ile Leu Gly Arg Gln Leu Cys
225 230 235 240
Lys Leu Thr Pro Phe Ser Ile Ser Gly Thr Glu Gly Leu Arg Glu Glu
245 250 255
Asp Val Ser Pro Val Gln Ala Val Ser Val Arg His Pro Ala Val Phe
260 265 270
Val Phe Gln Cys Cys Asn Ala Thr Gly Gly Ser Lys Gly Lys Thr Ser
275 280 285
Cys Asp Phe Lys Ile Ser His Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Asn Leu
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Val Arg Lys Met Trp Leu Glu Val Met Gly Tyr Pro Met Pro Ile His
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Phe Pro Arg Phe Lys Trp Ser Pro Ser Leu Arg Val Lys Asn Ala Leu
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Leu Pro Glu Gly Ser Val Asn Glu Asp Glu Asn Pro Phe Gly Leu Asp
340 345 350
Asn Ser Glu Asp Glu Glu Glu Val Val Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro
355 360 365
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370 375 380
Lys Lys Lys Ile Val Leu Glu Ser Ser Glu Glu Asp Glu
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<210> 79
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<212> PRT
<213> Fowl adenovirus 1
<400> 79
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1 5 10 15
Val Lys Arg Thr Ala Glu Val Met Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val
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Glu Val Val Ala Pro Gly Arg Gly Ala Thr Arg Lys Lys Val Ser Arg
35 40 45
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50 55 60
Thr Val Val Asp Asp Glu Glu Asn Ala Ser Asp Glu Glu Ser Pro Glu
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Ala Pro Leu Ser Asp Pro Val Val Tyr Gly Ala Gln Arg Ala Met Ala
85 90 95
Thr Val Ala Ser Ile Cys Glu Ala Leu Asp Leu Gln Trp Gln Gly Ala
100 105 110
Ser Val Arg Pro Asp Asp Ser Ile Trp Thr Lys Met Gly Gly Thr Tyr
115 120 125
Val Arg Lys Lys His Pro Glu Phe Arg Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
130 135 140
Ser Phe Asn Ala Gln Val Gly Arg Phe Leu Ala Ala Val Ile Tyr Ser
145 150 155 160
Arg Ala Gly Leu Glu Pro Lys Phe Val Pro Gly Gly Ala His Val Trp
165 170 175
Arg His Gly Trp Phe Pro Ala Leu Gln Glu Pro Phe Pro Lys Cys Met
180 185 190
His Gly Val Asp Met Val Thr Lys Pro Arg Thr Val Glu Leu Asn Pro
195 200 205
Ser Ser Glu Ala Gly Lys Arg Ala Leu Ala Glu Gln Asn Gly Val Ile
210 215 220
Glu Lys Asn Arg Phe Gly Arg Gln Val Val Val Leu Arg Phe Asp Ala
225 230 235 240
Asn Ala Val Cys Tyr Lys Asp Gln Glu His Ser Gly Phe Pro His Pro
245 250 255
His Ala His Gly Ser Cys Ala Met Val Phe Ser Asp Ala Ala Lys Ala
260 265 270
Val Ser Ala Met Arg His Asp Ile Asp Trp Thr Lys Ala Leu Tyr Pro
275 280 285
Asn Ala Asp Lys Arg Arg Ala Glu Glu Cys Val Leu Ile Ser Thr Asn
290 295 300
Cys Asn Cys Asn Tyr Ala Ser Asp Arg Ala Ile Ser Gly Arg Gln Phe
305 310 315 320
Cys Lys Met Thr Pro Tyr Lys Leu Asn Gly Thr Asp Asp Ile Thr Arg
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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<212> PRT
<213> Fowl adenovirus A
<400> 80
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Ser Asn Arg Gly Arg Ser Arg Pro Leu Pro Pro Gln Arg Pro Thr Gly
35 40 45
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115 120 125
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130 135 140
Pro Gly Arg Gly Ala Thr Arg Lys Lys Val Ser Arg Arg Glu Glu Ser
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Gly Lys Arg Ala Leu Ala Glu Gln Asn Gly Val Ile Glu Lys Asn Arg
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<212> PRT
<213> Fowl adenovirus 9
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Arg Phe Leu Ala Ala Met Val Tyr Gly Met Ala Glu Leu Glu Pro Lys
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<212> PRT
<213> Fowl adenovirus D
<400> 82
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Gly Asn Ala Met Phe Leu Lys Pro Arg Thr Val Glu Leu Asn Pro Thr
305 310 315 320
Ser Glu Ala Gly Lys Arg Ala Ile Ala Glu Gln Asn Gly Gln Ile Glu
325 330 335
Lys Asn Arg Phe Gly Lys Gln Val Val Val Leu Arg Phe Asp Arg Asn
340 345 350
Ala Val Cys Ser Arg Asp Ala Asp His Ser Gly Phe Pro Tyr Pro His
355 360 365
Val Ile Gly Ser Cys Gly Met Ala Phe Ser Asp Ala Ala Lys Ala Val
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Ser Ala Met Arg His Asp Leu Glu Trp Thr Lys Ala Leu Tyr Pro Asn
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Ala Glu Lys Arg Arg Ala Glu Glu His Ile Leu Ile Ser Thr Asn Cys
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420 425 430
Arg Met Ile Pro Tyr Lys Leu Ser Gly Thr Asp Asp Ile Ala Ser Asp
435 440 445
Thr Ala Arg Ser Arg Pro Asp Met Lys Ala His Lys Lys Tyr Pro His
450 455 460
Thr Met Val Tyr Thr Cys Cys Asn Pro Gln Ser Pro Ser Gly Thr Asp
465 470 475 480
Gly Pro Thr Ser Arg Ser Gly Arg Lys Thr Ser Asp Lys Thr Cys Ala
485 490 495
Trp Arg Leu Ser Ala Met Asp Leu Arg His Ala Tyr Val Phe Ala Thr
500 505 510
Glu Leu Val Leu Asn Ala Met Gly Val Gln Ala Pro Thr His Val Pro
515 520 525
Glu Phe Arg Trp His Glu Arg Phe Gly Phe Lys Thr Glu Val Ile Ala
530 535 540
Pro Val Lys Pro Val Glu Thr Gly Asp Pro Phe Ala
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<212> PRT
<213> Turkey adenovirus 3
<400> 83
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Ser Cys Gly Met Asn Phe Gly Asn Lys Glu Lys Ala Lys Ala Ala Phe
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Asn Gln Thr His Lys His Cys Asp Phe Lys Leu Ser Met Ile Asp Val
275 280 285
Arg Gln Ala Met Lys Ile Ser Lys Asp Ile Tyr Thr Lys Leu Lys Glu
290 295 300
Thr Ile Asp Asp Gly Ser Pro Thr Lys Ile Met Leu Pro Ala Phe Val
305 310 315 320
Phe Asn Pro Lys Lys His Ser Phe Lys Gln Ala Ile Val Ala Gln His
325 330 335
Glu Val Glu Ser Asp Asp Asp Ala Phe Cys
340 345
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<211> 380
<212> PRT
<213> Turkey adenovirus A
<400> 84
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<212> PRT
<213> Frog adenovirus 1
<400> 85
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<212> PRT
<213> Murine adenovirus 3
<400> 86
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1 5 10 15
Val Phe Gly Ser Arg Lys Gly Gly Met Lys Arg Leu Pro Pro Thr Glu
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Gly Ala Val Cys Asp Ser Pro Thr Asn Pro Glu Pro Gln Glu Glu Val
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Cys Thr Phe Leu Pro Asn Ala Gln Thr Ala Glu Leu Phe Arg Lys Leu
130 135 140
Cys His Ser Trp Leu Leu Gln Gln Lys Met Val Pro Ser Leu Thr Phe
145 150 155 160
Thr Thr Leu Arg Ser Phe Thr Met Gln Met Gly Arg Phe Val Leu Ala
165 170 175
Leu Leu Leu Gln Ala Ser Gly Leu Ser Pro Thr Glu Ala Ala Ala His
180 185 190
Ser Ile Ala Asn Val Ser Gly Val Ala Ala Trp Lys His Ala Ser Asp
195 200 205
Val Thr Leu His Cys Leu His Gly Ala Val Met Ile Ala Lys Asp His
210 215 220
His Val Asp Leu Asp Val Ser Ser Glu Gly Gly Gln Arg Ala Leu Lys
225 230 235 240
Glu Gln Gly Pro Asn Ala Val Val Thr Thr Asn Arg Trp Gly Arg Ser
245 250 255
Val Val Arg Val Lys Tyr Asp Ala Phe Val Cys Pro Met Asp Ala Gly
260 265 270
Val Pro Phe Asn Gln Pro Ser Asn Lys Ser Cys Gly Phe Cys Phe Thr
275 280 285
Asp Gly Lys Lys Ala Leu Lys Gly Phe Lys Gln Ile Val Ala Phe Gln
290 295 300
Ala Ala Leu Tyr Pro Gln Ala Ala Gly Gly Gly Glu Trp Met Leu Leu
305 310 315 320
Cys Leu Arg Cys Glu Cys Asn Phe Gly Val Ala Gln Pro Ile Leu Gly
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Leu Asp Gly Gly Asn Met Asp Ala Val Ala Lys Ala Ser Val Glu Asn
355 360 365
Pro Val Val Leu Val Ala Gln Cys Cys Asn Val Thr Phe Ser Lys Ala
370 375 380
Gly Lys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Lys Thr Cys Glu Trp Lys Ile
385 390 395 400
Ser Ser Val Asp Leu Val Thr Ala Ala Gln Leu Ala Lys Lys Met Ile
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His Lys Met Leu Asp Leu Pro Pro Ser Leu Phe Val Pro Glu Phe Lys
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Gly Asp Ser Asp Leu Gln Leu Phe Thr Thr Gly Gly Met
450 455 460
<210> 87
<211> 461
<212> PRT
<213> Murine adenovirus A
<400> 87
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1 5 10 15
Val Tyr Glu Thr Lys Arg Gly Gly Val Lys Arg Ser Ala Val Gly Glu
20 25 30
Ala Ser Thr Ala His Cys Gly Lys Lys Ser Arg Ala Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Arg Ser Ser Pro Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly Lys Phe Ala Asn Val
50 55 60
Ser Gly Gly Asp Arg Gly Ser Glu Asp Val Asn Met Glu Pro Glu Pro
65 70 75 80
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Val Phe Thr Glu Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Ala Cys Trp Gln
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Thr Ala Arg Glu Leu Leu His Lys Met Cys Leu Val Leu Lys Val Asp
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Gly Lys Gln Cys Thr Phe Leu Pro Asn Ala Gln Thr Ala Glu Leu Phe
130 135 140
Arg Lys Leu Ser His Ser Trp Leu Leu Gln Gln Lys Leu Val Pro Ser
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165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Gly Arg Ser Val Val Arg Val Thr Tyr Asp Ala Val Val Cys Ala Met
260 265 270
Asp Ala Ser Val Ala Phe Asn Gln Pro Thr Asn Lys Ser Cys Gly Phe
275 280 285
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435 440 445
Gly Asp Gly Asp Val Gln Leu Phe Val Thr Ala Lys Val
450 455 460
<210> 88
<211> 513
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 22
<400> 88
Met Ala Gly Arg Gly Gly Ser Gln Ser Glu Gln Arg Arg Gln Glu Arg
1 5 10 15
Thr Pro Glu Arg Gly Arg Gly Ser Ala Ser Arg Pro Pro Asn Arg Glu
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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275 280 285
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305 310 315 320
Val His Asp Ala Gly Cys Ala Thr Asn Gln Phe Ser Ser Lys Ser Cys
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<210> 89
<211> 512
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 24
<400> 89
Met Ala Gly Arg Gly Gly Ser Gln Ser Glu Gln Arg Arg Gln Glu Arg
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<212> PRT
<213> Simian adenovirus 23
<400> 90
Met Ala Gly Arg Gly Gly Ser Gln Ser Glu Gln Arg Arg Gln Glu Arg
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<211> 462
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 1
<400> 91
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1 5 10 15
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<211> 462
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 7
<400> 92
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Lys Ser Trp Glu Ser Thr Gly Cys Ala Val Trp Glu His Arg Asn Thr
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<210> 93
<211> 493
<212> PRT
<213> Cynomolgus adenovirus 1
<400> 93
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Lys Ile Cys His Thr Trp Leu Gln Glu Asp Leu Lys Tyr Cys Pro Leu
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Thr Phe Ser Thr Gln Lys Thr Phe Ser Ala Met Met Gly Arg Phe Leu
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Ser Trp Glu Pro Thr Gly Cys Val Val Trp Glu His Arg Cys Thr Glu
225 230 235 240
Gln Glu Gly Gln Leu Met Cys Leu His Gly Leu Pro Met Ile Ala Lys
245 250 255
Asp His Val Val Glu Met Asp Val Ser Ser Glu Ala Gly Gln Arg Ala
260 265 270
Leu Lys Glu Thr Pro Gln Leu Ala Lys Val Val Gln Asn Arg Trp Gly
275 280 285
Arg Asn Val Val Gln Leu Arg His Asp Asn Ala Arg Cys Cys Met Phe
290 295 300
Asp Ala Gln Cys Gly Thr Asn Val Phe Ser Gly Lys Ser Cys Gly Met
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325 330 335
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Ala Ser Leu Asn His Pro Ser Leu Leu Val Phe Gln Cys Ala Asn Pro
405 410 415
Ala Tyr Arg Asn Thr Arg Ala Thr Asn Gln Val Asn Cys Asp Phe Lys
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<210> 94
<211> 472
<212> PRT
<213> Bat adenovirus TJM
<400> 94
Met Ser His Val Ile Ser Ser Ser Ser Asp Glu Asp Ile Pro Val Pro
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Val Arg Lys Arg Gln Arg Lys Ser Lys Glu Asp Ala Lys Ala Arg Ala
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Asn Glu His Gln Trp Gln Leu Gly Met Glu Met Ala Leu Lys Ile Leu
130 135 140
Thr Ala Tyr Gln Val Asp His Lys Glu Leu Thr Leu Leu Pro Asp Ser
145 150 155 160
Gly Thr Leu Glu Cys Phe Lys Lys Ala Ala Gln Ala Tyr Leu Val Asn
165 170 175
Thr Lys Thr Val Val Thr Tyr Asn Phe Thr Thr Gln Lys Ser Phe Gln
180 185 190
His Met Val Gly Arg Ile Leu Leu Asp Phe Val Ile Lys Ala Ala Gly
195 200 205
Val Ala Pro Gly Leu Asn Pro Ser Gly Cys Val Val Trp Gln His Gly
210 215 220
Cys Gln Arg Gln Leu His Cys Leu His Gly Ser Pro Met Ile Gln Lys
225 230 235 240
Glu Gln Leu Ile Glu Met Asp Val Asn Ser Glu Asn Ala Gln Arg Val
245 250 255
Leu Lys Glu Asn Pro Glu Lys Thr Lys Ile Val Thr Asn Arg Trp Gly
260 265 270
Arg Asn Val Val Gln Met Lys Asn Glu Asp Ala Tyr Cys Cys Phe Met
275 280 285
Asp Val Asn Ile Ser Gly Gly Asn Phe Ser Ser Ser Ser Cys Gly Met
290 295 300
Ser Tyr Thr Asp Gly Pro Lys Ala Leu Met Ala Phe Gln Gln Ile Met
305 310 315 320
Ala Phe Gln Arg Ala Cys Tyr Pro Gln Met Ser Thr Ala Glu Ser His
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Thr Leu Asp His Pro Ala Met Leu Val Phe Gln Cys Cys Asn Pro Val
385 390 395 400
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Ser Thr Cys Ile Gly Thr Pro Pro Pro Leu Lys Phe Pro Glu Phe Lys
435 440 445
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450 455 460
Glu Asp Asn Asp Val Ser Leu Phe
465 470
<210> 95
<211> 454
<212> PRT
<213> Canine adenovirus 1
<400> 95
Met Ser His Lys Lys Val Val Ala Ile Ser Glu Ser Ser Ser Asp Glu
1 5 10 15
Glu Val Pro Val Ala Pro Pro Thr Ala Pro Pro Lys Lys Arg Gln Arg
20 25 30
Lys Ala Val Glu Glu Pro Arg Gly His Gln Ala Met Val Glu Ile Ala
35 40 45
Arg Gln Ala Thr Ala Ala Leu Lys Ala Arg Gly Asp Pro Gly Ser Ile
50 55 60
Ile Val Gln Thr Phe Cys Asp Gln Thr Val Asp Val Asp Lys Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Ile Phe Thr Pro Ala Lys Gln Lys Ser Ile Cys Asn Lys Ser
85 90 95
Gly Ser Pro Leu Ala Ser Val Ala Ser Lys Ile Phe Lys Ala Ser Glu
100 105 110
His Lys Trp Gln Ser Ala Met Glu Phe Ala Leu Lys Val Leu Asn Ala
115 120 125
Tyr Gln Val Asp His Ser Lys Leu Thr Leu Leu Pro Asp Glu Gly Thr
130 135 140
Leu Glu Cys Phe Lys Lys Ala Val Gln Ala Tyr Ile Thr Thr Ser Lys
145 150 155 160
Met His Val Thr Tyr Thr Phe Thr Asn Gln Lys Thr Phe Leu His Val
165 170 175
Ala Gly Arg Leu Leu Leu Asp Phe Val Ile Lys Ala Ala Glu Leu Ala
180 185 190
Pro Gly Val Asn Pro Ser Gly Cys Val Val Trp Gln His Gly Cys Gln
195 200 205
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Leu Val Glu Met Asp Val Asn Ser Glu Asn Ala Gln Arg Ala Leu Lys
225 230 235 240
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245 250 255
Val Val Gln Phe Lys Asn Glu Asp Ala Phe Cys Cys Ser Met Asp Val
260 265 270
Asn Met Ser Gly Gly Asn Phe Ser Gly Ala Ser Cys Gly Met Phe Tyr
275 280 285
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355 360 365
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Asn Ser Lys Ala Ala Pro Gln Lys Asn Cys Asp Phe Lys Ile Ser Ser
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450
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<211> 454
<212> PRT
<213> Canine adenovirus 2
<400> 96
Met Ser His Lys Lys Val Val Ala Ile Ser Glu Ser Ser Ser Asp Glu
1 5 10 15
Glu Val Pro Val Ala Pro Pro Thr Ala Pro Pro Lys Lys Arg Gln Arg
20 25 30
Lys Ala Val Glu Glu Pro Arg Gly His Gln Ala Met Val Glu Ile Ala
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Val Val Phe Ile Pro Pro Lys Gln Lys Ser Val Trp Ser Lys Pro
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Asn Ala Pro Ser Gly Leu Val Ala Ser Lys Phe Phe Lys Ala Ser Glu
100 105 110
His Lys Trp Gln Ser Ala Met Glu Leu Ala Leu Lys Val Leu Thr Ala
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Leu Val Glu Met Asp Val Asn Ser Glu Asn Ala Gln Arg Ala Leu Lys
225 230 235 240
Glu Asn Pro Glu Lys Thr Lys Ile Val Ser Asn Arg Trp Gly Arg Asn
245 250 255
Val Val Gln Phe Lys Asn Glu Asp Ala Phe Cys Cys Ser Met Asp Val
260 265 270
Asn Met Ser Gly Gly Asn Phe Ser Gly Ala Ser Cys Gly Met Phe Tyr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
His Ile Asp Lys Ser Glu Val Asp Asp Gln Lys Met Leu Ala Thr Leu
355 360 365
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435 440 445
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<212> PRT
<213> Bovine adenovirus 10
<400> 97
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Met Asp Glu Asn Val Ala Lys Lys Ala Arg Lys Arg Pro Leu Ser Val
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35 40 45
Ser Val Gly Phe Ser Asn Pro Pro Cys Lys Leu Gly Pro Lys Gln Ile
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Leu Val Pro Asp Ala Tyr Lys Phe Arg Asn Phe Arg Lys Ala Met Pro
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Ser Leu Phe
435
<210> 98
<211> 441
<212> PRT
<213> Porcine adenovirus 5
<400> 98
Met Arg Phe Val Thr Phe Phe Ser Ile Leu His Leu Glu Lys Met Ser
1 5 10 15
Arg Asn His Tyr Glu Asp Val Ser Asp Ser Ser Ala Asp Asp Glu Pro
20 25 30
Arg Leu Val Ile Asp Asp Gln Pro Lys Pro Lys Lys Ile Ala Arg Arg
35 40 45
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50 55 60
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Thr Pro Ser Thr Ser Val Lys Ser Ser Lys Leu Leu Leu Asp Arg Asn
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115 120 125
Thr Met Glu Cys Phe Lys Lys Ala Ala Gln Ala Trp Met Ser Asp Arg
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210 215 220
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325 330 335
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340 345 350
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435 440
