JP2002520026A - キメラアデノウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
分野に関し、より具体的にはウイルス、とりわけアデノウイルスを用いる遺伝子
治療に関する。
、または該細胞中の望ましくない機能を阻害するため、または該宿主細胞を排除
するために、遺伝情報が送達される。もちろんその遺伝情報は、その宿主細胞に
望ましい機能を付与すること、例えば分泌タンパク質を供給してその宿主の他の
細胞を処理することなどを意図するものであってもよい。
は(哺乳類)宿主中に存在する欠損を補償することを目指すもの、第二のアプロ
ーチは望ましくない物質(生物または細胞)の除去または排除を目指すもの、そ
して第三のアプローチは細胞に望ましい機能を付与することを目指すものである
。
ウイルスが提案されている。アデノウイルスに由来する遺伝子導入ベクター(い
わゆるアデノウイルスベクター)は、遺伝子導入にとってとりわけ有用なものに
する多くの特徴を有する。すなわち、1)アデノウイルスの生物学は詳細に特徴づ
けられており、2)アデノウイルスは重篤なヒトの病理に関係せず、3)該ウイルス
は極めて効率よくそのDNAを宿主細胞に導入し、4)該ウイルスは多種多様な細胞
に感染可能で、広い宿主域を持ち、5)該ウイルスは高いウイルス力価で大量に生
産することができ、ならびに6)該ウイルスはそのウイルスゲノムの初期領域1(E
1)の欠失によって複製欠損性にすることができる(ブロディ(Brody)ら、1994年
)。しかしアデノウイルスベクターの使用には、今なお、不都合が伴う。一般に
アデノウイルス、とりわけ、よく研究された血清型は、通常、それらが導入され
た宿主による免疫応答を誘発する。また該ウイルスは概して広い感染域を持つが
、一定の細胞および組織を標的とするには問題がある。またアデノウイルスの複
製とその他の機能は、追加の遺伝物質を提供し得る細胞にとって、常に極めて適
しているとは限らない。
イルスDNAは約90〜140塩基対の同一な逆方向末端反復配列(ITR)を含有し、そ
の正確な長さは血清型に依存する。ウイルス複製起点は、まさにそのゲノム末端
にあるITRに含まれる。遺伝子治療で現在使用されている大半のアデノウイルス
ベクターはE1領域に欠失を持ち、そこに新しい遺伝情報を導入され得る。E1欠失
はその組換えウイルスを複製欠損性にする(レブロ(Levrero)ら、1991年)。組
換えアデノウイルス、とりわけ血清型5は、動物モデルと免疫不全マウス中のヒ
ト異種移植片で、肝臓、気道上皮および充実性腫瘍への効率のよいインビボ遺伝
子導入に好適であることが広く証明されている(ボウト(Bout)、1996年;ブラエ
セ(Blaese)ら、1995年)。このように、標的細胞への好ましいインビボ遺伝子導
入法には、アデノウイルスベクターが遺伝子送達媒体として利用される。
する6つの亜群が提唱されている(表1参照)。これらのヒトアデノウイルスの
他に、多数の動物アデノウイルスが同定されている(イシバシ(Ishibashi)ら参
照、1983年)。
るその免疫学的弁別性に基づいて定義される。中和が2つのウイルス間で一定程
度の交差反応を示す場合、血清型の弁別性がA)赤血球凝集阻害における交差反応
の欠如によって示されるように赤血球凝集素が無関係である、またはB)DNA中に
実質的な生物物理学的/生化学的相違が存在するならば、血清型の弁別性が想定
される(フランキイ(Francki)ら、1991年)。最後に同定された9つの血清型(4
2〜51)はHIV感染患者から初めて単離された(ハイアホルザー(Hierholzer)ら、
1988年;シュヌル(Schnurr)ら、1993年;デ ジョング(De Jong)ら、1998年)。
理由はよくわからないが、それら免疫無防備な患者の大半は、免疫能を持つ個体
からはめったに、または決して単離されないアデノウイルスを排出した(ハイア
ホルザー(Hierholzer)ら、1988年、1992年;ホー(Khoo)ら、1995年;デ ジョン
グ(De Jong)ら、1998年)。
Ad2やAd5などのC亜群のアデノウイルスは、Ad3などのB亜群のアデノウイルスと
比べて異なる受容体に結合する(デファー(Defer)ら、1990年)。同様に、受容
体特異性はAd3をAd5ノブタンパク質と交換することによって改変させることがで
き、逆もまた同様であることが実証された(ケラスニク(Krasnykh)ら、1996年;
スティーベンソン(Stevenson)ら、1995年、1997年)。遺伝子治療用としてはア
デノウイルス血清型5がもっとも広く使用されている。血清型2、4および7と同様
に、血清型5は肺上皮およびその他の呼吸組織と本来の関係を有する。一方、例
えば血清型40および41は、胃腸路と本来の関係を有することが知られている。様
々なアデノウイルス血清型の疾患との関係に関する詳細な全体像については表2
を参照されたい。前述した血清型は、少なくともキャプシドタンパク質(ペント
ン−ベース、ヘキソン)、細胞結合を担うタンパク質(ファイバータンパク質)
、アデノウイルス複製に関与するタンパク質が相違する。
がいずれも追加の遺伝物質を宿主細胞に送達するのに理想的に適しているわけで
はないことである。あるものは宿主域に多少の制約があるが、免疫原性が低いと
いう利点を持ち、あるものはその逆である。あるものはビルレンスが制限されて
いるという問題はあるが、宿主域が広いか、かつ/または、免疫原性が低い。さ
らに複雑なことに、アデノウイルス血清型におけるこのバリエーションは処理さ
れる宿主にも著しく依存する。一部の宿主は一定の血清型に既に遭遇していて、
したがってその血清型または関連する血清型に対して強い免疫応答をマウントし
得る。この点については多くの他のバリエーションがあることが当業者には知ら
れている。
原性を持ち、それら他のアデノウイルスが、例えば一定の宿主細胞グループに対
する高い特異性、それら宿主細胞における良好な複製機構、一定の宿主細胞にお
ける高い感染率などといった、効率のよい遺伝子治療方式に対する他の要件の一
つについて通例、優れているという事実を利用する。すなわち本発明は、血清型
が異なる少なくとも2つのアデノウイルスの有用な特性をもつキメラアデノウイ
ルスを提供するものである。
上記の網羅的ではないリストのうちの2つをこえる必要条件が要求され、したが
って本発明は、キメラアデノウイルスを発現させうるベクターを得るために、必
要な部位に異なるアデノウイルス血清型由来の異なるアデノウイルス遺伝子を挿
入するためのカセットとして使用できるアデノウイルス由来のベクターを提供す
るものであり、それによって当然、目的の遺伝子を、例えばそのベクターが由来
する元のアデノウイルスのE1の部位に挿入することもできる。生産されるキメラ
アデノルイスは、この方法により、一定の障害に関して遺伝子治療を必要をする
一定の宿主の要求と必要に適合させることができる。もちろん、この産生を可能
にするには、十分量の安全なキメラアデノウイルスを生産するべく、一般的には
パッケージング細胞が必要になる。
製特性を持つキメラウイルスを与える、あるアデノウイルス血清型のファイバー
タンパク質および/または複製に関与するタンパク質の少なくとも一部と、抗原
性の低いキメラタンパク質をもたらす抗原性の低いもう一つのアデノウイルス血
清型に由来するペントンまたはヘキソンタンパク質の少なくとも一部とからなる
キメラアデノウイルスを提供する。通例、そのようなウイルスはベクター(通例
、プラスミド、コスミドまたはバキュロウイルス系)を用いて生産され、もちろ
んそれらのベクターも本発明の一部である。好ましいベクターは、処理される宿
主と処理される障害にとくに適合したキメラ組換えウイルスを作成するために使
用できるベクターである。そのようなベクターは本発明のもう一つの態様である
。したがって本発明は、少なくとも一つのITRとパッケージングシグナルとから
なり、目的の核酸配列用の挿入部位を持ち、さらに第一の血清型のアデノウイル
スのペントンおよび/またはヘキソンタンパク質をコードする遺伝子を機能的に
挿入するための挿入部位を持ち、また血清型が異なる第二のアデノウイルスのフ
ァイバータンパク質をコードする遺伝子用の挿入部位および/またはその遺伝子
またはその産物によって実行される機能に改善された特徴を持つ血清型に由来す
る遺伝子用の挿入部位を持つ、アデノウイルス由来の組換えベクターも提供する
。通例、本発明は、任意の望ましいキメラアデノウイルスの生産を可能にするカ
セットを提供するものであり、それは2つの血清型だけに由来するか、または望
ましい特徴を得るために必要な数の血清型に由来するものであるが、個別の性質
としてみたときに全ての特徴が最善であることが常に必要なわけではない。さら
には例えばペントンおよび/またはヘキソンをアデノウイルス遺伝子のもう一つ
の部分と一緒に常に改変することは必要でないかもしれない。免疫原性を他の性
質と一緒に改変させる必要がない場合もある。しかし、免疫原性が低いアデノウ
イルス血清型由来のペントンおよび/またはヘキソン遺伝子を使用することが好
ましい。本発明の重要な特徴はキメラウイルスを生産するための手段である。通
例、複製能を持つアデノウイルスを含有する宿主細胞に投与されるアデノウイル
スのバッチは望まれないが、常にあてはまるとは限らない。したがって一般的に
は、キメラウイルスをコードするベクター上のアデノウイルスゲノムから多くの
遺伝子(ただし少なくとも一つ)を削除し、そのベクターにキメラアデノウイル
スを生産させる細胞のゲノムに、それらの遺伝子を供給することが望ましい。こ
のような細胞は通常、パッケージング細胞と呼ばれる。したがって本発明は、ア
デノウイルスの生産に必要であり、かつ本発明のアデノウイルスベクター上に存
在しない全ての構成要素をトランスに含む、本発明のキメラアデノウイルス生産
用のパッケージング細胞をも提供する。通例、ベクターとパッケージング細胞は
、それらが必要な構成要素を全て持つが、組換えによって複製能を持つウイルス
を生じさせるオーバーラップ構成要素は持たないという点で、互いに適合してい
る必要がある。
とからなる部分のキットも提供し、該キットにより該細胞と該ベクターの間に複
製能を持つアデノウイルスの産生をもたらす組換えにつながる配列の重複は本質
的にない。
与えることができるために、アデノウイルス遺伝子が制限部位内に配置されたア
デノウイルス遺伝子のライブラリーを用意することが好ましい。通例、異なる血
清型の同じ種類の遺伝子が同じ制限部位内にあり、キメラウイルスの産生に使用
されるアデノウイルスベクター中にそれと同じ制限部位があることが好ましい。
異なる遺伝子に関する部位がすべてただ1つである場合は、そこから拾い上げ選
択するためのシステムが作られている。ライブラリーから望ましい血清型に由来
するペントン遺伝子を切り出し、それをベクター中の同じ部位に挿入することが
できる。つぎに、異なる制限酵素を使ってもう一つの制限酵素を用いた異なる血
清型のバンクから複製遺伝子を切り出し、その遺伝子をキメラベクター中の対応
する制限部位に挿入できる。したがって、挿入部位が異なり、好ましくはただ1
つの制限部位であるような本発明ベクターを得ることが好ましい。好ましくはこ
のベクターを、同じ制限部位内に対応する遺伝子を持つライブラリーと組み合わ
せる。このライブラリーとベクターの使用法は当分野の技術に含まれ、本発明の
一部である。通例、そのような方法はいくつかの制限消化段階と連結反応段階お
よびその産物のパッケージング細胞における発現からなる。また、相同組換えま
たは制限消化と組換えの組み合わせによって、そこから様々な望ましいアデノウ
イルス遺伝子が得られるようなライブラリーを使用することもできる。したがっ
て本発明は望ましい宿主域と減少した抗原性とを持つキメラアデノウイルスを生
産する方法であって、望ましい挿入部位を持つ本発明のベクターを用意し、その
ベクターに、比較的低い抗原性を持つアデノウイルス血清型に由来するペントン
またはヘキソンタンパク質の少なくとも機能的部分を挿入し、望ましい宿主域を
持つアデノウイルス血清型に由来するファイバータンパク質の少なくとも機能的
部分を挿入し、そのベクターを本発明のパッケージング細胞に導入し、キメラウ
イルス粒子を生産させることからなる方法を提供する。もちろん、異なる血清型
に由来する他のウイルス遺伝子の他の組合せも本明細書で先に開示されたのよう
に挿入できる。典型的に起こるアデノウイルスに対する免疫原性反応は、宿主に
よる中和抗体の産生である。通例これが、免疫原性の低い血清型のペントン、ヘ
キソンおよび/またはファイバーを選択する理由である。
ルスを作成する必要はないだろう。キメラタンパク質を生産することは当分野の
技術内で十分であり、例えばファイバータンパク質の場合であれば、それがある
血清型のベースを持ちもう一つの血清型に由来するシャフトとノブを持つことは
十分可能である。この方法で、ウイルス粒子の組立を担うタンパク質の各部分を
、一つの血清型に由来させて、完全なウイルス粒子の生産を促進することが可能
になる。
質が異なるアデノウイルス血清型に由来するキメラタンパク質である本発明のキ
メラアデノウイルスをも提供する。野生型ヘキソン、ペントン、ファイバー(タ
ンパク質)遺伝子などの全体またはそれらの一部を交換することによってキメラ
アデノウイルスを生成させることの他に、温度安定性、組立、固定、リダイレク
トされた(redirected)感染、変化した免疫応答などの好ましい特徴について容
易にスクリーニングできる点突然変異、欠失、挿入などの突然変異を持つヘキソ
ン、ペントン、ファイバー(タンパク質)遺伝子などを挿入することも、本発明
の範囲に含まれる。ここでも、他のキメラ的組み合わせを作ることもでき、それ
らも本発明の範囲に含まれる。
キメラアデノウイルスライブラリーの作成を可能にする。したがってさらに本発
明はキメラアデノウイルスのライブラリーも提供する。一態様として、本発明は
、キメラキャプシド、すなわち、少なくとも一部が、少なくとも2種類のアデノ
ウイルス血清型に由来するキャプシドタンパク質からなるキメラアデノウイルス
のライブラリーを提供する。好ましくは、各アデノウイルス亜群の少なくとも一
つの代表的アデノウイルスから得られる核酸および/またはタンパク質もしくは
その一部が、該(キメラ)アデノウイルスライブラリーに含まれる。好ましくは
