CN113698458A - 一种全液相合成曲普瑞林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种全液相合成曲普瑞林的方法，涉及医药技术领域。S1、液相合成化合物1：Fmoc‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑OH；S2、液相合成化合物2：R1‑D‑Trp‑Leu‑OR2；S3、液相合成化合物3：H‑D‑Trp‑Leu‑OR2；S4、液相合成化合物4：Fmoc‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑OR2；S5、液相合成化合物5：H‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑OR2；S6、液相合成化合物6：H‑His(R3)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑OR2；S7、液相合成化合物7：R4‑Pyr‑His(R3)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑OR2；S8、液相合成化合物8：R4‑Pyr‑His(R3)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑OH；S9、液相合成化合物9：H‑Arg(pbf)‑Pro‑Gly‑NH2；S10、液相合成化合物10：R4‑Pyr‑His(R3)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(pbf)‑Pro‑Gly‑NH2；S11、曲普瑞林粗品的制备。本发明提供的全液相法所制备的曲普瑞林粗品纯度在90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种全液相合成曲普瑞林的方法。
背景技术
曲普瑞林，英文名：Triptorelin，商品名：达菲林、达必佳，肽序列为：H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，分子式：C64H82N18O13，分子量：1310.63。曲普瑞林作为一种促性腺激素释放激素类似物，主要作用于垂体前叶，临床用于治疗相关性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宫内膜异位、子宫肌瘤、体外受精、中枢性性早熟症等。
目前曲普瑞林的制备方法主要以逐个缩合为主。例如专利US4010125使用Benzhydryl amine树脂为起始原料，以Boc保护的氨基酸为单体，专利CN200710044419.7和CN201310013712.2以及CN201310014882.2，均以Rink Amide MBHA树脂或者RinkAmide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次逐个接上氨基酸，裂解获得曲普瑞林粗品，最后HPLC进行分离纯化，获得目标产物。CN201410743707.1采用片段缩合的方式，所得曲普瑞林收率＞40％，纯度为98.5％。
以上方法有如下一些问题：a)曲普瑞林序列中存在Arg-Pro，在常规条件下用固相方法缩合需要过量氨基酸，且缩合效率低，容易出现缺陷肽。这是由于氨基酸自身结构导致的立体位阻使得缩合反应极为困难。b)使用Rink树脂羧基端氨基酸取代值不能太高，合成不经济；并且相对于2-氯-三苯甲基氯树脂价格不菲。c)收率和纯度难以兼得。目前还未有关于全液相法合成曲普瑞林的报道。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服了目前主流的固相反应成本高，使用溶剂多，使用易制毒试剂、环保压力大，产品粗品纯度低的缺点，从而提供一种全液相合成曲普瑞林的方法。产品粗品纯度可以达到90％以上，十分利于的大规模生产。
本发明提供一种全液相合成曲普瑞林的方法，包括如下步骤：
S1、液相合成化合物1：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；
S2、液相合成化合物2：R1-D-Trp-Leu-OR2；
S3、液相合成化合物3：H-D-Trp-Leu-OR2；
S4、液相合成化合物4：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S5、液相合成化合物5：H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S6、液相合成化合物6：H-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S7、液相合成化合物7：R4-Pyr-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S8、液相合成化合物8：R4-Pyr-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH；
S9、液相合成化合物9：H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
S10、液相合成化合物10：
R4-Pyr-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
S11、曲普瑞林粗品的制备；
其中，R1为氨基保护基团，包括Fmoc、Z、Boc中的任意一种；R2为羧基保护基团，包括甲酯Me，乙酯Et，苄酯Bzl，三苯甲酯Tr中的任意一种；R3包括Boc或Trt中的任意一种；R4为氨基保护基团，包括Fmoc、Z、Boc中的任意一种。
优选地，步骤S1具体包括以下步骤：
以Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu和H-Tyr(tBu)-OH为反应单元进行缩合反应，在溶剂中反应得到化合物1；所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu和所述H-Tyr(tBu)-OH的摩尔比为1∶1.05-2，所述H-Tyr(tBu)-OH与所述有机碱的摩尔比为1∶1，所述溶剂包括DMF、THF、甲醇、乙醇、NMP中的任意一种。
更为优选地，所述的有机碱为TEA，所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu和所述H-Tyr(tBu)-OH的摩尔比为1∶1.1，所述H-Tyr(tBu)-OH与所述有机碱的摩尔比为1∶1，所述溶剂包括DMF、THF、甲醇、乙醇、NMP中的任意一种，优选的，所述溶剂为DMF。