<210> 99
<211> 442
<212> PRT
<213> Ovine adenovirus A
<400> 99
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1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
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Gly Arg Ser Val Val Gln Met Lys Asn Ala Asp Ala Met Cys Cys Phe
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Tyr Asp Leu Lys Ser Ser Leu Asn Ser Phe Ser Ser Glu Ser Cys Gly
260 265 270
Tyr Phe Tyr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Arg Gln Gly Phe Tyr Gln Ile
275 280 285
Arg Asp Phe Val Lys Ala Met Tyr Pro Gln Met Pro Lys Ala Gly Glu
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Met Leu Leu Met Pro Leu Val Cys Glu Cys Asn Tyr Gly His His Val
305 310 315 320
Ile Pro Leu Leu Gly Lys Gln Thr Cys Lys Val Thr Pro Phe Ala Leu
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Asn Ala Val Ser Asn Ile Asp Arg Ser Leu Val Glu Asp Ala Lys Val
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Leu Ala Thr Leu Asn Asn Pro Val Val Leu Val Phe Gln Cys Cys Asn
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Met Trp Ser Ser Leu Thr Gly Thr Lys Ala Ser Ile Val Val Gln Glu
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Gly Gln Asp Asp Ala Asp Glu Cys Leu Phe
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<210> 100
<211> 457
<212> PRT
<213> Porcine adenovirus 3
<400> 100
Met Ser Arg Arg Tyr Ser Asp Val Ser Asp Tyr Asp Ser Gly Glu Glu
1 5 10 15
Gly Val Leu Ile Val Asp Asp Ala Pro Val Ala Thr Pro Ser Arg Arg
20 25 30
Gly Gly Gly Arg Lys Arg Ala Ala Ser Pro Pro Val Gln Glu Arg Arg
35 40 45
Lys Arg Ala Arg Ala Lys Pro Leu Val Ser Glu Glu Glu Glu Asp Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Gly Glu Glu Glu Glu Gly Ala Arg Pro Pro Arg Pro Val Thr
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Pro Ser Pro Ala Val Ala Arg Pro Leu Leu Gln Leu Asp Ala Gln Glu
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115 120 125
Leu Lys Val Asp Val Lys Gly Leu Thr Leu Leu Pro Asp Gly Ser Thr
130 135 140
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Ile Ser Cys Gln Leu Thr Phe Ser Thr Gln Lys Ser Leu Leu Thr Val
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Met Ala Arg Phe Leu Leu Asp Phe Val Val Lys Ala Ala Gly Leu Lys
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Arg Glu Thr Pro Glu Arg Ala Lys Ile Thr Thr Asn Arg Trp Gly
245 250 255
Arg Asn Val Val Gln Leu Arg Asn Asp Gly Ala Met Cys Cys Ser His
260 265 270
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275 280 285
Phe Tyr Ser Glu Gly Ser Lys Ala Gln Gln Ala Phe Glu Gln Leu Lys
290 295 300
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305 310 315 320
Leu Leu Met Pro Leu Val Cys Asp Cys Gly Trp Gly Cys Arg Gln Val
325 330 335
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340 345 350
Gly Ser Ala Ala Leu Asn Pro Gln Leu Val Glu Asp Pro Lys Ile Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Ile Ser Ala Pro Asp Val Met Leu Ala Leu Gln Leu Thr Lys Gln Met
405 410 415
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Lys Trp Gly Pro Gln Phe Gln Val Gln Asn Thr Ile Phe Pro Val Gly
435 440 445
Thr Glu Asp Asp Asp Glu Ser Leu Phe
450 455
<210> 101
<211> 432
<212> PRT
<213> Bovine adenovirus B
<400> 101
Met Asn Arg Ser Gly Asp Leu Thr Arg Ala Thr Ser Ser Ala Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gly Asp Glu Asn Pro Leu Val Ile Asp Glu Thr Pro Arg Lys Lys
20 25 30
Val Ser Arg Lys Arg Arg Ala Pro Ile Ala Glu Pro Pro Ala Glu Asp
35 40 45
Val Thr Ala Val Lys Arg Ala Lys Ile Phe Lys Pro Ser Ala Pro Ala
50 55 60
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Glu Ala Asp Glu Val Ala Trp Gln Arg Ala Met Glu Leu Ala Val Gly
85 90 95
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Val Leu Thr Ile Met Gly Arg Phe Leu Tyr Asp Phe Val Leu Lys Val
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Ala Gly Leu Gly Thr Thr Ser Trp Ser Pro Thr Gly Cys Val Val Trp
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Ile Thr Thr Asn Arg Trp Asn Met Asn Val Val Gln Leu Lys Asn Glu
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Asp Ala Ala Cys Cys His Phe Asp Ala Ala Leu Pro Ala Gly Ser Phe
245 250 255
Thr Ser Lys Ser Cys Gly Met Phe Phe Ser Glu Gly Pro Lys Ala Leu
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275 280 285
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Ile Thr Pro Phe Asn Ile Asn Ala Gly Ser Ala Val Asp Lys Ser Leu
325 330 335
Val Glu Asp Pro Lys Leu Leu Ala Ser Val Glu His Pro Ser Val Leu
340 345 350
Val Phe Gln Cys Cys Asn Pro Val Tyr Arg Gln Thr Arg Ala Asn Ala
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Gln Arg Asn Cys Asp Phe Lys Ile Ser Ala Pro Asp Met Ile Ser Ala
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<210> 102
<211> 467
<212> PRT
<213> Tree shrew adenovirus
<400> 102
Met Ser Asp Arg His Asp Tyr Ser Ser Asp Ser Ser Ser Asp Met Ile
1 5 10 15
Ile Cys Glu Asn Glu Pro Ala Pro Lys Glu Thr Gln Gly Pro Ser Val
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Met Arg Val Gly Phe Ser Asn Pro Pro Val Glu Ile Ile Arg Ser Gly
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Leu Pro Ser Leu Asp Gln Leu Met Lys Gly Glu Pro Ala Asp Glu Ser
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Ser Gln Asp Ser Thr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Arg Pro Ser Thr Ser
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Lys Leu Val Ser Ser Asp Glu Thr Lys Trp Gln Met Val Met Asp Met
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Ala Val Asn Met Leu Thr Pro Leu Lys Val Asp Leu Lys Asp Leu Thr
130 135 140
Met Leu Ala Asp Gln Gly Thr Leu Glu Cys Phe Gln Lys Ala Ala Gln
145 150 155 160
Ala Trp Met Thr Glu Arg Lys Ile Tyr Thr Pro Leu Thr Tyr Ser Thr
165 170 175
Gln Lys Thr Leu Leu Ser Leu Met Gly Arg Phe Leu Phe His Phe Ile
180 185 190
Met Thr Lys Val Gly Glu Ser Asp His Gly Gly Lys Ala Trp Pro Lys
195 200 205
Asn Thr Asn Val Ser Gly Ala Val Val Trp Lys His Gln Ser Gly Ala
210 215 220
Thr Leu Ser Cys Leu His Gly Leu Thr Met Leu Asn Lys Glu Gln Ile
225 230 235 240
Val Glu Met Asp Val Ser Ser Glu Asn Gly Gln Arg Ala Leu Lys Glu
245 250 255
Thr Pro Glu Lys Thr Lys Ile Thr Thr Asn Arg Trp Gly Arg Asn Val
260 265 270
Val Gln Val Arg Asn Glu Asp Ala Met Cys Cys Gln Phe Asp Ala Pro
275 280 285
Leu Pro Ala Asn Asn Phe Ser Thr Lys Ser Cys Gly Met Phe Tyr Ser
290 295 300
Glu Gly Glu Lys Ala Lys Thr Ala Phe Lys Gln Ile Met Ala Leu Gln
305 310 315 320
Arg Ala Cys Tyr Pro Lys Met Asp Gly Glu Gln Ile Val Ile Pro Ile
325 330 335
Lys Cys Asp Cys Asn Trp Ala Ser Thr Thr Pro Leu Leu Gly Arg Gln
340 345 350
Val Cys Lys Val Thr Pro Phe Thr Ile Ser Ala Thr Glu Ser Ile Asp
355 360 365
Arg Glu Leu Val Gln Asp Pro Lys Ile Leu Ala Thr Val His Asn Pro
370 375 380
Ala Val Leu Val Phe Gln Cys Cys Asn Pro Val Tyr Arg Asn Ser Arg
385 390 395 400
Ala Asn Pro Gln Lys Asn Cys Asp Trp Lys Ile Ser Ala Pro Asp Val
405 410 415
Met Thr Ala Leu Gln Leu Ala Lys Gln Met Trp Gln His Val Phe Lys
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435 440 445
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450 455 460
Ser Leu Phe
465
<210> 103
<211> 529
<212> PRT
<213> Human adenovirus 5
<400> 103
Met Ala Ser Arg Glu Glu Glu Gln Arg Glu Thr Thr Pro Glu Arg Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ala Ala Arg Arg Pro Pro Thr Met Glu Asp Val Ser Ser Pro
20 25 30
Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Arg Ala Pro Pro Lys Lys Arg Met Arg
35 40 45
Arg Arg Ile Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Ser Ser Gln Asp Ala Leu
50 55 60
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Asp Val Ala Leu Gln Met Val Gly Phe Ser Asn Pro Pro Val Leu Ile
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Ser Glu Ala Glu Ser Glu Ile Thr Val Met Asn Pro Leu Ser Val Pro
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Asp Lys Tyr His Val Asp Asn Asp Leu Lys Ala Asn Phe Lys Leu Leu
195 200 205
Pro Asp Gln Val Glu Ala Leu Ala Ala Val Cys Lys Thr Trp Leu Asn
210 215 220
Glu Glu His Arg Gly Leu Gln Leu Thr Phe Thr Ser Asn Lys Thr Phe
225 230 235 240
Val Thr Met Met Gly Arg Phe Leu Gln Ala Tyr Leu Gln Ser Phe Ala
245 250 255
Glu Val Thr Tyr Lys His His Glu Pro Thr Gly Cys Ala Leu Trp Leu
260 265 270
His Arg Cys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Leu Lys Cys Leu His Gly Ser
275 280 285
Ile Met Ile Asn Lys Glu His Val Ile Glu Met Asp Val Thr Ser Glu
290 295 300
Asn Gly Gln Arg Ala Leu Lys Glu Gln Ser Ser Lys Ala Lys Ile Val
305 310 315 320
Lys Asn Arg Trp Gly Arg Asn Val Val Gln Ile Ser Asn Thr Asp Ala
325 330 335
Arg Cys Cys Val His Asp Ala Ala Cys Pro Ala Asn Gln Phe Ser Gly
340 345 350
Lys Ser Cys Gly Met Phe Phe Ser Glu Gly Ala Lys Ala Gln Val Ala
355 360 365
Phe Lys Gln Ile Lys Ala Phe Met Gln Ala Leu Tyr Pro Asn Ala Gln
370 375 380
Thr Gly His Gly His Leu Leu Met Pro Leu Arg Cys Glu Cys Asn Ser
385 390 395 400
Lys Pro Gly His Ala Pro Phe Leu Gly Arg Gln Leu Pro Lys Leu Thr
405 410 415
Pro Phe Ala Leu Ser Asn Ala Glu Asp Leu Asp Ala Asp Leu Ile Ser
420 425 430
Asp Lys Ser Val Leu Ala Ser Val His His Pro Ala Leu Ile Val Phe
435 440 445
Gln Cys Cys Asn Pro Val Tyr Arg Asn Ser Arg Ala Gln Gly Gly Gly
450 455 460
Pro Asn Cys Asp Phe Lys Ile Ser Ala Pro Asp Leu Leu Asn Ala Leu
465 470 475 480
Val Met Val Arg Ser Leu Trp Ser Glu Asn Phe Thr Glu Leu Pro Arg
485 490 495
Met Val Val Pro Glu Phe Lys Trp Ser Thr Lys His Gln Tyr Arg Asn
500 505 510
Val Ser Leu Pro Val Ala His Ser Asp Ala Arg Gln Asn Pro Phe Asp
515 520 525
Phe
<210> 104
<211> 215
<212> PRT
<213> Murine adenovirus 1
<400> 104
Met Ser Ala Pro Ser Pro Tyr Val Trp Thr Phe Gln Pro Gln Arg Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Ile Asn Trp Leu
20 25 30
Ser Ala Gly Pro Glu Leu Arg Gly Lys Val Val Gln Leu Asn Glu Ala
35 40 45
Arg Asn Ala Ile Leu Met Lys Glu Gln Glu Ser Val Pro Thr Pro Arg
50 55 60
Ala Glu Ala Asn Pro Ser Phe Trp Pro Ala Ala Leu Ile Phe Gln Pro
65 70 75 80
Arg Pro Gln Ala Ile Pro Val His Pro Ala His Pro Asp Thr Phe Asp
85 90 95
Ala Ala Leu Thr Ser Asn Gly Ala Gln Leu Ala Gly Gly Ala Trp Ile
100 105 110
Asn Tyr Lys Asn Gly Ser Val Arg Tyr Glu Ala Pro Leu Gln Leu Ala
115 120 125
Glu Glu Gln Val Gly Gly Pro Leu Asn Ala Phe Ala Ile Lys His Gln
130 135 140
Leu Gln Leu Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ala Ser Met Ser Glu Met Ser
145 150 155 160
Gly Ala Pro Arg Ile Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Ser Trp Gln Phe
165 170 175
Ser Arg Glu Phe Pro Pro Thr Val Tyr Leu Asn Pro Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Pro Asp Thr Phe Pro His Gln Phe Leu Ser Asn Tyr Asp Ser Phe Ser
195 200 205
His Thr Val Asp Gly Tyr Asp
210 215
<210> 105
<211> 218
<212> PRT
<213> Murine adenovirus 3
<400> 105
Met Ser Ala Pro Ser Pro Tyr Met Trp Thr Phe Gln Pro Gln Arg Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Leu Asn Trp Leu
20 25 30
Ser Ala Gly Pro Ser Leu Arg Gly Lys Val Ile Glu Val Asn Gln Ala
35 40 45
Arg Asn Ser Ile Leu Leu Asn Gln Gln Glu Ala Val Pro Thr Pro Arg
50 55 60
Arg Asp Ile Asn Pro Pro Ser Trp Pro Ala Ser Leu Ile Phe His Pro
65 70 75 80
Arg Pro Lys Pro Ile Ala Val Leu Pro Ala His Pro Asp Ser Phe Asp
85 90 95
Pro Asn Val Thr Leu Glu Gly Ala Gln Leu Ala Gly Gly Ala Trp Val
100 105 110
Arg Tyr Lys Ser Gly Asn Glu Val Arg Tyr Thr Ala Pro Ile Gln Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Pro Thr Ser Arg Thr Pro Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Gln
130 135 140
Glu Leu Gln Leu Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Pro Pro Leu Met Gly
145 150 155 160
Glu Leu Ala Gly Ala Pro Arg Val Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Ser
165 170 175
Trp Gln Phe Thr Gln Glu Phe Pro Pro Thr Val Tyr Leu Asn Pro Tyr
180 185 190
Ser Gly Ala Pro Asp Thr Phe Pro His Gln Phe Leu Ser Asn Tyr Asp
195 200 205
Ser Val Ser Gln Ser Val Asn Gly Tyr Asp
210 215
<210> 106
<211> 217
<212> PRT
<213> Ovine adenovirus 7
<400> 106
Met Ala Gln Pro Val Thr Pro Tyr Val Trp Lys Tyr Gln Pro Glu Thr
1 5 10 15
Gly Tyr Thr Ala Gly Ala His Gln Asn Tyr Asn Thr Val Ile Asn Trp
20 25 30
Leu His Ala Asn Pro Gln Met Phe Ala Arg Ile Gln His Ile Asn Thr
35 40 45
Ala Arg Asn Val Met Asp Lys Phe Arg Ser Asp Leu Thr Arg Asp Asp
50 55 60
Ile Ala Val Asn Ile Asn Asn Trp Pro Ala Glu Asp Leu Met Gln Pro
65 70 75 80
Pro Asn Phe Pro Tyr Ile Pro Ala Thr Ser Lys Ser Ala Ser Thr Ile
85 90 95
Asn Asp Trp Leu Ala Thr Thr Gln Gly Ile Gln Leu Ser Gly Thr Ser
100 105 110
Glu Leu Asn Gly Trp Gly Ser Asn Arg Leu Thr Ser Tyr Pro Asp Ile
115 120 125
Pro Pro Ile Leu Lys Tyr Glu Arg Pro Gly Gln Gln Leu Gln Gly Gln
130 135 140
Gly Leu Phe Lys Gln Glu Asn Ile His Leu Phe Tyr Glu Ser Pro Arg
145 150 155 160
Leu Pro Arg Ser Gly Gly Leu Thr Pro Gln Gln Phe Val Lys Glu Phe
165 170 175
Pro Pro Val Val Tyr Asn Asn Pro Phe Ser Glu Ser Met Ser Val Phe
180 185 190
Pro Lys Glu Phe Ser Pro Leu Phe Asn Pro Ser Glu Ser Leu Lys Lys
195 200 205
Thr Ser Ser Gln Thr Leu Gln Tyr Lys
210 215
<210> 107
<211> 217
<212> PRT
<213> Ovine adenovirus D
<400> 107
Met Ala Gln Pro Val Thr Pro Tyr Val Trp Lys Tyr Gln Pro Glu Thr
1 5 10 15
Gly Tyr Thr Ala Gly Ala His Gln Asn Tyr Asn Thr Val Ile Asn Trp
20 25 30
Leu His Ala Asn Pro Gln Met Phe Ala Arg Ile Gln His Ile Asn Thr
35 40 45
Ala Arg Asn Val Met Asp Lys Phe Arg Ser Asp Leu Thr Arg Asp Asp
50 55 60
Ile Ala Val Asn Ile Asn Asn Trp Pro Ala Glu Asp Leu Met Gln Pro
65 70 75 80
Pro Asn Phe Pro Tyr Ile Pro Ala Thr Ser Lys Ser Ala Ser Thr Ile
85 90 95
Asn Asp Trp Leu Ala Thr Thr Gln Gly Ile Gln Leu Ser Gly Thr Ser
100 105 110
Glu Leu Asn Gly Trp Gly Ser Asn Arg Leu Thr Ser Tyr Pro Asp Ile
115 120 125
Pro Pro Ile Leu Lys Tyr Glu Arg Pro Gly Gln Gln Leu Gln Gly Gln
130 135 140
Gly Leu Phe Lys Gln Glu Asn Ile His Leu Phe Tyr Glu Ser Pro Arg
145 150 155 160
Leu Pro Arg Ser Gly Gly Leu Thr Pro Gln Gln Phe Val Lys Glu Phe
165 170 175
Pro Pro Val Val Tyr Asn Asn Pro Phe Ser Glu Ser Met Ser Val Phe
180 185 190
Pro Lys Glu Phe Ser Pro Leu Phe Asn Pro Ser Glu Ser Leu Lys Lys
195 200 205
Thr Ser Ser Gln Thr Leu Gln Tyr Lys
210 215
<210> 108
<211> 222
<212> PRT
<213> Bovine adenovirus 4
<400> 108
Met Gln Pro Val Thr Pro Tyr Ile Trp Lys Tyr Gln Pro Glu Thr Gly
1 5 10 15
His Thr Ala Gly Ala His Gln Asp Tyr Gly Ser Val Ile Asn Trp Leu
20 25 30
Gln Ser Asn Pro Gln Met Phe Asn Arg Ile Arg Asp Ile Asn Leu Gln
35 40 45
Arg Asn Asn Ile Asp Gln Thr Gln Gly Leu Met Thr Arg Asp Asp Leu
50 55 60
His Ser Asn Ile Asn Asn Trp Pro Ala Ser Gln Val Leu Gln Arg Gln
65 70 75 80
Gly Phe Pro Tyr Val Pro Ala Lys Met Asn Leu Glu Ala Ser Lys Gln
85 90 95
Asp Phe Ile Asp Ser Ala Arg Gly Ile Gln Leu Ser Gly Pro Asn Pro
100 105 110
Val Phe Thr Gly Thr Gly Ser Asn Asn Leu Thr Ser Tyr Pro Met Leu
115 120 125
Thr Glu Asn Ile Pro Pro Leu Met Leu Tyr His Arg Pro Gly Gln Gln
130 135 140
Leu Gln Gly Met Gly Thr Ile Ser Lys Glu Asn Phe His Leu Leu Glu
145 150 155 160
Glu Val Ser Arg Val Pro Arg Ser Gly Gly Leu Thr Pro Thr Glu Phe
165 170 175
Leu Thr Gln Phe Pro Pro Ile Val Tyr Arg His Pro Phe Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Ile Tyr Phe Pro Lys Glu Phe Asp Pro Leu Phe Ser Pro His Asn
195 200 205
Asp Pro Arg Leu Thr Ser Ser Lys Thr Leu Gln Tyr Val Pro
210 215 220
<210> 109
<211> 250
<212> PRT
<213> Duck adenovirus 1
<400> 109
Met Gln Pro Val Thr Pro Tyr Leu Trp Arg Tyr Gln Pro Glu Thr Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Gly Ala Arg Gln Asp Tyr Gly Ala Val Ile Asn Trp Phe
20 25 30
Asn Ser Gly Pro Asp Leu Tyr Arg Arg Ile Arg Asp Val Asn Ile Thr
35 40 45
Arg Asn Asn Val Glu Gln Thr Arg Ala Leu Ala Arg Thr Pro Leu Ser
50 55 60
Gly Asn Phe Asn Arg Trp Thr Ala Ala Gln Leu Thr His Pro Pro Gly
65 70 75 80
Thr Arg Tyr Lys Pro Tyr Phe Pro Val Asp Ser Ile Lys Gly Ala Arg
85 90 95
Asp Arg Val Ala Thr Gln Gln Gly Gln Ile Leu Ala Gly Ala Gly Tyr
100 105 110
Asp Leu His Asp Gly Arg Gln Tyr Arg Lys Ile Thr Arg Asp Ala Leu
115 120 125
Pro Phe Pro His Asn Trp Gln Val Lys Asp Gly Ser Arg Trp Val Asn
130 135 140
Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Ser Leu Thr Thr Tyr Pro Val Ile Ala
145 150 155 160
Asp Ile Pro Pro Ile Met Arg Tyr Gly Arg Pro Gly Gln Gln Leu Gln
165 170 175
Gly Ser Gly Phe His Arg Pro Ser Pro Ala Leu Leu Thr Glu Glu Ala
180 185 190
Arg Val Pro Arg Ser His Gly Met Thr Val Arg Gln Phe Val His Glu
195 200 205
Phe Pro Pro Val Val Phe Asn His Pro Phe Ser Glu Asp Ile Thr Tyr
210 215 220
Phe Pro Lys Glu Phe Asn Pro Leu Phe Asn Pro Ser Glu Asp Tyr Arg
225 230 235 240
Val Ser Ser Asp Arg Thr Leu Gln Tyr Val
245 250
<210> 110
<211> 278
<212> PRT
<213> Snake adenovirus
<400> 110
Met Glu Ala Pro Val Thr Pro Tyr Ile Trp Gln Tyr Gln Pro Glu Thr
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ala Gly Ala Arg Gln Asn Tyr Gly Ala Val Ile Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Ser Asp Asn Asn Met Tyr His Arg Val Gln Glu Val Asn Arg
35 40 45
Gln Arg Asn Lys Ile Asp Asp Phe Arg Glu Gln Thr Val Arg Ala Asp
50 55 60
Met Ala His Ser Phe Asn Asp Trp Lys Pro Gln Gln Leu Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Pro Ala Pro Asn Pro Ile Ala Gly Pro Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Asp Val Ile Phe Thr Ala Glu Gly Glu Gln Leu Ala Gly
100 105 110
Ala Ser Pro Ser Leu Leu Ser Gly Gly Ala Ser Leu Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Tyr Arg Leu Gly Asp Gly Arg Glu Tyr Arg Lys Phe Thr Arg Asp Ala
130 135 140
Met Pro Phe Pro His Asn Trp Leu Val Lys Glu Asn Gly Val Trp Val
145 150 155 160
Pro Val Glu Glu Arg Asp Pro Leu Leu Ser Glu Glu Gly Arg Asn Ala
165 170 175
Leu Ser Ser Tyr Pro Thr Leu Thr Tyr Ala Gln Pro Pro Ile Leu Arg