、核酸および/またはタンパク質もしくはその一部が2以上の代表的な各アデノウ
イルス亜群に由来する。最も好ましくは、該ライブラリーが基本的に全て既知の
代表的な各アデノウイルス亜群から得られる核酸および/またはタンパク質もし
くはその一部からなる。望ましい特性はある亜群の一般的性質ではないかもしれ
ないため、該(キメラ)ライブラリー中の各アデノウイルス亜群から2以上の代
表的なアデノウイルスに由来する核酸および/またはタンパク質もしくはその一
部が望ましい。また、あるアデノウイルス亜群の望ましい性質は、その亜群の様
々なメンバーにおいて様々な量で発現され得る。2以上の代表的なある亜群が確
実にそのライブラリーに含まれるようにすることによって、望ましい特性を最も
よく発現させるものの選択が保証される。
ノウイルスの性質を決定するためのスクリーニング検定に使用される。それによ
り、とりわけ望ましい諸性質からなる任意の特定キメラアデノウイルスを同定し
、ついでそれを例えば改良された核酸送達媒体の開発などに使用することができ
る。該キメラアデノウイルスライブラリーをスクリーニングされ得る望ましい性
質には、例えば標的細胞特異性、低下した免疫原性、増加した免疫原性、リダイ
レクトされた中和、リダイレクトされた赤血球凝集、向上した感染効率、低下し
た毒性、向上した複製および/またはインビボ投与時の組織分布の変化などの向
上した薬物動態が含まれるが、これらに限らない。異なるキメラアデノウイルス
の性質の比較は、その性質を持つアデノウイルスを与えるのに関与するアデノウ
イルス構成要素の概要説明につながり得る。ついで、このような知見は核酸送達
媒体をさらに最適化するために使用され得る。一側面として本発明は、アデノウ
イルス5と比較してマクロファージまたは線維芽様細胞を形質導入する能力が向
上している(キメラ)アデノウイルスの選択を提供するものであり、好ましくは
該(キメラ)アデノウイルスはB亜群のアデノウイルスのファイバータンパク質
もしくはそのファイバータンパク質の誘導体および/または類似体の組織向性決
定部分の少なくとも一部からなる。さらに本発明は、アデノウイルス5と比較し
て平滑筋細胞を形質導入する能力が向上している(キメラ)アデノウイルスの選
択を提供するものであり、好ましくは該(キメラ)アデノウイルスは、B亜群の
アデノウイルスのファイバータンパク質もしくは該ファイバータンパク質の誘導
体および/または類似体の組織向性決定部分の少なくとも一部からなる。さらに
本発明のキメラアデノウイルスライブラリーは、アデノウイルスの生物学を研究
するためにも使用できる。このようなライブラリーは、例えば様々なアデノウイ
ルス血清型の生物学の相違を研究するのに大変適している。一側面として本発明
はCAR陰性細胞を形質導入できる(キメラ)アデノウイルスの選択を提供するも
のである。該CAR陰性細胞は好ましくは羊水細胞またはその誘導体である。好ま
しくは該羊水細胞は絨毛膜絨毛細胞またはその誘導体である。該CAR陰性細胞は
好ましくは赤血球前駆細胞および/または単球前駆細胞および/またはその誘導体
などといったCAR陰性造血細胞であるがこれらに限らない。CAR陰性細胞を形質導
入できる該(キメラ)アデノウイルスは、好ましくは、DまたはF亜群のアデノウ
イルス由来のファイバータンパク質の少なくともアデノウイルス受容体結合部分
からなる。
パターンからなるキメラアデノウイルスを提供する。リダイレクトされた中和は
いくつかの状況で有用である。例えばそのキメラアデノウイルスを投与された患
者で既存の中和抗体を回避することなどであり、ただしこれらに限定されない。
既存の中和抗体はアデノウイルスを中和し、それによって投与されたウイルスの
有効量を減少させるだろう。通常、この効果は、例えば核酸を標的細胞に送達し
ようとする遺伝治療の状況では望ましくない。しかし例えば遺伝子治療の他の応
用例で、該キメラアデノウイルスを使って送達される目的の核酸が全身の細胞に
くまなく送達されるべきでない場合には、既存の中和抗体も有利でありうる。例
えば固形組織に針を使って行なわれる局所的送達を、漏出したキメラアデノウイ
ルスを中和できる血中の中和抗体の存在と組み合わせると、それは一定の領域に
形質導入を封じ込めるのに役立ちうる。
れた赤血球凝集パターンからなるキメラアデノウイルスを提供する。リダイレク
トされた赤血球凝集はいくつかの状況で有用である。赤血球凝集した物質は、マ
クロファージと誘導体および/または前駆体によって優先的に取り込まれる。し
たがってそれらのマクロファージへの核酸の送達を増進させることが望ましい場
合には、キメラアデノウイルスの増進した赤血球凝集が好ましい。しかし一般的
には標的細胞はそれらのマクロファージではなく、したがってそのような場合は
、低下した赤血球凝集が望ましい。その赤血球凝集がリダイレクトされたキメラ
アデノウイルスは、当業者が現在思いつくことのできる数多くの応用に有用であ
り、したがって本発明の不可欠部分を形成する。
ると、そのウイルスの約99%は肝臓に補集されることがマウスで証明されている
(ヘルツ(Herz)ら、1993年)。したがって生体内で他の器官を標的にできるよう
にアデノウイルス血清型5の宿主細胞域を改変することは、とくに他の改変、具
体的には免疫原性の改変との組み合わせで、本発明の主な目的である。
り、この過程はファイバータンパク質によって媒介される。ファイバータンパク
質は三量体構造を持ち(ストウテン(Stouten)ら、1992年)、その長さはウイル
スの血清型によって異なる(シグナス(Signas)ら、1985年;キッド(Kidd)ら、19
93年)。異なる血清型は、NおよびC末端は構造上類似するが中間のステム領域が
異なるポリペプチドを持つ。N末端の最初の30アミノ酸はペントンベース、とく
にテール中の保存されたFNPVYP領域(アルンベルグ(Arnberg)ら、1997年)への
ファイバーの固定に関与する(クロボツェック(Chroboczek)ら、1995年)。C末
端またはノブは細胞のアデノウイルス受容体との初期相互作用を担う。この初期
結合のあと、キャプシドペントンベースと細胞表面インテグリンの間の二次的結
合が被覆ピットにおけるウイルス粒子のインターナリゼーションとエンドサイト
ーシスをもたらす(モーガン(Morgan)ら、1969年;スベンソン(Svensson)ら、19
84年;バルガ(Varga)ら、1992年;グレバー(Greber)ら、1993年;ウイックハム(
Wickham)ら、1994年)。インテグリンは少なくとも14個のαサブユニットと8個
のβサブユニットが同定されているαβヘテロ二量体である(ハイネス(Hynes)
、1992年)。細胞中で発現される一連のインテグリンは複雑で、細胞型と細胞環
境ごとに異なるだろう。ノブは保存された領域をいくつか含有するが、ノブタン
パク質は血清型間で高度の可変性を示すことから、異なるアデノウイルス受容体
の存在が示唆される。例えばC亜群のアデノウイルス(Ad2、Ad5)とB亜群のアデ
ノウイルス(Ad3)は異なる受容体に結合することが証明されている(デフナー(
Defner)ら、1990年)。ファイバータンパク質は型特異的なγ抗原も含有し、こ
れはヘキソンのε抗原と共に血清型特異性を決定する。γ抗原はファイバー上に
局在し、これは17アミノ酸からなることが知られている(エイツ(Eiz)ら、1997
年)。したがって宿主の抗ファイバー抗体はノブの三量体構造に向けられる。抗
ファイバー抗体はペントンベースおよびヘキソンタンパク質に対する抗体と共に
アデノウイルス粒子の中和を担っている。まず抗ファイバー抗体がアデノウイル
ス粒子を脱外被させ、そのあと、ペントンベースが抗ペントンベース抗体に接近
できるようになる(ガヘリー−セガード(Gahery-Segard)ら、1998年)。これは
極めて効果的なアデノウイルス粒子の中和方法であるように思われるが、他の研
究者はこれら粒子の中和には抗ヘキソン抗体が最も効果的だと述べている(ガル
(Gall)ら、1996年)。
かの方法が過去に研究されており、あるいは今なお研究されている。ウイックハ
ムらは、ペントンベースへのαvβ3およびαvβ5インテグリンの結合を担うと考
えられているペントンベース中のRGD(Arg、Gly、Asp)モチーフを変化させた。
彼らはこのRGDモチーフを、α4βl受容体に特異的なもう一つのペプチドモチー
フで置換した。この方法により、アデノウイルスを特定の標的細胞にターゲッテ
ィングすることができた(ウイックハムら、1995年、1996年)。クラスニクらは
ノブ中にあるHIループを利用した。このループは、X線結晶学によれば、ノブ三
量体構造の外側にあり、したがってノブにおける分子内相互作用には寄与しない
と考えられる(クラスニクら、1998年)。しかし完全なCAR非依存的感染は観察
されなかった。
クロフージなどの抗原提示細胞における感染の欠失または低下を伴うアデノウイ
ルスを構築する方法と手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、イ
ンビトロで特定の細胞タイプにターゲッティングでき、またインビボで一定の細
胞タイプに対して変化した向性を持つ、前述のようなキメラアデノウイルスの生
成方法を提供することである。
織へのタンパク質または核酸送達媒体として使用できるようにする方法と手段を
提供することである。
イルスの生成について述べる。この目的のために、完全なアデノウイルス血清型
5ゲノムをともに含有する3つのプラスミドを構築した。これらのプラスミドから
アデノウイルス血清型5ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質および
ファイバータンパク質をコードするDNAを除去し、クローニングを容易にするリ
ンカーDNA配列で置換した。つぎにこれらのプラスミドを、異なるアデノウイル
ス、血清型(ヒトまたは動物)に由来するペントンベースタンパク質、ヘキソン
タンパク質およびファイバータンパク質をコードするDNAを挿入するためのテン
プレートとした。ポリメラーゼ連鎖反応法を(縮重)オリゴヌクレオチドと組み
合わせて使用することにより、様々な血清型に由来するDNAを得た。アデノウイ
ルス血清型5のゲノム中の元のE1位置には、任意の目的遺伝子をクローニングで
きる。3つのプラスミドを合わせて一度にトランスフェクションすることにより
、組換えキメラアデノウイルスが形成した。キメラアデノウイルスからなるライ
ブラリーのこの新しい技術は、このようにして、インビトロおよびインビボ遺伝
子治療用の改良された組換えアデノウイルスベクターの迅速なスクリーニングを
可能にする。
た例は報告されているが、ノブの複雑な構造と、CARと相互作用する正確なアミ
ノ酸の知見が限られていることが、そのようなターゲッティング方法を面倒で困
難なものにしている。前述の制約を克服するため、本発明者らは、他のアデノウ
イルス血清型に由来する既存のアデノウイルスファイバー、ペントンベースタン
パク質およびヘキソンタンパク質を使用した。代替アデノウイルス血清型の構造
タンパク質を含有するキメラアデノウイルス血清型5ライブラリーを作成するこ
とにより、本発明者らは、好ましい特徴を持つ組換えアデノウイルスベクターの
迅速なスクリーニングを可能にする技術を開発した。
ノウイルスに対する天然の現存するまたは誘導される中和性宿主活性を克服する
ために、キメラアデノウイルスを使用することについて述べる。この宿主免疫応
答は主としてアデノウイルスのキャプシド中に存在するペントンベースとヘキソ
ンタンパク質に向けられ、それより程度は低いがファイバーにも向けられる。
って定義される。したがって例えばアデノウイルス血清型5に基づくがペントン
ベースタンパク質および/またはヘキソンタンパク質に関してキメラであるキメ
ラウイルスは、変化した、重篤度の低い免疫応答を誘発する。このようなキメラ
アデノウイルスの必要性は、1)組換えアデノウイルス血清型5の反復した全身送
達は、その組換えアデノウイルス血清型5に対して力価の高い中和抗体が生成す
るので成功しないという観察(シュリック(Schulick)ら、1997年)と、2)既存の
免疫または自然免疫によって強調される。したがって本発明のこの側面は、遺伝
子治療のためにアデノウイルスの投与を繰り返すことができないという問題を回
避するものである。ペントンベース、ヘキソンおよびファイバータンパク質は、
好ましくはBおよびD亜群のアデノウイルスに由来し、より具体的にはアデノウイ
ルス血清型16、24、33、36、38、39、42および50のものである。その理由は、こ
れらの血清型がヒトからはめったに単離されず、このことはこれらの血清型に対
する中和抗体が低い抗体価で循環していることを示しているからである。
た向性を持つキメラアデノウイルスと、それらウイルスの生成方法を記述する。
例えばアデノウイルス血清型5に基づくが自然界に存在する任意のアデノウイル
スファイバーを提示するウイルス。このキメラアデノウイルス血清型5はインビ
トロおよびインビボで一定の細胞タイプにアデノウイルス血清型5よりも高いま
たは低い効率で感染できる。そのような細胞には内皮細胞、平滑筋細胞、樹状細
胞、ニューロン細胞、グリア細胞、滑膜細胞、肺上皮細胞、造血幹細胞、単球/
マクロファージ細胞などがあるが、これらに限らない。
トロ増幅を示すキメラアデノウイルスを同定する方法を記述する。異なる亜群に
由来するアデノウイルスは、一つの亜群内でもそうであるが、組換えアデノウイ
ルスの生産に使用される細胞タイプでの産生性感染に高い可変性を示す。表2は
様々なアデノウイルス血清型とそれらのヒト疾患との関係を概観したものであり
、所与のアデノウイルス血清型の複製が一定の細胞タイプで増進されることを示
している。遺伝子治療用の組換えアデノウイルスの生産にはいくつかの細胞株を
利用できる。それらにはPER.C6、911、293およびE1 A549があるが、これらに限
らない。これらのアデノウイルス産生細胞は、アデノウイルス血清型5系ウイル
スの増幅に最も適した細胞タイプではないかもしれない。したがって、本発明の
この側面では、本発明者らは、様々な血清型に由来するアデノウイルスを、例え
ばPER.C6でのそれらの増殖能力に基づいて選択し、それらの初期遺伝子(E1を除
く)とITRとを用いて、一般に使用されるアデノウイルス血清型2または5と比較
