CN107699586A - 一种通路克隆入门载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通路克隆入门载体的构建方法，包括引物设计、ICS1pro片段的扩增与纯化、pCR8片段的获得和pCR8‑ICS1pro质粒的构建。本发明利用通路克隆入门载体pCR8‑AtS5H来获得入门载体片段，而且该入门克隆可以保存和反复使用，因此实验过程中不需要购买昂贵的入门载体，同时该方法所用的其它试剂成本也非常低，从而大大降低了构建入门克隆的实验成本，并且非常省时，两天内即可完成入门克隆的构建和验证；本发明利用的一步SLIC技术是一种不依赖序列和连接的克隆方法，连接效率非常高，同时不受酶切位点限制，也不存在TA连接的非定向克隆问题，是一种非常值得推广的构建入门克隆的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速高效低成本构建通路克隆(Gateway)技术的入门载体的构建方法。
背景技术
载体构建是分子生物学和基因工程研究中必不可少的环节，是功能基因组研究的基本技术。随着分子技术的不断发展，目前已建立了多种载体构建方法，主要包括：传统的酶切连接法、重叠延伸PCR法、一步克隆法、In-Fusion试剂盒法、不依赖序列和连接的同源重组方法(Sequence and ligation-independent cloning，SLIC)和Gateway技术等。其中，Invitrogen公司开发的Gateway技术以λ噬菌体的位点特异重组系统为基础，首先利用BP反应(一个attBDNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应)或TOPO克隆将扩增的PCR片段构建至Gateway入门载体，再通过LR反应(一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应)将目的片段从入门载体克隆至不同功能的Gateway目的载体中，该方法具有以下优点：1)不受限制性内切酶酶切位点的限制；2)入门载体通用于不同目标载体；3)构建过程简单快速且定向插入，从而大大提高了实验效率。目前Invitrogen公司开发了多种可供选择的Gateway目的载体，同时研究人员也开发了很多与Gateway技术兼容的载体系统，如Mark等构建了与Gateway技术兼容的农杆菌双元表达载体pMDC系列载体，非常方便用于植物功能基因组研究，包括基因表达、蛋白亚细胞定位、蛋白互作、启动子表达分析等系列分子生物学试验。
目前构建入门载体有三种方法，一种方法是通过BP反应将PCR片段重组到pDONR和pENTR等系列载体，载体可以重复使用但是BP重组酶价格昂贵，而且插入片段长于2KB时效率会大大降低；第二种方法是利用TOPO克隆或TA克隆方法将PCR产物连接到pENTR/D-TOPO和pCR8/GW/TOPO等载体，但是这些入门载体价格昂贵，且不能够复制和反复使用，大大增加了实验成本；第三种方法是利用限制性内切酶将PCR片段连到入门载体，如Fu等构建的GEC和PEC载体，该方法成本低廉，但是常受限于载体上的酶切位点，而且耗时过长。因此开发一种快速高效低成本构建通路克隆入门载体的方法对于推广通路克隆应用有着重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中构建通路克隆入门载体存在的问题，提供一种通路克隆入门载体的构建方法，该方法省时，成本低，操作简单，成功率高，该方法构建的入门载体可以反复保存和反复使用，可兼容于具有attR序列的目标载体，用于功能基因组学和基因工程的研究和应用。
技术方案
一种通路克隆入门载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)引物设计
根据pCR8载体和水稻异分支酸合成酶基因的启动子(ICS1pro)序列设计基因扩增引物ICS1pro-F1和ICS1pro-R1，根据水稻异分支酸合成酶基因的启动子(ICS1pro)基因序列设计菌落PCR引物ICS1pro-F2和ICS1pro-R2；
(2)ICS1pro片段的扩增与纯化
以CTAB方法提取的日本晴的DNA为模板进行PCR基因扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并利用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，即得ICS1pro片段；
(3)pCR8片段的获得
采用通路克隆入门载体pCR8-AtS5H作为原始载体，利用限制性内切酶EcoRI对其进行单酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用胶回收试剂盒对割胶产物进行回收，得到pCR8片段；
(4)pCR8-ICS1pro质粒的构建
利用SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接，其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩尔比为2:1，26℃金属浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态(热激法)，采用菌落PCR验证和测序进行鉴定，从而最终得到阳性入门克隆载体pCR8-ICS1pro。
进一步，步骤(1)中，所述水稻采用日本晴。
进一步，步骤(1)中，所述基因扩增引物ICS1pro-F1：
5’-GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG-3’；
引物ICS1pro-R1：5’-AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG-3’；
菌落PCR引物ICS1pro-F2：5’-TTGGCTTGGGTAGGATTA-3’；
菌落PCR引物ICS1pro-R2：5’ACGAAGGAGCGAAGGTTA-3’。
进一步，步骤(2)中，所述PCR反应体系为(总体积50μL)：2×PCRBuffer for KODFX 25μL，2mM dNTP 10μL，10mM引物ICS1pro-F1 1.5μL，10mM引物ICS1pro-R1 1.5μL，KODFX 1μL，DNA 1μL，ddH2O 10μL。
进一步，步骤(2)中，所述PCR反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火30s，68℃延伸3min，共30个循环；68℃延伸10min。
进一步，步骤(3)中，所述单酶切的反应体系为：10×HBuffer5μL，EcoRI 2.5μL，pCR8-AtS5H质粒(100ng/μL)20μL，ddH2O 22.5μL；37℃下酶切3h。
进一步，步骤(4)中，利用SLIC法将回收的ICS1pro基因和pCR8片段进行连接的反应体系为10×NEB Buffer 2 1μL、100×BSA 0.1μL、ICS1pro片段(80ng/μl)3μL、pCR8片段(30ng/μl)4μL、ddH2O1.9μL、T4 DNA polymerase 0.2μL。