180 185 190
Tyr Arg Arg Leu Gly Gln Gln Leu Gln Gly Gly Gly Val Val Ala Pro
195 200 205
Ser Ser Arg Val Val Ser Leu Leu Thr Glu Gln Pro Arg Met Pro Arg
210 215 220
Thr Glu Gly Met Thr Pro Tyr Gln Phe Ser Ala Glu Phe Pro Pro Val
225 230 235 240
Val Tyr Asp His Pro Phe Ser Arg Asn Leu Thr Leu Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Phe Ser Pro Leu Phe Asp Pro Lys Asp Gln Val Leu Ala Thr Ser Leu
260 265 270
Ala Thr Leu Gln Tyr Arg
275
<210> 111
<211> 246
<212> PRT
<213> Fowl adenovirus 10
<400> 111
Met Asn Leu Leu Asn Ala Ala Pro Thr Pro Tyr Val Trp Lys Tyr Asn
1 5 10 15
Pro Val Thr Gly Lys Cys Ala Gly Ala Asn Arg Thr Thr Ala His Tyr
20 25 30
Arg Leu Val Leu Pro Gly Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Ala Ala Asp Glu
35 40 45
Ile Arg Arg Arg Phe Pro Glu Pro Ala Val Thr Arg Ala Ile Thr Ala
50 55 60
Arg Phe Glu Ala Glu Ser Asp Gln Gln Pro Tyr Ala Gly Pro His Glu
65 70 75 80
Thr Asn Ile Ile Thr Ala Asp Val Val Arg Ser Gly Pro Pro Pro Ser
85 90 95
Ala Val Tyr Pro Phe Asp Pro Ser Gly Val Gln Arg Val Gln Leu Ser
100 105 110
Gly Gly Met Met Gly Gly Arg Thr Glu Gly Arg Val Gln Leu Ser Gly
115 120 125
Gly Leu Thr Glu Gly Arg Met Gln Leu Ala Gly Gly Ala Ala Gly Lys
130 135 140
Leu Pro Thr Arg Ala Arg Pro Thr Leu Arg Pro Pro Arg Trp Cys Gly
145 150 155 160
Thr Thr Leu Thr Gly Asn Gly Leu Pro Ala Asp Tyr Pro Glu Met Thr
165 170 175
Pro Asp Ala Phe Lys Tyr Tyr Leu Arg Val Gln Gly Pro Ser Gln Glu
180 185 190
Val Asp Glu Pro Gly Val Met Ser Gln Arg Gln Phe Met Thr Thr Phe
195 200 205
Leu Pro Ala Met Val Pro His Pro Phe Asp Ser Glu Ser Pro Asp Ala
210 215 220
Phe Pro Ala Tyr Phe Ser Ser Val Tyr Lys Gly Thr Asn Gly Phe Glu
225 230 235 240
Pro Val Phe Trp Gln Gly
245
<210> 112
<211> 244
<212> PRT
<213> Fowl adenovirus 8
<400> 112
Met Asn Leu Leu Glu Ala Thr Pro Thr Glu Tyr Val Trp Lys Tyr Asn
1 5 10 15
Pro Leu Ser Gly Ile Pro Ala Gly Ala Gln Gln Asn Tyr Gly Ala Thr
20 25 30
Ile Asn Trp Val Val Pro Gly Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Ala Ala Asp
35 40 45
Glu Ile Arg Arg His Thr Leu Ser Pro Ala Ala Thr Arg Ala Ile Thr
50 55 60
Glu Arg Phe Glu Ala Glu Ser Asp Gln Gln Pro Phe Ala Asn Ala Arg
65 70 75 80
Glu Thr Ala Tyr Ile Thr Ala Asn Val Leu Asp Ser Gly Phe Pro Lys
85 90 95
Ser Ala Val Tyr Pro Val Asp Pro Ser Gly Val Gln Arg Val Gln Leu
100 105 110
Ser Gly Gly Ala Glu Gly Arg Met Gln Leu Ala Gly Gly Leu Thr Glu
115 120 125
Gly Arg Val Gln Leu Ser Gly Gly Val Leu Gly His Val Val Pro Pro
130 135 140
Gly Gly Arg Arg Arg Ala Gly Gly Arg Pro Pro Arg Trp Cys Gly Thr
145 150 155 160
Ala Leu Ala Gly Asn Gly Leu Pro Glu Asp Ala Glu Val Val Ser Asp
165 170 175
Thr Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Thr Gln Gly Pro Ser Gln Val Val Gln
180 185 190
Glu Pro Gly Val Tyr Ser Arg Arg Gln Phe Met Thr Thr Phe Leu Pro
195 200 205
Ala Val Val Pro Arg Pro Phe Ser Ser Pro Asn Pro Arg Asp Phe Pro
210 215 220
Ala Gln Tyr Ser Ala Ile Tyr Lys Gly Thr Asn Ala Tyr Glu Asp Val
225 230 235 240
Phe Trp Asp Trp
<210> 113
<211> 241
<212> PRT
<213> Fowl adenovirus 9
<400> 113
Met Asn Leu Leu Asp Ala Thr Pro Thr Glu Tyr Val Trp Lys Tyr Asn
1 5 10 15
Pro Leu Ser Gly Ile Pro Ala Gly Ala Gln Gln Asn Tyr Gly Ala Thr
20 25 30
Ile Asn Trp Val Val Pro Gly Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Ala Ala Asp
35 40 45
Glu Ile Arg Arg Asn Thr Leu Ser Pro Ala Val Thr Arg Ala Ile Thr
50 55 60
Ala Arg Phe Glu Ala Glu Ser Asp Gln Gln Pro Phe Ala Asn Pro Arg
65 70 75 80
Glu Thr Ala Tyr Ile Thr Ala Asn Val Leu Asp Ser Gly Phe Pro Lys
85 90 95
Ser Ala Val Tyr Pro Val Asp Pro Ser Gly Val Gln Lys Val Gln Leu
100 105 110
Ala Gly Gly Ala Glu Gly Arg Met Gln Leu Ser Gly Gly Leu Thr Glu
115 120 125
Gly Arg Val Gln Leu Ser Gly Gly Val Leu Gly His Val Pro Arg Arg
130 135 140
Ser Arg Arg Gly Ala Arg Pro Pro Arg Trp Cys Gly Thr Ala Leu Ala
145 150 155 160
Gly Asn Gly Leu Pro Glu Asp Ala Glu Met Val Ser Asp Thr Tyr Lys
165 170 175
Tyr Phe Leu Arg Thr Gln Gly Pro Ser Gln Val Val Ser Glu Pro Gly
180 185 190
Val Tyr Ser Gln Arg Gln Phe Met Thr Thr Phe Leu Pro Ala Val Val
195 200 205
Pro His Pro Phe Asp Ser Pro Asn Pro Asn Asp Phe Pro Ala Gln Tyr
210 215 220
Ser Ala Ile Tyr Lys Gly Thr Asn Ala Tyr Glu Asp Val Phe Trp Asp
225 230 235 240
Trp
<210> 114
<211> 245
<212> PRT
<213> Fowl adenovirus 1
<400> 114
Met Asn Leu Met Asn Ala Thr Pro Thr Glu Tyr Val Trp Lys Tyr Asn
1 5 10 15
Pro Val Ser Gly Ile Pro Ala Gly Ala Gln Gln Asn Tyr Gly Ala Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Val Leu Pro Gly Gly Thr Gly Phe Ala Ile Ala Thr Asn
35 40 45
Asp Ile Arg Arg Gln Thr Leu Asn Pro Ala Val Thr Arg Ala Ile Thr
50 55 60
Ala Arg Phe Glu Ala Glu Ser Asp Gln Gln Pro Tyr Ala Ser Pro His
65 70 75 80
Glu Thr Asn Val Ile Ala Ala Asn Val Leu Asp Ser Gly Tyr Pro Lys
85 90 95
Ser Gly Leu Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Gly Asn Gln Arg Val Gln Leu
100 105 110
Ala Gly Gly Leu Met Val Gly Arg Thr Glu Gly Arg Met Gln Leu Ala
115 120 125
Gly Gly Leu Thr Glu Gly Arg Val Gln Leu Ser Gly Gly Phe His Gly
130 135 140
Arg Pro Leu Val Arg Gly Arg Ser Arg Arg Pro Pro Arg Trp Cys Gly
145 150 155 160
Ala Glu Leu Thr Gly Asn Gly Leu Pro Glu Gln Ala Glu Val Thr Ser
165 170 175
Asp Thr Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Thr Gln Gly Pro Ser Gln Val Val
180 185 190
Glu Glu Pro Gly Val Phe Ser Gln Arg Gln Phe Met Thr Thr Phe Leu
195 200 205
Pro Ser Val Val Pro His Pro Phe Asp Ser Thr Asn Pro Gly Asp Phe
210 215 220
Pro Ala Gln Tyr Ser Ala Ile Tyr Lys Gly Arg Thr Ala Phe Glu Asp
225 230 235 240
Thr Phe Trp Asp Trp
245
<210> 115
<211> 200
<212> PRT
<213> Turkey adenovirus 3
<400> 115
Met Asp Pro Val Pro Leu Glu Tyr Ile Trp Gln Tyr Asn Pro Val Thr
1 5 10 15
Gly Arg Val Gly Gly Ala Asn Gln Asn Tyr Gly Gln Arg Ile Asn Val
20 25 30
Leu His Thr Asn Arg Tyr Leu Tyr Asn Arg Met Gln Asn Val Gln Lys
35 40 45
Lys Ser Asn Glu Arg Ala Thr Glu Arg Gly Leu Leu Ser Leu Lys Gly
50 55 60
Gly Ser Thr Leu Pro Thr Ile Ala Glu Asp Glu Pro Ala Gln Leu Asn
65 70 75 80
Ser Ala Ile Val Arg Met Ala Gly Leu Asn Asp Leu Asn Thr Val Gln
85 90 95
Ala Pro Asp Ser Ser Asn Leu Gln Asn Leu Ala Asn Ile Ala Leu Glu
100 105 110
Ala Ala Glu His Asn Lys Ala Thr Ser Ser Leu Leu Thr Thr Lys Lys
115 120 125
Phe Val Glu Glu Phe Pro Pro Val Val Tyr Glu Asn Pro Phe Ser Gly
130 135 140
Ser Asn Phe Ala Tyr Glu Phe Asn Pro Leu Tyr Ser Pro Ser Gly Asn
145 150 155 160
Glu Phe Ser Asn Pro Pro Phe Lys Phe Thr Gly Gly Ala Ile Ser Leu
165 170 175
Thr Gly Gln His Pro Val Leu Ser Gly Gly Ala Val Ile Leu Ser Gly
180 185 190
Gln Asn Pro Val Leu Asp Lys Ala
195 200
<210> 116
<211> 200
<212> PRT
<213> Avirulent turkey hemorrhagic enteritis virus
<400> 116
Met Asp Pro Val Pro Leu Glu Tyr Ile Trp Gln Tyr Asn Pro Val Thr
1 5 10 15
Gly Arg Val Gly Gly Ala Asn Gln Asn Tyr Gly Gln Arg Ile Asn Val
20 25 30
Leu His Thr Asn Arg Tyr Leu Tyr Asn Arg Met Gln Asn Val Gln Lys
35 40 45
Lys Ser Asn Glu Arg Ala Thr Glu Arg Gly Leu Leu Ser Leu Lys Gly
50 55 60
Gly Ser Thr Leu Pro Thr Ile Ala Glu Asp Glu Pro Ala Gln Leu Asn
65 70 75 80
Ser Ala Ile Val Arg Met Ala Gly Leu Asn Asp Leu Asn Thr Val Gln
85 90 95
Ala Pro Asp Ser Ser Asn Leu Gln Asn Leu Ala Asn Ile Ala Leu Glu
100 105 110
Ala Ala Glu His Asn Lys Ala Thr Ser Ser Leu Leu Thr Thr Lys Lys
115 120 125
Phe Val Glu Glu Phe Pro Pro Val Val Tyr Glu Asn Pro Phe Ser Gly
130 135 140
Ser Asn Phe Ala Tyr Glu Phe Asn Pro Leu Tyr Ser Pro Ser Gly Asn
145 150 155 160
Glu Phe Ser Asn Pro Pro Phe Lys Phe Thr Gly Gly Ala Ile Ser Leu
165 170 175
Thr Gly Gln His Pro Val Leu Ser Gly Gly Ala Val Ile Leu Ser Gly
180 185 190
Gln Asn Pro Val Leu Asp Lys Ala
195 200
<210> 117
<211> 200
<212> PRT
<213> Turkey adenovirus A
<400> 117
Met Asp Pro Val Pro Leu Glu Tyr Ile Trp Gln Tyr Asn Pro Val Thr
1 5 10 15
Gly Arg Val Gly Gly Ala Asn Gln Asn Tyr Gly Gln Arg Ile Asn Val
20 25 30
Leu His Thr Asn Arg Tyr Leu Tyr Asn Arg Met Gln Asn Val Gln Lys
35 40 45
Lys Ser Asn Glu Arg Ala Thr Glu Arg Gly Leu Leu Ser Leu Lys Gly
50 55 60
Gly Ser Thr Leu Pro Thr Ile Ala Glu Asp Glu Pro Ala Gln Leu Asn
65 70 75 80
Ser Ala Ile Val Arg Met Ala Gly Leu Asn Asp Leu Asn Thr Val Gln
85 90 95
Ala Pro Asp Ser Ser Asn Leu Gln Asn Leu Ala Asn Ile Ala Leu Glu
100 105 110
Ala Ala Glu His Asn Lys Ala Thr Ser Ser Leu Leu Thr Thr Lys Lys
115 120 125
Phe Val Glu Glu Phe Pro Pro Val Val Tyr Glu Asn Pro Phe Ser Gly
130 135 140
Ser Asn Phe Ala Tyr Glu Phe Asn Pro Leu Tyr Ser Pro Ser Gly Asn
145 150 155 160
Glu Phe Ser Asn Pro Pro Phe Lys Phe Thr Gly Gly Ala Ile Ser Leu
165 170 175
Thr Gly Gln His Pro Val Leu Ser Gly Gly Ala Val Ile Leu Ser Gly
180 185 190
Gln Asn Pro Val Leu Asp Lys Ala
195 200
<210> 118
<211> 193
<212> PRT
<213> Frog adenovirus 1
<400> 118
Met Glu Ala Glu Pro Ser Glu Tyr Ile Trp Gln Tyr Asn Pro Val Thr
1 5 10 15
Gly Arg Val Val Gly Ala Ser Gln Asn Phe Gly Ala Arg Ile Asn Thr
20 25 30
Leu His Ala Ser Pro Gln Leu Trp Ala Arg Met Gln Gln Val Gln Arg
35 40 45
Arg Arg Asn Glu Thr Val Thr Leu Ser Ala Leu Gln Gly Ser Gly Leu
50 55 60
Val Pro Ala Thr Pro Ser Ala Phe Gln Thr Thr Asp Ser Ser Asn Cys
65 70 75 80
Phe Leu Gly Gly Ser Asp Asn Trp Lys Glu Leu Leu Glu Pro Val Pro
85 90 95
Glu Ser Glu Glu Asn Pro Asn Gln Ala Leu Gln Asp Leu Leu Leu Ala
100 105 110
Ala Glu Ser Glu Lys Asp Gln Arg Asn Arg Asn Leu Thr Gln Ser Gln
115 120 125
Phe Val Ser Asp Phe Pro Pro Val Val Tyr Glu Arg Pro Phe Thr Gly
130 135 140
Ser Asp Phe Pro Leu Glu Phe Ser Pro Leu Tyr Ser Pro Asp Gly Asn
145 150 155 160
Gln Phe Thr Asn Thr Gly Trp Ile Ser Gln Ser Phe Pro Pro Asn Gln
165 170 175
Ser Phe Pro Glu Ile Ile Asn His Pro Thr Gln His Ser Ser Thr Thr
180 185 190
Ile
<210> 119
<211> 221
<212> PRT
<213> Porcine adenovirus 4
<400> 119
Met Pro Leu Ala Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Val Trp Ser Tyr Gln
1 5 10 15
Pro Gln Met Gly Val Pro Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Lys
20 25 30
Ile Asn Cys Leu Ser Ala Gly Pro Arg Met Ala Gln Thr Val Phe Ala
35 40 45
Leu Arg Asp Gln Arg Asn Arg Val Leu Thr Ala Glu Ala His Gly Gln
50 55 60
Thr Pro Arg Pro Val Val Asn Pro Ala Ser Trp Pro Ala Ala Ala Leu
65 70 75 80
Ser His Glu Pro Pro Pro Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg Asn Glu
85 90 95
Pro Thr Glu His Ala Met Thr Asp Ala Gly Tyr Gln Ile Ala Gly Gly
100 105 110
Ala Ala Pro Trp Ser Gly Val Lys Thr Gly Ser Phe Cys Gly Arg Gly
115 120 125
Leu Gln Leu Ala Glu Pro Pro Thr Thr Ala Ile Tyr Pro Ser Gly Leu
130 135 140
Phe His Leu Gly Arg Gly Gln Arg Leu Val Leu Asp His Gln Pro Ala
145 150 155 160
Arg Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Pro Ser Val Pro Arg Tyr Gly Gly
165 170 175
Ile Gly Ala Arg Gln Phe Leu Lys Glu Phe Thr Pro Ala Val Tyr Pro
180 185 190
Gln Pro Tyr Ser Gly Pro Pro Asn Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Cys Phe
195 200 205
Asn Tyr Asp Ser Val Ser Asn Ser Val Asp Gly Tyr Ser
210 215 220
<210> 120
<211> 198
<212> PRT
<213> Bovine adenovirus 10
<400> 120
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Val Trp Asn Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ala Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Leu His
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Lys Ser Met Ile Ser Lys Val Asn Thr Ile Cys
35 40 45
Glu Asn Arg Asn Ser Ile Leu Leu Ser Lys Gly Met Gln Gln Leu Ala
50 55 60
Arg Leu Asn Ala Asn Pro Pro Phe Thr Asn Arg Ser Gln Ser Val Thr
65 70 75 80
Ala Leu Lys Leu Pro Arg Tyr Glu Ile Leu Glu Gln Arg Met Ser Asn
85 90 95
Ser Gly Met Gln Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ala Glu Pro Leu
100 105 110
Cys Lys Gln Pro Leu Ala Pro Asp Gly Ser Phe Gln Leu Gly Gly Gly
115 120 125
Ala Lys Val Phe Ser Arg Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Ile Arg Lys Thr
130 135 140
Ile Leu Leu Leu Glu Tyr Ser Gly Gly Met Gly Glu Lys Gln Phe Val
145 150 155 160
Lys Glu Phe Val Pro Ala Val Tyr Phe Asn Pro Tyr Ser Gly Leu Pro
165 170 175
Ala Ser Tyr Pro Asp Gln Phe Ile Ser Asn Tyr Asp Ala Val Thr Asp
180 185 190
Ser Val Asp Gly Tyr Ala
195
<210> 121
<211> 216
<212> PRT
<213> Bovine adenovirus 3
<400> 121
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Val Trp Thr Phe Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn
20 25 30
Trp Phe Ser Ala Gly Pro Asp Met Ile His Asp Val Asn Asn Ile Arg
35 40 45
Asp Ala Gln Asn Arg Ile Leu Met Thr Gln Ser Ala Ile Thr Ala Thr
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Ile Asp Pro Arg Gln Trp Ala Ala His Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Pro Val Val Gly Thr Thr His Val Glu Met Pro Arg Asn Glu Val
85 90 95
Leu Glu Gln His Leu Thr Ser His Gly Ala Gln Ile Ala Gly Gly Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Asp Tyr Phe Lys Ser Pro Thr Ser Ala Arg Thr Leu Ile
115 120 125
Pro Leu Thr Ala Ser Cys Leu Arg Pro Asp Gly Val Phe Gln Leu Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Arg Ser Ser Phe Asn Pro Leu Gln Thr Asp Phe Ala Phe
145 150 155 160
His Ala Leu Pro Ser Arg Pro Arg His Gly Gly Ile Gly Ser Arg Gln
165 170 175
Phe Val Glu Glu Phe Val Pro Ala Val Tyr Leu Asn Pro Tyr Ser Gly
180 185 190
Pro Pro Asp Ser Tyr Pro Asp Gln Phe Ile Arg His Tyr Asn Val Tyr
195 200 205
Ser Asn Ser Val Ser Gly Tyr Ser
210 215
<210> 122
<211> 227
<212> PRT
<213> Tree shrew adenovirus
<400> 122
Met Ser Lys Asp Ile Pro Thr Pro Tyr Val Trp Thr Phe Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Val Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Gly Thr Lys Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile His Arg Val Asn Asn Ile Arg
35 40 45
Glu Ala Arg Asn Arg Ile Leu Leu Arg Gln Ala Ala Leu Thr Glu Thr
50 55 60
Pro Arg Ala Val Met Asn Pro Pro Asn Trp Pro Ser Thr Leu Leu Tyr
65 70 75 80
His Asp Val Ala Pro Pro Thr Ser Val Pro Leu Pro Arg Asn Glu Arg
85 90 95
Leu Glu Ile Ala Met Thr Asn His Gly Ala Gln Leu Ala Gly Gly Gly
100 105 110
His Thr Ser Leu Pro Glu Gly Leu Lys Arg Glu Leu Leu Phe Gly Ser
115 120 125
Gly Ile Gln Leu Asn Glu Gln Leu Pro Val Arg Pro Tyr Gly Ala Ala
130 135 140
Val Arg Ala Asp Gly Thr Phe Gln Leu Ala Gly Gly Ser Arg Ser Ser
145 150 155 160
Phe Asn Pro Arg Glu Glu Leu Phe Leu Lys Leu Gln Ser Ala Pro Ser
165 170 175
Gln Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Ser Trp Gln Phe Val Glu Glu Phe
180 185 190
Val Pro Ala Val Tyr Tyr Asn Pro Phe Ser Gly Pro Pro Gly Thr Tyr
195 200 205
Pro Asp Gln Phe Ile Ser Asn Tyr Asp Val Val Ser Asp Ser Val Asp
210 215 220
Gly Tyr Asp
225
<210> 123
<211> 221
<212> PRT
<213> Bovine adenovirus 1
<400> 123
Met Ser Lys Asp Ile Pro Thr Pro Tyr Val Trp Thr Phe Gln Pro Gln
1 5 10 15
Leu Gly Gly Cys Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile Asn Gln Val Asn Ser Val Arg Ala
35 40 45
Asp Arg Asn Arg Ile Leu Leu Arg Gln Ala Ala Val Ser Glu Thr Pro
50 55 60
Arg Leu Val Arg Asn Pro Pro Thr Trp Pro Ala Gln Tyr Leu Phe Gln
65 70 75 80
Pro Ile Gly Ala Pro Gln Thr Phe Glu Leu Pro Arg Asn Glu Ser Leu
85 90 95
Glu Val Ala Met Ser Asn Ser Gly Met Gln Leu Ala Gly Gly Gly Arg
100 105 110
Arg Thr Lys Asp Ile Lys Pro Glu Asp Ile Val Gly Arg Gly Leu Glu
115 120 125
Leu Asn Ser Asp Ile Pro Ser Ala Ser Phe Leu Arg Pro Asp Gly Val
130 135 140
Phe Gln Leu Ala Gly Gly Ser Arg Ser Ser Phe Asn Pro Gly Leu Ser
145 150 155 160
Thr Leu Leu Thr Val Gln Pro Ala Ser Ser Leu Pro Arg Ser Gly Gly
165 170 175
Ile Gly Glu Val Gln Phe Val His Glu Phe Val Pro Ser Val Tyr Phe
180 185 190
Gln Pro Phe Ser Gly Pro Pro Gly Thr Tyr Pro Asp Glu Phe Ile Tyr
195 200 205
Asn Tyr Asp Ile Val Ser Asp Ser Val Asp Gly Tyr Asp
210 215 220
<210> 124
<211> 223
<212> PRT
<213> Ovine adenovirus A
<400> 124
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro His Met Trp Thr Phe Gln Pro Gln
1 5 10 15
Leu Gly Gln Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile Ser Gln Val Asp Ser Ile Arg
35 40 45
Ala Glu Arg Asn Arg Ile Leu Leu His Gln Ala Ala Val Ser Ala Thr
50 55 60
Pro Arg Ala Ile Met Asn Pro Pro Ala Trp Pro Ala Ser Arg Leu Phe
65 70 75 80
Gln Pro Val Asp Thr Val Gln Thr Leu Glu Leu Pro Arg Asn Glu Leu
85 90 95
Leu Glu Thr Ala Met Thr Asn Ser Gly Met Gln Leu Ala Gly Gly Gly
100 105 110
Val His Arg Thr Lys Asp Ile Lys Pro Glu Asp Leu Val Gly Arg Gly
115 120 125
Ile Gln Leu Asn Ser Tyr Gln Pro Pro Thr Thr Arg Leu Lys Pro Glu
130 135 140
Arg Val Phe Gln Leu Ala Gly Gly Ser Arg Ser Ser Phe Asn Pro Ser
145 150 155 160
Ile Asn Thr Leu Leu Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Val Pro Arg Ser
165 170 175
Gly Gly Ile Gly Glu Val Gln Phe Val His Glu Phe Val Pro Ser Val
180 185 190
Tyr Phe Gln Pro Phe Ser Gly Pro Pro Gly Ser Tyr Pro Asp Glu Phe
195 200 205
Ile Tyr Asn Phe Asp Val Ala Thr Asp Ser Ile Asp Gly Tyr Ala
210 215 220
<210> 125
<211> 224
<212> PRT
<213> Canine adenovirus 2
<400> 125
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Thr Gly His Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Gln Met Asn
20 25 30
Trp Phe Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile Ser Gln Val Tyr Gly Ile Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Asn Lys Val Leu Ile Thr Gln Ala Glu Ile Thr Lys Thr
50 55 60
Pro Arg Thr Ile Met Asp Pro Pro Ile Trp Pro Ala Ala Met Leu Val
65 70 75 80
Gln Glu Ala Ala Pro Pro Lys Thr Val Thr Leu Pro Arg Asn His Thr
85 90 95
Leu Glu Gln Ala Met Thr Asn Ser Gly Ala Gln Leu Ala Gly Gly Arg
100 105 110
Gln Leu Cys Pro Ser Gln Ile Gly Ile Lys Ser Pro Val Leu Ala Gly
115 120 125
Thr Gly Ile Gln Leu Ser Glu Asp Ile Pro Ser Ala Ser Trp Ile Arg
130 135 140
Pro Asp Gly Ile Phe Gln Leu Gly Gly Gly Ser Arg Ser Ser Phe Ser
145 150 155 160
Pro Thr Gln Ala Phe Leu Thr Leu Gln Gln Ala Ser Ser Thr Pro Arg
165 170 175