して増殖の点で優れ、したがってより高い力価を与えるキメラウイルスを構築す
る。
または動物血清型に由来するDNAで置換されているアデノウイルス血清型5の別個
の部分からなるライブラリーの構築と使用を記述する。全体として完全なアデノ
ウイルスゲノムを包含するこの構築物のセットは、一定の患者群に、さらには一
個体にカスタマイズされた独自のキメラアデノウイルスの構築を可能にする。
失と、プロモーターに連結されたまたは連結されていない異種遺伝子の挿入とを
含んでも含まなくてもよい。さらにキメラアデノウイルスは、E3領域中の欠失と
、プロモーターに連結された異種遺伝子の挿入とを含んでも含まなくてもよい。
さらにキメラアデノウイルスは、E2および/またはE4領域中の欠失と、プロモー
ターに連結された異種遺伝子の挿入を含んでも含まなくてもよい。後者の場合、
組換えアデノウイルスを生成させるには、E2および/またはE4を相補する細胞株
が必要である。
イルス血清型5の全ゲノムを様々なプラスミドまたはコスミドにクローニングし
たところ、まだ組換えウイルス産生能を保持していた。この目的のために、下記
のプラスミドを作成した。
ルス5型(Ad5)DNAを過剰のdNTPの存在下にクレノウ酵素で処理した。クレノウ
酵素を不活化し、フェノール/クロロホルム抽出によって精製し、つぎにエタノ
ール沈殿を行なったあと、そのDNAをBamHIで消化した。このDNA調製物をさらに
精製することなく、つぎのように調製したpBr322由来のベクターDNAとの連結反
応に使用した:pBr322 DNAをEcoRVとBamHIで消化し、TSAP酵素(ライフ テクノ
ロジーズ社(Life Technologies))による処理で脱リン酸化し、LMPアガロース
ゲル(シープラークGTG(SeaPlaque GTG))で精製した。コンピテント大腸菌D
H5a(Life Techn.)への形質転換とアンピシリン耐性コロニーの分析後に、Ad5
中のBamHI部位から右ITRまで伸びるインサートに予想される消化パターンを示し
た一つのクローンを選択した。
していることが明らかになり、ITRの残りの部分は正しいことがわかった。この
欠落したG残基は複製中の他方のITRによって補われる。
ベクター断片をLMPアガロース(シープラークGTG)で単離し、野生型Ad5 DNAか
ら得られる4.8kbのSalI-BamHI断片に連結し、ジーンクリーン(Geneclene)IIキ
ット(バイオ101社(Bio 101))で精製した。一つのクローンを選択し、Ad5配
列の完全性を制限酵素分析によって決定した。クローンpBr/Ad.Sal-rITRは、ア
デノ5型配列をbp16746にあるSalI部位からrITR(最も3′のG残基を欠くもの)ま
で含有する。
よってゲルから分離した。pBr322を同じ酵素で消化し、ジーンクリーンによって
アガロースゲルから精製した。両断片を連結し、コンピテントDH5aに形質転換し
た。得られたクローンpBr/Ad.Cla-Bamを制限酵素消化によって分析したところ、
bp919から21566までのアデノウイルス配列を持つインサートを含有することが明
らかになった。
した。AflIIを65℃で20分間熱失活させたあと、その断片末端をクレノウ酵素で
補充した。つぎにそのDNAをPacI部位を含有する平滑二本鎖オリゴリンカー(5′
-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3′)に連結した。このリンカーはつぎの2つのオリ
ゴヌクレオチド:5′-AATTGTCTTAATTAACCGC-3′と5′-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3′
をアニーリングさせたあと、クレノウ酵素で平滑末端化することによって作成し
た。連結したDNAを沈殿させて緩衝液を換えたあと、その連結物を過剰のPacI酵
素で消化することにより、このオリゴのコンカテマーを除去した。bp3534から21
566までのAd5配列とベクター配列とを含有する22016bpの部分断片をLMPアガロー
ス(シープラークGTG)で単離し、再連結し、コンピテントDH5aに形質転換した
。PacI部位を含有することが見出され、大きいアデノ断片を保持していた一つの
クローンを選択し、その5′末端を配列決定することにより、(失われた)AflII
部位にPacIリンカーが正しく挿入されていることを確かめた。
CC寄託物P97082121) クローンpBr/Ad.Bam-rITR中のAd5のITR近くにPacI部位を挿入できるように、p
Br322骨格中のClaI部位とITR配列の開始位置との間にある約190ヌクレオチドを
除去した。これはつぎのように行なった:pBr/Ad.Bam-rITRをClaIで消化し、様
々な時間(2分、5分、10分および15分)にわたってヌクレアーゼBal31で処理し
た。ヌクレオチド除去の程度は、同じ緩衝液と条件を用いてpBr322 DNA(やはり
ClaI部位で消化したもの)で行なった別個の反応によって追跡した。Bal31酵素
を75℃で10分間のインキュベーションによって失活させ、DNAを沈殿させ、より
少体積のTE緩衝液に再懸濁した。平滑末端を保証するために、そのDNAをさらに
過剰のdNTPの存在下にT4 DNAポリメラーゼで処理した。(対照の)pBr322 DNAの
SalIによる消化後に、10分または15分間処理した試料中に満足な分解(約150bp
)が観察された。つぎに、10分または15分間処理したpBr/Ad.Bam-rITR試料を前
述の平滑末端PacIリンカーに連結した(pBr/Ad.AflII-Bam参照)。連結物を沈殿
によって精製し、過剰のPacIで消化し、LMPアガロースゲルでリンカーから分離
した。再連結のあと、DNAをコンピテントDH5aに形質転換し、コロニーを分析し
た。ほぼ望ましい長さの欠失を示した10個のクローンを選択し、それらをTトラ
ック配列決定によってさらに分析した(T7シークエンシングキット、ファルマシ
アバイオテク社(Pharmacia Biotech))。rITRのすぐ下流に挿入されたPacIリン
カーを持つ2つのクローンが見つかった。PacIによる消化後に、クローン#2では2
8bpが、クローン#8では27bpがITRに結合している。
いAd5インサートをクローニングした。まず、ただ1つのPacI部位を含有するリン
カーをpWE15のEcoRI部位に挿入してpWE.pacを作成した。この目的のために、pBr
/Ad.AflII-BamHIについて記述したような二本鎖PacIオリゴ、ただしそのEcoRI突
出末端を持つものを使用した。つぎに下記の断片をアガロースゲルから電気溶出
法によって単離した:PacIで消化したpWE.pac、PacIとBamHIで消化したpBr/AflI
I-Bam、BamHIとPacIで消化したpBr/Ad.Bam-rITR#2。これらの断片を合わせて連
結し、1ファージパッケージングエキストラクツ(ストラタジーン社(Stratagen
e))を製造者のプロトコルに従って使用することによりパッケージングした。
宿主細菌への感染後に、コロニーを平板上で生育し、完全なインサートの存在に
ついて分析した。pWE/Ad.AflII-rITRはbp3534(AflII部位)から右ITR(最も3′
のG残基を欠くもの)までの全てのアデノウイルス5型配列を含有する。
lIで消化した。それぞれ左ITR-Sal(9.4)およびSal(16.7)-右ITRと呼ばれる
、得られた断片のうち2つをLMPアガロース(シープラークGTG)で単離した。pBr
322 DNAをEcoRVとSalIで消化し、ホスファターゼ(ライフ テクノロジーズ社)
で処理した。そのベクター断片をジーンクリーン法(バイオ101社)を使って単
離し、Ad5 SalI断片に連結した。9.4kbの断片を用いた連結反応だけがインサー
トを持つコロニーを与えた。クローニング境界の分析と配列決定後に、完全なIT
R配列を含有し、bp9462のSalI部位まで伸びている1クローンを選択した。
クノロジーズ社)。このクローンをAd5中の三番目のSalI部位まで延長するため
に、pBr/Ad.Cla-BamをBamHIで直鎖化し、SalIで部分消化した。9462から16746ま
でのアデノウイルス配列を含有する7.3kbのSalI断片をLMPアガロースゲルで単離
し、SalI消化したpBr/Ad.lITR-Sal(9.4)ベクター断片に連結した。
にそのDNAをPacIで消化し、アガロースゲルから単離した。pWE/AflII-rITRをEco
RIで消化し、クレノウ酵素による処理のあと、PacIで消化した。アデノウイルス
配列を含有する大きい24kb断片をアガロースゲルから単離し、ClaI消化し平滑末
端化したpWE.pacベクターに、クローンテック社の連結発現キット(Ligation Ex
pressTM Kit)を用いて連結した。ストラタジーン社のウルトラコンピテントXL10
-ゴールド(Ultracompetent XL10-Gold)細胞を形質転換したあと、予想される
インサートを含有するクローンを同定した。pWE/AflII-EcoRIはbp3534から27336
までのAd5配列を含有する。
ないことは、新しい組換えウイルスの安全でRCAを含まない生成と増殖にとって
必須である。アダプタープラスミドpMLPI.TK(図1)は、本発明の改良されたパ
ッケージング細胞株と組み合わせて本発明に従って使用するように設計されたア
ダプタープラスミドの一例である。このプラスミドを、特定プロモーターと遺伝
子配列とからなる核酸分子を容易に交換することができる新しいベクターを作成
するための出発物質として使用した。
プライマーを使ってPCR断片を生成させた:LTR-1:5′-CTG TAC GTA CCA GTG CA
C TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3′およびLTR-2:5′-GCG GAT CCT
TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC
G-3′。Pwo DNAポリメラーゼ(ベーリンガー マンハイム社(Boehringer Mannhe
im))を製造者のプロトコルに従ってつぎの温度サイクルで使用した:95℃で5分
間、55℃で3分間および72℃で1分間を1回;95℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1
分間を30サイクル、その後72℃で10分間を1回。つぎにそのPCR産物をBamHIで消
化し、PvuIIとBamHIで消化したpMLP10(レブレロら、1991年)ベクターに連結す
ることにより、ベクターpLTR10を生成させた。このベクターはbp1からbp454まで
のアデノウイルス配列を含有し、その後ろに、野生型エンハンサー配列が突然変
異型ポリオーマウイルス(PyF101)由来のエンハンサーで置換されているMo-MuL
V LTRの一部からなるプロモーターが続いている。そのプロモーター断片をL420
と名付けた。つぎに、ネズミHSA遺伝子のコード領域を挿入した。pLTR10をBstBI
で消化したあと、クレノウ処理とNcoIによる消化を行なった。HSA遺伝子は、つ
ぎのプライマーを用いるpUC18-HSA(ケイ(Kay)ら、1990年)でのPCR増幅によっ
て得られた:HSA1、5′-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3′およびHSA
2、5′-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG A
A-3′。その269bpの増幅断片をNcoI部位とBglII部位を使ってシャトルベクター
にサブクローニングした。配列決定によって、HSA遺伝子の正しいコード配列、
ただしTAG停止コドンのすぐ後ろに余分なTAG挿入を持つ配列の組込みを確認した
。つぎに、HSA遺伝子のコード領域を、そのTAG重複を含めて、NcoI(付着)-Sal
I(平滑)断片として切り出し、pLTR10から得られる3.5kbのNcoI(付着)/BstBI
(平滑)断片にクローニングすることにより、pLTR-HSA10を得た。
グナル、L420プロモーターおよびHSA遺伝子を含有する断片を、同じ酵素で消化
したベクターpMLPI.TKに挿入することにより、そのプロモーターと遺伝子配列を
置換した。これにより、プロモーターと遺伝子配列の周辺に都合のよい様々な制
限酵素の認識部位を含有する新しいアダプタープラスミドpAd/L420-HSA(図2)
が得られた。SnaBIとAvrIIはプロモータ配列を交換するためにHpaI、NheI、KpnI
、HindIIIと組み合わせることができ、また後者の部位はこの構築物中の遺伝子
を置換するためにHSAコード領域の3′側にあるClaIまたはBamHI部位と組み合わ
せることができる。
、マルチプルクローニング部位、イントロンおよびポリAシグナルで置き換える
ことによって、核酸分子が容易に交換できるように設計されたもう一つのアダプ
タープラスミドを作成した。この目的のために、pAd/L420-HSAをAvrIIとBglIIで
消化したあと、平滑末端を得るためにクレノウで処理した。pBr322ベクター配列
とアデノウイルス配列とを持つ5.1kbの断片を単離し、HhaIおよびAvrIIによる消
化とそれに続くT4 DNAポリメラーゼでの処理によって得られるpcDNA1/amp(イン
ビトロゲン社(Invitrogen))の平滑1570bp断片に連結した。このアダプタープラ
スミドをpCLIP.Lucと名付けた(図3)。
に、つぎの各構築物を調製する:a)オーバーラップするアデノウイルスゲノム
断片の3′側で切断する制限酵素によって直鎖化された目的の遺伝子を持つ発現
カセットを含有するアダプター構築物であって、好ましくはpBr322ベクター配列
を含まないもの、およびb)PacIで消化した相補アデノウイルスゲノム構築物pWE
/Ad.AflII-rITR。
らに精製する。これらのプラスミドのアデノウイルスパッケージング細胞株、好
ましくは本発明の細胞株への同時トランスフェクションは、アダプターと相補構
築物の間の一段階相同組換えによって、組換え複製欠損アデノウイルスを生成す