进一步，所述菌落PCR验证的反应体系包括2×Taq MasterMix 5μL、10mM引物ICS1pro-F2 1μL、10mM引物ICS1pro-R2 1μL和ddH2O 3μL；反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸10min。
有益效果：(1)本发明方法非常省时，两天内即可完成入门克隆的构建和验证；(2)本发明利用通路克隆入门载体pCR8-AtS5H来获得入门载体片段，而且该入门克隆可以保存和反复使用(本研究中以pCR8-AtS5H入门克隆为例，但其他任何含有合适酶切位点的入门克隆都适用于该方法)，因此实验过程中不需要购买昂贵的入门载体，同时该方法所用的其它试剂成本也非常低，从而大大降低了构建入门克隆的实验成本；(3)本发明利用的一步SLIC技术是一种不依赖序列和连接的克隆方法，连接效率非常高，同时不受酶切位点限制，也不存在TA连接的非定向克隆问题。综上，本发明建立的利用一步SLIC技术构建入门克隆的方法操作非常简单，同时效率高且成本低，是一种非常值得推广的构建入门克隆的新方法。
附图说明
图1为ICS1pro基因启动子扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为pCR8-AtS5H质粒图谱；
图3为pCR8-AtS5H质粒EcoRI单酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为pCR8-ICS1pro质粒的菌落PCR验证的电泳图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实施例，以入门克隆pCR8-AtS5H和水稻异分支酸合成酶基因(LOC_Os09g19734)的启动子片段为例进一步阐述本发明。
在下述实施例中，所用限制性内切酶EcoRI可从TAKARA公司购买；T4 DNApolymerase可从NEB(NewEnglandBiolab)公司购买；KODFX可从TOYOBO公司购买；LR重组试剂可从赛默飞世尔科技(中国)有限公司购买。
实施例1
(1)引物设计
根据pCR8载体和水稻异分支酸合成酶基因的启动子(ICS1pro)序列设计基因扩增引物ICS1pro-F1：5’-GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG-3’和ICS1pro-R1：5’-AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG-3’，根据水稻异分支酸合成酶基因的启动子基因序列设计菌落PCR引物ICS1pro-F2：5’-TTGGCTTGGGTAGGATTA-3’和ICS1pro-R2：5’ACGAAGGAGCGAAGGTTA-3’；所述水稻采用日本晴；上述引物均由由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成；
(2)ICS1pro片段的扩增与纯化
以CTAB方法提取的日本晴DNA为模板进行PCR基因扩增，PCR反应体系为(总体积50μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTP 10μL，10mM引物ICS1pro-F1 1.5μL，10mM引物ICS1pro-R1 1.5μL，KOD FX 1μL，DNA 1μL，ddH2O 10μL；反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火30s，68℃延伸3min，共30个循环；68℃延伸10min；基因扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，PCR产物大小约3000bp左右，与理论预测的目标片段大小(2892bp)相符，切胶并利用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，即得ICS1pro片段；最后洗脱时使用20μL的10mMTris·HCl(pH8.0)；
(3)pCR8片段的获得
采用通路克隆入门载体pCR8-AtS5H作为原始载体(如图2，其中S5H为插入片段)，利用限制性内切酶EcoRI对其进行单酶切，所述单酶切的反应体系为：10×HBuffer5μL，EcoRI2.5μL，pCR8-AtS5H质粒(100ng/μL)20μL，ddH2O 22.5μL；37℃下酶切3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(见图3)，pCR8-AtS5H酶切后产物大小分别为3000bp和1100bp左右，与理论预测的片段大小相符，其中3000bp左右的条带为pCR8片段，利用胶回收试剂盒对割胶产物进行回收，得到PCR8片段，洗脱时使用20μL的10mMTris·HCl(pH8.0)；
(4)pCR8-ICS1pro质粒的构建
利用SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接，反应体系为：10×NEBBuffer 21μL、100×BSA 0.1μL、ICS1pro片段(80ng/μl)3μL、pCR8片段(30ng/μl)4μL、ddH2O1.9μL、T4 DNA polymerase 0.2μL；其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩尔比为2:1，26℃金属浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态(热激法)，随机挑取6个单菌落进行菌落PCR验证，其PCR反应体系为(总体积10μL)：2×TaqMaster Mix 5μL，10mM引物ICS1pro-F21μL，10mM引物ICS1pro-R21μL，ddH2O 3μL；反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸10min，PCR产物电泳结果如图4所示，其中7为阳性对照，8为阴性对照，6个菌落PCR产物均与阳性对照大小一致，提取1号菌株质粒并送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，其序列与水稻中ICS1pro序列完全一致，因此该克隆即为阳性入门克隆载体pCR8-ICS1pro。
Claims (7)
1.一种通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)引物设计
根据pCR8载体和水稻异分支酸合成酶基因的启动子序列设计基因扩增引物ICS1pro-F1和ICS1pro-R1，根据水稻异分支酸合成酶基因的启动子序列设计菌落PCR引物ICS1pro-F2和ICS1pro-R2；
(2)ICS1pro片段的扩增与纯化
以CTAB方法提取的日本晴DNA为模板进行PCR基因扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并利用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，即得ICS1pro片段；