Ala Gly Gly Val Gly Thr Tyr Gln Phe Val Arg Glu Phe Val Pro Glu
180 185 190
Val Tyr Leu Asn Pro Phe Ser Gly Pro Pro Asp Thr Phe Pro Asp Gln
195 200 205
Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Ile Val Thr Asn Ser Val Asp Gly Tyr Asp
210 215 220
<210> 126
<211> 224
<212> PRT
<213> Canine adenovirus 1
<400> 126
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Ile Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Thr Gly His Ala Ala Gly Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Gln Met Asn
20 25 30
Trp Phe Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile Ser His Val Tyr Gly Ile Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Asn Lys Val Leu Met Thr Gln Ala Gln Ile Thr Lys Thr
50 55 60
Pro Arg Thr Ile Met Asp Pro Pro Ile Trp Pro Ala Ser Met Leu Val
65 70 75 80
Gln Lys His Ala Thr Pro Lys Thr Ile Ala Leu Pro Arg Asn His Thr
85 90 95
Leu Glu Gln Ala Met Val Asn Cys Gly Ala Gln Leu Ala Gly Gly Arg
100 105 110
Gln Pro Ser Pro Ser His Ile Asp Ile Lys Asp Thr Met Leu Ala Gly
115 120 125
Thr Gly Ile Gln Leu Gly Glu Asp Ile Pro Ser Val Ser Trp Ile Arg
130 135 140
Pro Asp Gly Ile Phe Gln Leu Gly Gly Gly Ser Arg Ser Ser Phe Ser
145 150 155 160
Pro Thr Gln Ala Phe Leu Thr Leu Gln Gln Ala Ser Ser Thr Pro Arg
165 170 175
Thr Gly Gly Val Gly Ser Tyr Gln Phe Val Arg Glu Phe Val Pro Glu
180 185 190
Val Tyr Leu Asn Pro Phe Ser Gly Pro Pro Asp Thr Phe Pro Asp Gln
195 200 205
Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Ile Val Thr Asn Ser Val Asp Gly Tyr Asp
210 215 220
<210> 127
<211> 222
<212> PRT
<213> Bat adenovirus TJM
<400> 127
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Phe Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ser Gly His Ala Ala Gly Ala Ala Gln Asp Tyr Ser Thr Gln Met Asn
20 25 30
Trp Phe Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile Asn Gln Val Tyr Gln Ile Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Asn Arg Ile Leu Thr Thr Gln Ala Gln Ile Thr Glu Thr
50 55 60
Pro Arg Glu Val Met Asn Pro Pro Val Trp Pro Ala Ala Thr Ile Val
65 70 75 80
Gln Glu Ala Pro Pro Pro Thr Thr Val Ala Leu Pro Arg Asn His Ala
85 90 95
Leu Glu Thr Ala Met Thr Asn Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Gly Arg
100 105 110
Cys Leu Leu Pro Ala Ala Arg Ala Ala Cys Pro Ile Lys Gly Arg Gly
115 120 125
Leu Gln Leu Ser Glu Asp Ile Pro Ser Ala Ser Trp Ile Arg Pro Asp
130 135 140
Gly Ile Phe Gln Leu Gly Gly Gly Ser Arg Ser Ser Phe Asn Pro Thr
145 150 155 160
Gln Ala Phe Leu Thr Leu Gln Gln Ala Ser Ser Gln Pro Arg Ala Gly
165 170 175
Gly Ile Gly Thr Val Gln Phe Val Arg Glu Phe Val Pro Glu Val Tyr
180 185 190
Leu Asn Pro Phe Ser Gly Pro Pro Asp Thr Phe Pro Asp Gln Phe Ile
195 200 205
Pro Asn Tyr Asp Ile Val Thr Asn Ser Val Asp Gly Tyr Asp
210 215 220
<210> 128
<211> 223
<212> PRT
<213> Porcine adenovirus 1
<400> 128
Met Ser Lys Gln Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ser Gly Arg Ala Ala Gly Ala Ser Val Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile Gly Gln Val Asn Asp Ile Arg
35 40 45
His Thr Arg Asn Gln Ile Leu Ile Arg Gln Ala Leu Ile Thr Glu Thr
50 55 60
Pro Arg Pro Val Gln Asn Pro Pro Ser Trp Pro Ala Arg Leu Leu Pro
65 70 75 80
Gln Met Thr Gln Pro Pro Thr His Leu His Leu Pro Arg Asn Glu Ile
85 90 95
Leu Glu Gly Arg Leu Thr Asp Ala Gly Met Gln Leu Ala Gly Gly Gly
100 105 110
Ala Leu Ala Pro Arg Asp Leu Tyr Ala Leu Thr Leu Arg Gly Arg Gly
115 120 125
Ile Gln Leu Asn Glu Asp Leu Pro Phe Ser Ala Ser Thr Leu Arg Pro
130 135 140
Asp Gly Ile Phe Gln Leu Gly Gly Gly Gly Arg Ser Ser Phe Asn Pro
145 150 155 160
Thr Asp Ala Tyr Leu Thr Leu Gln Asn Ser Ser Ser Leu Pro Arg Ser
165 170 175
Gly Gly Ile Gly Ser Asp Gln Phe Val Arg Glu Phe Val Pro Thr Val
180 185 190
Tyr Ile Asn Pro Phe Ser Gly Pro Pro Gly Thr Tyr Pro Asp Gln Phe
195 200 205
Ile Ala Asn Tyr Asn Ile Leu Thr Asp Ser Val Ala Gly Tyr Asp
210 215 220
<210> 129
<211> 223
<212> PRT
<213> Porcine adenovirus 3
<400> 129
Met Ser Lys Gln Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ser Gly Arg Ala Ala Gly Ala Ser Val Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro Ser Met Ile Gly Gln Val Asn Asp Ile Arg
35 40 45
His Thr Arg Asn Gln Ile Leu Ile Arg Gln Ala Leu Ile Thr Glu Thr
50 55 60
Pro Arg Pro Val Gln Asn Pro Pro Ser Trp Pro Ala Ser Leu Leu Pro
65 70 75 80
Gln Met Thr Gln Pro Pro Thr His Leu His Leu Pro Arg Asn Glu Ile
85 90 95
Leu Glu Gly Arg Leu Thr Asp Ala Gly Met Gln Leu Ala Gly Gly Gly
100 105 110
Ala Leu Ala Pro Arg Asp Leu Tyr Ala Leu Thr Leu Arg Gly Arg Gly
115 120 125
Ile Gln Leu Asn Glu Asp Leu Pro Leu Ser Ala Ser Thr Leu Arg Pro
130 135 140
Asp Gly Ile Phe Gln Leu Gly Gly Gly Gly Arg Ser Ser Phe Asn Pro
145 150 155 160
Thr Asp Ala Tyr Leu Thr Leu Gln Asn Ser Ser Ser Leu Pro Arg Ser
165 170 175
Gly Gly Ile Gly Ser Glu Gln Phe Val Arg Glu Phe Val Pro Thr Val
180 185 190
Tyr Ile Asn Pro Phe Ser Gly Pro Pro Gly Thr Tyr Pro Asp Gln Phe
195 200 205
Ile Ala Asn Tyr Asn Ile Leu Thr Asp Ser Val Ala Gly Tyr Asp
210 215 220
<210> 130
<211> 227
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 22
<400> 130
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro Ala Met Ile Ser Arg Val Asn Asp Ile Arg
35 40 45
Ala Arg Arg Asn Gln Ile Leu Leu Glu Gln Ser Ala Ile Thr Ala Thr
50 55 60
Pro Arg His His Leu Asn Pro Arg Asn Trp Pro Ala Ala Leu Val Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Ile Pro Gln Pro Thr Thr Val Leu Leu Pro Arg Asp Ala Gln
85 90 95
Ala Glu Val Gln Leu Thr Asn Ser Gly Val Gln Leu Ala Gly Gly Ala
100 105 110
Ala Leu Cys Arg His Arg Pro Ala Gln Gly Ile Lys Arg Leu Val Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Gly Thr Gln Leu Asn Asp Glu Val Val Ser Ser Ser Leu
130 135 140
Gly Leu Arg Pro Asp Gly Val Phe Gln Leu Ala Gly Ser Gly Arg Ser
145 150 155 160
Ser Phe Thr Pro Arg Gln Ala Val Leu Thr Leu Glu Ser Ser Ser Ser
165 170 175
Gln Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Thr Leu Gln Phe Val Glu Glu Phe
180 185 190
Thr Pro Ser Val Tyr Phe Asn Pro Phe Ser Gly Ser Pro Gly His Tyr
195 200 205
Pro Asp Glu Phe Ile Pro Asn Phe Asp Ala Ile Ser Glu Ser Val Asp
210 215 220
Gly Tyr Asp
225
<210> 131
<211> 227
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 23
<400> 131
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro Ala Met Ile Ser Arg Val Asn Asp Ile Arg
35 40 45
Ala His Arg Asn Gln Ile Leu Leu Glu Gln Ser Ala Ile Thr Ala Thr
50 55 60
Pro Arg His His Leu Asn Pro Arg Asn Trp Pro Ala Ala Leu Val Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Ile Pro Gln Pro Thr Thr Val Leu Leu Pro Arg Asp Ala Gln
85 90 95
Ala Glu Val Gln Leu Thr Asn Ser Gly Val Gln Leu Ala Gly Gly Ala
100 105 110
Ala Leu Cys Arg His Arg Pro Ala Gln Gly Ile Lys Arg Leu Val Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Gly Thr Gln Leu Asn Asp Glu Val Val Ser Ser Ser Leu
130 135 140
Gly Leu Arg Pro Asp Gly Val Phe Gln Leu Ala Gly Ser Gly Arg Ser
145 150 155 160
Ser Phe Thr Pro Arg Gln Ala Val Leu Thr Leu Glu Ser Ser Ser Ser
165 170 175
Gln Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Thr Leu Gln Phe Val Glu Glu Phe
180 185 190
Thr Pro Ser Val Tyr Phe Asn Pro Phe Ser Gly Ser Pro Gly His Tyr
195 200 205
Pro Asp Glu Phe Ile Pro Asn Phe Asp Ala Ile Ser Glu Ser Val Asp
210 215 220
Gly Tyr Asp
225
<210> 132
<211> 227
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 24
<400> 132
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro Ala Met Ile Ser Arg Val Asn Asp Ile Arg
35 40 45
Ala His Arg Asn Gln Ile Leu Leu Glu Gln Ser Ala Ile Thr Ala Thr
50 55 60
Pro Arg His His Leu Asn Pro Arg Asn Trp Pro Ala Ala Leu Val Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Ile Pro Gln Pro Thr Thr Val Leu Leu Pro Arg Asp Ala Gln
85 90 95
Ala Glu Val Gln Leu Thr Asn Ser Gly Val Gln Leu Ala Gly Gly Ala
100 105 110
Ala Leu Cys Arg His Arg Pro Ala Gln Gly Ile Lys Arg Leu Val Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Gly Thr Gln Leu Asn Asp Glu Val Val Ser Ser Ser Leu
130 135 140
Gly Leu Arg Pro Asp Gly Val Phe Gln Leu Ala Gly Ser Gly Arg Ser
145 150 155 160
Ser Phe Thr Pro Arg Gln Ala Val Leu Thr Leu Glu Ser Ser Ser Ser
165 170 175
Gln Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Thr Leu Gln Phe Val Glu Glu Phe
180 185 190
Thr Pro Ser Val Tyr Phe Asn Pro Phe Ser Gly Ser Pro Gly His Tyr
195 200 205
Pro Asp Glu Phe Ile Pro Asn Phe Asp Ala Ile Ser Glu Ser Val Asp
210 215 220
Gly Tyr Asp
225
<210> 133
<211> 233
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 1
<400> 133
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Gln Asp Tyr Ser Ser Lys Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro His Met Ile Ser Arg Val Asn Gly Ile Arg
35 40 45
Ala His Arg Asn Gln Ile Leu Leu Glu Gln Ala Ala Ile Thr Ala Thr
50 55 60
Pro Arg Arg Gln Leu Asn Pro Pro Ser Trp Pro Ala Ala Gln Val Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Asn Pro Arg Pro Thr Thr Val Leu Leu Pro Arg Asp Ala Glu
85 90 95
Ala Glu Val Leu Met Thr Asn Ser Gly Val Gln Leu Ala Gly Gly Ser
100 105 110
Arg Tyr Ala Arg Tyr Arg Gly Arg Ala Ala Pro Tyr Ser Pro Gly Ser
115 120 125
Ile Lys Arg Val Ile Ile Arg Gly Arg Gly Ile Gln Leu Asn Asp Glu
130 135 140
Thr Val Ser Ser Ser Thr Gly Leu Arg Pro Asp Gly Val Phe Gln Leu
145 150 155 160
Gly Gly Ala Gly Arg Ser Ser Phe Thr Thr Arg Gln Ala Tyr Leu Thr
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Ser Ser Gln Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Thr Leu
180 185 190
Gln Phe Val Glu Glu Phe Val Pro Ser Val Tyr Phe Asn Pro Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Pro Gly Arg Tyr Pro Asp Ala Phe Ile Pro Asn Phe Asp Ala
210 215 220
Val Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Asp
225 230
<210> 134
<211> 233
<212> PRT
<213> Simian adenovirus 7
<400> 134
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Gln Asp Tyr Ser Ser Lys Met Asn
20 25 30
Trp Leu Ser Ala Gly Pro His Met Ile Ser Arg Val Asn Gly Ile Arg
35 40 45
Ala His Arg Asn Gln Ile Leu Leu Glu Gln Ala Ala Ile Thr Ala Thr
50 55 60
Pro Arg Arg Gln Leu Asn Pro Pro Ser Trp Pro Ala Ala Gln Val Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Thr Pro Arg Pro Thr Thr Val Leu Leu Pro Arg Asp Ala Glu
85 90 95
Ala Glu Val Leu Met Thr Asn Ser Gly Val Gln Leu Ala Gly Gly Ser
100 105 110
Arg Tyr Ala Arg Tyr Arg Gly Arg Ala Ala Pro Tyr Ser Pro Gly Ser
115 120 125
Ile Lys Arg Val Ile Ile Arg Gly Arg Gly Ile Gln Leu Asn Asp Glu
130 135 140
Ala Val Ser Ser Ser Thr Gly Leu Arg Pro Asp Gly Val Phe Gln Leu
145 150 155 160
Gly Gly Ala Gly Arg Ser Ser Phe Thr Thr Arg Gln Ala Tyr Leu Thr
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Ser Ser Gln Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Thr Leu
180 185 190
Gln Phe Val Glu Glu Phe Val Pro Ser Val Tyr Phe Asn Pro Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Pro Gly Arg Tyr Pro Asp Ala Phe Ile Pro Asn Phe Asp Ala
210 215 220
Val Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Asp
225 230
<210> 135
<211> 227
<212> PRT
<213> Human adenovirus 5
<400> 135
Met Ser Lys Glu Ile Pro Thr Pro Tyr Met Trp Ser Tyr Gln Pro Gln
1 5 10 15
Met Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Gln Asp Tyr Ser Thr Arg Ile Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Ala Gly Pro His Met Ile Ser Arg Val Asn Gly Ile Arg
35 40 45
Ala His Arg Asn Arg Ile Leu Leu Glu Gln Ala Ala Ile Thr Thr Thr
50 55 60
Pro Arg Asn Asn Leu Asn Pro Arg Ser Trp Pro Ala Ala Leu Val Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Ser Pro Ala Pro Thr Thr Val Val Leu Pro Arg Asp Ala Gln
85 90 95
Ala Glu Val Gln Met Thr Asn Ser Gly Ala Gln Leu Ala Gly Gly Phe
100 105 110
Arg His Arg Val Arg Ser Pro Gly Gln Gly Ile Thr His Leu Thr Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Gly Ile Gln Leu Asn Asp Glu Ser Val Ser Ser Ser Leu
130 135 140
Gly Leu Arg Pro Asp Gly Thr Phe Gln Ile Gly Gly Ala Gly Arg Pro
145 150 155 160
Ser Phe Thr Pro Arg Gln Ala Ile Leu Thr Leu Gln Thr Ser Ser Ser
165 170 175
Glu Pro Arg Ser Gly Gly Ile Gly Thr Leu Gln Phe Ile Glu Glu Phe
180 185 190
Val Pro Ser Val Tyr Phe Asn Pro Phe Ser Gly Pro Pro Gly His Tyr
195 200 205
Pro Asp Gln Phe Ile Pro Asn Phe Asp Ala Val Lys Asp Ser Ala Asp
210 215 220
Gly Tyr Asp
225
<210> 136
<211> 951
<212> PRT
<213> Human adenovirus 5
<400> 136
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser
1 5 10 15
Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala
20 25 30
Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro
35 40 45
Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu
50 55 60
Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met
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Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr
100 105 110
Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly
115 120 125
Ala Pro Asn Pro Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile
130 135 140
Asn Leu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln
145 150 155 160
Ala Glu Gln Gln Lys Thr His Val Phe Gly Gln Ala Pro Tyr Ser Gly
165 170 175
Ile Asn Ile Thr Lys Glu Gly Ile Gln Ile Gly Val Glu Gly Gln Thr
180 185 190
Pro Lys Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu
195 200 205
Ser Gln Trp Tyr Glu Thr Glu Ile Asn His Ala Ala Gly Arg Val Leu
210 215 220
Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Lys Pro
225 230 235 240
Thr Asn Glu Asn Gly Gly Gln Gly Ile Leu Val Lys Gln Gln Asn Gly
245 250 255
Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln Phe Phe Ser Thr Thr Glu Ala
260 265 270
Ala Ala Gly Asn Gly Asp Asn Leu Thr Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser
275 280 285
Glu Asp Val Asp Ile Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Ser Tyr Met Pro
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Thr Ile Lys Glu Gly Asn Ser Arg Glu Leu Met Gly Gln Gln Ser Met
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325 330 335
Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala
340 345 350
Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu
355 360 365
Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe
370 375 380
Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile
385 390 395 400
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405 410 415
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Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr
465 470 475 480
Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Ser Pro Ser Asn Val Lys Ile Ser Asp Asn
485 490 495
Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Lys Arg Val Val Ala Pro Gly Leu
500 505 510
Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr Met
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly
565 570 575
Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val Leu
580 585 590
Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile Lys
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900 905 910
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Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe
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Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr
945 950
<210> 137
<211> 35938
<212> DNA
<213> Human adenovirus 5
<400> 137
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480
tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540
tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600
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tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720
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ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct ggctttccac ccagtgacga 960
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ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga 1140
tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa 1200
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ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 1320
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ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 1440
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gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040
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gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg 2340
gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400
gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460
tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520
ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580
tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640
agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700
tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760
gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820
acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880
gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940
aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000
ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060
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aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300
tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360
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ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660
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ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780
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actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900
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atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080
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cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200
acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260
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ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt 4380
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tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag 4500
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gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg 4800
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gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat 5220
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ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt 5700
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ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 6180
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gcgccaaccg cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag 6480
gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagggggtc 6540
tagctgcgtc tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc 6600
gtcgaagtag tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc 6660
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ggcgtacatg ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt 6780
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gagctcctgc aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg cgggctagat ccaggtgata 8460
cctaatttcc aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg 8520
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gtggcggcga ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc 9000
tcgttccaga cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc 9060
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aggtagttga gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgtcgc 9180
aacgtggatt cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc 9240
acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga 9300
cggatgagct cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct 9360
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atctccccgc ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc ggccgttctc gcgggggcgc 9540
agttggaaga cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg gcggggggct gccatgcggc 9600
agggatacgg cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg taggtactcc gccgccgagg 9660
gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag 9720
tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg 9780
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accggcactt cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg 10020
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ctcatcggct gaagcagggc taggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc 10140
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caaaaagtta gcattataat tagaatagga tttaaacccc ccggtcattt cctgctcaat 29340
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<210> 138
<211> 34794
<212> DNA
<213> Human adenovirus B2
<400> 138
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
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ttgttacagg gtggggacgg acctttggac ttgagtacac ggaaacgtcc aagacaataa 1440
gtgttccata tccgtgttta cttaaggtga cgtcaatatt tgtgtgacag tgcaatgtaa 1500
taaaaatatg ttaactgttc actggttttt attgcttttt gggcggggac tcaggtatat 1560
aagtagaagc agacctgtgt ggttagctca taggagctgg ctttcatcca tggaggtttg 1620
ggccattttg gaagacctta ggaagactag gcaactgtta gagaacgctt cggacggagt 1680
ctccggtttt tggagattct ggttcgctag tgaattagct agggtagttt ttaggataaa 1740
acaggactat aaccaagaat ttgaaaagtt gttggtagat tgcccaggac tttttgaagc 1800
tcttaatttg ggccatcagg ttcactttaa agaaaaagtt ttatcagttt tagacttttc 1860
aaccccaggt agaactgctg ctgctgtggc ttttcttact tttatattag ataaatggat 1920
cccgcagact catttcagca ggggatacgt tttggatttc atagccacag cattgtggag 1980
aacatggaag gttcgcaaga tgaggacaat cttaggttac tggccagtgc agcctttggg 2040
tgtagcggga atcctgaggc atccaccggt catgccagcg gttctggagg aggaacagca 2100
agaggacaac ccgagagccg gcctggaccc tccagtggag gaggcggagt agctgacttg 2160
tctcctgaac tgcaacgggt gcttactgga tctacgtcca ctggacggga taggggcgtt 2220
aagagggaga gggcatctag tggtactgat gctagatctg agttggcttt aagtttaatg 2280
agtcgcagac gtcctgaaac catttggtgg catgaggttc agaaagaggg aagggatgaa 2340
gtttctgtat tgcaggagaa atattcactg gaacaggtga aaacatgttg gttggagcct 2400
gaggatgatt gggaggtggc cattaaaaat tatgccaaga tagctttgag gcctgataaa 2460
cagtataaga ttactagacg gattaatatc cggaatgctt gttacatatc tggaaatggg 2520
gctgaggtgg taatagatac tcaagacaag gcagttatta gatgctgcat gatggatatg 2580
tggcctgggg tagtcggtat ggaagcagta acttttgtaa atgttaagtt taggggagat 2640
ggttataatg gaatagtgtt tatggccaat accaaactta tattgcatgg ttgtagcttt 2700
tttggtttca acaatacctg tgtagatgcc tggggacagg ttagtgtacg gggatgtagt 2760
ttctatgcgt gttggattgc cacagctggc agaaccaaga gtcaattgtc tctgaagaaa 2820
tgcatatttc aaagatgtaa cctgggcatt ctgaatgaag gcgaagcaag ggtccgccac 2880
tgcgcttcta cagatactgg atgttttatt ttgattaagg gaaatgccag cgtaaagcat 2940
aacatgattt gcggtgcttc cgatgagagg ccttatcaaa tgctcacttg tgctggtggg 3000
cattgtaata tgctggctac tgtgcatatt gtttcccatc aacgcaaaaa atggcctgtt 3060
tttgatcaca atgtgatgac gaagtgtacc atgcatgcag gtgggcgtag aggaatgttt 3120
atgccttacc agtgtaacat gaatcatgtg aaagtgttgt tggaaccaga tgccttttcc 3180
agaatgagcc taacaggaat ttttgacatg aacatgcaaa tctggaagat cctgaggtat 3240
gatgatacga gatcgagggt acgcgcatgc gaatgcggag gcaagcatgc caggttccag 3300
ccggtgtgtg tagatgtgac tgaagatctc agaccggatc atttggttat tgcccgcact 3360
ggagcagagt tcggatccag tggagaagaa actgactaag gtgagtattg ggaaaacttt 3420
ggggtgggat tttcagatgg acagattgag taaaaatttg ttttttctgt cttgcagctg 3480
tcatgagtgg aaacgcttct tttaaggggg gagtcttcag cccttatctg acagggcgtc 3540
tcccatcctg ggcaggagtt cgtcagaatg ttatgggatc tactgtggat ggaagacccg 3600
tccaacccgc caattcttca acgctgacct atgctacttt aagttcttca cctttggacg 3660
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atggaagcat catggctaat tccacttcct ctaataaccc ttctaccctg actcaggaca 3780
agttacttgt ccttttggcc cagctggagg ctttgaccca acgtctgggt gaactttctc 3840
agcaggtggt cgagttgcga gtacaaactg agtctgctgt cggcacggca aagtctaaat 3900
aaaaaaatcc cagaatcaat gaataaataa acaagcttgt tgttgattta aaatcaagtg 3960
tttttatttc atttttcgcg cacggtatgc cctagaccac cgatctctat cattgagaac 4020
tcggtggatt ttttccagga tcctatagag gtgggattga atgtttagat acatgggcat 4080
taggccgtct ttggggtgga gatagctcca ttgaagggat tcatgctccg gggtagtgtt 4140
gtaaatcacc cagtcataac aaggtcgcag tgcatggtgt tgcacaatat cttttagaag 4200
taggctgatt gccacagata agcccttggt gtaggtgttt acaaaccggt tgagctggga 4260
tgggtgcatt cggggtgaaa ttatgtgcat tttggattgg atttttaagt tggcaatatt 4320
gccgccaaga tcccgtcttg ggttcatgtt atgaaggacc accaagacgg tgtatccggt 4380
acatttagga aatttatcgt gcagcttgga tggaaaagcg tggaaaaatt tggagacacc 4440
cttgtgtcct ccaagatttt ccatgcactc atccatgata atagcaatgg ggccgtgggc 4500
agcggcgcgg gcaaacacgt tccgtgggtc tgacacatca tagttatgtt cctgagttaa 4560
atcatcataa gccattttaa tgaatttggg gcggagagta ccagattggg gtatgaatgt 4620
tccttcgggc cccggagcat agttcccctc acagatttgc atttcccaag ctttcagttc 4680
cgagggtgga atcatgtcca cctggggggc tatgaaaaac accgtttctg gggcgggggt 4740
gattaattgt gatgatagca aatttctgag caattgagat ttgccacatc cggtggggcc 4800
ataaatgatt ccgattacgg gttgcaggtg gtagtttagg gaacggcaac tgccgtcttc 4860
tcgaagcaag ggggccacct cgttcatcat ttcccttaca tgcatatttt cccgcaccaa 4920
atccattagg aggcgctctc ctcctagtga tagaagttct tgtagtgagg aaaagttttt 4980
cagcggtttc agaccgtcag ccatgggcat tttggagaga gtttgctgca aaagttctag 5040
tctgttccac agttcagtga tgtgttctat ggcatctcga tccagcagac ctcctcgttt 5100
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ttctgtcgct tggcgccctg tatgtcggcc aagtagcagt ttaccatgag ttcgtagttg 5340
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cactctgata caaaggcgcg cgtccaggcc agcacaaagg aggctatgtg ggaggggtag 5760
cgatcgttgt caaccagggg gtccaccttt tccaaagtat gcaaacacat gtcaccctct 5820
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cgattatgca aggtaattaa atccacactg gtggccacct cgcctcgaag gggttcattg 6360
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cagatgtcat agacgtagat gggatcctca aagatgccta tgtaggttgg atagcatcgc 6660
ccccctctga tacttgctcg cacatagtca tatagttcat gtgatggcgc tagcagcccc 6720
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acaagtacgt ctagggcgca gtagtcaagt gtttcttgaa tgatgtcata acctggttgg 6960
tttttctttt cccacagttc gcggttgaga aggtattctt cgcgatcctt ccagtactct 7020
tctagcggaa acccgtcttt gtctgcacgg taagatccta gcatgtagaa ctgattaact 7080
gccttgtaag ggcagcagcc cttctctacg ggtagagagt atgcttgagc agcttttcgt 7140
agcgaagcgt gagtaagggc aaaggtgtct ctgaccatga ctttgagaaa ttggtatttg 7200
aagtcgatgt cgtcacaggc tccctgttcc cagagttgga agtctacccg tttcttgtag 7260
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aaattgcgag tgatgcgaaa aggctgtggt acttccgctc gattgttgat cacctgggca 7380
gctaggacga tctcgtcgaa accgttgatg ttgtgtccta cgatgtataa ttctatgaaa 7440
cgcggcgtgc ctctgacgtg aggtagctta ctgagctcat caaaggttag gtctgtgggg 7500
tcagataagg cgtagtgttc gagagcccat tcgtgcaggt gaggatttgc atgtaggaat 7560
gatgaccaaa gatctaccgc cagtgctgtt tgtaactggt cccgatactg acgaaaatgc 7620
cggccaattg ccattttttc tggagtgaca cagtagaagg ttctggggtc ttgttgccat 7680
cgatcccact tgagtttaat ggctagatcg tgggccatgt tgacgagacg ctcttctcct 7740
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taagtttcca catcgtaggt caggaagagt ctttctgtgc gaggatgaga gccgatcggg 7860
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tgttcatctt ctgtttcgat ggtggtcatg ctgacgagcc cccgcgggag gcaagtccag 8160
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gtcctgagac gctgcggact caggttagta ggtagggaca gaagattaac ttgcatgatc 8280
ttttccaggg cgtgcgggag gttcagatgg tacttgattt ccacaggttc gtttgtagag 8340
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cttttgatcg gtggtggctc tcttgcttct tgcatgctca gaagcggtga cggggacgcg 8460
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cttgtacgtc accagagttg tcctggtagg cgatctccgc catgaactgc tcgatttctt 8760
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ggcccatgag ttgggagaat gcattcatgc ccgcctcgtt ccagacgcgg ctgtaaacca 8880
cggccccctc ggagtctctt gcgcgcatca ccacctgagc gaggttaagc tccacgtgtc 8940
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gtacttcgcg ttcgaaggct cccgggatct cttcttcctc ttctatctct tcttccacta 9240
acatctcttc ttcgtcttca ggcgggggcg gagggggcac gcggcgacgt cgacggcgca 9300
cgggcaaacg gtcgatgaat cgttcaatga cctctccgcg gcggcggcgc atggtttcag 9360
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attggcccgt agggactgca cgcagagatc tgatcgtgtc aagatccacg ggatctgaaa 9540
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gcacttcttc ctcacccgtt ctgccatgca tacgtgtgag tccaaatccg cgcattggtt 9900
gtaccagtgc caagtcagct acgactcttt cggcgaggat ggcttgctgt acttgggtaa 9960
gggtggcttg aaagtcatca aaatccacaa agcggtggta agctcctgta ttaatggtgt 10020
aagcacagtt ggccatgact gaccagttaa ctgtctggtg accagggcgc acgagctcgg 10080
tgtatttaag gcgcgaatag gcgcgggtgt caaagatgta atcgttgcag gtgcgcacca 10140
gatactggta ccctataaga aaatgcggcg gtggttggcg gtagagaggc catcgttctg 10200
tagctggagc gccaggggcg aggtcttcca acataaggcg gtgatagccg tagatgtacc 10260
tggacatcca ggtgattcct gcggcggtag tagaagcccg aggaaactcg cgtacgcggt 10320
tccaaatgtt gcgtagcggc atgaagtagt tcattgtagg cacggtttga ccagtgaggc 10380
gcgcgcagtc attgatgctc tatagacacg gagaaaatga aagcgttcag cgactcgact 10440
ccgtagcctg gaggaacgtg aacgggttgg gtcgcggtgt accccggttc gagacttgta 10500
ctcgagccgg ccggagccgc ggctaacgtg gtattggcac tcccgtctcg acccagccta 10560
caaaaatcca ggatacggaa tcgagtcgtt ttgctggttt ccgaatggca gggaagtgag 10620
tcctattttt tttttttgcc gctcagatgc atcccgtgct gcgacagatg cgcccccaac 10680
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caactgccgc cgtgagcggt gcgggacagc ccgcctatga tctggacttg gaagagggcg 10800
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aagattctcg cgaggcgtat gtgccccaac agaacctatt tagagacaga agcggcgagg 10920
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accgaagacg agtgttgcgg gacgaggatt tcgaagttga tgaaatgaca gggatcagtc 11040
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aagttaccct tggtttgatg catttgtggg atttgatgga agctatcatt cagaacccta 11220
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ctttcagaga ggcgctgctg aacatcaccg aacccgaggg gagatggttg tatgatctta 11340
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tttctaaaaa aaaaaaaaat gtccattctt atctcgccca gtaataacac cggttggggt 15420
ctgcgcgctc caagcaagat gtacggaggc gcacgcaaac gttctaccca acatcctgtc 15480
cgtgttcgcg gacattttcg cgctccatgg ggcgccctca agggccgcac tcgcgttcga 15540
accaccgtcg atgatgtaat cgatcaggtg gttgccgacg cccgtaatta tactcctact 15600
gcgcctacat ctactgtgga tgcagttatt gacagtgtag tggctgacgc tcgcaactat 15660
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tattatggaa ccgactataa aagtagttta gattataaca ttattgtact gccatctacc 29220
actccagcac cccgcacaac tactttctct agcagcagtg tcgctaacaa tacaatttcc 29280
aatccaacct ttgccgcgct tttaaaacgc actgtgaata attctacaac ttcacataca 29340
acaatttcca cttcaacaat cagcattatc gctgcagtga caattggaat atctattctt 29400
gtttttacca taacctacta cgcctgctgc tatagaaaag acaaacataa aggtgatcca 29460
ttacttagat ttgatattta atttgttctt ttttttttta tttacagtat ggtgaacacc 29520
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tactttcaca gcagtagcca cagcaacccc agactgtata ggagcatttg cttcctatgc 29640
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tttccaactt atagactgga tccttgtgcg aattgcctac ctgcgccacc atcccgaata 29760
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gagaaaaatc agaaattccc ccaaatttaa taatgattgc tggaataatt aatataatct 30000
gttgcaccat aatttcattt ttgatatacc ccctatttga ttttggctgg aatgctccca 30060
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cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattattgat gatg 34794
<210> 139
<211> 35343
<212> DNA
<213> Human adenovirus type 3
<400> 139
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaac atgtaaatga ggtaatttaa 60
aaaagtgcgc gctgtgtggt gattggctgc ggggttaacg gctaaaaggg gcggcgcgac 120
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gtagatgccc atgatgacga ccctaacgag gaggctgtga atttaatatt tccagaatct 780
atgattcttc aggctgacat agccaacgaa tctactccac ttcatacacc gactctgtca 840
cccatacctg aattggaaga ggaggacgaa ctagacctcc ggtgttatga ggaaggtttt 900
cctcccagcg attcagagga tgaacggggt gagcagacca tggctctgat ctcagactat 960
gcttgtgtga ttgtggagga gcaagatgtg attgaaaaat ctactgagcc agtacaaggc 1020
tgtaggaact gccagtacca ccgggataag tccggagatg tgaacgcctc ctgcgctttg 1080
tgctatatga aacagacttt cagctttatt tacagtaagt ggagtgaatg tgagagaggc 1140
tgagtgctta acacataact gtaatgcttg aacagctgtg ctaagtgtgg tttattttgt 1200
tactaggtcc ggtgtcagag gatgagttat caccctcaga agaagaccac ccgtctcccc 1260
ctgagctgtc aggcgaaacg cccctgcaag tgttcagacc caccccagtc agacccagtg 1320
gcgagaggcg agcggctgtt gacaaaattg aggacttgtt gcaggacatg ggtggggatg 1380
aacctttgga cctgagcttg aaacgcccca ggaactagac gcagctgcgc ttagtcatgt 1440
gtaaataaag ttgtacaata aaagtctatg tgacgcatgc aaggtgtggt ttatgactca 1500
tgggcggggc ttagtcctat ataagtggca acacctgggc acttgggcac agaccttcag 1560
ggagttcctg atggatgtgt ggactatcct tgcagacttt agcaagacac gccggcttgt 1620
agaggatagt tcagacgggt gctccgggtt ctggagacac tggtttggaa ctcctctatc 1680
tcgcctggtg tacacagtta agaaggatta taaagaggaa tttgaaaata tttttgctga 1740
ctgctctggc ctgctagatt ctctgaatct tggccaccag tcccttttcc aggaaagggt 1800
actccacagc cttgattttt ccagcccagg gcgcactaca gccggggttg cttttgtggt 1860
ttttctggtt gacaaatgga gccaggacac ccaactgagc aggggctaca tcctggactt 1920
cgcagccatg cacctgtgga gggcctggat caggcagcgg ggacagagaa tcttgaatta 1980
ctggcttcta cagccagcag ctccgggtct tcttcgtcta cacagacaaa catccatgtt 2040
ggaggaagaa atgaggcagg ccatggacga gaacccgagg agcggcctgg accctccgtc 2100
ggaagaggag ctggattgaa tcaggtatcc agcctgtacc cagagcttag caaggtgctg 2160
acatccatgg ccaggggagt taagagggag aggagcgatg ggggtaatac cgggatgatg 2220
accgagctga cggccagcct gatgaatcgg aagcgcccag agcgccttac ctggtacgag 2280
ctacagcagg agtgcaggga tgagttgggc ctgatgcagg ataaatatgg cctggagcag 2340
ataaaaaccc attggttgaa cccagatgag gattgggagg aggctattaa gaagtatgcc 2400
aagatagccc tgcgcccaga ttgcaagtac atagtgacca agaccgtgaa tatcagacat 2460
gcctgctaca tctcggggaa cggggcagag gtggtcatcg ataccctgga caaggccgcc 2520
ttcaggtgtt gcatgatggg aatgagagca ggagtgatga atatgaattc catgatcttc 2580
atgaacatga agttcaatgg agagaagttt aatggggtgc tgttcatggc caacagccac 2640
atgaccctgc atggctgcag tttcttcggc ttcaacaata tgtgcgcaga ggtctggggc 2700
gcttccaaga tcaggggatg taagttttat ggctgctgga tgggcgtggt cggaagaccc 2760
aagagcgaga tgtctgtgaa gcagtgtgtg tttgagaaat gctacctggg agtctctacc 2820
gagggcaatg ctagagtgag acactgctct tccctggaga cgggctgctt ctgcctggtg 2880
aagggcacag cctctctgaa gcataatatg gtgaagggct gcacggatga gcgcatgtac 2940
aacatgctga cctgcgattc gggggtctgc catatcctga agaacatcca tgtgacctcc 3000
caccccagaa agaagtggcc agtgtttgag aataacctgc tgatcaagtg ccatatgcac 3060
ctgggagcca gaaggggcac cttccagccg taccagtgca actttagcca gaccaagctg 3120
ctgttggaga acgatgcctt ctccagggtg aacctgaacg gcatctttga catggatgtc 3180
tcggtgtaca agatcctgag atacgatgag accaagtcca gggtgcgcgc ttgcgagtgc 3240
gggggcagac acaccaggat gcagccagtg gccctggatg tgaccgagga gctgagacca 3300
gaccacctgg tgatggcctg taccgggacc gagttcagct ccagtgggga ggacacagat 3360
tagaggtagg tcgagtgagt agtgggcgtg gctaaggtga ctataaaggc gggtgtctta 3420
cgagggtctt tttgcttttc tgcagacatc atgaacggga ccggcggggc cttcgaaggg 3480
gggcttttta gcccttattt gacaacccgc ctgccgggat gggccggagt tcgtcagaat 3540
gtgatgggat cgacggtgga tgggcgccca gtgcttccag caaattcctc gaccatgacc 3600
tacgcgaccg tggggagctc gtcgctcgac agcaccgccg cagccgcggc agccgcagct 3660
gccatgacag cgacgagact ggcctcgagc tacatgccca gcagcggcag cagcccctct 3720
gtgcccagtt ccatcatcgc cgaggagaaa ctgctggccc tgctggccga gctggaagcc 3780