る(図4)。
例えばEcoRIとBamHIで消化したpBr/Ad.Cla-Bamや、PacIとBamHIで消化したpBr/A
d.AflII-BamHIを、SalIで消化したpBr/Ad.Sal-rITRと組み合わせることができる
。この場合は3つのプラスミドが組み合わされ、組換えアデノウイルスを得るに
は2回の相同組換えが必要である(図5)。当業者は本発明から逸脱することな
くアダプターと相補プラスミドの他の組み合わせも使用できることを理解すべき
である。
様々なアダプタープラスミドとAd.AflII-rITR断片とを使って、いくつかの組換
えアノウイルスを生産するために行われた。アデノウイルスパッケージング細胞
(PER.C6)を約25cm2のフラスコに接種し、翌日、それらが集密度約80%になっ
たところで、DNAとリポフェクタミン剤(Life Tech.)の混合物で、製造者の説
明通りにトランスフェクションした。通例、40μlのリポフェクタミン、4μgの
アダプタープラスミドおよび4μgの相補アデノウイルスゲノム断片AflII-rITR(
または二重相同組換えの場合は3つのプラスミド全て2μg)を使用する。pAd/CMV
-LacZアダプターを用いた対照トランスフェクションで測定したところ、これら
の条件で約50%の一過性トランスフェクション効率(トランスフェクションの48
時間後)が得られる。2日後に、細胞を約80cm2のフラスコに継代し、さらに培養
する。約5日(単一相同組換えの場合)から11日(二重相同組換えの場合)後に
細胞変性効果(CPE)が見られ、機能的アデノウイルスが形成したことが示され
る。完全なCPEが起こったら細胞と培地を収集し、凍結-融解操作によって組換え
ウイルスを放出させる。完全なCPEの発生にもかかわらず、初期段階で力価が変
わりやすいことが見出されるので、通常、収率を上げるために、80cm2フラスコ
での追加の増幅段階を行なう。
を活性な導入遺伝子を持つウイルスについて試験する。
いので、E1領域での置換に加えて、アデノウイルス中のE3領域(の一部)を欠失
させるか置換することが可能である。これにより、最大パッケージングサイズ(
野生型ゲノムの長さの約105%)をこえないで、より大きなインサートを使用し
たり、2以上の遺伝子を挿入する機会が生じる。これは例えば、pBr/Ad.Bam-rITR
クローン中のE3領域の一部をXbaIによる消化と再連結で欠失させることによって
行なうことができる。これにより、既知のE3コード領域すべてを含むAd5野生型
配列28592-30470が除去される。もう一つの例は、E3領域中のgp19Kのコード領域
を、新しい配列の挿入を可能にするポリリンカーで正確に置換することである。
これにより、1)他のコード領域は全て無傷のまま残り、2)導入遺伝子はE3プロ
モーターとpA配列によって制御されるので異種プロモーターの必要がなくなり、
したがってコード配列のためにより多くのスペースが残る。
断片をピーブルースクリプト(pBluescript)(KS-)(ストラタジーン社)のEc
oRI部位にクローニングした。つぎに、ポリリンカー中のHindIII部位を、EcoRV
およびHindIIによる消化とそれに続く再連結によって除去した。得られたクロー
ンpBS.Eco-Eco/ad5DHIIIを使ってgp19Kコード領域を欠失させた。プライマー1(
5′-GGG TAT TAG GCC AA AGG CGC A-3′)とプライマー2(5′-GAT CCC ATG GAA
GCT TGG GTG GCG ACC CCA GCG-3′)とを使って、pBS.Eco-Eco/Ad5DHIIIから野
生型Ad5 DNA中の配列28511から28734に相当する配列を増幅した。同じDNAにプラ
イマー3(5′-GAT CCC ATG GGG ATC CTT TAC TAA GTT ACA AAG CTA-3′)とプラ
イマー4(5′-GTC GCT GTA GTT GGA CTG G-3′)を使って、29217から29476まで
のAd5配列を増幅した。得られた2つのPCR断片を、新たに導入されたNcoI部位を
利用して互いに連結したあと、XbaIとMunIで消化した。つぎにこの断片を、XbaI
(部分)とMunIで消化したpBS.Eco-Eco/ad5ΔHIIIベクターに連結することによ
り、pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19Kを生成させた。HindIIIとBamHI部位に外来
遺伝子を挿入できるように、pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K中にXbaI欠失を作
ってブルースクリプトポリリンカー中のBamHI部位を除去した。得られたプラス
ミドpBS.Eco-Eco/ad5ΔHIIIΔgp19KΔXbaIは、Ad5中の配列28733(HindIII)と2
9218(BamHI)とに対応するただ1つのHindIII部位とBamHI部位を含有する。これ
らの部位への外来遺伝子の導入後に、欠失させたXbaI断片を再導入するか、その
インサートをpBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19KにHindIIIと例えばMunIとを使って
再クローニングする。この方法を用いて、本発明者らはHSV-TK、hIL-1a、ラット
IL-3、ルシフェラーゼまたはLacZを発現させるプラスミドを作成した。pBS.Eco-
Eco/ad5ΔHIII.Δgp19Kプラスミド中のただ1つのSrfI部位とNotI部位(挿入され
た目的の遺伝子を持つものまたは持たないもの)は、目的の遺伝子を含む領域を
pBr/Ad.Bam-rITRの対応する領域に移して、構築物pBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K(挿
入された目的の遺伝子を持つものまたは持たないもの)を得るために使用される
。この構築物は、組換えアデノウイルスを産生するために前述のように使用され
る。そのウイルスの状況では挿入された遺伝子の発現がアデノウイルスE3プロモ
ーターによって制御される。
アダプタープラスミド、 b)pWE/Ad.AflII-EcoRI断片、および c)第二の目的遺伝子が挿入された、または挿入されていないpBr/Ad.Bam-rITRΔ
gp19Kプラスミド からなるプラスミド系システムを用いて、E1置換ベクターについて前述したよう
な二重相同組換え法によって作成される。
に達成できる。しかしそのようなウイルスの生成と増殖はトランスに相補性を要
求する場合がある。
スの生成 2つ以上の別個のクローン化アデノウイルス配列の同時トランスフェクション
によって組換えアデノウイルスを作成するための後述の方法。つぎに、他のアデ
ノウイルス血清型に由来するDNA配列を容易に導入できる鋳型クローンを作成す
るために、これらのクローン化アデノウイルス配列を使って特定のアデノウイル
ス血清型5配列を除去した。これら鋳型クローンの一例として、ファイバータン
パク質をコードするDNAの交換を可能にするプラスミドの構築について以下に述
べる。
の間に位置する。ファイバーをコードするアデノウイルス血清型5のDNAを除去す
るために、本発明者らは構築物pBr/Ad.Bam-rITRから出発した。この構築物から
、まず一つのNdeI部位を除去した。この目的のためにpBr322プラスミドDNAをNde
Iで消化したあと、突出末端をクレノウ酵素で補充した。つぎに、そのpBr322プ
ラスミドを再連結し、NdeIで消化し、大腸菌DH5αに形質転換した。得られたpBr
/ΔNdeIプラスミドをScaIとSalIで消化し、得られた3198bpのベクター断片をpBr
/Ad.BamrITR由来の15349bpのScaI-SalI断片に連結することにより、プラスミドp
Br/Ad.Bam-rITRΔNdeIを得、したがってただ1つのNdeI部位を含有した。つぎに
、オリゴヌクレオチドNY-上流:
6)。増幅されたファイバーDNAのクローニングを容易にするために、増幅中に
、NdeI制限部位(太字部分)とNsiI制限部位(下線部)の両方が導入された。増
幅は各々94℃で45秒、60℃で1分および72℃で45秒の25サイクルからなった。こ
のPCR反応は25pmolのオリゴヌクレオチドNY-上流またはNY-下流、2mM dNTP、1.5
mM MgCl2を含むPCR緩衝液および1単位のエロンガーゼ(Elongase)熱安定性ポリ
メラーゼ(ギブコ社(Gibco)、オランダ)を含んだ。そのPCR産物の10分の1を
アガロースゲルで泳動したところ、±2200bpの予想DNA断片が増幅されることが
明らかになった。つぎにこのPCR断片をジーンクリーンキットシステム(バイオ1
01社)を使って精製した。つぎに、構築物pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIとPCR産物の両
方を制限酵素NdeIとSbfIで消化した。つぎにPCR断片を、T4リガーゼ酵素を使っ
て、NdeIおよびSbfI消化したpBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIにクローニングして、pBr/A
d.BamRΔFibを得た。このプラスミドには、除去されたファイバー配列の代わり
に挿入されるただ1つのNdeI部位とNsiI部位とを使って、任意のPCR増幅ファイバ
ー配列を挿入できる。アダプタープラスミド、PacIとEcoRIで消化した構築物pBr
/Ad.AflII-EcoRI、および異種ファイバー配列が挿入されているpBr/Ad.BamRΔFi
b構築物を使用して、後述するパッケージング細胞における二重相同組換えによ
り、ウイルスを生成させることができる。ウイルスの生成効率を増加させるため
に、構築物pBr/Ad.BamRΔFibを、右ITRに隣接してPacI部位が生成するように修
飾した。ここに、pBr/Ad.BamRΔFibをAvrIIで消化し、5kbのアデノ断片を単離し
、ベクターpBr/Ad.Bam-rITR.pac#8に導入して、対応するAvrII断片を置換した。
得られた構築物をpBr/Ad.BamRΔFib.pacと名付けた。
ァイバー修飾右側アデノウイルスクローンを、実施例1にpWE/Ad.AflII-rITRに
ついて記述したように、大きいコスミドクローンに導入することができる。その
ような大きなコスミドクローンは一回だけの相同組換えによるアデノウイルスの
生成を可能にするため、その工程は極めて効率がよくなる。
、縮重オリゴヌクレオチドを合成した。この目的のために、まず、代替血清型の
ファイバータンパク質をコードする既知のDNA配列を整列して、ファイバータン
パク質のテール領域とノブ領域の両方で保存された領域を同定した。
列から、(縮重)オリゴヌクレオチドを合成した(表3参照)。また表3には、
特定の血清型のファイバータンパク質をコードするDNAを増幅するために使用し
たオリゴヌクレオチドの組み合わせも示す。増幅反応(50μl)は、1反応につき
、2mMのdNTP、25pmolの各オリゴヌクレオチド、標準1×PCR緩衝液、1.5mM MgCl2 および1単位のPwo熱安定性ポリメラーゼ(ベーリンガー社(Boehringer))を含
有した。サイクラープログラムは、94℃で30秒、60〜64℃で60秒および72℃で12
0秒から各々構成される20サイクルを含んだ。そのPCR産物の10分の1をアガロー
スゲルで泳動することにより、DNA断片が増幅されたことが証明された。それぞ
れ異なる鋳型で、2回の独立したPCR反応を行なったあと、得られた独立のPCR断
片を配列決定してヌクレオチド配列を決めた。11種類の血清型から、該ヌクレオ
チド配列はゲンバンク(GenBank)中に存在する配列になぞらえることができた
。他の全ての血清型のファイバータンパク質をコードするDNAはこれまで未知で
あったため、相同性、すなわち配列の分岐を決定するために、他の亜群メンバー
から得られた既知の配列と整列した。現在までに知られている51のヒト血清型の
うち、血清型1、6および26を除く全てのファイバー配列が増幅され、配列決定さ
れている。様々なアデノウイルス血清型から得られるファイバーのタンパク質配
列を図7に示す。
化した。つぎに、消化したDNAをアガロースゲルで泳動したあと、断片をそのゲ
ルから単離し、ジーンクリーンキット(バイオ101社)を使って精製した。つぎ
に、それらのPCR断片をpBr/AdBamRΔFibのNdeI部位とNsiI部位にクローニングす
ることにより、pBr/AdBamRFibXX(ここにXXはそのファイバーDNAを単離した血清
型番号を表わす)を作成した。これまでに血清型5/7/8/9/10/11/12/13/
14/16/17/19/21/24/27/28/29/30/32/33/34/35/36/37/38/40-S
/40-L/41-S/42/45/47/49/51のファイバー配列がpBr/AdBamRFibXXにクロ
ーニングされている。pBr/AdBamRFibXX(XXは5/8/9/10/11/13/16/17/24
/27/30/32/33/34/35/38/40-S/40-L/45/47/49/51)から、ファイバ
ー配列を包含する6kbのAvrII断片をゲル電気泳動とジーンクリーンで単離した。
つぎにこのAvrII断片を、AvrIIで完全に消化して先に記述したように脱リン酸化
したプラスミドpBr/Ad.Bam-rITR.pac(実施例1参照)にクローニングすること
により、プラスミドpBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXXを生成した。つぎに、構築物pWE
.pac、pBr/AflII-BamおよびpBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXXを用いて修飾ファイバー
を持つコスミドクローンを生成させるために、このプラスミドを使用した。この
コスミドクローニングにより、構築物pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX(XXはそのファ
イバーDNAを単離した血清型番号を表わす)が形成した。
容易に交換できる新しいベクターを作成した。