优选地，步骤S2具体包括以下步骤：
以R1-D-Trp-OH、H-Leu-OR2为反应单元进行缩合反应，R1-D-Trp-OH与H-Leu-OR2的摩尔比为1∶1.05-2，加入活化剂、有机碱、缩合剂，H-Leu-OR2与活化剂、缩合剂、有机碱的比为1∶1∶1∶1，反应完全后，过滤、析出、洗涤、干燥，收集固体得化合物2；
所述活化剂为多肽合成常用的活化剂，包括HOSu、HOBt、HOAt、HOOBt中的任意一种，更为优选地，所述活化剂为HOSu；所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种，更为优选地，所述缩合剂为DCC；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种，更为优选地，所述有机碱为TEA；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种，更为优选地，所述溶剂为DMF。
优选地，步骤S3具体包括以下步骤：
以步骤S2制得的化合物2为底物，加入脱保护试剂和溶剂，浓缩至少量，析出，过滤，真空干燥得化合物3；
所述脱保护试剂包括三氟乙酸、氯化氢溶液、二乙胺、哌嗪、哌啶中的任意一种；所述溶剂为DMF、甲醇、乙醇、DCM、THF中的任意一种。
进一步地，R1为氨基保护剂，优选为Fmoc或Boc。
进一步地，R2为羧基保护剂，优选为Me或Et；更优选为Me。
当R1为Fmoc时，步骤S3中脱保护试剂优选为二乙胺；当R1为Boc时，脱保护试剂优选为TFA。
优选地，步骤S4具体包括以下步骤：
以步骤S1合成的化合物1和步骤S3合成的化合物3为反应单元进行缩合反应，其中化合物1和化合物3的摩尔比为1∶1.05-2，加入有机碱、缩合剂，其中化合物3与有机碱、缩合剂的摩尔比为1∶1∶1，在溶剂中反应完全后，浓缩、过滤、洗涤、干燥，得化合物4；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。更为优选地，所述溶剂为DMF。
优选地，步骤S5中具体包括以下步骤：
取化合物4，加入脱保护试剂反应脱去Fmoc基团，浓缩至少量，析出固体，过滤，真空干燥得化合物5；所述脱保护试剂包括二乙胺、哌嗪、哌啶溶液的任意一种。
优选地，步骤S6具体包括以下步骤：
以Fmoc-His(R3)-OH、步骤S5中合成的化合物5为反应单元进行缩合反应，其中化合物5与Fmoc-His(R3)-OH的摩尔比为1∶1.05-2，加入活化剂、有机碱、缩合剂，其中Fmoc-His(R3)-OH与活化剂、缩合剂、有机碱的比为1∶1∶1∶1，在溶剂中反应完全，浓缩、过滤、洗涤、干燥，脱保护得化合物6；
所述活化剂为多肽合成常用的活化剂，包括HOSu、HOBt、HOAt、HOOBt中的任意一种；所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。更为优选地，所述溶剂为DMF。
优选地，步骤S7具体包括以下步骤：
以R4-Pyr-OH和步骤S6合成的化合物6进行缩合反应，其中化合物6与R4-Pyr-OH的摩尔比为1∶1.05-2；加入有机碱、缩合剂，其中R4-Pyr-OH与缩合剂、有机碱的摩尔比为1∶1∶1，反应完全后，过滤、洗涤、干燥，得化合物7；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。更为优选地，所述溶剂为DMF。
优选地，步骤S8具体包括以下步骤：
取甲醇和化合物7反应，缓慢加入2M NaOH，反应2-4h，过滤、洗涤、干燥得化合物8；
其中，NaOH和化合物7的摩尔比为1.5∶1-20∶1；
步骤S9具体包括以下步骤：
以R1-Arg(pbf)-OH、H-Pro-Gly-NH2为反应单元进行缩合反应，其中R1-Arg(pbf)-OH和H-Pro-Gly-NH2的摩尔比为1∶1.05-2，加入有机碱、缩合剂，其中R1-Arg(pbf)-OH与有机碱、缩合剂的摩尔比为1∶1∶1，在溶剂中反应完全后，析出固体，过滤，干燥，脱保护，浓缩，析出固体，过滤，真空干燥得化合物9；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。更为优选地，所述溶剂为DMF。
需要说明的是，当R1-Arg(pbf)-OH中R1为Boc基团时，所采用的脱保护试剂为50％TFA/DCM，化合物9和化合物10中pbf基团不存在。
优选地，步骤S10具体包括以下步骤：
以化合物8和化合物9为反应单元进行缩合反应，其中化合物8和化合物9的摩尔比为1∶1.05-2，加入缩合剂、有机碱，其中化合物9和缩合剂、有机碱的摩尔比为1∶1∶1，反应完全后，过滤、洗涤、干燥得化合物10；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种；更为优选地，所述溶剂为DMF。
步骤S11具体包括以下步骤：
取化合物10于反应器中，加入裂解液反应完成后，用冷冻乙醚沉淀，过滤，收集固体，得到曲普瑞林粗品；所述裂解液的组分，按体积比计，包括：TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5。
需要说明的是，上述技术方案中所用试剂均为普通市售药剂；在上述技术方案中，析出或者析出固体操作通常采用醚类试剂，包括石油醚、异丙醚、乙醚中的任意一种或任意组合，优选地，为石油醚。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明通过全液相合成法，创造性地发明绿色、温和的生产工艺，没有使用任何剧毒、易制毒试剂，生产的产品收率在90％左右，粗品纯度可达90％以上，成本极大降低，非常适合大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例制备的化合物1的HPLC谱图；
图2是本发明实施例制备的化合物2的HPLC谱图；
图3是本发明实施例制备的化合物3的HPLC谱图；
图4是本发明实施例制备的化合物4的HPLC谱图；
图5是本发明实施例制备的化合物5的HPLC谱图；
图6是本发明实施例制备的化合物6的HPLC谱图；
图7是本发明实施例制备的化合物7的HPLC谱图；
图8是本发明实施例制备的化合物8的HPLC谱图；
图9是本发明实施例制备的化合物9的HPLC谱图；
图10是本发明实施例制备的化合物10的HPLC谱图；
图11是本发明实施例制备的丙氨瑞林粗品的HPLC谱图。
具体实施方式
本发明权利要求书和说明书中出现物质的英文缩写对应的中文名称见表1.
表1
实施例1