ctgagccgcc agctggccgc cctgacccag caggtgtccg agctccgcga gcagcaacag 3840
cagcaaaata aatgattcaa taaacacaga ttctgattca aacagcaaag catctttatt 3900
atttattttt tcgcgcgcgg taggccctgg tccacctctc ccgatcattg agagtgcggt 3960
ggattttttc caggacccgg tagaggtggg attggatgtt gaggtacatg ggcatgagcc 4020
cgtcccgggg gtggaggtag caccactgca tggcctcgtg ctctggggtc gtgttgtaga 4080
tgatccagtc atagcagggg cgctgggcgt ggtgctggat gatgtctttg agaaggagac 4140
tgatggccac ggggagcccc ttggtgtagg tattggcgaa gcggttgagc tgggagggat 4200
gcatgcgggg ggagatgatg tgcagtttgg cctggatctt gaggttggcg atgttgccac 4260
ccagatcccg ccgggggttc atgttgtgca ggaccaccag gacggtgtag cccgtgcact 4320
tggggaactt gtcatgcaac ttggaaggga atgcgtggaa gaatttggag acgcccttgt 4380
gcccgcccag gttttccatg cattcatcca tgatgatggc gatgggcccg tgggctgcgg 4440
ctttggcaaa gacgtttctg gggtcagata catcataatt atgctcctgg gtgagatcat 4500
cataagacat tttaatgaat ttggggcgga gggtgccaga ttgggggacg atggttccct 4560
cgggccccgg ggcgaagttc ccctcacaga tctgcatctc ccaggctttc atctcggagg 4620
gggggatcat gtccacctgc ggggcgatga aaaaaacggt ttccggggct ggggtgatga 4680
gctgcgaaga gagcaggttt ctcaacagct gggacttgcc gcacccggtc gggccgtaga 4740
tgaccccgat gacgggttgc aggtggtagt tcaaggacat gcagctgccg tcgtcccgga 4800
ggaggggggc cacctcgttg agcatgtctc tgacttggag gttttcccga acgagctcgc 4860
cgaggaggcg gtccccgccc agcgagagga gctcttgcag ggaagcaaag tttttcaggg 4920
gcttgagtcc gtcggccatg ggcatcttgg cgagggtctg cgagaggagc tccaggcggt 4980
cccagagctc ggtgacgtgc tctacggcat ctcgatccag cagacttcct cgtttcgggg 5040
gttgggacga ctgcgactgt agggcacgag acgatgggcg tccagcgcgg ccagcgtcat 5100
gtccttccag ggtctcaggg tccgagtgag ggtggtctcc gtcacggtga aggggtgggc 5160
ccctggctgg gcgcttgcaa gggtgcgctt gagactcatc ctgctggtgc tgaaacgggc 5220
acggtcttcg ccctgcgagt cggcgagata gcagttgacc atgagctcgt agttgagggc 5280
ctcggcggcg tggcccttgg cgcggagctt gcccttggaa gagcgcccgc aggcgggaca 5340
gaggagggat tgcagggcgt agagcttggg ggcgagaaag acggactcgg gagcgaaagc 5400
gtccgctccg cagtgggcgc agacggtctc gcactcgacg agccaggtga gctctggctg 5460
ctcggggtca aaaaccagtt ttcccccgtt ctttttgatg cgcttcttac ctcgcgtctc 5520
catgagtctg tgtccgcgct cggtgacaaa caggctgtcg gtgtccccgt agacggactt 5580
gattggcctg tcctgcaggg gcgtcccgcg gtcctcctcg tagagaaact cggaccactc 5640
tgagacaaag gcgcgcgtcc acgccaagac aaaggaggcc acgtgcgagg ggtagcggtc 5700
gttgtccact agggggtcca ccttttccac cgtgtgcaga cacatgtccc cctcctccgc 5760
atccaagaag gtgattggct tgtaggtgta ggccacgtga ccgggggtcc ccgacggggg 5820
ggtataaaag ggggcgggtc tgtgctcgtc ctcactctct tccgcgtcgc tgtccacgag 5880
cgccagctgt tggggtaggt attccctctc gagagcgggc atgacctcgg cactcaggtt 5940
gtcagtttct agaaacgagg aggatttgat gttggcttgc cctgccgcga tgctttttag 6000
gagactttca tccatctggt cagaaaagac tattttttta ttgtcaagct tggtggcgaa 6060
ggagccatag agggcgttgg atagaagctt ggcgatggat ctcatggtct gatttttgtc 6120
acggtcggcg cgctccttgg ccgcgatgtt tagctggaca tactcgcgcg cgacgcactt 6180
ccattcgggg aagacggtgg tgcgctcgtc gggcacgatc ctgacgcgcc agccgcggtt 6240
atgcagggtg accaggtcca cgctggtggc cacctcgccg cgcaggggct cgttggtcca 6300
gcagagtctg ccgcccttgc gcgagcagaa cgggggcagc acatcaagca gatgctcgtc 6360
aggggggtcc gcatcgatgg tgaagatgcc cggacagagt tccttgtcaa aataatcgat 6420
ttttgaggat gcatcatcca aggccatctg ccactcgcgg gcggccagcg ctcgctcgta 6480
ggggttgagg ggcggacccc agggcatggg atgagtgagg gcggaggcgt acatgccgca 6540
gatgtcgtag acatagatgg gctccgagag gatgccgatg taggtgggat aacagcgccc 6600
cccgcggatg ctggcgcgca cgtagtcata caactcgtgc gagggggcca agaaggcggg 6660
gccgagattg gtgcgctggg gctgctcggc gcggaagacg atctggcgaa agatggcgtg 6720
cgagttggag gagatggtgg gccgttggaa gatgttaaag tgggcgtggg gcaagcggac 6780
cgagtcgcgg atgaagtgcg cgtaggagtc ttgcagcttg gcgacgagct cggcggtgac 6840
gaggacgtcc atggcgcagt agtccagcgt ttcgcggatg atgtcataac ccgcctctcc 6900
tttcttctcc cacagctcgc ggttgagggc gtactcctcg tcatccttcc agtactcccg 6960
gagcgggaat cctcgatcgt ccgcacggta agagcccagc atgtagaaat ggttcacggc 7020
cttgtaggga cagcagccct tctccacggg gagggcgtaa gcttgagcgg ccttgcggag 7080
cgaggtgtgc gtcagggcga aggtgtccct gaccatgact ttcaagaact ggtacttgaa 7140
atccgagtcg tcgcagccgc cgtgctccca gagctcgaaa tcggtgcgct tcttcgagag 7200
ggggttaggc agagcgaaag tgacgtcatt gaagagaatc ttgcctgctc gcggcatgaa 7260
attgcgggtg atgcggaaag ggcccgggac ggaggctcgg ttgttgatca cctgggcggc 7320
aaggacgatc tcgtcgaagc cgttgatgtt gtgcccgacg atgtagagtt ccatgaatcg 7380
cgggcggcct ttgatgtgcg gcagcttttt gagctcctcg taggtgaggt cctcggggca 7440
ttgcaggccg tgctgctcta gcgcccactc ctggagatgt gggttggctt gcatgaagga 7500
agcccagagc tcgcgggcca tgagggtctg gagctcgtcg cgaaagaggc ggaactgctg 7560
gcccacggcc atcttttctg gggtgacgca gtagaaggtg agggggtccc gctcccagcg 7620
atcccagcgt aagcgcacgg cgagatcgcg agcgagggcg accagctcgg gttcccccga 7680
gaatttcatg accagcatga aggggacgag ctgcttgccg aaggacccca tccaggtgta 7740
ggtttctaca tcgtaggtga caaagagccg ctccgtgcga ggatgagagc cgattgggaa 7800
gaactggatt tcctgccacc agttggacga gtggctgttg atgtgatgaa agtagaaatc 7860
ccgccggcga accgagcact cgtgctgatg cttgtaaaag cgtccgcagt actcgcagcg 7920
ctgcacgggc tgtacctcat ccacgagata cacagcgcgt cccttgagga ggaacttcag 7980
gagtggcggc cctggctggt ggctttcatg ttcgcctgcg tgggactcac cctggggctc 8040
ctcgaggacg gagaggctga cgagcccgcg cgggagccag gtccagatct cggcgcggcg 8100
ggggcggaga gcgaagacga gggcgcgcag ttgggagctg tccatggtgt cgcggagatc 8160
caggtccggg ggcagggttc tgaggttgac ctcgtagagg cgggtgaggg cgtgcttgag 8220
atgcagatgg tacttgatct ccacgggtga gttggtggtc gtgtccacgc attgcatgag 8280
cccgtagctg cgcggggcca cgaccgtgcc gcggtgcgct tttagaagcg gtgtcgcggg 8340
cgtgctcccg gcggcagcgg cggttctggc cccgcgggca ggggcggcag aggcacgtcg 8400
gcgtggcgct cgggcaggtc ccggtgctgc gccctgagag cgctggcgtg cgcgacgacg 8460
cggcggttga catcctggat ctgccgcctc tgcgtgaaga ccacgggccc cgtgactttg 8520
aacctgaaag acagttcaac agaatcaatc tctgcgtcat tgacggcggc ctgacgcagg 8580
atctcttgca cgtcgcccga gttgtcctgg taggcgatct cggtcatgaa ctgttcgatc 8640
tcctcctcct ggagatcgcc gcggcccgcg cgctccacgg tggcggcgag gtcattggag 8700
atgcggccca tgagctgcga gaaggcgccc aggccgctct cgttccagac gcggctgtag 8760
accacgtccc cgtcggcgtc gcgtgcgcgc atgaccacct gcgcgaggtt gagctccacg 8820
tgccgcgtga agacggcgta gttgcgcagg cgctggaaga ggtagttgag ggtggtggcg 8880
atgtgctcgg tgacgaagaa gtacatgatc cagcggcgca ggggcatctc gctgatgtcg 8940
ccgatggcct ccagcctttc catggcctcg tagaaatcca cggcgaagtt gaaaaactgg 9000
gcattgcggg ccgagaccgt gagctcgtct tccaggagcc ggatgagctc ggcgatggtg 9060
gcgcgcacct cgcgctcgaa atccccgggg gcctcctctt cttcctcttc ttccatgacg 9120
acctcttctt ctatttcttc ctctgggggc ggtggtggtg gcggggcccg acgacgacgg 9180
cgacgcaccg ggagacggtc gacgaagcgc tcgatcatct ccccgcggcg gcgacgcatg 9240
gtttcggtga cggcgcgacc ccgttcgcga ggacgcagcg tgaagacgcc gccggtcatc 9300
tcccggtaat ggggcgggtc cccgttgggc agcgataggg cgctgacgat gcatcttatc 9360
aattgcggtg taggggacgt gagcgcgtcg agatcgaccg gatcggagaa tctttcgagg 9420
aaagcgtcta gccaatcgca gtcgcaaggt aagctcaaac acgtagcagc cctgtggacg 9480
ctgttagaat tgcggttgct gatgatgtaa ttgaagtagg cgtttttgag gcggcggatg 9540
gtggcgagga ggaccaggtc cttgggtccc gcttgctgga tgcggagccg ctcggccatg 9600
ccccaggcct ggccctgaca ccggctcagg ttcttgtagt agtcatgcat gagcctctcg 9660
atgtcatcac tggcggaggc ggagtcttcc atgcgggtga ccccgacgcc cctgagcggc 9720
tgcacgagcg ccaggtcggc gacgacgcgc tcggcgagga tggcctgttg cacgcgggtg 9780
agggtgtcct ggaagtcgtc catgtcgaca aagcggtggt aggccccggt gttgatggtg 9840
taggtgcagt tggccatgag cgaccagttg acggtctgca ggccgggttg cacgacctcg 9900
gagtacctga gccgcgagaa ggcgcgcgag tcgaagacgt agtcattgca ggtgcgcacg 9960
aggtactggt agccgactag gaagtgcggc ggcggctggc ggtagagcgg ccagcgctgg 10020
gtggccggcg cgcccggggc caggtcctcg agcatgaggc ggtggtagcc gtagaggtag 10080
cgggacatcc aggtgatgcc ggcggcggtg gtggaggcgc gcgggaactc gcggacgcgg 10140
ttccagatgt tgcgcagcgg caggaaatag tccatggtcg gcacggtctg gccggtgaga 10200
cgcgcgcagt cattgacgct ctagaggcaa aaacgaaagc ggttgagcgg gctcttcctc 10260
cgtagcctgg cggaacgcaa acgggttagg ccgcgtgtgt accccggttc gagtcccctt 10320
gaatcaggct ggagccgcga ctaacgtggt attggcactc ccgtctcgac ccgagcccga 10380
tagccgccag gatacggcgg agagtccttt ttgccggcca aggggggtcg ctagacttga 10440
aagcgaccga aaaccctgcc gggtagtggc tcgcgcccgt agtctggaga agcatcgcca 10500
gggttgagtc gcggcagaac ccggttcgcg gacggccgcg gcgagcggga cttggtcacc 10560
ccgccgattt aaagacccac agccagccga cttctccagt tacgggagcg agcccccttt 10620
tttctttttg ccagatgcat cccgtcctgc gccaaatgcg tcccaccccc ccggcgacca 10680
ccgcgaccgc ggccgtagca ggcgccggcg ctagccagcc acagccacag acagagatgg 10740
acttggaaga gggcgaaggg ctggcgagac tgggggcgcc gtccccggag cgacaccccc 10800
gcgtgcagct gcagaaggac gtgcgcccgg cgtacgtgcc tgcgcagaac ctgttcaggg 10860
accgcagcgg ggaggagccc gaggagatgc gcgactgccg gtttcgggcg ggcagggagc 10920
tgcgcgaggg cctggaccgc cagcgcgtgc tgcgcgacga ggatttcgag ccgaacgagc 10980
agacggggat cagccccgcg cgcgctcacg tggcggcggc caacctggtg acggcctacg 11040
agcagacggt gaagcaggag cgcaacttcc aaaagagttt caacaaccac gtgcgcaccc 11100
tgatcgcgcg cgaggaggtg gccctgggcc tgatgcacct gtgggacctg gcggaggcca 11160
tcgtgcagaa cccggacagc aagcctctga cggcgcagct gttcctggtg gtgcagcaca 11220
gcagggacaa cgaggcgttc agggaggcac tgctgaacat cgccgagccc gagggtcgct 11280
ggctgctgga gctgatcaac atcttgcaga gcatcgtagt gcaggagcgc agcctgagct 11340
tggccgagaa ggtggcggcg atcaactact cggtgctgag cctgggcaag ttttacgcgc 11400
gcaagattta caagacgccg tacgtgccca tagacaagga ggtgaagata gacagctttt 11460
acatgcgcat ggcgctcaag gtgctgacgc tgagcgacga cctgggcgtg taccgcaacg 11520
accgcatcca caaggccgtg agcacgagcc ggcggcgcga gctaagcgac cgcgagctga 11580
tgctgagcct gcgccgggcg ctggtagggg gcgctgccgg cggcgaggag tcctacttcg 11640
acatgggggc ggacctgcat tggcagccga gccggcgcgc cttggaggcc gcctacggtc 11700
cagaggactt ggatgaggaa gaggaagagg aggaggatgc acccgctgcg gggtactgac 11760
gcctccgtga tgtgttttta gatgcagcaa gccccggacc ccgccataag ggcggcgctg 11820
caaagccagc cgtccggtct agcatcggac gactgggagg ccgcgatgca acgcatcatg 11880
gccctgacga cccgcaaccc cgagtccttt agacaacagc cgcaggccaa cagactctcg 11940
gccattctgg aggcggtggt cccctctcgg accaacccca cgcacgagaa ggtgctggcg 12000
atcgtgaacg cgctggcgga gaacaaggcc atccgtcccg acgaggccgg gctggtgtac 12060
aacgccctgc tggagcgcgt gggccgctac aacagcacga acgtgcagtc caacctggac 12120
cggctggtga cggacgtgcg cgaggccgtg gcgcagcgcg agcggttcaa gaacgagggc 12180
ctgggctcgc tggtggcgct gaacgccttc ctggcgacgc agccggcgaa cgtgccgcgc 12240
gggcaggacg attacaccaa ctttatcagc gcgctgcggc tgatggtgac cgaggttccc 12300
cagagcgagg tgtaccagtc gggcccggac tactttttcc agacgagccg gcagggcttg 12360
cagacggtga acctgagcca ggctttcaag aacctgcgag ggctgtgggg cgtgcaggcg 12420
cccgtgggcg accggtcgac ggtgagcagc ttgctgacgc ccaactcgcg gctgctgctg 12480
ctgctgatcg cgcccttcac cgacagcggc agcgtgaacc gcaactcgta cctgggccat 12540
ctgctgacgc tgtaccgcga ggccataggc caggcgcagg tggacgagca gaccttccag 12600
gagatcacta gcgtgagccg cgcgctgggg cagaacgaca ccgacagtct gagggccacc 12660
ctgaacttct tgctgaccaa tagacagcag aagatcccgg cgcaatatgc gctgtcggcc 12720
gaggaggaaa ggatcctgag atatgtgcag cagagcgtag ggctgttcct gatgcaggag 12780
ggggccaccc ccagcgccgc gctggacatg accgcgcgca acatggaacc tagcatgtac 12840
gccgccaacc ggccgttcat caataagctg atggactacc tgcaccgcgc ggcggtcatg 12900
aacacggact actttacaaa cgccatcctg aacccgcact ggctcccgcc gccggggttc 12960
tacacgggcg agtacgacat gcccgacccc aacgacgggt tcctgtggga cgacgtggac 13020
agcgtggtgt tctcgccgac ctttcaaaag cgccaggagg cgccgccgag cgagggcgcg 13080
gtggggagga gcccctttcc tagcttaggg agtttgcata gcttgccggg ctcggtgaac 13140
agcggcaggg tgagccggcc gcgcttgctg ggcgaggacg agtacctgaa cgactcgctg 13200
ctgcagccgc cgcgggccaa gaacgccatg gccaataacg ggatagagag tctggtggac 13260
aaactgaacc gttggaagac ctacgctcag gaccataggg atgcgcccgc gccgcggcga 13320
cagcgccacg accggcagcg gggcctggtg tgggacgacg aggactcggc cgacgatagc 13380
agcgtgttgg acttgggcgg gagcggtggg gtcaacccgt tcgcgcatct gcagcccaaa 13440
ctggggcgac ggatgttttg aaatgcaaaa taaaactcac caaggccata gcgtgcgttc 13500
tcttccttgt tagagatgag gcgtgcggtg gtgtcttcct ctcctcctcc ctcgtacgag 13560
agcgtgatgg cgcaggcgac cctggaggtt ccgtttgtgc ctccgcggta tatggctcct 13620
acggagggca gaaacagcat tcgttactcg gagctggctc cgcagtacga caccactcgc 13680
gtgtacttgg tggacaacaa gtcggcggac atcgcttccc tgaactacca aaacgaccac 13740
agcaacttcc tgaccacggt ggtgcagaac aacgatttca cccccgccga ggccagcacg 13800
cagacgataa attttgacga gcggtcgcgg tggggcggtg atctgaagac cattctgcac 13860
actaacatgc ccaatgtgaa cgagtacatg ttcaccagca agtttaaggc gcgggtgatg 13920
gtggctagga agcatccaga gggggtagtt gaaacagatt tgagtcagga taagcttgaa 13980
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gagagcgata tcggagtcaa gtttgacagc agaaatttca agctgggctg ggacccggtg 14160
accaagctgg tgatgccagg ggtctacacc tacgaggcct tccacccgga cgtggtgctg 14220
ctgccgggct gcggggtgga cttcaccgag agccgcctga gcaacctcct gggcattcgc 14280
aagaagcaac ctttccaaga gggcttcaga atcatgtatg aggatctaga aggtggcaac 14340
atccccgccc tccttgatgt gcccaagtac ttggaaagca agaagaaagt tgaagacgaa 14400
actaaaaatg cagctgcggc tacagccgat acaaccacta ggggtgatac atttgcaact 14460
ccagcgcaag agacagcagc tgataagaag gtagaagtct tgcccattga aaaggatgag 14520
agtggtagaa gttacaacct gatccagggg acccacgaca cgctgtaccg cagttggtac 14580
ctgtcctata cctacgggga ccccgagaag ggggtgcagt cgtggacgct gctcaccacc 14640
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ccagtcacct tccgctctac ccagcaagtc agcaactacc ccgtggtcgg cgccgagctc 14760
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tacatgtaac atccagaacc tgacactgct ctttgtcaac ttaacgcata atggagcata 28080
cattggttat aacaaagacg gttctgatag agaattatat gaggtgtcag tcaaaacctt 28140
gtttcagaac ggggctggac aaagtaaggt tgaacaaggt aataaaggga aacctaatac 28200
tgctcaaagt ggtggtaaaa aaaccaaaac agaacataga aaccagagtc caaaaagaaa 28260
atcaacaaat aaccttcagc caacacaatt gtatgttagg ccttttacta atgttagttt 28320
aactggacct ccaaatggca aggttacttg gtatgatggc gaacttaatg atccatgtga 28380
acaaaagtac aaactcagaa ctttttgcaa tcagcaaaat ctaactttaa ttaatgtaag 28440
cagcacttat gatggcatct attatggcac tgatgaaaaa gataaggcaa atcgttacag 28500
aataaaagta aatactacaa atcacaaaac tgttaaaatt aagccacata ccagagaacc 28560
tcctgctgta caagaaaaac agtttgaatt acaagatgca gaaactgatg aaaacgaatc 28620
aaaaattccc tcagctactg tggcaatcgt ggtgggagtg attgcgggct ttgtaactct 28680
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ggtagaccca ctactcagct tctcttactg aaactcagtc actctcattt cagaaccatg 28800
aaggctttca cagcttgcgt tctgattagc atagtcacac ttagttcagc tgcaatgatt 28860
aatgttaatg tcactagagg tggtaaaatt acattgaatg ggacttatcc acaaactaca 28920
tggacaagat atcataaaga tggatggaaa aatatctgtg aatggaatgt tactgcatat 28980
aaatgcttca ataatggaag cattactatt actgccactg ccaacattac ttctggcaca 29040
tacaaagctg aaagctataa aaatgaaatc aaaaaactaa cctataaaaa caacaaaacc 29100
acatttgaag attctggaaa ttatgaacat caaaaattat ctttttatat gttgacaata 29160
attgaactgc ctacaactaa ggctcccacc acaaccagta caactattaa gaccactact 29220
cacactacag tgcaaaatac tactttattg attgggtttt tactgagaga gaatgaaagt 29280
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gatattcaaa ttacttttct ggttgtctgt gggatcttta ttcttgtggt tcttctgtac 29460
tttgtctgct gcaaagccag agagaaatct aggaggccca tctacaggcc agtgattggg 29520
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tgctcatgct gctatccctc ctatcccctg ccctcgccac ttctgctgac tctaaatgca 29940
aattcgcgga gatatggaat ttcttagatt gctatcagga gaaaattgat atgccctcct 30000
attacttggt gattgtggga atagtcatgg tctgctcctg cactttcttt gccatcatga 30060
tctacccctg ttttgatctc ggctggaact ctgttgaggc attcacatac acactagaaa 30120
gcagttcact agcctccacg ccaccgccca caccgcctcc ccgcagaaat cagttcccac 30180
tgattcagta cttagaagag ccccctcccc ggcccccttc cactgttagc tactttcaca 30240
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cagcgcatcc tgcaactgcg cgtccgtcag cagcaggagc gggccgccaa ggagctcctc 30360
gatgccatca acatccacca gtgcaagaag ggcatcttct gccttgtcaa acaggcaaag 30420
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ggcgagacca acggctgcat ccactgctcc tgcgaaagcc ccgagtgcat atactccctc 30600
ctcaagaccc tttgcggact ccgcgacctc ctccccatga actgatgttg attaaaagca 30660
cgaaaaccaa tcagaccctt cccccatttc cccattccca attactcata aaataaatca 30720
ttggaattaa tcattcaata aaaatcactt acttgaaatc tgaaagtatg tctctggtgt 30780
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cggcgaactt cctccacacc ttgaaaggga tgtcaaattc ctggtccaca attttcattg 30900
tcttccctct cagatgtcaa agaggctccg ggtggaagat gacttcaacc ccgtctaccc 30960
ctatggctac gcgcggaatc agaatatccc cttcctcact cccccctttg tctcctccga 31020
tggattccaa aacttccccc ctggggtcct gtcactcaaa ctggctgacc caatagccat 31080
cgtcaatggg aatgtctcac tcaaagtggg agggggtctc actttgcaag atggaactgg 31140
aaaactaaca gtcaatgctg atccaccttt gcaacttaca aacaacaaat tagggattgc 31200
tttggacgct ccatttgatg ttatagacaa taaactcaca ttgttagcgg gccatggctt 31260
gtctattata acaaaagaaa catcaacact gcctggcttg attaatactc ttgtagtatt 31320
aactggaaag ggtattggaa cagaatcaac agataatggc ggaagcgtat gtgttagagt 31380
tggagaaggt ggcggcttat catttaataa tgatggagac ttggtagcat ttaataaaaa 31440
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accagtaacc attaaaacta cctttaatca ggaaactgga tgtgaatatt ctatcacatt 31920
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acataatcac catgttattc agcagcccat aattcagggc gctccagcca aagctcatgt 32580
tggggatgat ggaacccacg tgaccatcgt accagatgcg gcagtatatc aggtgcctgc 32640
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cggccagcag ggtgcctccc gcccgacact gcagggagcc cggggatgaa cagtggcaat 32820
gcaggatcca gcgctcgtac ccgctcacca tctgagctct caccaagtcc agggtagcag 32880
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ggacagaact tacattatga taatctgcat gatcacaatc gggcaacagg ggatgttgtt 33060
cagtcagtga agccctggtt tcctcatcag atcgtggtaa acgggccctg cgatatggat 33120
gatggcggag cgagctggat tgaatctcgg tttgcattgt agtggattct cttgcgtacc 33180
ttgtcgtact tctgccagca gaaatgggcc cttgaacagc agatacccct cctgcggccg 33240
tcctttcgct gctgccgctc agtcatccaa ctgaagtaca tccattctcg aagattctgg 33300