プライマーを使って、PCR断片を生成させた:LTR-1:5′-CTG TAC GTA CCA GTG
CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3′およびLTR-2:5′-GCG GAT C
CT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA A
TC G-3′。Pwo DNAポリメラーゼ(ベーリンガー マンハイム社)を製造者のプロ
トコルに従ってつぎの温度サイクルで使用した:95℃で5分間、55℃で3分間およ
び72℃で1分間を1回;95℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1分間を30サイクル、
その後72℃で10分間を1回。つぎにそのPCR産物をBamHIで消化し、PvuIIとBamHI
で消化したpMLP10(レブレロら、1991年;Gene 101巻、195〜202頁)に連結する
ことにより、ベクターpLTR10を作成した。このベクターはbp1からbp454までのア
デノウイルス配列を含有し、その後ろに、野生型エンハンサー配列が突然変異型
ポリオーマウイルス(PyF101)由来のエンハンサーで置換されているMo-MuLV LT
Rの一部からなるプロモーターが続いている。そのプロモーター断片をL420と命
名した。配列決定によってLTR断片の正しい増幅が確認されたが、PCR断片中の最
も5′側にある塩基が欠落していて、PvuII部位は修復されなかった。つぎに、ネ
ズミHSA遺伝子のコード領域を挿入した。pLTR10をBstBIで消化したあと、クレノ
ウ処理とNcoIによる消化を行なった。HSA遺伝子は、つぎのプライマーを用いて
、pUC18-HSA(ケイら、1990年;J.Immunol.145巻、1952〜1959頁)でのPCR増幅に
よって得た:HSA1、5′-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3′およびHSA
2、5′-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG A
A-3′。その269bpの増幅断片をNcoI部位とBglII部位を使ってシャトルベクター
にサブクローニングした。配列決定により、HSA遺伝子の正しいコード配列、た
だしTAG停止コドンのすぐ後ろに余分なTAG挿入を持つ配列の組込みが確認された
。つぎに、HSA遺伝子のコード領域を、そのTAG重複を含めて、NcoI(付着)-Sal
I(平滑)断片として切り出し、pLTR10から得られる3.5kbのNcoI(付着)/BstBI
(平滑)断片にクローニングして、pLTR-HSA10を得た。
シグナル、L420プロモーターおよびHSA遺伝子を含有する断片を、同じ酵素で消
化したベクターpMLPI.TKに挿入することにより、そのプロモーターおよび遺伝子
配列を置換した。これにより、プロモーターおよび遺伝子配列の周辺に都合のよ
い様々な制限酵素の認識部位を含有する新しいアダプタープラスミドpAd5/L420-
HSAが得られた。SnaBIとAvrIIはプロモータ配列を交換するためにHpaI、NheI、K
pnI、HindIIIと組み合わせることができ、一方、後者の部位はこの構築物中の遺
伝子を置換するためにHSAコード領域の3′側にあるClaIまたはBamHI部位と組み
合わせることができる。
ドを、pAd5/L420-HSA中のプロモーター、遺伝子およびポリA配列を、CMVプロモ
ーター、マルチプルクローニングサイト、イントロンおよびポリAシグナルで置
き換えることによって作成した。この目的のために、pAd5/L420-HSAをAvrIIとBg
lIIで消化したあと、平滑末端を得るためにクレノウで処理した。pBr322ベクタ
ー配列とアデノウイルス配列とを持つ5.1kbの断片を単離し、HhaIとAvrIIで消化
してからT4 DNAポリメラーゼで処理することによって得たpcDNA1/amp(インビト
ロゲン社)の平滑1570bp断片に連結した。このアダプタープラスミドをpAd5/Cli
pと名付けた。そのアデノウイルス断片からベクター配列を除去できるように、p
Ad5/ClipをEcoRIで部分消化し、直鎖断片を単離した。5′-TTAAGTCGAC-3′とい
う配列のオリゴをそれ自身にアニールさせて、SalI部位とEcoRI突出部を持つリ
ンカーを生じさせた。そのリンカーを、部分消化したpAd5/Clipベクターに連結
し、pAd5/Clip中の左アデノウイルスITRの23bp上流にあるEcoRI部位に挿入され
たリンカーを持つクローンを選択して、pAd5/Clipsalとした。
伝子をプラスミドpMLP.nlsLacZ(EP 95〜202 213)からプライマー5′GGGGTGGCC
AGGGTACCTCTAGGCTTTTGCAAと5′GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCCを用いたPCRによ
って増幅した。このPCR反応はEx Taq(タカラ社(Takara))を用い、その供給者
のプロトコールに従って、つぎの増幅プログラムで行なった:94℃5分、1サイク
ル;94℃45秒、60℃30秒、72℃2分、5サイクル;94℃45秒、65℃30秒、72℃2分
、25サイクル;72、10分;94℃45秒、60℃30秒、72℃2分、5サイクル、Iサイク
ル。つぎにそのPCR産物をKpnIとBamHIで消化し、消化されたDNA断片を、KpnI/Ba
mHIで消化したpcDNA3(インビトロゲン社)に連結して、pcDNA3.nlsLacZを生成
させた。つぎに、プラスミドpAd5/ClipをSpeIで消化した。5′部分CMVプロモー
ターの一部とアデノウイルス配列とを含有する大断片を単離した。プラスミドpc
DNA3.nlsLacZをSpeIで消化し、CMVプロモーターの3′部分とLacZ遺伝子とを含有
する断片を単離した。つぎに、それらの断片を連結してpAd/Clip.LacZを生成し
た。CMVプロモーターの復元は制限消化によって確認された。
c(EP 95〜202 213)をHindIIIとBamHIで消化した。ルシフェラーゼ遺伝子を含
有するDNA断片を単離した。アダプタープラスミドpAd5/ClipをHindIIIとBamHIで
消化し、その大断片を単離した。つぎに、単離したDNA断片を連結してpAd5/Clip
.Lucを生成させた。アダプターpClipsal.Lucは同じ方法で、ただしHIIIとBamHI
で消化したアダプターpClipsalをベクター断片として使用することによって作成
した。また、pCMV.TK(EP 95〜202 213)のTK含有HIII-BamHI断片をpClipsalに
挿入してpAd5/Clip.TKを作成した。左ITRのすぐ上流にSalI部位が存在するので
、アデノインサートからベクター配列を遊離させることができる。これらベクタ
ー配列の除去は、PER.C6における相同組換え中のベクター生成の頻度を向上させ
る。
スを作成するために、3つの構築物pCLIP.Luc、pWE/AdAflII-EcoおよびpBr/AdBam
rITR.pac/fibXX(XX=12、16、28、40-L、51および5)をアデノウイルス産生細
胞に導入した。5/7/8/9/10/11/12/13/14/16/17/19/21/24/27/28
/29/30/32/33/34/35/36/37/38/40-S/40-L/41-S/42/45/47/49/
51のファイバーを保持する組換えAd5ウイルスを作成するために、2つの構築物pC
LIP.LucとpWE/Ad.AflII-rITR/FibXXをアデノウイルス産生細胞に導入した。
dBamrITR.pac/fibXXの両方4μg(またはコスミドの場合は4μgのpCLIP.Lucおよ
び4μgのpWE/Ad.AflII-rITR/FibXX)とを無血清DMEMに希釈して総体積を100μl
にした。このDNA懸濁液に、1倍希釈リポフェクタミン(ギブコ社)100μlを加え
た。室温で30分後に、そのDNA-リポフェクタミン複合体溶液を2.5mlの無血清DME
Mに加え、つぎにそれをT25cm2組織培養フラスコに加えた。このフラスコはトラ
ンスフェクションの24時間前に播種された2×106個のPER.C6細胞を含んでいた。
2時間後に、20%ウシ胎仔血清を補足したDMEM 2.4mlを加えることによって、そ
のDNA-リポフェクタミン複合体含有培地を倍に希釈した。さらに24時間後に、10
%ウシ胎仔血清を補足した新しいDMEMで培地を置換した。細胞を6〜8日培養した
あと、収集し、3回凍結/融解した。室温、3000rpmで5分間の遠心分離によって細
胞片を除去した。その上清(12.5ml)のうち3〜5mlを使って、PER.C6細胞(T80c
m2組織培養フラスコ)を再び感染させた。この再感染は、5〜6日後に完全な細胞
変性効果(CPE)をもたらし、そのあと、アデノウイルスが前述のように収集さ
れる。生成したウイルスのバッチを使って、2つの検定を常套的に行なった。1)
1980μlのDMEMを添加することによって10倍に希釈した20μlのウイルス上清を使
って、感染の24時間前に6穴プレートの1ウェルにつき105細胞の濃度で播種したA
549細胞を感染させた。48時間後に、タンパク質溶解液を調製し、つぎにそれを
使ってマーカー遺伝子発現(ルシフェラーゼ活性)を測定した。2)20μlのウイ
ルス上清を使って、ヒト911細胞でのウイルス力価を決定する。この目的のため
に、911細胞を96穴プレートの1ウェルにつき4×104細胞の濃度で播種した。播種
の3〜4時間後に、培地をアデノウイルス上清(希釈範囲:2μl〜5×10-9μl)で
置換した。キメラファイバーアデノウイルス血清型5のウイルス力価は常に1mlあ
たり1×108感染単位をこえていた。
いて、懸濁培養にとくに適合させた1〜1.5×106細胞/mlのPER.C6を含有する1リ
ットルの発酵槽に接種した。接種の3日後に細胞を収集し、室温1750rpmで10分間
遠心分離することによってペレット化した。つぎに、ペレット化した細胞中に存
在するキメラアデノウイルスを、つぎの下流プロセシング(downstream process
ing)プロトコルで抽出し、精製した。ペレットを50mlの10mM NaPO4に溶解し、
−20℃で凍結した。37℃で融解したあと、5.6mlのデオキシコレート(5%w/v)
を加え、そのあと、その溶液をホモジナイズした。つぎに、細胞を破砕するため
に、その溶液を37℃で15分間インキュベートした。その溶液をホモジナイズした
あと、1875μlの(1M)MgCl2を加え、5mlの100%グリセロールを加えた。375μl
のDNアーゼ(10mg/ml)を添加したあと、その溶液を37℃で30分間インキュベー
トした。ブレーキをかけずに室温、1880×gで30分間の遠心分離により、細胞片
を除去した。つぎに上清を、10mlのフレオンにのせることによってタンパク質か
ら精製した。ブレーキをかけずに室温、2000rpmで15分間の遠心分離を行なうと
、3つのバンドが見えたが、そのうちの上部のバンドはアデノウイルスに相当す
る。このバンドをピペッティングによって単離したあと、それをTris/HCl(1M)
緩衝塩化セシウムブロック勾配(範囲:1.2から1.4g/ml)にのせた。ウイルスは
他の成分とは対照的に1.4g/ml塩化セシウム溶液には移動しなかったので、10℃
、21000rpmで2.5時間の遠心分離後に、ウイルスが残留タンパク質と細胞片から
精製された。そのウイルスバンドを単離したあと、Tris/HCl(1M)で緩衝化した
1.33g/ml塩化セシウムの連続的勾配を用いる二回目の精製を行なう。この勾配の
上端にウイルスをのせたあと、ウイルスを10℃、55000rpmで17時間遠心分離した
。つぎに、そのウイルスバンドを単離し、30μlのショ糖(50w/v)を添加したあ
と、過剰の塩化セシウムをそれぞれ1時間からなる3回の透析によって除去する。
透析のために、ウイルスを透析スライドに移す(スライド-a-ライザー(Slide-a-
lizer)、カットオフ10000kDa、ピアス社(Pierce)、米国)。透析に使用する緩衝
液は、増加する濃度のショ糖を補足したPBS(1回目から3回目にかけて:30ml、6
0mlおよび150mlショ糖(50%w/v)/1.5リットルPBS、すべてに7.5mlの2%(w/v
)CaMgCl2を補足)である。透析後に、ウイルスをスライド-a-ライザーから取り
出したあと、それを25および100μlずつに等分し、そのあと、ウイルスを−85℃
で保存する。
ッチ50μlを高速液体クロマトグラフィーカラム(HPLC)にかける。アデノウイ
ルスはカラム(陰イオン交換)に結合されたあと、NaCl勾配(範囲300〜600mM)
を用いて溶出される。ウイルスピーク下の面積を決定することにより、ウイルス
粒子の数を計算できる。ウイルスのバッチ中に存在する1mlあたりの感染単位(I
U)数を決定するために、911細胞で力価測定を行なう。この目的のために、96穴
プレートの1ウェルにつき4×104個の911細胞を、B、DおよびF列に、1ウェルにつ
き100μlの総体積で播種する。播種の3時間後に細胞がそのプラスチック支持体
に付着したあと、培地を除去できる。その細胞に、様々な希釈率のウイルス(範
囲:102倍希釈から2×109)を含有する200μlを2つ一組にして加える。CPEに関
するスクリーニングにより、14日後になおCPEを示す最も高いウイルス希釈液が
、少なくとも1感染単位を含有するとみなされる。これらのウェル中に存在する
ウイルス体積の計算値と共にこの観察を用いることにより、与えられたウイルス
のバッチ1mlあたりの感染単位数が得られる。生産結果、すなわち1mlあたりのウ
イルス粒子と1mlあたりのIUまたは現在までに生産されたキメラアデノウイルス
を、表4に示す。
イレクトされた感染を証明するために、様々な起源を持つヒト細胞株のパネルを
使用した。このパネルには、とりわけ、ヒト肝細胞、初代線維芽細胞、造血系細
胞株、初代平滑筋細胞、初代滑膜細胞、および羊膜細胞や絨毛膜絨毛などの羊水
由来の初代細胞が含まれる。これらの細胞タイプを、ファイバータンパク質が異
なる一群のキメラアデノウイルスに感染させた。この目的のために、標的細胞を