1、液相合成化合物1：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH
1.1投料：
按照表2的物料进行投料。
表2
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSU | 100mmol |
| H-Tyr(tBu)-OH | 110mmol |
| TEA | 110mmol |
| DMF | 400ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
1.2操作过程
将合成Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu用DMF完全溶解后，再准确称取H-Tyr(tBu)-OH加入上述反应瓶，加入TEA反应，HPLC检测反应完全后，将反应液分两次倒入三角瓶中，再加入0.5M盐酸快速搅拌析出，过滤的固体，然后用纯化水洗至中性，35℃干燥。收集固体装至容器中，称重。收率为96％。化合物1的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，50％B-90％B。
HPLC结果参照图1，收率：96％；纯度：87.6％。
2、液相合成化合物2：Fmoc-D-Trp-Leu-OMe.HCl
2.1投料
按照表3的物料进行投料。
表3
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-D-Trp-OH | 150mmol |
| HOSU | 165mmol |
| TEA | 165mmol |
| DCC | 165mmol |
| H-Leu-OEt.HCl | 165mmol |
| DMF | 500ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
2.2操作过程：
准确称取Fmoc-D-Trp-OH、HOSU于反应瓶中，用DMF完全溶解后，再称取H-Leu-OEt.HCl于三角瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min，加入TEA，快速摇匀，加入上述反应瓶中，继续冷浴5min后加入DCC开始反应，HPLC检测反应完全后，过滤反应液，用0.5M盐酸水溶液析出，过滤的固体，然后用纯化水洗至中性，35℃干燥。收集固体装至三角瓶中，称重。化合物2的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，50％B-90％B。
HPLC结果参照图2，收率：108.1％，纯度：95.7％。
3、液相合成化合物3：H-D-Trp-Leu-OMe
3.1投料：
按照表4的物料进行投料。
表4
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-D-Trp-Leu-OMe.HCl | 150mmol |
| 二乙胺 | 400ml |
| 石油醚 | 1L |
3.2操作过程
准确称取Fmoc-D-Trp-Leu-OEt.HCl于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥。化合物3的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，30％B-50％B。
HPLC结果参照图3，收率：87.2％；纯度：93.3％。
4、液相合成化合物4：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe
4.1投料：
按照表5的物料进行投料。
表5
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH | 96mmol |
| BOP | 105.6mmol |
| TEA | 105.6mmol |
| H-D-Trp-Leu-OMe | 105.6mmol |
| DMF | 200ml |
| DCM | 200ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
4.2操作过程
准确称取Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-D-Trp-Leu-OMe用DCM溶解后加入反应中开始反应，HPLC检测反应完全，浓缩，用0.5M盐酸沉淀，过滤收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，称重。化合物4的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，80％B-90％B。
HPLC结果参照图4，收率：92％,纯度：80％。
5、合成H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe
5.1投料
按照表6的物料投料。
表6
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-OEt | 88.3mmol |
| 二乙胺 | 500ml |
| 石油醚 | 1L |
5.2操作过程
准确称取Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，加入二乙胺反应脱去Fmoc基团，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥。化合物5的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，70％B-90％B。
HPLC结果参照图5，收率：92.1％，纯度：90.3％。
6、合成H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe
6.1投料
按照表7的物料进行投料。
表7
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-His(Trt)-OH | 89.5mmol |
| HOBt | 89.5mmol |
| DCC | 89.5mmol |
| H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe | 81.3mmol |
| 二乙胺 | 500ml |
| DMF | 400ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
6.2操作过程