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gtacatccag cataagaatc acattaaagg ctggccctcc atcgatttca tcaatcatca 33660
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tcacttcctc gtatcgattt cgtgactcaa cttccgggtt cccacgttac gtcacttctg 34860
cccttacatg taactcagtc gtagggcgcc atgttgccca cgtccaaaat ggtttccatg 34920
tccagccacg cctccgcggc gaccgttagc cgtgcgtcgt gacgtcattt gcatcgtctt 34980
ctctcgtcca atcagcgttg gctccgcccc gaaaccgtta aaattcaaaa gctcatttgc 35040
atattaactt ttgtttactt tgtggggtat attatataga tag 35083
<210> 141
<211> 34794
<212> DNA
<213> Human adenovirus type 11
<400> 141
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg atcgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gctaaaaggg gcggtgcgac 120
cgtgggaaaa tgacgttttg tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtg 180
acgcataaaa aggctttttt ctcacggaac tacttagttt tcccacggta tttaacagga 240
aatgaggtag ttttgaccgg atgcaagtga aaattgttga ttttcgcgcg aaaactgaat 300
gaggaagtgt ttttctgaat aatgtggtat ttatggcagg gtggagtatt tgttcagggc 360
caggtagact ttgacccatt acgtggaggt ttcgattacc gtgtttttta cctgaatttc 420
cgcgtaccgt gtcaaagtct tctgttttta cgtaggtgtc agctgatcgc tagggtattt 480
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ctgcgccggc agtttaataa taaaaaaatg agagatttgc gatttctgcc tcaggaaata 600
atctctgctg agactggaaa tgaaatattg gagcttgtgg tgcacgccct gatgggagac 660
gatccggagc cacctgtgca gctttttgag cctcctacgc ttcaggaact gtatgattta 720
gaggtagagg gatcggagga ttctaatgag gaagctgtaa atggcttttt taccgattct 780
atgcttttag ctgctaatga agggttagaa ttagatccgc ctttggacac ttttgatact 840
ccaggggtaa ttgtggaaag cggtacaggt gtaagaaaat tacctgattt gagttccgtg 900
gactgtgatt tgcactgcta tgaagacggg tttcctccga gtgatgagga ggaccatgaa 960
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cagttggatt gcccggagct tcctggacat ggctgtaagt cttgtgaatt tcacaggaaa 1080
aatactggag taaaggaact gttatgttcg ctttgttata tgagaacgca ctgccacttt 1140
atttacagta agtgtgttta agttaaaatt taaaggaata tgctgttttt cacatgtata 1200
ttgagtgtga gttttgtgct tcttattata ggtcctgtgt ctgatgctga tgaatcacca 1260
tctcctgatt ctactacctc acctcctgag attcaagcac ctgttcctgt ggacgtgcgc 1320
aagcccattc ctgtgaagct taagcctggg aaacgtccag cagtggaaaa acttgaggac 1380
ttgttacagg gtggggacgg acctttggac ttgagtacac ggaaacgtcc aagacaataa 1440
gtgttccata tccgtgttta cttaaggtga cgtcaatatt tgtgtgacag tgcaatgtaa 1500
taaaaatatg ttaactgttc actggttttt attgcttttt gggcggggac tcaggtatat 1560
aagtagaagc agacctgtgt ggttagctca taggagctgg ctttcatcca tggaggtttg 1620
ggccattttg gaagacctta ggaagactag gcaactgtta gagaacgctt cggacggagt 1680
ctccggtttt tggagattct ggttcgctag tgaattagct agggtagttt ttaggataaa 1740
acaggactat aaccaagaat ttgaaaagtt gttggtagat tgcccaggac tttttgaagc 1800
tcttaatttg ggccatcagg ttcactttaa agaaaaagtt ttatcagttt tagacttttc 1860
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cccgcagact catttcagca ggggatacgt tttggatttc atagccacag cattgtggag 1980
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agtcgcagac gtcctgaaac catttggtgg catgaggttc agaaagaggg aagggatgaa 2340
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gctgaggtgg taatagatac tcaagacaag gcagttatta gatgctgcat gatggatatg 2580
tggcctgggg tagtcggtat ggaagcagta acttttgtaa atgttaagtt taggggagat 2640
ggttataatg gaatagtgtt tatggccaat accaaactta tattgcatgg ttgtagcttt 2700
tttggtttca acaatacctg tgtagatgcc tggggacagg ttagtgtacg gggatgtagt 2760
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cattgtaata tgctggctac tgtgcatatt gtttcccatc aacgcaaaaa atggcctgtt 3060
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ccggtgtgtg tagatgtgac tgaagatctc agaccggatc atttggttat tgcccgcact 3360
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ggggtgggat tttcagatgg acagattgag taaaaatttg ttttttctgt cttgcagctg 3480
tcatgagtgg aaacgcttct tttaaggggg gagtcttcag cccttatctg acagggcgtc 3540
tcccatcctg ggcaggagtt cgtcagaatg ttatgggatc tactgtggat ggaagacccg 3600
tccaacccgc caattcttca acgctgacct atgctacttt aagttcttca cctttggacg 3660
cagctgcagc tgccgccgcc gcttctgttg ccgctaacac tgtgcttgga atgggttact 3720
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cgatcgttgt caaccagggg gtccaccttt tccaaagtat gcaaacacat gtcaccctct 5820
tcaacatcca ggaatgtgat tggcttgtag gtgtatttca cgtgacctgg ggtccccgct 5880
gggggggtat aaaagggggc ggttctttgc tcttcctcac tgtcttccgg atcgctgtcc 5940
aggaacgtca gctgttgggg taggtattcc ctctcgaagg cgggcatgac ctctgcactc 6000
aggttgtcag tttctaagaa cgaggaggat ttgatattga cagtgccggt tgagatgcct 6060
ttcatgaggt tttcgtccat ttggtcagaa aacacaattt ttttattgtc aagtttggtg 6120
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cacttccatt cggggaagat agttgttaat tcatctggca cgattctcac ttgccaccct 6300
cgattatgca aggtaattaa atccacactg gtggccacct cgcctcgaag gggttcattg 6360
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tgagaattgg aagagatggt gggtctttga aaaatgttga aatgggcatg aggtagacct 6840
acagagtctc tgacaaagtg ggcataagat tcttgaagct tggttaccag ttcggcggtg 6900
acaagtacgt ctagggcgca gtagtcaagt gtttcttgaa tgatgtcata acctggttgg 6960
tttttctttt cccacagttc gcggttgaga aggtattctt cgcgatcctt ccagtactct 7020
tctagcggaa acccgtcttt gtctgcacgg taagatccta gcatgtagaa ctgattaact 7080
gccttgtaag ggcagcagcc cttctctacg ggtagagagt atgcttgagc agcttttcgt 7140
agcgaagcgt gagtaagggc aaaggtgtct ctgaccatga ctttgagaaa ttggtatttg 7200
aagtcgatgt cgtcacaggc tccctgttcc cagagttgga agtctacccg tttcttgtag 7260
gcggggttgg gcaaagcgaa agtaacatca ttgaagagaa tcttaccggc tctgggcata 7320
aaattgcgag tgatgcgaaa aggctgtggt acttccgctc gattgttgat cacctgggca 7380
gctaggacga tctcgtcgaa accgttgatg ttgtgtccta cgatgtataa ttctatgaaa 7440
cgcggcgtgc ctctgacgtg aggtagctta ctgagctcat caaaggttag gtctgtgggg 7500
tcagataagg cgtagtgttc gagagcccat tcgtgcaggt gaggatttgc atgtaggaat 7560
gatgaccaaa gatctaccgc cagtgctgtt tgtaactggt cccgatactg acgaaaatgc 7620
cggccaattg ccattttttc tggagtgaca cagtagaagg ttctggggtc ttgttgccat 7680
cgatcccact tgagtttaat ggctagatcg tgggccatgt tgacgagacg ctcttctcct 7740
gagagtttca tgaccagcat gaaaggaact agttgtttgc caaaggatcc catccaggtg 7800
taagtttcca catcgtaggt caggaagagt ctttctgtgc gaggatgaga gccgatcggg 7860
aagaactgga tttcctgcca ccagttggag gattggctgt tgatgtgatg gaagtagaag 7920
tttctgcggc gcgccgagca ttcgtgtttg tgcttgtaca gacggccgca gtagtcgcag 7980
cgttgcacgg gttgtatctc gtgaatgagt tgtacctggc ttcccttgac gagaaatttc 8040
agtgggaagc cgaggcctgg cgattgtatc tcgtgctctt ctatattcgc tgtatcggcc 8100
tgttcatctt ctgtttcgat ggtggtcatg ctgacgagcc cccgcgggag gcaagtccag 8160
acctcggcgc gggaggggcg gagctgaagg acgagagcgc gcaggctgga gctgtccaga 8220
gtcctgagac gctgcggact caggttagta ggtagggaca gaagattaac ttgcatgatc 8280
ttttccaggg cgtgcgggag gttcagatgg tacttgattt ccacaggttc gtttgtagag 8340
acgtcaatgg cttgcagggt tccgtgtcct ttgggcgcca ctaccgtacc tttgtttttt 8400
cttttgatcg gtggtggctc tcttgcttct tgcatgctca gaagcggtga cggggacgcg 8460
cgccgggcgg cagcggttgt tccggacccg agggcatggc tggtagtggc acgtcggcgc 8520
cgcgcacggg caggttctgg tactgcgctc tgagaagact tgcgtgcgcc accacgcgtc 8580
gattgacgtc ttgtatctga cgtctctggg tgaaagctac cggccccgtg agcttgaacc 8640
tgaaagagag ttcaacagaa tcaatttcgg tatcgttaac ggcagcttgt ctcagtattt 8700
cttgtacgtc accagagttg tcctggtagg cgatctccgc catgaactgc tcgatttctt 8760
cctcctgaag atctccgcga cccgctcttt cgacggtggc cgcgaggtca ttggagatac 8820
ggcccatgag ttgggagaat gcattcatgc ccgcctcgtt ccagacgcgg ctgtaaacca 8880
cggccccctc ggagtctctt gcgcgcatca ccacctgagc gaggttaagc tccacgtgtc 8940
tggtgaagac cgcatagttg cataggcgct gaaaaaggta gttgagtgtg gtggcaatgt 9000
gttcggcgac gaagaaatac atgatccatc gtctcagcgg catttcgcta acatcgccca 9060
gagcttccaa gcgctccatg gcctcgtaga agtccacggc aaaattaaaa aactgggagt 9120
ttcgcgcgga cacggtcaat tcctcctcga gaagacggat gagttcggct atggtggccc 9180
gtacttcgcg ttcgaaggct cccgggatct cttcttcctc ttctatctct tcttccacta 9240
acatctcttc ttcgtcttca ggcgggggcg gagggggcac gcggcgacgt cgacggcgca 9300
cgggcaaacg gtcgatgaat cgttcaatga cctctccgcg gcggcggcgc atggtttcag 9360
tgacggcgcg gccgttctcg cgcggtcgca gagtaaaaac accgccgcgc atctccttaa 9420
agtggtgact gggaggttct ccgtttggga gggagagggc gctgattata cattttatta 9480
attggcccgt agggactgca cgcagagatc tgatcgtgtc aagatccacg ggatctgaaa 9540
acctttcgac gaaagcgtct aaccagtcac agtcacaagg taggctgagt acggcttctt 9600
gtgggcgggg gtggttatgt gttcggtctg ggtcttctgt ttcttcttca tctcgggaag 9660
gtgagacgat gctgctggtg atgaaattaa agtaggcagt tctaagacgg cggatggtgg 9720
cgaggagcac caggtctttg ggtccggctt gctggatacg caggcgattg gccattcccc 9780
aagcattatc ctgacatcta gcaagatctt tgtagtagtc ttgcatgagc cgttctacgg 9840
gcacttcttc ctcacccgtt ctgccatgca tacgtgtgag tccaaatccg cgcattggtt 9900
gtaccagtgc caagtcagct acgactcttt cggcgaggat ggcttgctgt acttgggtaa 9960
gggtggcttg aaagtcatca aaatccacaa agcggtggta agctcctgta ttaatggtgt 10020
aagcacagtt ggccatgact gaccagttaa ctgtctggtg accagggcgc acgagctcgg 10080
tgtatttaag gcgcgaatag gcgcgggtgt caaagatgta atcgttgcag gtgcgcacca 10140
gatactggta ccctataaga aaatgcggcg gtggttggcg gtagagaggc catcgttctg 10200
tagctggagc gccaggggcg aggtcttcca acataaggcg gtgatagccg tagatgtacc 10260
tggacatcca ggtgattcct gcggcggtag tagaagcccg aggaaactcg cgtacgcggt 10320
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gcgcgcagtc attgatgctc tatagacacg gagaaaatga aagcgttcag cgactcgact 10440
ccgtagcctg gaggaacgtg aacgggttgg gtcgcggtgt accccggttc gagacttgta 10500
ctcgagccgg ccggagccgc ggctaacgtg gtattggcac tcccgtctcg acccagccta 10560
caaaaatcca ggatacggaa tcgagtcgtt ttgctggttt ccgaatggca gggaagtgag 10620
tcctattttt tttttttgcc gctcagatgc atcccgtgct gcgacagatg cgcccccaac 10680
aacagccccc ctcgcagcag cagcagcagc aatcacaaaa ggctgtccct gcaactactg 10740
caactgccgc cgtgagcggt gcgggacagc ccgcctatga tctggacttg gaagagggcg 10800
aaggactggc acgtctaggt gcgccttcac ccgagcggca tccgcgagtt caactgaaaa 10860
aagattctcg cgaggcgtat gtgccccaac agaacctatt tagagacaga agcggcgagg 10920
agccggagga gatgcgagct tcccgcttta acgcgggtcg tgagctgcgt cacggtttgg 10980
accgaagacg agtgttgcgg gacgaggatt tcgaagttga tgaaatgaca gggatcagtc 11040
ctgccagggc acacgtggct gcagccaacc ttgtatcggc ttacgagcag acagtaaagg 11100
aagagcgtaa cttccaaaag tcttttaata atcatgtgcg aaccctgatt gcccgcgaag 11160
aagttaccct tggtttgatg catttgtggg atttgatgga agctatcatt cagaacccta 11220
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ctgccatcaa ttactcggtt ttgagcttgg gaaaatatta cgctcgcaaa atctacaaga 11460
ctccatacgt tcccatagac aaggaggtga agatagatgg gttctacatg cgcatgacgc 11520
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acccgtgttt tttgctagat ggaacagcaa gcaccggatc ccgcaatgcg ggcggcgctg 11880
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tcggccatca tggaagctgt agtgccttcc cgctctaatc ccactcatga gaaggtcctg 12060
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gccaacctgg gttcgctggt ggcgttaaat gctttcttga gtactcagcc tgctaatgtg 12300
ccgcgtggtc aacaggatta tactaacttt ttaagcgctt tgagactgat ggtatcagaa 12360
gtacctcaga gcgaagtgta tcagtccggt cctgattact tctttcagac tagcagacag 12420
ggcttgcaga cggtaaatct gagccaagct tttaaaaacc ttaaaggttt gtggggagtg 12480
catgccccgg taggagaaag agcaaccgtg tctagcttgt taactccgaa ctcccgccta 12540
ttattactgt tggtagctcc tttcaccgac agcggtagca tcgaccgtaa ttcctatttg 12600
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tatcaagaaa ttacccaagt cagtcgcgct ttgggacagg aagacactgg cagtttggaa 12720
gccactctga acttcttgct taccaatcgg tctcaaaaga tccctcctca atatgctctt 12780
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caagaggggg caactccgac tgcagcactg gacatgacag cgcgaaatat ggagcccagc 12900
atgtatgcca gtaaccgacc tttcattaac aaactgctgg actacttgca cagagctgcc 12960
gctatgaact ctgattattt caccaatgcc atcttaaacc cgcactggct gcccccacct 13020
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gagtctgcaa gtccttttcc tagtctaccc ttttctctac acagtgtacg tagcagcgaa 13260
gtgggtagaa taagtcgccc gagtttaatg ggcgaagagg agtatctaaa cgattccttg 13320
ctcagaccgg caagagaaaa aaatttccca aacaatggaa tagaaagttt ggtggataaa 13380
atgagtagat ggaagactta tgctcaggat cacagagacg agcctgggat catggggatt 13440
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gatgaggatt cggccgatga tagcagcgtg ctggacttgg gtgggagagg aaggggcaac 13560
ccgtttgctc atttgcgccc tcgcttgggt ggtatgttgt aaaaaaaaat aaaaaaaaaa 13620
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cgagagcgtg atgcagcagc agcaggcgac ggcggtgatg caatccccac tggaggctcc 13800
ctttgtgcct ccgcgatacc tggcacctac ggagggcaga aacagcattc gttattcgga 13860
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gggcggtcag ctaaagacca tcatgcatac taacatgcca aacgtgaacg agtatatgtt 14100
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cacctgcgga gcagagcagg tctactggtc gcttccagac atgatgaagg atcctgtcac 15000
tttccgctcc actagacaag tcagtaacta ccctgtggtg ggtgcagagc ttatgcccgt 15060
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tttctaaaaa aaaaaaaaat gtccattctt atctcgccca gtaataacac cggttggggt 15420
ctgcgcgctc caagcaagat gtacggaggc gcacgcaaac gttctaccca acatcctgtc 15480
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gagacagtgt cgataccctt ggatcatgga aatcccaccc ctagtcttaa accggtcact 16440
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taacgaattt gaaataaagc gcactgtgga tggcgaaggc tacaacgtag cccaatgcaa 20520
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cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattattgat gatg 34794
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<211> 34125
<212> DNA
<213> Human adenovirus A
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tgtgtaattt gattgggtgg aggtgtggct ttggcgtgct tgtaagtttg ggcggatgag 120
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tagagataag caggaaaaaa aagaaagttt aaaggaagct gctgttctta gtaggctaac 2160
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atgtaaccct tccccacctt tctggttcac accaaactgg ccatgttact tggctagtag 27540
agacatcaga ttatggttca gcttctccag acaacttcat tttcagtgga caaaaactat 27600
gccagtttac tgacagaacc atggtgtggc cttattacaa tttacatttt aactgtgaaa 27660
attatgacct taatctgttt tggcttaagg tggaaaattc ggctatttac aacgttaaaa 27720
atacagtcaa tgcttctgaa acaaatattt actatgattt aagagtagta caaatttttc 27780
cacctaaatg catcattact tcaaagtacc ttacaaacga ttattgtcac attacaatta 27840
actgcactaa ctctgattac cccaataagg ttgtgtttaa taatgtcagt cgatggtact 27900
acggatacgg taagggcagc ccaacccttc ccaactactt tataactaac tttaatgttt 27960
caggtattac taaaagcttt aatcacactt acccttttaa tgagctctgt gattatccca 28020
catcccaatc tcaacacagt ttaacacata cagtaagcac agtaatcttt ttaggaataa 28080
ttggcttcag cattttgatt attatagcag cctttattta tctgtgctgg catagaaaat 28140
ctttgtgtgt ttctaaaaca gaacctctta tgccgattcc ttactagttt tcttttttct 28200
tacagtatgg tgacggttct tctcatcttt ttatgcctgc cagtcatttt ttcttcttcg 28260
acttttgccg cagtcagtga ccttgatccc gagtgtttag ccccctttgc ggtgtacctg 28320
attttcacat ttgtgactgc tacctgcgtc tgcagtatta ttactctgct aatcacctcg 28380
ctccaatttt ttgattacta ctacgtgaga attgtttacc gcagacacca cccccgttac 28440
caaaaccctc aaattgcggc tcttttgcag ctccaaccat gaaaacagca ttagttcttt 28500
tctttatgtt aatcccagtt tgggctagtt cttgtcaact acataaacca tggaattttt 28560
tagattgtta tactaaagaa acaaactaca taggctgggt ttatggaatt atgtctggct 28620
tagtatttgt ctcctctgta gtttctttac aactgtatgc gcgccttaat tttagttgga 28680
ataagtatac tgatgatctt cccgaatatc caaaccccca ggatgattta cccctaaata 28740
ttgtatttcc agagcccccg cgtcctcctt ctgttgttag ctattttaag ttcaccggtg 28800
aagatgattg aacctgatct agaaattgat ggaagaatca ccgaacagag gctcctcact 28860
gatcgcgcta ggcgacgcca acaggatcaa aaaaataaag agttaattga tttacaaacc 28920
gtgcatcagt gtaaaaaagg acttttttgc ctggtaaaac aagctaccct tcgctatgaa 28980
tctttaccag gcaaagaaca tcaactgtgc tacacgctgc ccactcagcg acaaaccttt 29040
actgcaatgg tgggctcggt acctattaaa gtgtcccaac aagcaggaga acaagaaggc 29100
tctattcggt gcctatgtga taaccctgaa tgtttgtaca ctttaataaa aacactgtgc 29160
ggtttaagaa atcttttacc aatgaattaa ataaattact taccggaaat ctgaaaatac 29220
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cttgcaaaca gcaaactttc tccaaatctt aaatggaagg tcagattctt cttcccaatc 29340
cctacccacc atcttcatct tttctagatg aagcgcagca gaacccagta tgctgaagaa 29400
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gtaccctttg ttacaccccc ttttacttct tccaatggtc ttcaagaaaa accaccaggt 29520
gtattagcac ttaattacaa agaccccatt gtaactgaaa atggaaccct tacactcaag 29580
ctaggggacg gaataaaact taatgcccaa ggtcaactta cagctagtaa taatatcaat 29640
gttttggagc cccttaccaa cacctcacaa ggtcttaaac tttcttggag cgccccccta 29700
gcagtaaagg ctagtgccct cacacttaac acaagagcgc ccttaaccac aacggatgaa 29760
agcttagcct taataaccgc ccctcccatt acagtagagt cttcgcgttt gggcttggcc 29820
accatagccc ctctaagctt agatggaggt ggaaacctag gtttaaatct ttctgctccc 29880
ctggacgtta gtaacaacaa tttgcatctc accactgaaa ctcccttagt tgtaaattct 29940
agcggtgccc tatctgttgc tactgcagac cccataagtg ttcgcaacaa cgctcttacc 30000
ctacctacgg cagatccgtt aatggtgagc tccgatgggt tgggaataag tgtcactagt 30060
cccattacag taataaacgg ttccttagcc ttgtctacaa ctgctcccct caacagcaca 30120
ggatccactt taagtctgtc tgttgccaat cctctgacta tttcacaaga cacattgact 30180
gtttccactg gtaacggtct tcaagtgtcg gggtctcaat tagtaacaag aataggggat 30240
ggtttaacat tcgataatgg ggtcatgaaa gtaaacgttg ccgggggaat gagaacttct 30300
ggcggtagaa taattttaga tgttaattat ccctttgatg cgagcaataa cctgtcctta 30360
agacggggat tgggactaat ttataaccaa tctacaaact ggaacttaac aactgatatt 30420
agtaccgaaa aaggtttaat gtttagtggc aatcaaatag ctcttaatgc aggtcagggg 30480
cttacattta ataatggcca acttagggtt aagttgggag ctggacttat ttttgattca 30540
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acaactcctg acccaccacc aaactgcagc ctcatacaag agctagatgc aaaactcacc 30660
ctgtgcttaa caaaaaacgg atctattgtt aatggcattg taagtttagt gggtgttaag 30720
ggtaatctcc taaatatcca aagtactact accactgtag gagtgcattt agtgtttgat 30780
gaacagggaa gattaatcac atcaacccct actgccctgg ttccccaagc ttcgtgggga 30840