6穴プレートの各ウェルにつき105細胞の濃度で、10%ウシ胎仔血清を補足したダ
ルベッコ改変イーグル培地(DMEM、ライフ テクノロジーズ社、オランダ)2mlに
播種する。24時間後に、0、10、50、250、1250、2500、5000とMOI(1細胞あたり
のウイルス粒子数に基づくMOI)が増加する様々なキメラアデノウイルスを含有
する新鮮な培地で置換する。ウイルスを添加した約2時間後に、ウイルスを含有
する培地を捨て、細胞をPBSで1回洗浄し、つぎに新鮮な培地(ウイルスを含有し
ないもの)2mlを各ウェルに加える。48時間後に、1500rpmで5分間遠心分離する
ことによって細胞を収集し、洗浄し、ペレット状にする。つぎに細胞を0.1mlの
溶解緩衝液(トリス−リン酸緩衝液(pH7.8)中の1%トリトン(Triton)X-100
、15%グリセロール、2mM EDTA、2mM DTTおよび25mM MgCl2)中で溶解し、その
溶解物の総タンパク質濃度を測定する(バイオラッド社、タンパク質標準II)。
マーカー遺伝子発現(ルシフェラーゼ活性)を決定するために、20μlのタンパ
ク質試料を100μlのルシフェラーゼ基質(ルシフェリン(Luciferine)、プロメガ
社(Promega)、オランダ)と混合したあと、ルーマット(Lumat)LB 9507装置(イ
ージー アンド ジー ベルトルド社(EG & G Berthold)、オランダ)で測定する。
タンパク質1μgあたりのルシフェラーゼ活性(RLU)の量として与えられるこれ
ら感染実験の結果を表5に示す。これらの結果は、ファイバータンパク質の変化
がアデノウイルス血清型5宿主域の変化をもたらすことを明白に立証している。
定するために、アデノウイルス血清型5感染に関与することが知られているタン
パク質、すなわちコクサッキーアデノウイルス受容体(CAR)、MHCクラスIおよ
びインテグリン類(αvβ3、αvβ5)の発現を測定した。この目的のために、1
×105個の標的細胞をフローサイトメトリー用に設計されたチューブ(1細胞タイ
プにつき4本のチューブ)に移した。細胞をPBS/0.5%BSAで1回洗浄したあと、そ
れらの細胞を室温、1750rpmで5分間の遠心分離によってペレット状にした。つぎ
に、100倍希釈したαvβ3抗体(マブ(Mab) 1961、ブランスウィック ケミー社(B
runswick chemie)、オランダ・アムステルダム)、100倍希釈した抗体αvβ5(
抗体(マブ 1976、ブランスウィック ケミー社、オランダ・アムステルダム)ま
たは2000倍希釈したCAR抗体(ハーバードメディカルスクール、米国ボストンの
ベルゲルソン(Bergelson)博士の厚意により贈与されたもの(スーら))10μlを
、その細胞ペレットに加えたあと、細胞を暗所にて4℃で30分間インキュベート
した。このインキュベーションのあと、細胞をPBS/0.5%BSAで2回洗浄し、室温
、1750rpmで5分間の遠心分離によって再びペレット状にした。細胞を標識するた
めに、フィコエリスリン(PE)で標識したラット抗マウスIgG1(10μl)を細胞
ペレットに加え、続いて細胞を再び暗所にて4℃で30分間インキュベートした。
最後に細胞をPBS/0.5%BSAで2回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。こ
れらの実験の結果を表6に示す。表6にはA、B、C、DおよびF亜群から得られる
アデノウイルスの感染効率も含まれている。これらのデータは、C亜群アデノウ
イルスの感染がCARの発現と相関することを明白に示している。またこのデータ
は、B、DまたはF亜群のアデノウイルスのファイバーを保持するキメラアデノウ
イルスが、測定できるレベルのCARタンパク質を発現させない細胞に感染できる
こと、したがって異なる(CAR非依存的)経路によって細胞に感染できることも
証明している。
らのウイルスを放射活性のI123/I125か、蛍光プローブで標識した。蛍光顕微鏡
を使用するか、放射活性を測定することにより、特定の細胞タイプへの様々な血
清型の感染の効率が決定される。ファイバータンパク質に関してキメラなアデノ
ウイルスのインビボでのリダイレクトされた感染を証明するため、CBA/caマウス
(各キメラアデノウイルスにつき2匹)に1×109個の感染性粒子を尾静脈から注
射した。特定組織へのアデノウイルス感染の検出は2つの異なるレベルでモニタ
ーされる。すなわち、1)アデノウイルスを放射活性標識することにより、キメ
ラアデノウイルスの結合をモニターする(アイゼンローア(Eisenlohr)ら、1987
年;マトリン(Matlin)ら、1981年;リッチマン(Richman)ら、1998年)。尾静脈
を通したインビボ全身送達の1時間後にマウスを屠殺し、そのあと、様々な器官
または組織中の放射活性を測定することによって選択性を調べる。2)感染の成
功を、マーカー遺伝子のアデノウイルス遺伝子発現、すなわちlacZまたはルシフ
ェラーゼ活性によってモニターする。投与の4日後にマウスを屠殺したあと、器
官と組織を単離する。試料には肝臓、脾臓、胃腸路、末梢血、骨髄、大動脈、筋
肉などを含めた。この方法を用いて、興味の対象である組織に対するキメラアデ
ノウイルスの選択的結合を調べることができる。さらに、この方法を用いること
により、特定器官の特定細胞へのキメラアデノウイルスの選択的感染を決定でき
る。
コートチューブ(Iodogen precoated tube、ピアス社)中、室温で6分間インキ
ュベートすることにより、80μCiのI123(サイゲネ ビーブイ社(Cygne BV)、オ
ランダ)またはI125(アマシャム社)を活性化した。放射標識反応は、100μlの
ヨウ素化緩衝液中に1,5.1010個のアデノウイルス粒子を含有するエッペンドルフ
チューブに、活性化されたヨウ素を移すことによって開始した。その反応を室温
で9分間進行させたあと、組み込まれた標識を遊離の標識から、セファデックス2
5カラム(P-10、ファルマシア社)を用いたゲル濾過によって分離した。この目
的のために、P-10カラムを10mlのPBS緩衝液で前洗浄したあと、2mlのヨウ素化緩
衝液を補足した放射標識反応液を充填した。最初の通過液を捨てたあと、カラム
を0.5mlずつのPBS緩衝液で溶出し、様々な画分を別個のチューブに集めた。カラ
ムによって減速される遊離の標識は、第10〜16画分に濃縮された。放射標識ウイ
ルス粒子は、主として、2〜3mlの総溶出体積に相当する第4、5および6画分に蓄
積した。これらウイルス含有画分の放射活性を測定し、1分あたりのカウント数
(cpm)として表わしたところ、最高で1010ウイルス粒子につき5×106cpmになっ
た。
を行なった。例えばある反応ではウイルス粒子に同じ処理を施したが放射性ヨウ
素を省略した。つぎに溶出したウイルス粒子を使ってA549細胞を感染させた。感
染した細胞の量は、LacZなどの視覚的マーカー遺伝子の発現によって確証した。
また、放射標識アデノウイルスに相当する溶出画分のうち、少量を使ってA549細
胞を感染させることによって導入遺伝子の発現を調べ、それが、使用した特定の
ウイルスバッチのウイルス生存度を表わすものであると解釈した。
官に対する親和性を決定するための種々のインビトロおよびインビボ試験に使用
できる。インビトロ試験では、例えばHUVEC(ヒト臍静脈内皮細胞)やSMC(平滑
筋細胞)などの様々な細胞株を適当な培養培地が入った24穴プレートに播種し、
感染の多重度が10、100および1000の放射標識アデノウイルス粒子に感染させる
。対照として、細胞を同等量の遊離ヨウ素と共にインキュベートする。感染の2
時間後に細胞をPBS緩衝液でよく洗浄し、残存放射活性を測定する。細胞に結合
して残っている放射活性の量(遊離の標識と共にインキュベートした対照細胞の
放射活性量について補正したもの)は、細胞に結合するまたは細胞を貫通したウ
イルス量の直接的尺度である。
イルスの体内分布を比較した。この目的のために、ラットを全身麻酔下に置き、
0.1〜2MBqの放射標識アデノウイルス粒子を尾静脈に静脈内(iv)投与した。対
照として、一匹のラットに同等量の遊離のヨウ素のみを与えた。つぎにそれらの
動物をガンマスキャナーにのせ、10分間スキャンすることによってガンマ放射源
の位置を特定し、そうすることによって全身に導入されたアデノウイルスのイン
ビボ体内分布を決定した。1時間後に動物を屠殺し、重量測定をすると共にシン
チレーションカウンターを用いて放射活性の正確な定量を行なうために、主な器
官を摘出した。iv後の様々な器官における放射活性の分布を組織1グラムあたり
のcpmとして表わし、図8に示す。
。これらの細胞タイプは羊水から単離され、標準的条件下にエクスビボで培養さ
れる(ロエスト(Roest)ら、1996年)。このような細胞は出生前診断に使用する
のに理想的な標的である。例えば、ジストロフィン遺伝子中の突然変異は未知で
あり、未分化の絨毛膜絨毛または羊膜絨毛細胞中で産生されるジストロフィンの
レベルは極めて低いため、逆転写PCRやDNA PCRなどの標準的技術では筋ジストロ
フィーの出生前診断が不可能な場合がある(毎年約50〜100例)。これらの例で
は、主として絨毛膜絨毛細胞の単離と急速な分化が行なわれる。つぎに、形質導
入されるとその絨毛膜絨毛を1週間以内に横紋筋細胞に分化させるレトロウイル
ス(ロエストら、1996年)か、MyoD cDNAを持つアデノウイルス(ロエストら、1
999年)に、これらの絨毛膜絨毛を感染させる。完全な分化後に、ジストロフィ
ンタンパク質が発現されるかどうかを決定するために、それらの細胞をウェスタ
ン分析か免疫組織化学に使用することができる。現在まで、絨毛膜絨毛細胞の感
染効率は思わしくなく、レトロウイルスで形質導入された細胞のわずか2〜5%に
過ぎなかった(ロエストら、1996年)。血清型5アデノウイルスを使用して絨毛
膜絨毛にMyoD cDNAを送達することにより、細胞の約10%〜20%(ロエストら、1
999年)を形質導入できるが、それは高い感染多重度(MOI)を使用した場合に限
られ、その高い感染多重度は望ましくない毒性を、したがって細胞死をもたらす
。表5の結果は、試験したなかで最高のMOI(MOI=1細胞あたり5000ウイルス粒子
)でルシフェラーゼ活性がかろうじて測定されるに過ぎない(75RLU/μgタンパ
ク質)ことから、アデノウイルス血清型5が絨毛膜絨毛細胞の形質導入用として
理想的な候補ではないことを明白に証明している。これらの結果はコクサッキー
アデノウイルス受容体(CAR)とインテグリン類の存在に関するフローサイトメ
トリーを用いて確認され、そのフローサイトメトリーはアデノウイルス血清型5
の受容体が絨毛膜絨毛上にはわずかに存在するにすぎないことを示す(表6)。
驚くべきことに、B亜群(ファイバー16および/または51)もしくはF亜群(ファ
イバー40-L)のファイバーを含有するアデノウイルス血清型5系ベクターは、ど
ちらも絨毛膜絨毛を高い効率で形質導入する。ルシフェラーゼ活性によれば、最
もうまく働くベクターはファイバー40-Lを持つアデノウイルス5であり、これは
タンパク質1μgあたり1,688,028相対光単位(アデノウイルス血清型5と比較して
>20,000倍増加した導入遺伝子発現)をもたらす。したがってこのベクターを用
いて羊水中に存在する細胞を形質導入することによって、前述の目的で急速な分
化を可能にしたり、出生前発育中に遺伝子発現を阻害したり、羊水に目的の核酸
を導入して発現させることができる。
の生成 2またはそれ以上の別個のクローン化アデノウイルス配列の同時トランスフェ
クションによって組換えアデノウイルスを作成するための後述の方法。つぎに、
他のアデノウイルス血清型に由来するDNA配列を容易に導入できる鋳型クローン
を作成するために、これらのクローン化アデノウイルス配列を使って特定のアデ
ノウイルス血清型5配列を除去した。それら鋳型クローンの一例として、ヘキソ
ンタンパク質をコードするDNAの交換を可能にするプラスミドの構築について記
述する。
間にある。代替アデノウイルス血清型由来のヘキソンコード配列の、アデノウイ
ルス血清型5骨格への交換が容易に行なえるように、まずシャトルベクターを作
成した。pBr/Ad.Eco-PmeIと呼ばれるこのサブクローンは、まずプラスミドpBr32
2をEcoRIとEcoRVで消化し、pWE/Ad.AflII-Ecoの14kbのPmeI-EcoRI断片を挿入す
ることによって作成された。このシャトルベクター中に、SanDIによる消化と再
連結によって1430bpのSanDI断片の欠失を作って、pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDIを得
た。除去された断片はただ1つのSpeI部位とMunI部位を含有する。pBr/Ad.Eco-Pm
eIΔSanDIから、ヘキソンをコードするアデノウイルス血清型5 DNAを欠失させた
。ここではヘキソン隣接配列をPCRで増幅し、互いに連結することによって、ヘ
キソンコード領域を置換するただ1つの制限部位を生成させた。これらのPCR反応
には、4種類のオリゴヌクレオチドΔhex1〜Δhex4が必要だった。Δhex1:5′-C
CT GGT GCT GCC AAC AGC-3′。
amHIとFseIで消化した。オリゴヌクレオチドΔhex3とΔhex4を使って得られる±
1600bpの増幅DNA産物をBamHIとSbfIで消化した。つぎに、これらの消化したPCR
断片をアガロースゲルから精製し、FseIとSbfIで消化したpBr/Ad.Eco-PmeIΔSan
DIに、T4リガーゼ酵素を用いる三部分連結反応で連結した。得られた構築物をpB
r/Ad.Eco-PmeΔHexonと名付けた。この構築物の一部を配列決定して、正しいヌ
クレオチド配列とただ1つの制限部位MunIとSpeIの存在を確認した。
、縮重オリゴヌクレオチドを合成した。この目的のために、まず、代替血清型の
ヘキソンタンパク質をコードする既知のDNA配列を整列して、ヘキソンタンパク
質のN末端とC末端の両方で保存された領域を同定した。6つの既知の亜群のうち5
つを代表する9種類の血清型のヌクレオチド配列を含むその整列から、(縮重)
オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、HEX-上流(5