(3)pCR8片段的获得
采用通路克隆入门载体pCR8-AtS5H作为原始载体，利用限制性内切酶EcoRI对其进行单酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用胶回收试剂盒对割胶产物进行回收，得到pCR8片段；
(4)pCR8-ICS1pro质粒的构建
利用一步SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接，其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩尔比为2:1，26℃金属浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，采用菌落PCR验证和测序进行鉴定，从而最终得到阳性入门克隆载体pCR8-ICS1pro；
步骤(1)中，所述水稻采用日本晴。
2.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因扩增引物ICS1pro-F1：5’-GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG-3’；
引物ICS1pro-R1：5’-AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG-3’；
菌落PCR引物ICS1pro-F2：5’-TTGGCTTGGGTAGGATTA-3’；
菌落PCR引物ICS1pro-R2：5’ACGAAGGAGCGAAGGTTA-3’。
3.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应体系为(总体积50μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTP 10μL，10mM引物ICS1pro-F11.5μL，10mM引物ICS1pro-R11.5μL，KOD FX 1μL，DNA 1μL，ddH2O 10μL。
4.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火30s，68℃延伸3min，共30个循环；68℃延伸10min。
5.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述单酶切的反应体系为：10×H Buffer 5μL，EcoR I 2.5μL，pCR8-AtS5H质粒(100ng/μL)20μL，ddH2O 22.5μL；37℃下酶切3h。
6.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，利用SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接的反应体系为：10×NEB Buffer 21μL、100×BSA 0.1μL、ICS1pro片段(80ng/μl)3μL、pCR8片段(30ng/μl)4μL、ddH2O 1.9μL、T4DNA polymerase 0.2μL。
7.如权利要求1至6任一项所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，所述菌落PCR验证的反应体系包括2×Taq Master Mix 5μL、10mM引物ICS1pro-F2 1μL、10mM引物ICS1pro-R2 1μL和ddH2O 3μL；反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸10min。
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| CN201711138520.9A CN107699586A (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种通路克隆入门载体的构建方法 |
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|---|---|---|---|
| CN201711138520.9A CN107699586A (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种通路克隆入门载体的构建方法 |
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|---|---|
| CN107699586A true CN107699586A (zh) | 2018-02-16 |
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| CN201711138520.9A Pending CN107699586A (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种通路克隆入门载体的构建方法 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2013539363A (ja) * | 2010-08-16 | 2013-10-24 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | アデノウイルスの構築方法 |
-
2017
- 2017-11-16 CN CN201711138520.9A patent/CN107699586A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013539363A (ja) * | 2010-08-16 | 2013-10-24 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | アデノウイルスの構築方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JAE-YEON JEONG 等: "One-Step Sequence- and Ligation-Independent Cloning as a Rapid and Versatile Cloning Method for Functional Genomics Studies", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| YANJUN ZHANG 等: "S5H/DMR6 Encodes a Salicylic Acid 5-Hydroxylase That Fine-Tunes Salicylic Acid Homeostasis", 《PLANT PHYSIOLOGY》 * |
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