准确称取Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt、H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DCC开始反应，HPLC检测反应完全，过滤反应液，倒入反应瓶中，再加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入0.5M盐酸溶液析出固体，过滤，烘干，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，烘干，称重。化合物6的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，70％B-90％B。
HPLC结果参照图6，收率：86％，纯度：90.6％。
7、液相合成化合物7：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe
7.1投料
按照表8的物料进行投料。
表8
| 物料 | 用量 |
| Boc-Pyr-OH | 76.9mmol |
| BOP | 76.9mmol |
| TEA | 76.9mmol |
| H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe | 69.9mmol |
| DMF | 350ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
7.2操作过程
准确称取Boc-Pyr-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe用DMF溶解后加入反应中开始反应，HPLC检测反应完全，过滤反应液，滤渣用DMF洗涤两次，用0.5M盐酸沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重。
化合物7的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，70％B-90％B。
HPLC结果参照图7，收率：80％，纯度：78.5％。
8、液相合成化合物8：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH
8.1投料
按照下述物料进行投料。
Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe：56mmol
甲醇：1110ml
2M NaOH：110ml
0.1M盐酸溶液：2L
8.2操作过程
称取Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe，置于甲醇中搅拌使完全溶解，缓慢加入2M NaOH，开始反应，HPLC检测反应完全，加入盐酸溶液，沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重。化合物7的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，70％B-90％B。
HPLC结果参照图8，收率：72％，纯度：84.7％。
9、液相合成化合物9：H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2
9.1投料
按照表9的物料进行投料。
表9
| 物料 | 用量 |
| H-Pro-Gly-NH<sub>2</sub> | 150mmol |
| BOP | 157.5mmol |
| DIEA | 157.5mmol |
| Fmoc-Arg(pbf)-OH | 157.5mmol |
| TEA | 157.5mmol |
| DMF | 400ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
| 二乙胺 | 500ml |
9.2操作过程
准确称取Fmoc-Arg(pbf)-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min，加入DIEA，撤掉冷浴，反应20min。
称取H-Pro-Gly-NH2于三角瓶中，用DMF完全溶解后加入TEA，快速混匀后加入上反应中开始反应，HPLC检测反应完全，用0.5M盐酸沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥。加入二乙胺反应20min，浓缩、石油醚析出固体，过滤，真空干燥。化合物9的HPLC检测条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，5％B-30％B
其结果参照图9，收率93％，纯度：95.5％。
10、液相合成化合物10：
Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2
10.1投料
按照表10的物料进行投料。
表10
| 物料 | 用量 |
| Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH | 40.3mmol |
| BOP | 44.3mmol |
| TEA | 44.3mmol |
| H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH<sub>2</sub> | 44.3mmol |
| DMF | 200ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 500ml |
10.2操作过程
准确称取Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2用DMF溶解后加入反应中开始反应；HPLC检测反应完全后，加入0.5M盐酸析出固体，过滤收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重。HPLC检测条件同常规。结果参照图10，收率95％，纯度：81.1％。
HPLC分析条件为：
流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；
检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，
梯度：0-30min，70％B-90％B。
11、合成曲普瑞林粗品
11.1投料
化合物10：42.1mmol
裂解液(TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5)：300ml
11.2操作过程
将Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2加入反应瓶中，加入裂解液反应30min后用冷冻乙醚沉淀，过滤，收集固体，得到产物粗品，产物用水溶解后HPLC检测分析。HPLC检测分析条件同常规。结果参照图11，收率：89.4％，纯度91.3％。
实施例2
1、液相合成化合物1：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH
1.1投料：
按照表11的物料进行投料。
表11
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSU | 100mmol |
| H-Tyr(tBu)-OH | 200mmol |
| TEA | 200mmol |
| DMF | 400ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
其操作过程同实施例1。收率：95.6％；纯度：87.2％。
2、液相合成化合物2：Boc-D-Trp-Leu-OEt.HCl
2.1投料
按照表12的物料进行投料。
表12
| 物料 | 用量 |
| Boc-D-Trp-OH | 150mmol |
| HOSU | 300mmol |
| TEA | 300mmol |
| DCC | 300mmol |
| H-Leu-OEt.HCl | 300mmol |
| DMF | 500ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
其操作过程同实施例1。收率：107.1％，纯度：95.2％。
3、液相合成化合物3：H-D-Trp-Leu-OEt
3.1投料：
按照表13的物料进行投料。
表13
| 物料 | 用量 |
| Boc-D-Trp-Leu-OEt.HCl | 150mmol |
| 50％TFA/DCM | 500ml |
| 石油醚 | 1L |
其操作过程同实施例1。收率：87.1％；纯度：90.8％。
4、液相合成化合物4：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OEt
4.1投料：
按照表14的物料进行投料。
表14
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH | 96mmol |
| BOP | 105.6mmol |
| TEA | 105.6mmol |
| H-D-Trp-Leu-OEt | 105.6mmol |
| DMF | 200ml |
| DCM | 200ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
其操作过程同实施例1。收率：91.2％,纯度：79.8％。
5、合成H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OEt
其过程同实施例1。
6、合成H-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OEt
6.1投料
按照表15的物料进行投料。
表15
| 物料 | 用量 |
| Fmoc-His(Boc)-OH | 162.6mmol |
| HOBt | 162.6mmol |
| DCC | 162.6mmol |
| H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OEt | 81.3mmol |
| 二乙胺 | 500ml |
| DMF | 400ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
操作过程同实施例1。收率：85.6％，纯度：81.2％。
7、液相合成化合物7：Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OEt
7.1投料
按照表16的物料进行投料。
表16
其操作过程同实施例1。收率：80％，纯度：85.3％。
8、液相合成化合物8：Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH
8.1投料
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OEt：56mmol
甲醇：1110ml
2M NaOH：110ml
0.1M盐酸溶液：2L
其操作过程同实施例1。收率：73％，纯度：89％。
9、液相合成化合物9：H-Arg-Pro-Gly-NH2
9.1投料
按照表17的物料进行投料。
表17
| 物料 | 用量 |
| H-Pro-Gly-NH<sub>2</sub> | 150mmol |
| BOP | 300mmol |
| DIEA | 300mmol |
| Fmoc-Arg(pbf)-OH | 300mmol |
| TEA | 300mmol |
| DMF | 400ml |
| 0.5M盐酸溶液 | 1L |
| 50％TFA/DCM | 500ml |
操作过程同实施例1。收率92％；纯度：95.4％。
10、液相合成化合物10：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
10.1投料
按照表18的物料进行投料。
表18
操作过程同实施例1。收率95％，纯度：75％。
11、合成曲普瑞林粗品
11.1投料
化合物10：42.1mmol
裂解液(TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5)：300ml。
操作过程同实施例1。收率：90.4％，纯度90.9％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、液相合成化合物1：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；
S2、液相合成化合物2：R1-D-Trp-Leu-OR2；
S3、液相合成化合物3：H-D-Trp-Leu-OR2；
S4、液相合成化合物4：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S5、液相合成化合物5：H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S6、液相合成化合物6：H-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S7、液相合成化合物7：R4-Pyr-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR2；