′-GGACGTGT AAG ATG GCY ACC CCH TCG ATG MTG-3′)およびHEX-下流(5′-CCA
TCG ATG GTT ATG TKG TKG CGT TRC CGG C-3′)と名付けた。増幅反応(50μl
)は、1反応につき、2mMの各dNTP、25pmolの各オリゴヌクレオチド、標準1×PCR
緩衝液、1.5mM MgCl2および1単位のPwo熱安定性ポリメラーゼ(ベーリンガー社
)を含有した。サイクラープログラムは、94℃で30秒、60〜64℃で60秒および72
℃で120秒からそれぞれ構成される20サイクルを含んだ。そのPCR産物の10分の1
をアガロースゲルで泳動することにより、DNA断片が増幅されたことが証明され
た。それぞれ異なる鋳型で、2回の独立したPCR反応を行なった後、得られた独立
のPCR断片を配列決定してヌクレオチド配列を決めた。9種類の血清型から得られ
るヌクレオチド配列はゲンバンク中に存在する配列になぞらえることができた。
他の全ての血清型のヘキソンタンパク質をコードするヌクレオチド配列は未知で
ある。現在までに、血清型1、8、13および18を除く各血清型のヘキソン配列がPC
R増幅されている。血清型34、35、36および41のヘキソンのタンパク質配列を図
10に示す。
SpeIで消化した。つぎに、消化したDNAをアガロースゲルで泳動したあと、各断
片をそのゲルから単離し、ジーンクリーンキット(バイオ101社)を使って精製
した。つぎに、それらのPCR断片をpBr/Ad.Eco-PmeΔHexonのMunI部位とSpeI部位
にクローニングすることにより、pBr/Ad.Eco-PmeΔHexXX(ここにXXはそのファ
イバーDNAを単離した血清型番号を表わす)を作成した。これまでに血清型2、3
、4、5、7、9、10、11、14、15、16、19、20、22、23、25、26、27、28、29、30
、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、46、47、48、49、50、51
のヘキソン配列がpBr/Ad.Eco-PmeΔHexXXにクローニングされている。pBr/Ad.Ec
o-PmeΔHexXX(XXは20、25、26、28、30、34、35)から、ヘキソン配列を包含す
る9.6kbのAscI断片をゲル電気泳動とアガロースプロトコル(ベーリンガー マン
ハイム社、オランダ)によって単離した。つぎに、このAscI断片を、AscIで完全
に消化して先に記述したように脱リン酸化したコスミドpWE/Ad.AflII-rITRsp(
実施例1参照)にクローニングした。このコスミドクローニングにより、構築物
pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX(XXはそのヘキソンDNAを単離した血清型番号を表わす
)が形成した。
構築物pCLIP.LucとpWE/Ad.AflII-rITR/HexXXをアデノウイルス産生細胞に導入し
た。トランスフェクションのために、4μgのpCLIP.Lucと4μgのpWE/Ad.AflII-rI
TR/HexXXを無血清DMEMに希釈して総体積を100μlにした。このDNA懸濁液に、2/3
倍希釈リポフェクタミン(ギブコ社)100μlを加えた。室温で30分後に、そのDN
A-リポフェクタミン複合体溶液を2.5mlの無血清DMEMに加え、つぎにそれをT25cm 2 組織培養フラスコに加えた(DNA-リポフェクタミン複合体の添加に先立って5ml
の無血清培地で細胞を洗浄)。このフラスコはトランスフェクションの24時間前
に播種された3×106個のPER.C6細胞を含んでいた。
そのDNA-リポフェクタミン錯複合体体含有培地を倍に希釈した。さらに24時間後
に、10%ウシ胎仔血清を補足した新しいDMEMで、培地を置換した。細胞を6〜8日
培養したあと、収集し、凍結/融解した。室温、3000rpmで5分間の遠心分離によ
って細胞片を除去した。その上清(12.5ml)のうち3〜5mlを使って、PER.C6細胞
(T80cm2組織培養フラスコ)を再び感染させた。
らはまずヒトの患者(25人のがん患者と50人の慢性関節リウマチ患者)から得た
75種類の血清を、ヒト911細胞に対する毒性について調べた。この目的のために
、911細胞を96穴マイクロタイタープレートに1ウェルあたり3×104細胞の濃度で
播種した。24時間後に、ウェルA1〜H1、A5〜H5およびA9〜H9を除く全ウェルの培
地を、5%ウシ胎仔血清を補足した50μlのDMEMで置換した。ウェルA1、A2、B1お
よびB2には、50μlの患者血清1を加えた。同様にウェルC1、C2、D1およびD2には
50μlの患者血清2を加えるなどした。つぎに、ウェルA2〜H2の50μlをA3〜H3に
移し、そのあと、ウェルA3〜H3の50μlをA4〜H4に移した。このようにしてこの
試験計画により、各患者血清について0倍、2倍、4倍および8倍の血清希釈液が得
られた。ウェルA5〜H5ないしA8〜H8およびA9〜H9ないしH12〜H12に同じ処置を行
なうと、96穴マイクロタイタープレート1枚につき12種類の血清が試験されるこ
とになる。つぎに、試験した全部で75のヒト患者血清のうちヒト911細胞に対し
て明らかな毒性を持たなかった25の血清を、キメラアデノウイルス感染を中和で
きる抗体の存在について調べた。この目的のために、96穴マイクロタイタープレ
ートのウェルA1〜H1以外を、5%ウシ胎仔血清を補足した50μlのDMEMで満たした
。ウェルA1、A2、B1およびB2に、50μlの患者血清1を加えた。同様にウェルC1、
C2、D1およびD2には50μlの患者血清2を加えるなどした。つぎに、ウェルA2〜H2
の50μlをウェルA3〜A4に移し、そのあと、ウェルA3〜H3の50mlをA4〜H4に移す
などを、A12〜H12まで行なった(希釈範囲:0〜1/2048)。ウェルA12〜H12から5
0μlを捨てた。つぎに50μlのウイルスを加えたあと、そのマイクロタイタープ
レートを37℃で1時間インキュベートした。50μlの911細胞懸濁液(3×104細胞/
穴)を添加してから、プレートを7〜9日間インキュベートし、そのあと、中和能
をCPEの不在、存在または重篤度によって採点した。対照として、これらの実験
中に、血清の不在、ウイルスの不在および血清とウイルスの不在を採用した。こ
れらの実験に基づいて、それに対する中和抗体がヒトによってほとんど生成され
ないキメラウイルスがいくつか同定される。前述したものと同様の実験をヒトと
動物から得られる野生型アデノウイルス血清型で行なうことにより、宿主の防御
システムによる中和を受けにくい血清型がスクリーニングされる。これらの実験
は類似しているものの、数多くの試料の高スルーフプットスクリーニング(thro
ughput screening)を一度に行ない得るような方法で開発される。この検定を以
下に説明する。
てスクリーニングできるように、自動化された96穴検定法を開発した。 ヒト血清 100個体のパネルを選択した。ボランティア(男性50%、女性50%)は人種に
関して制約のない20歳から60歳の健康な個体だった。すべてのボランティアがイ
ンフォームドコンセントの書式にサインした。アデノウイルスの研究に職業的に
関与している人々は除外した。
500rpmで10分間遠心分離した。約30mlの血清をポリプロピレンチューブに移し、
さらに使用するまで−20℃で凍結保存した。
ないように小分けにした。一部を使って、約70の96穴プレートを満たすのに十分
な量で、培地(DMEM、ギブコBRL社)に5段階の2倍希釈液を作った。無希釈血清
と希釈血清の一部を深穴プレート(96穴フォーマット)中でピペッティングし、
プログラムされたプレートメイト(platemate)を使って96穴プレートに100μl
ずつ分注した。この方法で、下記の計画に従って、プレートに8種類の血清を倍
にして充填した(100μl/穴)。
よびSx/32は2倍連続希釈液を表わす。最後のプレートには、陰性対照として、10
0μlのウシ胎仔血清を満たした4つのウェルも含めた。プレートをさらに使用す
るまで−20℃で保存した。
既知のヒトアデノウイルス全てのプロトタイプを接種し、完全なCPEを示した時
に収集した。凍結/融解後に1〜2mlの粗製溶解液を使って、PER.C6細胞を含むT80
フラスコへ接種し、完全なCPEを示した時点でウイルスを収集した。接種とCPEの
発生の間の時間枠と、新しい培養を再感染するのに必要なウイルスの量は、血清
型間で異なった。凍結/融解によってアデノウイルスストックを調製し、それら
を使って、PER.C6細胞を含む3〜4個のT175cm2三層フラスコへ接種した。CPEが起
こったら、そのフラスコをタッピングすることによって細胞を収集し、細胞をペ
レット状にし、つぎのように2段階CsCl勾配によってウイルスを単離精製した。
細胞ペレットを50mlの10mM NaPO4緩衝液(pH7.2)に溶解し、−20℃で凍結した
。37℃で融解したあと、5.6mlのデオキシコール酸ナトリウム(5%w/v)を加え
た。その溶液を穏やかに混合し、37℃で5〜15分間インキュベートして、細胞を
完全に溶解した。その溶液をホモジナイズしたあと、1875μlの1M MgCl2を加え
た。375μlのDNアーゼ(10mg/ml)を添加したあと、その溶液を37℃で30分間イ
ンキュベートした。室温、1880×gで30分間、ブレーキなしの遠心分離によって
細胞片を除去した。つぎにその上清をフレオンでの抽出(3回)によってタンパ
ク質から精製した。清澄化した上清を1MTris/HCl緩衝塩化セシウムブロック勾配
(範囲:1.2/1.4g/ml)にのせ、10℃で21000rpmで2.5時間遠心分離した。ウイル
スバンドを単離したあと、1.33g/mlの塩化セシウムの1M Tris/HCl緩衝連続勾配
を用いて二回目の精製を行なった。つぎにウイルスを10℃で55000rpmで17時間遠
心分離した。ウイルスバンドを単離し、ショ糖(50%w/v)を最終濃度が1%にな
るように加える。透析スライド(スライド-a-ライザー、カットオフ10000kDa、
ピアス社、米国)中で、CaCl2(0.9mM)、MgCl2(0.5mM)および増加する濃度の
ショ糖(1、2、5%)を補足した1.5リットルのPBSに対して透析(室温で1時間を
3回)することにより、過剰の塩化セシウムを除去する。透析後、ウイルスをそ
のスライド-a-ライザーから取り出し、つぎにそれを25および100μlずつに小分
けにして、直ちにそのウイルスを−85℃で保存する。1ミリリットルあたりのウ
イルス粒子数を決定するために、ウイルスのバッチ50μlをシャブラム(Shabram)
ら(1997)が記述しているように高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)にかける
。ウイルスは、0mMから600mMまでの範囲のNaCl勾配を使って溶出させた。表Iに
示すように、ウイルスが溶出するNaCl濃度は、血清型間で有意に異なった。
た。アデノウイルス8型と40型を911-E4細胞(ヒー(He)ら、1998年)で生育させ
た。精製したストックは5×1010から5×1012ウイルス粒子/ml(VP/ml)を含んだ
。
するために、アデノウイルスをPER.C6細胞で力価測定した。ここでは100μlの培
地を96穴プレートの各ウェルに分注した。前もって104、105、106または107倍希
釈したアデノウイルスストック25μlを96穴プレートの第2列に加え、10回上下に
ピペッティングすることによって混合した。つぎに、25μlを第2列から第3列に
移し、再び混合した。これを第11列まで繰り返したあと、第11列から25μlを捨
てた。この方法で、予備希釈したストックから始めて5倍ずつの連続希釈液を得
た。つぎに、3×104個のPER.C6細胞を100μlの体積に加え、そのプレートを37℃
、5%CO2で5または6日間インキュベートした。CPEを顕微鏡でモニターした。リ
ード(Reed)とムエンシェ(Muensch)の方法を使って細胞培養阻害用量50%(CCID5
0)を計算した。
析した。この検定では、生細胞を比色法的染色によって定量する。ここでは20μ
lのMTT(PBS中7.5mg/ml)をウェルに加え、37℃、5%CO2で2時間インキュベート
した。上清を除去し、100μlの20:1イソプロパノール/トリトンX-100溶液をウ
ェルに加えた。それらのプレートを96穴振盪機に3〜5分間置いて、沈殿した染色
を可溶化した。吸光度を540nmと690nm(バックグラウンド)で測定した。この検
定によって、進行中のCPEまたは完全なCPEを伴うウェルを識別できる。
あたり200 CCID50に希釈したアデノウイルスストックを調製し、血清を含む上記
プレートの第1〜11列に50μlずつ加えた。プレートを37℃、5%CO2で1時間イン
キュベートした。つぎに、6×105/mlのPER.C6細胞50μlをすべてのウェルに分注
し、37℃、5%CO2で1日インキュベートした。血清の毒性効果を避けるために、
上清を各行ごとに新しいピペットチップを使って除去し、200μlの新鮮な培地を
全てのウェルに加えた。プレートを37℃、5%CO2でさらに4日間インキュベート
した。また、ウサギで生成し、行AおよびBの試験しようとする各血清型に特異的
な希釈陽性対照血清と、行CとDの陰性対照血清(FCS)とで、倍の並行対照プレ
ートを用意した。また、行E〜Hのそれぞれでは、試験しようとする各ウイルスの
200 CCID50から始まる5倍希釈液を使って、前述のように力価測定を行なった。
第5日に対照プレートの一つを顕微鏡で分析すると共に、MTT検定で分析した。実
験的力価を顕微鏡で観察した対照力価測定プレートから計算した。CPEが完全で
あることがわかった場合、すなわちMTTで分析した対照力価測定実験における第
一希釈液が明らかな細胞死を示す場合は、全検定プレートを処理した。そうでな
い場合は、完全なCPEが明らかになるまで1日以上検定を進行させたあと、全プレ
ートを処理した。ほとんどの場合、検定は第5日に終了した。最も高い血清濃度
で血清を含まない対照と比較して40%の最大保護がみられる場合、その血清試料
は非中和性であるとみなした。