tatagacaag gccaatcagt gtctaccaat actgttacca atggtctagg ttttatgcct 30900
aatgtgagtg cttaccctag accaaatgcc agtgaggcta aaagccaaat ggtaagtctc 30960
acgtacttac agggagatac atctaaacct ataacaatga aagttgcatt taatggcatt 31020
acgtcgctaa atggatactc tttaacattc atgtggtcag gtctatcaaa ctatataaat 31080
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caaaacacaa attgcgtact tattgtttat tttttttttt ttttacacta tacgcgtggt 31200
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caactgcact tgaatatttc gacttaggtt ttttggcgtt agcgtccaca cagtttcttt 31320
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gatgcataat taaacccttt agcagttgct gacgataacg ttcatgccga ctatgtttta 31560
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gacgagcgca acagcgcatg cgtatctcac ttaagtcttt acaataatca caacacagca 31680
ctaacatgtt atttaaaatt ccataattaa aggcgctcca tccaaaacta actttttcta 31740
acgctaacca ggcatggcca tcatacataa ttttaaagta aattaaatgg cgacctctaa 31800
caaaggtgct tcccacatac atcacctctt taggcattaa atggttaaca acctcccgat 31860
accaaaaaca ccttttgtta attaaggcgc catatacggc cattttgaac cagcgtccca 31920
aaagcatccc agctgacata cactgtagtg aacccggacg ctggcaatga caatgaataa 31980
gccaccgctc atgaccatgt aataattgag taacttcaac atttatagtg gcacaacaca 32040
tacatacact catgtatttt ttcaaaataa acatctcata atcagttaga atcatatccc 32100
acggtattgg ccattcctgc agcactgtaa aacctacaca tgaaggaatg cctcttacct 32160
cacttacatt atgtaaagtc agactattac actcaggcca taaagaattt tccgaagtac 32220
tcaacgtagc ttttgactgt tcctcacagg gcggtagttg gtacttgttg tatggtgcca 32280
atctgtagcg ataccgtctg tcgcgctgca tcgtaaacaa cagacttgcg agcgtcttcg 32340
tacttaaaaa aacaaaacca cgtacgacca ctggttatcg cacctcgtcc tttttgtttg 32400
cagcgttggc gttccgtcaa aaaagcaaag tacaaccact ctcgcaggct tgctaaaatg 32460
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ggaggaggaa tacaaggtag aggcataaaa acttaatcaa gacggtcagc aaggatttga 32640
atgcgtaaat ctcgcaggtg gcagcgatcg cctccgctgt gctggtgaaa gatcacagcc 32700
agatcaaatt gtaagcgatt ttccaaatgt tcaacaacag cttctaaaag agccacagct 32760
ctgatttcga taaacaaaag caaagcaaat gcattatcat gaaactcttc tatcatcaaa 32820
ctgcctgact gaaccattcc caggtaattt tcattcttcc actgttgtat tatttgaaca 32880
cactgatttt gcaggtttaa accgtgaata ttaaaaagct ctgtaagggc gccctccacc 32940
gccatccgca ggcagtactt catatttgct gaaaaaagtc tggatcttca aacacctgca 33000
gtaaattcag tagatttaca ttaggctcca caccttggtc tcgcagctga catcttaatg 33060
ccagttgtat aaaatcatac aaatcagaag ccagcagcaa agaaagttca cctccaggta 33120
caagttccgg agttcccaca gaacatacaa cttgcacaaa tggacccata ttagtaagcg 33180
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tcggaatgat taaacaacaa aacactgagc tccattcttg agcctggata aagcgtttca 33540
gcgccaacaa aaacccctct ggcgttcatg tcgcataatg aaaacaatgt tcccaaatat 33600
ccaggaggaa tatcaactgc tatgtgcaaa tataaaagca caactccatg tggaggtata 33660
acaaaattcg caggagaaaa taacacataa gcattagagt cgccctcttg tttaggcaac 33720
atagccccag gtcccgtaaa atacacataa agagtctcaa aagcagccat aatgccttac 33780
cagaaaaaca gtacaaagcc aggcacagca gacacaatct gccgcaagtg cgcaccttta 33840
atactgaaaa atagtgacgt aaatggccaa agttcgccta cacaacacaa aaaaaacccc 33900
aaaagcccgc gaaaaaaatc acttccgcat atgactcggc ataatacggt gttctcacga 33960
cacgtcacat ccggcgcgcc cggctcccac gccgcgcccc acttcctcat ccgcccaaac 34020
ttacaagcac gccaaagcca cacctccacc caatcaaatt acacactacg cccacttcat 34080
tttaatattg gcactagtcc agtataaggt atattattag atagg 34125
<210> 143
<211> 34775
<212> DNA
<213> Human adenovirus type 34
<400> 143
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaattgtgg ggtgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gctaaacggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgttttg tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtg 180
acgcataaaa aggctttttt tctcacggaa ctactgactt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgctg atttgcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctacggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatttctgct gagactggaa atgaaatact ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgtg aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aaggattaga attagatccg cctttggaca ctttcgatac 840
tccaggggtg attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgggttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
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tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtggg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgagtcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacggc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaga gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgta tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt agaaagacta ggcaactgtt agaggacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaagaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcaa gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgcc gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt cgtagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtc cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctgga gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattc caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttaattaag ggcaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgccggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgttga ccaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tctttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tgcgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct gagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
ggggtggggt tttcagatgg acagattgag taaaaatttg ttttttctgt ctttcagctg 3480
tcatgagtgg aaacgcttct tttaaggggg gagtcttcag cccttatctg acagggcgtc 3540
tcccatcctg ggcaggagtt cgtcagaatg ttatgggatc tactgtggat ggaagacccg 3600
tccaacccgc caattcttca acgctgacct atgctacttt aagttcttca cctttggacg 3660
cagctgcagc cgccgccgcc gcctctgttg ccgctaacac tgtgcttgga atgggttact 3720
atggaagtat cgtggctaat tccacttcct ctaataaccc ttctaccctg actcaggaca 3780
agttacttgt ccttttggcc cagctggagg ctttgaccca acgtctgggt gaactttatc 3840
agcaggtggc cgagttgcga gtacaaactg agtctgctgt cggcacggca aagtctaaat 3900
aaaaaaaaat tccacaatca atgaataaat aaacgagctt gttgttgatt taaaatcaag 3960
tgtttttatt tcatttttcg cgcacggtat gccctagacc accgatctcg atcattgaga 4020
acacggtgga ttttttccag aatcctatag aggtgggatt gaatgtttag atacatgggc 4080
attaggccat ctttggggtg gagatagctc cattgaaggg attcatgctc cggggtagtg 4140
ttgtaaatca cccagtcata acaaggtcgc agtgcatggt gttgcacaat atcttttaga 4200
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gaggggtgca ttcggggtga aattatgtgc attttggatt ggatttttaa gttggcaata 4320
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gtacatttag gaaatttatc gtgtagcttg gatggaaaag cgtggaaaaa tttggagaca 4440
cccttgtgtc ctccgagatt ttccatgcac tcatccatga taatagcaat ggggccgtgg 4500
gcagcagcgc gggcaaacac gttccgtggg tctgacacat catagttatg ttcctgagtt 4560
aaatcatcat aagccatttt aatgaatttg gggcggagag tacccgattg gggtatgaat 4620
gttccttcgg gccccggagc atagttcccc tcacagattt gcatttccca agctttcagt 4680
tccgatggtg gaatcatgtc cacctggggg gctatgaaga acaccgtttc tggggcgggg 4740
gtgattagtt gggatgatag caagtttctg agcaattgag atttgccaca tccggtgggg 4800
ccataaatga ttccgattac aggttgcagg tggtagttta gggaacggca actgccgtct 4860
tctcgaagca agggggccac ctcgttcatc atttccctta catgcatatt ttcccgcacc 4920
aaatccatta ggaggcgctc tcctcctagt gatagaagtt cttgtagtga ggaaaagttt 4980
ttcagcggtt ttagaccgtc agccatgggc attttggaga gagtttgctg caaaagttct 5040
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tgagcgcctc ggctgcgtgg cctttggcgc ggagcttacc tttggaagtt ttcttgcata 5400
ccgggcagta taggcatttc agcgcataca gcttgggcgc aaggaaaatg gattctgggg 5460
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tggtctccat gagttcgtgt cctcgttgag tgacaaacag gctgtccgta tccccgtaga 5640
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accactctga tacaaaggcg cgcgtccagg ccagcacaaa ggaggctatg tgggaggggt 5760
agcgatcgtt gtcaaccagg gggtccacct tttccaaagt atgcaaacac atgtcaccct 5820
cttcaacatc caggaatgtg attggcttgt aggtgtattt cacgtgacct ggggtccccg 5880
ctgggggggt ataaaagggg gcggttcttt gctcttcctc actgtcttcc ggatcgctgt 5940
ccaggaacgt cagctgttgg ggtaggtatt ccctctcgaa ggcgggcatg acctctgcac 6000
tcaggttgtc agtttctaag aacgaggagg atttgatatt gacagtgccg gttgagatgc 6060
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ggcacttcca ttcggggaag atagttgtca attcatctgg cacgattctc acttgccacc 6300
ctcgattatg caaggtaatt aaatccacac tggtggccac ctcgcctcga aggggttcgt 6360
tggtccaaca gagcctacct cctttcctag aacagaaagg gggaagtggg tctagcataa 6420
gttcatcggg agggtctgca tccatggtaa agattcccgg aagtaaatcc ttatcaaaat 6480
agctgatggg agtggggtca tctaaggcca tttgccattc tcgagctgcc agtgcacgct 6540
catatgggtt aaggggactg ccccagggca tgggatgggt gagtgcagag gcatacatgc 6600
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cgtgagaatt ggaagagatg gtgggtcttt gaaaaatgtt gaaatgggca tgaggtagac 6840
ctacagagtc tctgacaaag tgggcataag attcttgaag cttggttacc agttcggcgg 6900
tgacaagtac gtctagggcg cagtagtcaa gtgtttcttg aatgatgtca taacctggtt 6960
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ctgccttgta agggcagcag cccttctcta cgggtagaga gtatgcttga gcagcttttc 7140
gcagcgaagc gtgagtaagg gcgaaggtgt ctctgaccat gactttgaga aattggtatt 7200
tgaagtccat gtcgtcacag gctccctgtt cccagagttg gaagtctacc cgtttcttgt 7260
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taaaattgcg agtgatgcgg aaaggctgtg gtacttccgc tcgattgttg atcacctggg 7380
cagctaggac gatctcgtcg aaaccgttga tgttgtgtcc tacgatgtat aattctatga 7440
aacgcggcgt gcctttgacg tgaggtagct tattgagctc atcaaaggtt aggtctgtag 7500
ggtcagataa ggcgtagtgt tcgagagccc attcgtgcag gtgaggattt gcatgtagga 7560
atgatgacca aagatccacc gccagtgctg tttgtaactg gtcccgatac tgacgaaaat 7620
gctggccaat tgccattttt tctggagtga cacagtagaa ggttctgggg tcttgttgcc 7680
atcgatccca ctttagttta atggctagat cgtgggccat gttgacgaga cgctcttctc 7740
ctgagagttt catgaccagc atgaaaggaa ctagttgttt gccaaaggac cccatccagg 7800
tgtaagtttc cacatcgtag gtcaggaaga gtctttctgt gcgaggatga gagccgatcg 7860
ggaagaactg gatttcctgc caccagttgg aggattggct gttgatgtga tggaagtaga 7920
agtttctgcg gcgcgccgag cattcgtgtt tgtgcttgta cagacggccg cagtagtcgc 7980
agcgttgcac gggttgtatc tcgtgaatga gctgtacctg gcttcccttg acgagaaatt 8040
tcagtgggaa gccgaggcct ggcgattgta tctcgtgctc ttctatattc gctgtatcgg 8100
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tcttttccag ggcgtgcggg aggttcagat ggtacttgat ttccacaggt tcgtttgtag 8340
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ttcttttgat cggtggtggc tctcttgctt cttgcatgct cagaagcgat gacggggacg 8460
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gaccggcaag agaaaaaaat ttcccaaaca atggaataga aagtttggtg gataaaatga 13380
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ctgcgtacac cgttctcggc cggtaacgct accacgtaag aagcttcttg cttcttgcaa 21120
acagcagctg caaccatggc ctgcggatcc caaaacggct ccagcgagca agagctcaga 21180
gccattgtcc aagacctggg ttgcggacca tattttttgg gaacctttga taagcgcttc 21240
ccggggttca tggcccccga taagctcgcc tgtgccattg taaatacggc cggacgtgag 21300
acggggggag agcactggtt ggctttcggt tggaacccac gttctaacac ctgctacctt 21360
tttgatcctt ttggattctc ggatgatcgt ctcaaacaga tttaccagtt tgaatatgag 21420
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acccagaccg tgcagggccc ccgttctgcc gcctgcggac ttttctgctg catgttcctt 21540
catgcctttg tgcactggcc tgaccgtccc atggacggaa accccaccat gaaattgcta 21600
actggagtgc caaacaacat gcttcattct cctaaagtcc agcccaccct gtgtgacaat 21660
caaaaagcac tctaccattt tctcaatacc cattcgcctt attttcgctc tcatcgtaca 21720
cacatcgaaa gggccactgc gttcgaccgt atggatgtgc aataatgatt catgtaaaca 21780
acgtgttcaa taaacagcac tttatttttt acatgtatcg aggctctgga ttacttattt 21840
atttacaagt cgaatgggtt ctgacgagaa tcagaatgac ccgcaggcag tgatacgttg 21900
cggaactgat acttgggttg ccacttgaat tcgggaatca ccaacttggg aaccggtata 21960
tcgggcagga tgtcactcca cagctttctg gtcagctgca aagctcccag caggtcagga 22020
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tgttcgtgct gctcaggcat tagtttaaaa gaggttctaa gttcgttatc cagcctgtac 22860
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ctaatcggat tcttaacagt gcaggcagca gctcctttag ccagagggtc atctttggcg 22980
atcttctcaa tgcttctttt gccatccttc tcaacgatgc gcacgggcgg gtagctgaaa 23040
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accccgctgt caacctgccc cctaaagtca tgacggccgt catggaccag ttactcatta 24360
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tttcctacat gggtattctg catgagaatc gcctaggaca aagcgtgctg cacagcaccc 24720
ttaaggggga agcccgccgt gattacatcc gcgattgtgt ttatctctac ctgtgccaca 24780
cgtggcaaac cggcatgggt gtatggcagc aatgtttaga agaacagaac ctgaaagagc 24840
taaacaagct cttacagaaa tctcttaagg ttctgtggac agggttcgac gagcgcaccg 24900
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cgcgcttatt caaaaaaggc gggaattaca tcatcctcga catgagtaaa gaaattccca 26520
cgccttacat gtggagttat cagccccaaa tgggattggc ggcaggcgcc tcccaggact 26580
actccacccg catgaattgg ctcagcgccg ggccttctat gatttctcga gttaatgata 26640
tacgcgccta ccgaaaccaa atacttttgg aacagtcagc tcttaccacc acgccccgcc 26700
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ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
agttagcggg cggctccacc ctatgtcgtc acaggcctcg gcataatata aaacgcctga 26880
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ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc 27060
aatttgtgga ggagtttact ccctctgtct acttcaaccc cttctccgga tctcctgggc 27120
actacccgga cgagttcata ccgaacttcg acgcgattag cgagtcagtg gacggctacg 27180
attgatgtct ggtgacgcgg ctgagctatc tcggctgcga catctagacc actgccgccg 27240
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ccctcaaggt ccggcccacg gagtgcggat tactatcgaa ggcaaaatac actctcgcct 27360
gcaacgaatt ttctcccagc ggcccgtgct gatcgagcga gaccagggaa acaccacggt 27420
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aaacatccaa ttaagattat attttgactc ttctggaaat ctattaactg atgaatcaga 31440
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aaactacatt catggaatat gttactacat gactagttat gatagaagtc tatttccctt 31620
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cacactctta agttggtcaa aagaatgctg gcttcagttg taatcaaaac tccatcgcat 33120
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cagctttcca gccttgaatt attcgtgtca gttcttgtgg taaatccaat ccacacatta 33540
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agccacaggg tctccagctc gaccctcgta aaacctgtca tggtgattaa acaacagcac 34140
cgaaagttcc tcgcggtgac cagcatgaat aattcttgat gaagcataca atccagacat 34200
gttagcatca gttaacgaga aaaaacagcc aacatagcct ttgggtataa ttatgcttaa 34260
tcgtaagtat agcaaagcca cccctcgcgg atacaaagta aaaggcacag gagaataaaa 34320
aatataatta tttctctgct gctgttcagg caacgtcgcc cccggtccct ctaaatacac 34380
atacaaagcc tcatcagcca tggcttacca gacaaagtac agcgggcacg cacaagctct 34440
aaagtcactc tccaacctct ccacaatata tatacacaag ccctaaactg acgtaatggg 34500
agtaaagtgt aaaaaatccc gccaaaccca acacacaccc cgaaactgcg tcaccaggga 34560
aaagtacagt ttcacttccg caatcccaac aagcgtcact tcctctttct cacggtacgt 34620
cacatcccat taacttgcaa cgtcattttc ccacggccgc gccgccccgt ttagccgtta 34680
accccacagc caatcaccac acaccccaca atttttaaaa tcacctcatt tacatattgg 34740
caccattcca tctataaggt atattattga tgatg 34775
Claims (16)
- 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법으로서,
서열 및 결찰 독립 클로닝(SLIC: sequence and ligation independent cloning)에 의해 하이브리드화 가능 아데노바이러스 목적 벡터 골격을 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈과 조합함으로써 아데노바이러스 게놈을 조립하는 단계로서, 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈은 E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E2-L4 모듈, E1 모듈, E3 모듈, E4 모듈 또는 이들의 조합을 포함하는 단계를 포함하는 제조 방법. - 제1항에 있어서, 하이브리드화 가능 아데노바이러스 목적 벡터 골격은 E2-L2 모듈, L3-L4 모듈, E2-L2 모듈과 L3-L4 모듈 둘 다, 또는 E2-L4 모듈을 포함하는 아데노바이러스 코어 모듈 목적 벡터이고; 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈은 E1 모듈, E3 모듈, E4 모듈, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 하이브리드화 가능 아데노바이러스 목적 벡터 골격은 p15A 복제 기점을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드화 가능 아데노바이러스 목적 벡터 골격은 포유동물 I-SceI 발현 카세트를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 모듈은 길이가 12 kb 이상인 제조 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 모듈은 길이가 14 kb 이상인 제조 방법.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 모듈은 E2-L2 모듈 및 L3-L4 모듈을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 모듈은 E2-L4 모듈을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드화 가능 아데노바이러스 목적 벡터 골격 및 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈은 길이 약 20 내지 약 25 염기 쌍의 단일 가닥 핵산 오버행을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제9항에 있어서, 하이브리드화 가능 아데노바이러스 목적 벡터 골격 및 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈은 각 말단 상에 단일 가닥 핵산 오버행을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈은
환형이거나 환형 플라스미드 내에 함유되는 아데노바이러스 유전자 모듈을 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 선형 아데노바이러스 유전자 모듈을 형성하는 단계; 및
선형 아데노바이러스 유전자 모듈을 엑소뉴클레아제와 접촉시켜 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈을 형성하는 단계
에 의해 형성되는 것인 제조 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드화 가능 아데노바이러스 목적 벡터 골격은
환형 목적 벡터 골격을 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 선형 목적 벡터 골격을 형성하는 단계; 및
선형 목적 벡터 골격을 엑소뉴클레아제와 접촉시켜 하이브리드화 가능 목적 벡터 골격을 형성하는 단계
에 의해 형성되는 것인 제조 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈을 세포 내에 형질감염시키는 단계를 더 포함하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈은 세포에서 발현될 때 재조합 아데노바이러스를 형성할 수 있는 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈은 보충 세포주에서 발현될 때 또는 헬퍼 바이러스와 함께 세포에서 발현될 때 재조합 아데노바이러스를 형성할 수 있는 아데노바이러스 게놈 구성체의 일부인 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 하이브리드화 가능 아데노바이러스 유전자 모듈 중 하나 이상이 이러한 유전자 모듈이 유래하는 야생형 아데노바이러스에 비해 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 제조 방법.
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