S8、液相合成化合物8：R4-Pyr-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH；
S9、液相合成化合物9：H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
S10、液相合成化合物10：
R4-Pyr-His(R3)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
S11、曲普瑞林粗品的制备；
其中，R1为氨基保护基团，包括Fmoc、Z、Boc中的任意一种；R2为羧基保护基团，包括甲酯Me，乙酯Et，苄酯Bzl，三苯甲酯Tr中的任意一种；R3包括Boc或Trt中的任意一种；R4为氨基保护基团，包括Fmoc、Z、Boc中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下步骤：
以Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu和H-Tyr(tBu)-OH为反应单元进行缩合反应，在溶剂中反应得到化合物1；所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu和所述H-Tyr(tBu)-OH的摩尔比为1∶1.05-2，所述H-Tyr(tBu)-OH与所述有机碱的摩尔比为1∶1，所述溶剂包括DMF、THF、甲醇、乙醇、NMP中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S2具体包括以下步骤：
以R1-D-Trp-OH、H-Leu-OR2为反应单元进行缩合反应，R1-D-Trp-OH与H-Leu-OR2的摩尔比为1∶1.05-2，加入活化剂、有机碱、缩合剂，H-Leu-OR2与活化剂、缩合剂、有机碱的比为1∶1∶1∶1，反应完全后，过滤、析出、洗涤、干燥，收集固体得化合物2；
所述活化剂为多肽合成常用的活化剂，包括HOSu、HOBt、HOAt、HOOBt中的任意一种；所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S3具体包括以下步骤：
以步骤S2制得的化合物2为底物，加入脱保护试剂和溶剂，浓缩至少量，析出，过滤，真空干燥得化合物3；
所述脱保护试剂包括三氟乙酸、二乙胺、哌嗪、哌啶中的任意一种；所述溶剂为DMF、甲醇、乙醇、DCM、THF中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S4具体包括以下步骤：
以步骤S1合成的化合物1和步骤S3合成的化合物3为反应单元进行缩合反应，其中化合物1和化合物3的摩尔比为1∶1.05-2，加入有机碱、缩合剂，其中化合物3与有机碱、缩合剂的摩尔比为1∶1∶1，在溶剂中反应完全后，浓缩、过滤、洗涤、干燥，得化合物4；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S5中具体包括以下步骤：
取化合物4，加入脱保护试剂反应脱去Fmoc基团，浓缩至少量，析出固体，过滤，真空干燥得化合物5；所述脱保护试剂包括二乙胺、哌嗪、哌啶溶液的任意一种。
7.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S6具体包括以下步骤：
以Fmoc-His(R3)-OH、步骤S5中合成的化合物5为反应单元进行缩合反应，其中化合物5与Fmoc-His(R3)-OH的摩尔比为1∶1.05-2，加入活化剂、有机碱、缩合剂，其中Fmoc-His(R3)-OH与活化剂、缩合剂、有机碱的比为1∶1∶1∶1，在溶剂中反应完全，浓缩、过滤、洗涤、干燥，得化合物6；
所述活化剂为多肽合成常用的活化剂，包括HOSu、HOBt、HOAt、HOOBt中的任意一种；所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S7具体包括以下步骤：
以R4-Pyr-OH和步骤S6合成的化合物6进行缩合反应，其中化合物6与R4-Pyr-OH的摩尔比为1∶1.05-2；加入有机碱、缩合剂，其中R4-Pyr-OH与缩合剂、有机碱的摩尔比为1∶1∶1，反应完全后，过滤、洗涤、干燥，得化合物7；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S8具体包括以下步骤：
取甲醇和化合物7反应，缓慢加入2M NaOH，反应2-4h，过滤、洗涤、干燥得化合物8；
其中，NaOH和化合物7的摩尔比为1.5∶1-20∶1；
步骤S9具体包括以下步骤：
以R1-Arg(pbf)-OH、H-Pro-Gly-NH2为反应单元进行缩合反应，其中R1-Arg(pbf)-OH和H-Pro-Gly-NH2的摩尔比为1∶1.05-2，加入有机碱、缩合剂，其中R1-Arg(pbf)-OH与有机碱、缩合剂的摩尔比为1∶1∶1，在溶剂中反应完全后，析出固体，过滤，干燥，脱保护，浓缩，析出固体，过滤，真空干燥得化合物9；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的一种全液相合成曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤S10具体包括以下步骤：
以化合物8和化合物9为反应单元进行缩合反应，其中化合物8和化合物9的摩尔比为1∶1.05-2，加入缩合剂、有机碱，其中化合物9和缩合剂、有机碱的摩尔比为1∶1∶1，反应完全后，过滤、洗涤、干燥得化合物10；
所述缩合剂为多肽合成常用的缩合剂，包括DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU、HATU中的任意一种；所述有机碱包括DIEA、TEA、NMM中的任意一种；所述溶剂包括THF、DCM、DMF、NMP、二氧六环中的任意一种；
步骤S11具体包括以下步骤：
取化合物10于反应器中，加入裂解液反应完成后，用冷冻乙醚沉淀，过滤，收集固体，得到曲普瑞林粗品；
所述裂解液的组分，按体积比计，包括：TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5。
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| CN108440653A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-08-24 | 海南医学院 | 一种布舍瑞林化合物的合成方法 |
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