によって組換えアデノウイルスを作成するための後述の方法。つぎに、他のアデ
ノウイルス血清型に由来するDNA配列を容易に導入できる鋳型クローンを作成す
るために、これらのクローン化アデノウイルス配列を使って特定のアデノウイル
ス血清型5配列を除去した。それら鋳型クローンの一例として、ペントンタンパ
ク質をコードするDNAの交換を可能にするプラスミドの構築ついて記述する。
I-EcoRV断片を、同じ酵素で消化したpBr322に挿入することによって、ペントン
配列用のシャトルベクターを作成した。得られたベクターをpBr/XNと名付けた。
このプラスミドからAd5ペントン配列を除去し、つぎにこれらは他の血清型から
得られる新しいペントン配列を導入するために使用されるただ1つの制限部位で
置換した。ここではpBr/XN中のペントンの左隣接配列をつぎのプライマ-を用い
てPCR増幅した:
領域の5′端にただ1つのBsrGI部位(太字部分)も導入する。
、元のAd5ペントン領域の3′端にただ1つのAflII部位(太字部分)も導入する。
得られた2つのPCR断片をBamHIで消化し、互いに連結した。つぎにその連結混合
物をAvrIIとBglIIで消化した。pBr/XNもAvrIIとBglIIで消化し、そのベクター断
片を、消化し連結したPCR断片に連結した。得られたクローンをpBr/Ad.Δペント
ンと名付けた。Ad5以外の血清型から得られるペントンコード配列を、その5′端
と3′端がそれぞれBsrGI部位とAflII部位を含有するようにPCR増幅した。それら
の異種ペントン配列をpBr/Ad.Δペントンに導入することにより、pBr/Ad.ペント
ンXX(ここにXXは挿入されたペントン配列を増幅するために使用した血清型に対
応する血清型の番号を表わす)と呼ばれる構築物が生成する。つぎに、それらの
新しいペントン配列を、共通するFseI断片を交換することによってpWE/Ad.AflII
-rITR構築物に導入する。重要なことに、pWE/Ad.AflII-rITRの代わりに、それぞ
れ修飾されたヘキソンおよび/またはファイバー配列を持つpWE/Ad.AfllII-rITR/
HexXXまたはpWE/Ad.AfllII-rITR/FibXXベクターに、pBr/Ad.ペントンXXから得ら
れるFseI断片を挿入することもできる。このようにして、アデノウイルスを作成
するための本プラスミド型システムは、標的細胞への感染の効率と特異性および
免疫原性に関して望ましい特徴を持つアデノウイルスの自由度の高い設計を可能
にする。
オリゴヌクレオチドを合成した。各アデノウイルス亜群のうち、現時点でペント
ン配列が知られているものは一つしかない。したがって、それら既知の配列に基
づいてオリゴヌクレオチドを設計した。すなわち、C亜群からペントン配列を増
幅するには、オリゴヌクレオチドP5-for(5′-gctcgatgtacaatgcggcgcgcggcgatg
tat-3′)とP5-rev(5′-gctcgacttaagtcaaaaagtgcggctcgatag-3′)を使用した
。B亜群からペントン配列を増幅するには、オリゴヌクレオチドP3-for(5′-gct
cgatgtacaatgaggagacgagccgtgcta-3′)とP3-rev(5′-gctcgacttaagttagaaagtg
cggcttgaaag-3′)を使用した。D亜群からペントン配列を増幅するには、オリゴ
ヌクレオチドP17-for(5′-gctcgatgtacaatgaggcgtgcggtggtgtcttc-3′)とP17-
rev(5′-gctcgacttaagttagaaggtgcgactggaaagc-3′)を使用した。F亜群からペ
ントン配列を増幅するには、オリゴヌクレオチドPF-for(5′-gctcgatgtacaatga
gacgtgcggtgggagtg-3′)とPF-rev(5′-gctcgacttaagttaaaacgtgcggctagacag-3
′)を使用した。前述したフォワードオリゴヌクレオチドはすべてBsrGI制限部
位をその5′末端に含有し、リバースオリゴヌクレオチドは全てその5′末端にAf
lII制限部位を含有する。
チド、標準1×PCR緩衝液、1.5mM MgCl2および1単位のPwo熱安定性ポリメラーゼ
(ベーリンガー社)を含有した。サイクラープログラムは、94℃で30秒、60〜64
℃で60秒および72℃で120秒からそれぞれ構成される20サイクルを含んだ。そのP
CR産物の10分の1をアガロースゲルで泳動することにより、DNA断片が増幅された
ことが証明された。それぞれ異なる鋳型で、2回の独立したPCR反応を行なったあ
と、得られた独立のPCR断片を配列決定してヌクレオチド配列を決めた。51種類
のヒト血清型のうち、20のペントン配列が増幅された。
化した。つぎに、消化したDNAをアガロースゲルで泳動したあと、各断片をその
ゲルから単離し、ジーンクリーンキット(バイオ101社)を使って精製した。つ
ぎに、それらPCR断片をpBr/Ad.ΔペントンのBsrGI部位とAflII部位にクローニン
グすることにより、pBr/Ad.ペントンXX(ここにXXはそのペントンDNAを単離した
血清型番号を表わす)を作成した。これまでに血清型2、3、5、6、7、11、21、
26、35、39、40、41、42、47、48、49および51のペントン配列がpBr/Ad.ペント
ンXXにクローニングされている。pBr/Ad.ペントンXXから、ペントン配列を包含
する5.1kbのFseI断片をゲル電気泳動とジーンクリーンによって単離した。つぎ
にこのFseI断片を、1)FseIで完全に消化して先に記述したように脱リン酸化し
たコスミドpWE/Ad.AflII-rITR(実施例1参照)にクローニングした。このコス
ミドクローニングにより、構築物pWE/Ad.AflII-rITR/ペントンXX(XXはそのペン
トンDNAを単離した血清型番号を表わす)が形成した。
構築物pCLIP.LucとpWE/Ad.AflII-rITR/PenXXをアデノウイルス産生細胞にトラン
スフェクトした。
/ペントンXXを無血清DMEMに希釈して総体積を100μlにした。このDNA懸濁液に、
1倍希釈リポフェクタミン(ギブコ社)100μlを加えた。室温で30分後に、そのD
NA-リポフェクタミン複合体溶液を2.5mlの無血清DMEMに加え、つぎにそれをT25c
m2組織培養フラスコに加えた。このフラスコはトランスフェクションの24時間前
に播種された2×106個のPER.C6細胞を含んでいた。2時間後に、20%ウシ胎仔血
清を補足したDMEM 2.5mlを加えることによって、そのDNA-リポフェクタミン複合
体含有培地を倍に希釈した。さらに24時間後に、10%ウシ胎仔血清を補足した新
しいDMEMで、培地を置換した。細胞を6〜8日培養したあと、収集し、3回凍結/融
解した。室温、3000rpmで5分間の遠心分離によって、細胞片を除去した。その上
清(12.5ml)のうち3〜5mlを使って、感染PER.C6細胞(T80cm2組織培養フラスコ
)を再び感染させた。この再感染は5〜6日後に完全な細胞変性効果(CPE)をも
たらし、そのあと、アデノウイルが前述のように収集される。
る免疫応答の変化をもたらすファイバータンパク質またはヘキソンタンパク質に
関してキメラな組換えアデノウイルスベクターの構築を包含する。これらのキメ
ラアデノウイルスベクターは遺伝子導入と組換えDNAワクチンの目的で作成され
る。実施例1〜9に記述したものと類似する方法で、ペントンに関してキメラア
デノウイルスが構築され、またアデノウイルスの組立に必要な小タンパク質をコ
ードするDNAや、アデノウイルスの複製に必要な配列などといった(ただしこれ
らに限らない)他の全てのアデノウイルスタンパク質に関してキメラアデノウイ
ルスが構築され得ることは、強調されなければならない。さらにまた、この技術
を用いることにより、現存するアデノウイルス血清型の一部を組み合わせて任意
の与えられた標的細胞または標的疾患にとって好ましい特徴を持つアデノウイル
スベクターを作成するという目的で、二重キメラ、三重キメラ、四重キメラ等の
キメラアデノウイルスベクターを構築できることも強調されなければならない。
約。
ドするDNAの増幅に使用されるオリゴヌクレオチドと縮重オリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドA〜E中の太字はNdeI制限部位を表わす。オリゴヌクレオチド
1〜6と8中の太字はNsiI制限部位を表わす。ヌクレオチド7中の太字はPacI制限部
位を表わす。
子数はHPLCを用いて決定した。1ミリリットルあたりの感染単位(IU)数はヒト9
11細胞での力価測定によって決定した。IU/mlは受容体媒介過程を反映するので
、感染実験のために1ミリリットルあたりのウイルス粒子数を全てのキメラアデ
ノウイルスから得た。
、CCL-1185)。K562:ヒト赤白血病(ATCC、CCL-243)。SupT1:ヒトリンパ芽球
ハイブリッドBおよびT(ATCC 、CRL-1991)。GM09503:ヒト初代線維芽細胞。HE
PG2:ヒト肝がん(ATCC、HB8065)。CEM:ヒトリンパ芽球細胞(ATCC、CRL-1992
)。HeLa:ヒト子宮頚癌(ATCC、CCL-2)。初代羊膜細胞と絨毛膜絨毛細胞はオ
ランダ・ライデンの人類遺伝学部門(department of antropogenetics)から入
手した。初代平滑筋細胞と滑膜細胞はTNO-PG(オランダ・ライデン)から入手し
た。1細胞あたり5000ウイルス粒子のMOIで感染させた細胞のルシフェラーゼ活性
(タンパク質1μgあたりの相対光単位(RLU))測定値を示す。
ノウイルス受容体(CAR)およびMHCクラスIの発現。表5に記載の細胞に加えて
、HUVEC:ヒト臍静脈内皮細胞をTNO-PG(オランダ・ライデン)から入手した。
いずれかの分子をその膜上に発現させる細胞の百分率を示す。各亜群の一代表株
のファイバーを保持するAd5系ベクターと感染効率を表の右側に示す。ND:未決
定。0%とは、その細胞の膜におけるその分子の発現がフローサイトメートリー
では検出できないことを意味する。100%とは、細胞膜におけるその分子の高発
現を意味する。
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ルス5型ファイバーDNAがただ1つのNsiI部位を含有する短いDNA区間で置換される
。
33、34、35、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49および51のファ
イバータンパク質配列。太字はアデノウイルス血清型5のテール部分を表わす。
太字が存在しない場合は、Ad5テールを含有しないPCR断片が配列決定されたこと
を意味する。配列中に存在するXは、ヌクレオチドが同定されていないために未
同定であるアミノ酸を意味する。配列の最後に、ファイバーの停止コドンが点で
示されている。
ラなアデノウイルスとのインビボ体内分布の比較。放射標識アデノウイルス(10 10 ウイルス粒子、0.1〜2MBq)を尾静脈に静脈内投与した。対照として、同等量
の遊離の標識を対照動物に注射した。1時間後にラットを屠殺し、器官をキャリ
ブレートした。図に示す器官の放射活性をシンチレーションカウンターで測定し
、それを組織1グラムあたりのカウント毎分として表わす。
5タンパク質のヘキソンをコードするDNAを欠失させるために使用したオリゴヌク
レオチド・デルタhex1〜4の配列も示す。
に存在するXは、ヌクレオチドが同定されていないために未同定のアミノ酸を意
味する。配列の最後に、ヘキソンの停止コドンが点で示されている。
Claims (10)
- 【請求項1】 キメラウイルスに所望の宿主域を与えるアデノウイルス血清
型のファイバータンパク質の少なくとも一部と抗原性の少ないキメラアデノウイ
ルスをもたらす抗原性の少ない他のアデノウイルス血清型由来のペントンまたは
ヘキソンタンパク質の少なくとも一部とからなるキメラアデノウイルス。 - 【請求項2】 少なくとも1つのITRおよびパッケージングシグナルからなる
アデノウイルスに由来する組換えベクターであって、目的の核酸配列の挿入部位
を有し、さらにアデノウイルスの第1血清型のペントンおよび/またはヘキソン
タンパク質をコードする遺伝子を機能的に挿入するための挿入部位を有し、なら
びに異なる血清型の第2のアデノウイルスのファイバータンパク質をコードする
遺伝のための挿入部位を有する組換えベクター。 - 【請求項3】 プラスミドである請求項2記載の組換えベクター。
- 【請求項4】 請求項1記載のキメラアデノウイルスを産生するためのパッ
ケージング細胞であって、トランスで請求項2記載のアデノウイルスベクター上
にないアデノウイルス産生に必要なすべての構成要素からなるパッケージング細
胞。 - 【請求項5】 請求項4記載のパッケージング細胞および請求項2または3記
載の組換えベクターからなる部分のキットであって、該キットにより本質的に組
換えが重複することはなく、該細胞および該ベクター間で複製可能なアデノウイ
ルスを産生するキット。 - 【請求項6】 前記挿入部位が異なるものであり、好ましくはただ1つの制
限部位である請求項2または3記載のベクター。 - 【請求項7】 所望の宿主域および低減された抗原性を有するキメラアデノ
ウイルスを産生するための方法であって、請求項2記載のベクターを提供し、少
なくとも比較的弱い抗原性を有するアデノウイルス血清型に由来するペントンま
たはヘキソンタンパク質の機能的部分を該ベクターに挿入し、少なくとも所望の
宿主域を有するアデノウイルス血清型に由来するファイバータンパク質の機能的
部分を挿入し、ならびに該ベクターを請求項4記載のパッケージング細胞にトラ
ンスフェクションし、ならびにキメラウイルス粒子を産生する方法。 - 【請求項8】 前記低減された抗原性が中和抗体を生じるための低減された
能力である請求項7記載の方法。 - 【請求項9】 ヘキソン、ペントンおよび/またはファイバータンパク質が
異なるアデノウイルス血清型に由来するキメラタンパク質である請求項1記載の
キメラアデノウイルス。 - 【請求項10】 異なるアデノウイルス血清型に由来する核酸からなる核酸
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